KR20110128134A

KR20110128134A - 효소―탄소구조물 복합체, 그 제조방법 및 그 용도

Info

Publication number: KR20110128134A
Application number: KR1020110043980A
Authority: KR
Inventors: 김중배
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2010-05-20
Filing date: 2011-05-11
Publication date: 2011-11-28
Also published as: KR101394138B1; US9074174B2; WO2011145826A2; US20130143130A1; WO2011145826A3

Abstract

본 발명의 효소-탄소구조물 복합체는 효소와 탄소구조물 사이에 화학적 결합(특히 공유결합)이 형성되지 않으면서 현저하게 많은 양의 효소가 탄소구조물의 표면에 고정화된다. 따라서 화학적 결합을 위하여 탄소구조물의 표면을 개질하지 않으므로 효소-탄소구조물의 전기전도성을 저감하지 않으면서, 다양한 환경에서 오랜시간이 경과하여도 효소-탄소구조물 복합체의 높은 안정성을 유지한다.
따라서, 본 발명의 효소-탄소구조물 복합체를 바이오 센서, 바이오 연료전지 등에 사용하는 경우 종래의 효소-탄소구조물 복합체에 비하여 그 성능을 현저하게 개선시킬 수 있다.

Description

효소―탄소구조물 복합체, 그 제조방법 및 그 용도{Complex of Enzyme-carbon structure, manufacturing method and use thereof}

본 발명은 효소-탄소구조물 복합체, 그 제조방법 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래의 효소-탄소구조물 복합체에 비하여 효소와 탄소구조물간의 공유결합이 형성되지 않으면서 훨씬 많은 양의 효소를 길이방향으로 신장된 탄소구조물에 고정시키고 이를 장기간 안정적으로 유지할 수 있는 효소-탄소구조물 복합체, 그 제조방법 및 이를 이용한 바이오 센서, 바이오 연료전지, 효소컬럼, ELISA 장치, 바이오 정화기기, Antifouling 용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제조장치 등의 용도를 제공하는 것이다.

효소-탄소구조물 복합체은 그 목적에 따라 바이오 센서, 바이오 연료전지, 효소컬럼, ELISA 장치(키트), 바이오 정화기기, Antifouling 용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제조장치 등의 용도에 폭넓게 사용되며, 이 경우 탄소구조물은 탄소나노튜브, 로드타입, 와이어 타입 등 다양한 형태가 사용된다.

한편, 효소-탄소구조물 복합체를 연료전지의 전극 또는 바이오 센서 등으로 사용하기 위하여 탄소구조물의 표면에 효소를 고정시켜야 하는데 탄소구조물은 그 표면에 효소와 화학적으로 결합할 수 있는 작용기를 가지고 있지 않으므로 탄소구조물의 표면을 개질한 후 효소와 탄소구조물 사이에 공유결합을 형성하고 후처리 공정을 통하여 효소-탄소구조물 복합체를 형성하였다. 구체적으로 도 1의 우측은 종래의 효소-탄소구조물(탄소나노튜브) 복합체의 제조방법을 도시한 것으로서, 탄소구조물을 강산으로 처리하여 탄소구조물 표면을 산화시켜 효소와 공유결합할 수 있는 반응기를 형성시킨다. 이후 EDC/NHS 등의 링커를 처리하고 효소를 첨가하여 탄소구조물과 효소간에 공유결합을 형성한다.

탄소구조물과 효소간에 공유결합이 형성되면 단순히 탄소구조물과 효소간에 흡착된 경우에 비하여 많은 양의 효소가 탄소구조물의 표면에 고정될 수 있고 비교적 높은 안정성 및 효율을 가질 수 있게 된다. 그러나 공유결합을 위하여 탄소구조물의 표면을 개질하여야 하므로 탄소구조물의 전기전도성을 현저하게 저감하는 결과를 초래한다. 또한, 다양한 환경에서 장기간 반복 사용을 목적으로 하는 효소연료전지나 혈당센서를 포함한 바이오센서 등에서의 성공적인 응용을 위한 획기적인 안정성을 달성하지는 못하고 있는 실정이다. 그 이유로 오랜 시간이나 가혹한 조건에서는 한 두 개의 공유결합에 의해 고정된 효소가 변성 (denaturation)이 되기 때문인 것으로 알려져 있다.

본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 길이방향으로 신장된 탄소구조물의 표면에 현저하게 많은 효소를 안정적으로 고정화시킬 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 탄소구조물의 표면에 효소와 공유결합할 수 있는 작용기가 거의 존재하지 않더라도 현저하게 많은 효소를 안정적으로 고정화시킬 수 있는 효소-탄소구조물 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 첫번째 과제를 해결하기 위하여, (1) 길이방향으로 신장된 탄소구조물의 표면에 효소를 흡착시키는 단계; (2) 상기 흡착된 효소를 석출시키기 위하여 상기 탄소구조물에 석출화제를 첨가하는 단계; 및 (3) 상기 석출된 효소간에 가교결합을 형성하기 위하여 상기 탄소나노튜브에 가교결합제를 첨가하는 단계를 포함하는 효소-탄소구조물 복합체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 탄소구조물은 직경이 마이크로미터 또는 나노미터 단위일 수 있으며, 탄소튜브, 탄소로드 또는 탄소와이어 등 일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 탄소구조물은 표면이 개질되지 않은 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 석출화제는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 부틸알콜, 아세톤, PEG, 암모늄 설페이트, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 및 이들의 수용액을 단독 또는 혼합한 것일 수 있으며, 상기 석출화제의 농도는 10 ~ 50중량%일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 가교결합제는 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 1-에틸-3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 글루타르알데하이드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 효소-탄소구조물 복합체는 탄소구조물을 둘러싼 효소들간에 쉘을 형성하나, 효소와 탄소구조물 사이에 공유결합이 형성되지 않을 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 효소는 키모트립신, 트립신, 서브틸리신, 파파인, 리파아제, 홀세라디쉬 페록시다아제, 소이빈 페록시다아제, 클로로 페록시다아제, 망가네이제 페록시다아제, 티로시나아제, 락카아제, 셀룰라아제, 사일라네이즈, 락타아제, 수크라아제, 오가노포스포히드로라아제, 클로리네스테라아제, 글루코스 옥시다아제, 알코올 데히드로제나아제, 글루코스 데히드로제나아제, 히드로제나아제 및 글루코스 이소머라아제로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 두번째 과제를 해결하기 위하여, 길이방향으로 신장된 탄소구조물; 상기 탄소구조물을 둘러싼 효소를 포함하는 쉘;을 포함하되, 상기 효소와 탄소구조물 사이에 공유결합이 형성되지 않은 것을 특징으로 하는 효소-탄소구조물 복합체를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 탄소구조물은 탄소나노튜브, 탄소나노로드, 탄소나노와이어 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 쉘의 두께는 10 ~ 1000 ㎚일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 효소-탄소구조물 복합체를 포함하는 바이오센서, 바이오연료전지, 효소컬럼, ELISA 장치, 바이오 정화기기, Antifouling 용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제조장치로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 장치를 제공한다.

본 발명의 효소-탄소구조물 복합체는 종래의 탄소구조물의 표면개질에 의한 효소와 탄소구조물간에 공유결합으로 형성된 복합체에 비하여 현저하게 많은 양의 효소가 탄소구조물에 고정될 수 있을 뿐 아니라 외부충격으로부터 고정된 효소가 쉽게 유출되지 않으므로 장기간 경과한 경우에도 그 안정성이 유지된다.

또한, 탄소구조물의 표면을 개질하지 않아 표면에 효소와 공유결합을 수행하는 작용기가 존재하지 않는 경우에도 많은 양의 효소를 안정적으로 고정화할 수 있다.

따라서, 본 발명의 효소-탄소구조물 복합체를 바이오 센서, 바이오 연료전지, 효소컬럼, ELISA 장치, 바이오 정화기기, Antifouling 용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제조장치 등에 사용하는 경우 종래의 매트릭스 복합체에 비하여 그 성능을 현저하게 개선시킬 수 있다.

도 1에서 좌측은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 효소-탄소나노튜브 복합체 제조방법의 개략도이고, 우측은 종래의 효소-탄소나노튜브 복합체 제조방법의 개략도이다.
도 2는 ADS-GOx/B-CNT(효소흡착), EPC-GOx/B-CNTs(본 발명의 일실시예에 따른 복합체) 그리고 CA-GOx/EDC-NHS-CNTs(표면개질 후 공유결합된 효소) 활성을 측정한 그래프이다.
도 3은 EPC-GOx/B-CNTs와 CA-GOx/EN-CNTs의 시간이 경과함에 따른 안정성을 측정한 그래프이다.
도 4a는 EPC-GOx/B-CNTs와 CA-GOx/EN-CNTs를 채용한 바이오 연료전전지의 분극곡선이고, 도 4b는 바이오연료전지의 출력-전류 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 효소-탄소구조물 복합체의 사시도 및 도 5b는 이에 대한 단면도이다.
도 6a는 표면개질되지 않은 B-CNTs의 SEM 사진이고, 도 6b는 강산으로 처리되어 표면개질된 CNTs의 SEM 사진이며, 도 6c는 CA-GOx/EN-CNTs에 대한 SEM 사진이고, 도 6d는 EPC-GOx/B-CNTs 에 대한 사진이다.
7a 및 7b는 본 발명의 EPC-GOx/B-CNTs의 SEM 사진으로서, 도 7a는 1,000 배이고, 도 7b는 120,000 배이다.

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래의 탄소구조물에 효소를 고정하는 방법은 모두 수율이 너무 낮을 뿐 아니라 장기간 사용할 경우 안정성이 크게 떨어지게 되어 이를 상업화하기는 지극히 곤란한 문제가 있었다. 또한 개질되지 않은 탄소구조물의 표면은 상업적으로 이용할 수 있을만큼 효소의 고정화가 충분히 이루어지지 않는 문제가 있다. 이에 탄소구조물에 강산처리 등을 통한 표면개질을 수행하는 경우 효소의 고정화율을 향상시킬 수 있지만, 탄소구조물 자체의 전기 전도성이 저하될 뿐 아니라 장시간 경과후 고정화된 효소의 안정성에 문제가 발생하는 경우가 많았다.

이에 본 발명에서는 (1) 길이방향으로 신장된 탄소구조물의 표면에 효소를 흡착시키는 단계; (2) 상기 흡착된 효소를 석출시키기 위하여 상기 탄소구조물에 석출화제를 첨가하는 단계; 및 (3) 상기 석출된 효소간에 가교결합을 형성하기 위하여 상기 탄소나노튜브에 가교결합제를 첨가하는 단계를 포함하는 효소-탄소구조물 복합체의 제조방법을 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 종래의 복합체에 비하여 현저하게 많은 양의 효소가 탄소구조물의 표면에 고정화될 수 있을 뿐 아니라 외부충격으로부터 고정된 효소가 쉽게 유출되지 않으므로 장기간 경과한 경우에도 그 안정성이 유지된다. 또한, 탄소구조물의 표면을 개질하지 않아 표면에 효소와 공유결합을 수행하는 작용기가 존재하지 않는 경우에도 많은 양의 효소를 안정적으로 고정화할 수 있다.

먼저 (1) 단계로서 길이방향으로 신장된 탄소구조물의 표면에 효소를 흡착시킨다. 본 발명에 사용되는 탄소구조물은 직경이 마이크로미터 또는 나노미터 단위일 수 있으며, 그 형상은 길이방향으로 신장되기만 하면 형상의 제한이 없지만 바람직하게는 탄소튜브, 탄소로드 또는 탄소와이어 등의 형상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 탄소나노튜브일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 사용될 수 있는 탄소구조물은 표면이 개질되어 효소와 공유결합을 수행할 수 있는 작용기를 포함하거나, 표면이 개질되지 않아 상기 작용기를 포함하지 않는 것에 모두 적용될 수 있으나, 바람직하게는 탄소구조물의 표면이 개질되지 않는 것이 탄소구조물의 전기전도성을 감소시키지 않는데 매우 유리하다. 그러므로 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 (1) 단계 이전에 효소와의 공유결합을 위하여 산화공정 등의 탄소구조물의 표면을 개질하는 공정을 포함하지 않을 수 있다. 이를 통해 탄소구조물와 효소간의 화학적 결합(특히 공유결합)이 인위적으로 형성되지 않게 된다.

한편, 산화공정 등의 표면개질공정에 따라서 탄소구조물의 표면에 작용기를 생성하는 과정에서 탄소구조물의 전기전도성이 필연적으로 감소하게 된다. 이에 따라 효소를 고정화하여 전기화학적 응용을 하고자 할 때, 표면개질된 탄소구조물의 감소된 전기전도성은 부정적인 결과를 초래한다. 또한, 표면개질공정은 1 ~ 3일 정도 소요되는데, 이 공정을 제거함으로써 전체 공정을 간편화할 수 있게 된다.

본 발명에 사용될 수 있는 효소는 사용하려는 목적에 따라 상기 파이버 매트릭스의 표면에 흡착될 수 있는 것이면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 목적에 따라 키모트립신, 트립신, 서브틸리신, 파파인, 리파아제, 홀세라디쉬 페록시다아제, 소이빈 페록시다아제, 클로로 페록시다아제, 망가네이제 페록시다아제, 티로시나아제, 락카아제, 셀룰라아제, 사일라네이즈, 락타아제, 수크라아제, 오가노포스포히드로라아제, 클로리네스테라아제, 글루코스 옥시다아제, 알코올 데히드로제나아제, 글루코스 데히드로제나아제, 히드로제나아제, 글루코스 이소머라아제 및 이들의 혼합물을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 탄소나노튜브의 표면에 효소를 흡착시키는 방법은 효소가 포함된 용액상에서 탄소구조물을 침지하는 것을 통해 달성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 탄소구조물의 표면에 효소를 흡착시킬 수 있는 것이다.

다음 (2) 단계로서 (2) 상기 흡착된 효소를 석출시키기 위하여 상기 탄소구조물에 석출화제를 첨가(enzyme precipiatation)한다.

탄소구조물의 표면에 흡착된 효소는 그 크기가 매우 작으므로 육안으로 거의 관찰되지 않는다. 이에 상기 흡착된 효소를 석출시키기 위하여 상기 매트릭스에 석출화제를 첨가하는 경우 흡착된 효소들이 서로 뭉치게 되어 그 크기가 커지게 되어 결국 탄소구조물의 표면에서 석출된다. 이 때 사용될 수 있는 석출화제는 효소의 활성에 거의 영향을 미치지 않으면서 효소를 석출시킬 수 있는 것이면 종류의 제한없이 사용될 수 있지만 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 부틸알콜, 아세톤, PEG, 암모늄 설페이트, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 및 이들의 수용액을 단독 또는 혼합한 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

다음, (3) 단계로서 상기 석출된 효소들간의 가교결합을 형성하기 위하여 가교결합제를 첨가하여 효소집적체를 형성한다. 그 결과 마치 햄(탄소구조물)과 이를 둘러싼 부풀어 오른 밀가루 반죽(가교결합된 효소)로 이루어진 핫도그 형상처럼 상기 효소집합체들이 가교결합이 형성되어 탄소구조물의 외부를 코팅하게 되는 것이다. 바람직하게는 탄소구조물의 표면이 개질되지 않은 경우라면 탄소구조물과 효소간의 인위적인 화학적 결합(공유결합)이 형성되지 않게 된다. 즉, 탄소구조물의 주위를 효소집적체가 쉘을 형성하면서 감싸게 되며, 상기 탄소구조물과 효소집적체간에는 공유결합이 발생하지 않을 수 있는 것이다.

한편, 본 발명의 제조방법 중 석출화제를 사용하지 않고 곧바로 가교결합제로 처리한 경우에는 탄소구조물의 표면에 효소의 코팅이 거의 이루어지지 않게 된다.

한편, 본 발명의 제조방법 중 석출화제를 사용하지 않고 곧바로 가교결합제로 처리한 경우에는, 탄소구조물의 표면 주변에 많은 효소가 가교결합을 위헤서 모이는 효과가 없어서 효소코팅이 효율적으로 형성되지 않게 된다. 예를 들면 이러한 접근방식으로는 효소활성도 공유결합된 효소와 비슷하고, 안정성도 본 발명에 크게 미치지 못함을 확인하였다.

본 발명에 사용될 수 있는 가교결합제는 효소의 활성을 저해하지 않고서 효소간에 가교결합을 형성할 수 있는 것이면 종류의 제한없이 사용될 수 있지만 바람직하게는 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 1-에틸-3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 글루타르알데하이드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 포함하여 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 글루타르알데하이드를 사용할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니며 당업계에 공지된 가교결합제를 제한없이 사용하는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

한편 바람직하게는, 상기 쉘은 수층 내지 수백층의 효소의 층으로 형성될 수 있으며, 상기 쉘의 두께는 10 ~ 1000㎚일 수 있으며, 보다 바람직하게는 15 ~ 300㎚일 수 있다.

한편, 상기 (3) 단계 이후 바람직하게는 상기 효소-탄소구조물 복합체를 수세하여 첨가된 가교결합제 및 석출화제를 제거하는 공정을 더 수행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 길이방향으로 신장된 탄소구조물; 상기 탄소구조물을 둘러싼 효소를 포함하는 쉘;을 포함하되, 상기 효소와 탄소구조물 사이에 공유결합이 형성되지 않는 효소-탄소구조물 복합체을 포함하는 효소-탄소구조물 복합체를 제공한다.

도 5a는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 효소-탄소구조물 복합체의 사시도 및 도 5b는 이에 대한 단면도이다. 이를 살펴보면 탄소구조물의 표면을 효소 집적체를 포함하는 쉘이 감싸고 있다. 도 5b에서 탄소구조물(101)의 표면을 효소 집적체를 포함하는 쉘(102)이 감싸는 부분에 대한 단면도로서 탄소나노튜브와 쉘을 형성하는 효소집적체 사이에는 공유결합이 형성되지 않으면서 마치 핫도그처럼 효소집적체를 포함하는 쉘이 탄소나노튜브의 표면을 둘러싸고 있다. 상기 쉘을 형성하는 효소집적체는 단일층이 아니라 효소들이 가교결합을 통해 여러층을 형성하므로 가사 탄소구조물과 효소 사이에 공유결합이 형성되지 않아 이들간의 결합력이 비교적 약하더라도 여러층으로 결합된 효소들이 하나의 쉘을 형성하여 효소들이 변성되거나 이탈하는 것을 방지한다. 이를 통해, 종래의 공유결합에 의한 복합체에 비하여 훨씬 많은 양의 효소가 고정될 수 있을 뿐 아니라, 오랜 시간이 경과한 후에도 효소의 고정량의 감소폭이 훨씬 작다. 한편, 도 5a, 5b에서 효소들간에 표시된 실선은 가교결합된 것을 나타내는 의미이다.

결국, 본 발명의 효소-탄소구조물 복합체는 효소와 공유결합할 수 있는 작용기를 생성하기 위하여 탄소구조물의 표면을 강산 등으로 개질하지 않고서도 탄소구조물의 표면에서 석출된 효소들이 가교결합되어 탄소구조물의 표면을 감싸는 쉘을 형성하게 되므로 마치 핫도그와 같이 탄소구조물과 효소간에 공유결합이 형성되지 않는 경우에도 탄소구조물의 표면에 많은 양의 효소가 많은 층의 가교결합된 효소들로 구성된 쉘을 형성하여 고정화될 수 있다. 이를 통해 개질공정등에 의한 탄소구조물의 전기전도도의 저하를 방지할 수 있고 탄소구조물과 효소가 단순히 몇개의 공유결합에 의해 결합된 것이 아니기 때문에 오랜시간이 지난 이후에도 효소의 활성이 유지될 수 있는 것이다.

그러므로, 본 발명의 효소-탄소구조물 복합체는 종래의 복합체에 비하여 현저하게 많은 양의 효소가 탄소구조물에 고정될 수 있을 뿐 아니라 장기간 경과한 경우에도 그 안정성이 유지된다.

또한, 탄소구조물 복합체의 표면을 강산등으로 개질하지 않아도 되므로 탄소구조물의 물성저하를 방지할 수 있는 것이다.

따라서, 본 발명의 효소-탄소구조물 복합체를 바이오 센서, 바이오 연료전지, 효소컬럼, ELISA 장치, 바이오 정화기기, Antifouling 용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제조장치 등에 사용하는 경우 종래의 복합체를 사용하는 경우에 비하여 그 성능을 현저하게 개선시킬 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다.

<실시예 1> Bare CNT(강산 등으로 표면처리를 거치지 않은 탄소나노튜브)에 석출된 GOx(글루코스 옥시다제)의 준비

Bare CNTs (2 mg, multi-walled, 30±15 nm in outer diameter and 1~5 ㎛ in length, purity >95%, Nanolab, Inc., Newton, MA, USA)를 10mg/ml 1ml GOx solution과 함께 섞어 주었다. Bare CNT (B-CNT)와 GOx의 혼합용액을 실온 100rpm에서 1시간 동안 교반시켰다. 그 뒤 bare CNT에 GOx가 잘 흡착되기 위해 4℃에서 12시간 동안 넣어둔다. 이 과정까지의 방법을 ADS-GOx/B-CNT(단순흡착)라고 한다.

EPC-GOx/B-CNT(석출화제 첨가 후 가교결합제 첨가)를 제조하기 위해 1ml 22wt% ammonium sulfate용액을 1ml 10mg/ml GOx 용액에 넣어준 후 30분동안 실온에서 교반시켜준다. ADS-GOx/B-CNT의 효소 석출 코딩을 위해 22중량%의 ammonium sulfate 처리된 GOx용액과 3ml의 PB buffer에 들어 있는 2mg ADS-GOx/B-CNT를 섞어 준 후 가교결합을 위하여 0.25% GA (glutaraldehyde) solution을 넣어주었다. 그 뒤 용액을 실온의 100rpm에서 30분 동안 교반시켜준 후 4℃에서 12시간동안 보관하였다.

CNT에 공유결합된 GOx (CA-GOx/EN-CNTs)는 100mM MES buffer의 2 mg EDC-NHS 처리된 CNT를 통해 실험하였다. 1ml 10mg/ml GOx 용액과 3 ml PB buffer에 들어 있는 표면개질된 2 mg EDC-NHS 처리된 CNT를 섞어준 후 실온에서 100rpm으로 1시간동안 교반시켰다. 그 뒤 4℃에서 충분한 반응을 위하여 12시간 동안 놓아두었다. 모든 샘플은 4 ℃에서 12시간 동안 반응을 시켜준 후 100mM PB buffer를 이용하여 효소가 더 이상 새어나오는 것이 없도록 여러번 씻어주었다. 잘 씻어준 샘플들을 사용하기 전까지 4 ℃에 보관한다.

<실시예 2> 효소음극의 준비

두께는 370 μm 이고 넓이는 0.332 cm²인 carbon paper electrode (CP) (Fuel Cell Store, San Diego, CA, USA) 는 바이오연료전지의 작동을 위한 효소 음극을 위한 물질로서 사용되었다. CP의 친소성을 위해 황산과 질산의 3:1 비율의 용액에 의해 산처리를 하였다. 산처리된 CP를 0.5% Nafion 용액을 넣어 준비한 각각의 샘플에 넣고 10분동안 담궈두었다. 그 후 꺼내 1시간동안 말려준후 100mM PB buffer를 이용하여 여러번 씻어준 후 4 ℃에서 보관하였다.

<실시예 3> 바이오연료전지의 출력 측정

바이오연료전지의 성능을 측정하기 위해 Bio-Logic SP-150 (TN, USA)이 사용되었다. 3.5 cm x 3 cm (PEM-type)의 소형 바이오연료전지를 만들어 사용하였다. 바이오연료전지의 중요 구성으로는 carbon paper를 포함하는 효소음극, 음극 공간, 전류 수용체와 그리고 맴브레인 (MEA)으로 이루어져 있다. 양성자 교환 맴브레인, 에어펌프 그리고 Pt 양극 전극은 Fuel Cell Store (San Diego, CA, USA)로부터 구입하였다. 100mM PB를 이용하여 만든 200mM 글루코스 용액을 연료로서 음극 공간에 넣어주고 양극에서 충분한 공기를 공급한다. 분극 곡선은 constant load discharge (CLD)를 이용하여 측정하였다.

산처리하지 않고 물에 녹인 CNT를 기본으로 하여 GOx의 석출 코팅이 ADS-GOx/B-CNT의 표면에 일어나며 그것의 전기화학적 성능은 EDC-NHS 처리되어 효소를 CNT와 공유결합시킨 CA-GOx/EN-CNT와 비교하였다.

도 1은 EPC-GOx/B-CNT(석출화제 첨가 후 가교결합)와 CA-GOx/EN-CNT(표면개질 후 공유결합)를 개략적으로 보여주고 있다. ADS-GOx/B-CNT(단순흡착)가 준비된 후 GOx 덩어리를 만들기 위해 ammonium sulfate를 이용하여 석출된 GOx가 GA에 의해 ADS-GOx/B-CNT의 표면과 가교결합하여 GOx의 응집체 코팅이 발생한다. CNT에 공유결합한 GOx는 EDC-NHS 처리된 CNT와 GOx 용액과의 반응으로 준비된다.

도 2는 ADS-GOx/B-CNT(효소흡착), EPC-GOx/B-CNTs(본 발명의 일실시예에 따른 복합체) 그리고 CA-GOx/EDC-NHS-CNTs(표면개질 후 공유결합된 효소) 활성을 측정한 그래프이다. ADS-GOx/B-CNT, EPC-GOx/B-CNT 및 CA-GOx/EN-CNT의 초기 활성은 0.003, 0.034 그리고 0.0074 A500/min으로 측정되었다 (도 2). EPC-GOx/B-CNT의 활성은 ADS-GOx/B-CNT에 비해 약 10배 높고 CA-GOx/EN-CNT에 비해 약 5배 정도 높은 값을 보여주고 있다. EPC-GOx/B-CNT의 활성 증가는 효소의 담지량 증가로 설명될 수 있다. 효소 석출과정은 EPC-GOx의 CNT의 무게당 높은 효소 담지량과 높은 활성을 위해 중요한 역할을 수행한다.

도 3은 EPC-GOx/B-CNTs와 CA-GOx/EN-CNTs의 시간이 경과함에 따른 안정성을 측정한 그래프이다. GOx분석을 통해 측정된 각각의 활성 지점들은 모두 실온에서 보관중인 main stack에서 조금씩 따서 측정되었다. EPC-GOx/B-CNT가 약 270일동안 활성의 손실이 거의 없는 동안 CA-GOx/EN-CNT는 계속적인 활성이 줄어드는 모습을 보여주고 있다. 또한 50℃에서의 EPC-GOx/B-CNT의 활성은 다른 GOx 고정화방법에 비해 휠씬 좋은 결과를 보여주고 있다. 이러한 결과는 EPC-GOx/B-CNT가 비록 CNT와 GOx 사이에 결합이 약하더라도 여러층으로 결합된 효소들이 서로 변성되거나 새어나오는 것을 막고 있다는 것을 말해준다. EPC-GOx/B-CNT의 모습은 SEM을 통해 관찰되었다. SEM 사진을 통해 EPC-GOx/B-CNT는 여러층의 효소가 코팅되었고 B-CNT의 주위를 쉘을 형성하여 단단하게 감싸고 있는다고 할 수 있다. 또한 이것이 오랜시간동안 효소가 새어나오는 것을 막아준다. 이러한 결과를 통해 우리는 CA-GOx/EN-CNT에 비하여 EPC-GOx/B-CNT가 전기화학적으로 좋은 성능을 보여줄 것이라 예상할 수 있다.

효소기반의 바이오연료전지를 하기 앞서 CA-GOx/EDC-NHS-CNTs와 EPC-GOx/B-CNTs를 carbon paper를 이용하여 효소 전극을 만들었다. 효소전극을 만든 후 전기화학적 성능을 측정하기 위해 current-voltage characteristic (VI) plots을 tky하였다 (도 4). VI plot에 따르면 EPC-GOx/B-CNTs에 의한 바이오연료전지가 CA-GOx/EDC-NHS-CNTs에 비해 더 높은 open cell potential (OCP), 적은 overpotential 그리고 더 높은 최대출력밀도를 생산한다. 출력밀도 그래프는 VI 그래프를 기초로 하여 작성되었다. EPC-GOx/B-CNTs의 바이오연료전지 출력밀도는 연구된 전체 전류 밀도 범위의 CA-GOx/EDC-NHS-CNTs보다 높은 값을 보여준다. 게다가 EPC-GOx/B-CNTs의 최대출력밀도는 CA-GOx/EDC-NHS-CNTs보다 약 7배정도 높은 값을 보여주고 있다. EPC-GOx/B-CNTs에 있어서의 이러한 전기화학적 성능향상은 전자발생률과 전자전달상수로 설명될 수 있다.

효소전극에 있어서 전자발생률은 CNT 무게당 효소활성에 비례한다고 설명할수 있다. 도 2에서 보듯이 EPC-GOx/B-CNTs는 CA-GOx/EDC-NHS-CNTs보다 높은 값을 보여주고 있다. 모든 바이오연료전지실험에서 전극에의 CNT 담지량을 고정하였기 때문에 EPC-GOx/B-CNTs의 시간당 전자 발생률은 CA-GOx/EDC-NHS-CNTs보다 높다. 그러나 효소전극에 있어서 생산된 전자는 전지화학적 성능을 측정하기 위해 전류 수용체로 모여져야 한다. 마지막 부분의 전자전달상수는 얼마나 효과적으로 각각의 효소 전극이 효소의 활성지점으로부터 전자를 모을 수 있는지 증명하는데 사용될 수 있다. EPC-GOx/B-CNTs의 전자전달상수는 CA-GOx/EDC-NHS-CNTs보다 휠씬 높은 값을 보여주고 있다 그러므로 EPC-GOx/B-CNTs는 CNT 무게당 더 많은 전자를 생산하고 CA-GOx/EDC-NHS-CNTs보다 더 효율적으로 전자를 전달한다. 결론적으로 EPC-GOx/B-CNTs는 CA-GOx/EDC-NHS-CNTs보다 전기화학적으로 우수한 성능을 보여준다.

EPC-GOx/B-CNTs의 항상된 전기화학적 성능이 CA-GOx/EDC-NHS-CNTs에 비해 단순히 효소 담지량이 많아 발생한다는 논쟁이 있을 수 있다. 만약 이 논쟁이 사실이라면 OCP는 각각의 효소 전극에서 서로 비슷해야 한다. 하지만 바이오연료전지의 OCP는 EPC-GOx/B-CNTs가 CA-GOx/EDC-NHS-CNTs 비해 높은 값을 보여주고 있다. 이것은 고유한 전기적 성질이 향상되었음을 보여준다. 게다가 최대출력밀도가 효소활성보다 더 높은 값을 보여주고 있다. 이 비례가 서로 다른 것은 그것의 전자 전달상수가 다르기 때문이다. 효소활성의 비가 4.59는 전달전달상수의 비 1.68과 곱해졌을 때 최대출력밀도의 비 7.49와 비슷한 값을 보여준다 (표 1). 그러므로 전기화학적 향상된 성능의 EPC-GOx/B-CNTs는 높은 전자발생과 전자 전달 효율의 결과의 결합으로 생각할 수 있다.

	Activity (ΔA₅₀₀min^-1permgCNTs)	Maximum Power density (μW cm^-2)	Electron transfer rate constant (s^-1)
CA-GOx/EN-CNT	0.0074	1.05	1.831
EPC-GOx/B-CNT	0.034	7.86	3.085
Ratio*	4.59	7.49	1.68

한편, 도 6a는 표면개질되지 않은 B-CNTs의 SEM 사진이고, 도 6b는 강산으로 처리되어 표면개질된 CNTs의 SEM 사진이며, 도 6c는 CA-GOx/EN-CNTs에 대한 SEM 사진이고, 도 6d는 EPC-GOx/B-CNTs 에 대한 사진이다. 이를 통해 CA-GOx/EN-CNTs에 비하여 훨씬 많은 양의 효소가 CNTs의 표면에 고정된 것을 확인할 수 있다.

7a 및 7b는 본 발명의 EPC-GOx/B-CNTs의 SEM 사진으로서, 도 7a는 1,000 배이고, 도 7b는 120,000 배이다. 이를 통해 GOx가 B-CNT 주변에 쉘을 형성하고, 상기 쉘의 두께가 다른 방법들에 비하여 현저하게 두꺼우므로, 다량의 효소가 고정되는 것을 확인할 수 있다.

효소-3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체를 바이오 센서, 바이오 연료전지, 효소컬럼, ELISA 장치, 바이오 정화기기, Antifouling 용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제조장치 등에 사용하는 경우 종래의 매트릭스 복합체에 비하여 그 성능을 현저하게 개선시킬 수 있다.

Claims

(1) 길이방향으로 신장된 탄소구조물의 표면에 효소를 흡착시키는 단계;
(2) 상기 흡착된 효소를 석출시키기 위하여 상기 탄소구조물에 석출화제를 첨가하는 단계; 및
(3) 상기 석출된 효소간에 가교결합을 형성하기 위하여 상기 탄소나노튜브에 가교결합제를 첨가하는 단계를 포함하는 효소-탄소구조물 복합체의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 탄소구조물은 직경이 마이크로미터 또는 나노미터 단위인 것을 특징으로 하는 효소-탄소구조물 복합체의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 탄소구조물은 탄소튜브, 탄소로드, 탄소와이어 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 효소-탄소구조물 복합체의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 탄소구조물은 표면이 개질되지 않은 것을 특징으로 하는 효소-탄소구조물 복합체의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 석출화제는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 부틸알콜, 아세톤, PEG, 암모늄 설페이트, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 및 이들의 수용액을 단독 또는 혼합한 것을 특징으로 하는 효소-탄소구조물 복합체의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 석출화제의 농도는 10 ~ 50중량%인 것을 특징으로 하는 효소-탄소구조물 복합체의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 가교결합제는 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 1-에틸-3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 글루타르알데하이드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소-탄소구조물 복합체의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 효소-탄소구조물 복합체는 탄소구조물을 둘러싼 효소들간에 쉘을 형성하나, 효소와 탄소구조물 사이에 공유결합이 형성되지 않은 것을 특징으로 하는 효소-탄소구조물 복합체의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 효소는 키모트립신, 트립신, 서브틸리신, 파파인, 리파아제, 홀세라디쉬 페록시다아제, 소이빈 페록시다아제, 클로로 페록시다아제, 망가네이제 페록시다아제, 티로시나아제, 락카아제, 셀룰라아제, 사일라네이즈, 락타아제, 수크라아제, 오가노포스포히드로라아제, 클로리네스테라아제, 글루코스 옥시다아제, 알코올 데히드로제나아제, 글루코스 데히드로제나아제, 히드로제나아제 및 글루코스 이소머라아제로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 효소-탄소구조물 복합체의 제조방법.
길이방향으로 신장된 탄소구조물;
상기 탄소구조물을 둘러싼 효소를 포함하는 쉘;을 포함하되, 상기 효소와 탄소구조물 사이에 공유결합이 형성되지 않은 것을 특징으로 하는 효소-탄소구조물 복합체.
제10항에 있어서,
상기 탄소구조물은 탄소나노튜브, 탄소나노로드, 탄소나노와이어 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 효소-탄소구조물 복합체.
제10항에 있어서,
상기 탄소구조물은 표면이 개질되지 않은 것을 특징으로 하는 효소-탄소구조물 복합체.
제10항에 있어서,
상기 쉘의 두께는 10 ~ 100㎚인 것을 특징으로 하는 효소-탄소구조물 복합체.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 효소-탄소구조물 복합체를 포함하는 바이오센서, 바이오연료전지, 효소컬럼, ELISA 장치, 바이오 정화기기, Antifouling 용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제조장치로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 장치.