KR20110117621A

KR20110117621A - 종양 억제 타겟으로서 Ｈａｄｅｓ의 용도

Info

Publication number: KR20110117621A
Application number: KR1020110036784A
Authority: KR
Inventors: 배승희; 안성관; 이재호; 정진혁
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-04-21
Filing date: 2011-04-20
Publication date: 2011-10-27
Also published as: KR101367832B1; WO2011132955A3; EP2561885A2; EP2561885A4; US20130157959A1; WO2011132955A2

Abstract

본 발명은 종양 억제 타겟으로서 Hades의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제를 유효성분으로 함유하는 종양 억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명자들은 과발현된 Hades가 p53과 상호작용하여 p53의 핵방출(exonuclear) 기전을 저해함으로써, p53의 종양 억제 기능을 저해시키고, Hades의 제거(knockdown)가 p53의 발현을 증가시키는 것을 확인함으로써, Hades가 p53의 부정적(negative) 조절자임을 처음으로 밝혀냈다. 따라서 종양 세포에서 과발현하는 Hades의 기능을 억제하면 p53에 의한 종양 억제 기능이 효과적으로 일어날 것이다. 즉, Hades 단백질의 발현을 조절하거나, Hades의 작용을 억제하는 억제제를 개발할 수 있으며, 뿐만 아니라 Hades와 p53의 상호작용을 저해하는 신약 후보물질을 도출하여 항암제로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

Description

종양 억제 타겟으로서 Ｈａｄｅｓ의 용도 {Use of Hades as a target for tumor suppressor}

본 발명은 종양 억제 타겟으로서 Hades의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제를 유효성분으로 함유하는 종양 억제용 조성물에 관한 것이다.

종양 억제자인 p53은 DNA 손상 및 저산소증(hypoxia) 등을 포함하는 다양한 세포 신호에 대해 반응하여 세포사멸(apoptosis) 및 세포 주기 정지(arrest)를 유도하는 중앙 스위치 역할을 한다. 핵(nucleus) 내에서 p53의 기능은 세포의 항상성유지(cellular homeostasis) 및 유기적 생존(organismal survival)에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 잘 알려져 있으며 [Dulic et al., Cell 76, 1013-1023 (1994); Lowe et al., Nature 362, 847-849 (1993); Lane DP Cancer. Nature 358, 15-16 (1992); Raycroft et al., Science 249, 1049-1051 (1990)], 또한 핵 외부에서 핵방출(exonuclear) 기전과 같은 transcription-independent mechanism은 p53의 종양 억제 기능을 유지하는데에 중요하다 [Green et al., Nature 458, 1127-1130 (2009)]. p53의 핵방출(exonuclear) 기전은 단백질 합성 및 유전자 전사(transcription)의 부재에서 p53-의존적인 세포사멸 [Wagner et al., Genes Dev. 8, 2817-2830 (1994)] 및 전사적으로 결함이있는 p53 돌연변이에 의한 세포사멸의 유도 [Caelles et al., Nature 370, 220-223 (1994); Haupt et al., Genes Dev. 9, 2170-2183 (1995)]를 포함한다. 또한, 무세포계(cell-free system)에서 세포질 p53(cytoplasmic p53)의 활성은 미토콘드리아 시토크롬 C(mitochondrial cytochrome C)의 방출을 유도한다 [Schuler et al., J Biol Chem. 275, 7337-7342 (2000)]. p53은 DNA 손상시 세포질 및 미토콘드리아에 위치하고 [Marchenko et al., J Biol Chem. 275, 16202 (2000)], 세포질에서 Bcl-xl 및 Bad에 결합한다 [Mihara et al., Molecular Cell 11, 577-590 (2003)]. 이로인해 pro-apoptotic Bcl-2 단백질 및 항-세포사멸(anti-apoptotic) Bcl-2 단백질 사이의 상호작용을 억제하고, pro-apoptotic Bcl-2 단백질의 올리고머화(oligomerization)를 촉진한다 [Chipuk et al., Science 303, 1010-1014 (2004); Jiang et al., Mol Cell Biol. 26, 9071-9082 (2006); Tomita et al., J Biol Chem. 281, 8600-8606 (2006)].

세포질 p53의 조절 메커니즘 및 p53의 핵방출(exonuclear) 기전은 부분적으로 설명되어져왔다. p53의 유비퀴틴화(ubiquitination)는 p53의 위치 및 핵방출(exonuclear) 기전을 조절하는 것으로 생각되었다 [Geyer et al., Nat Cell Biol. 2, 569-573 (2000); Marchenko et al., EMBO J. 26, 923-934 (2007)]. p53의 유비퀴틴화된 형태는 Bax에 결합하지 못하는 반면, 유비퀴틴-특이적 프로테아제(protease)인 HAUSP에 의한 p53의 탈유비퀴틴화(deubiquitination)는 BH3-도메인 단백질에 대해 p53을 결합하도록 하며, 미토콘드리아 투과성 및 세포 사멸을 증가시킨다 [Marchenko et al., Cell Cycle 6, 1718-1723 (2007)]. 따라서, p53 유비퀴틴화는 p53과 Bcl-2 단백질 사이의 상호작용을 억제한다. 상기의 결과들은 p53 유비퀴틴화가 프로테아좀(proteasomal) 분해와 같은 p53의 핵-세포질 셔틀링(shuttling) 및 핵방출(exonuclear) 기전에서 중요한 역할을 수행하는 것을 의미한다. 하지만, p53의 핵방출(exonuclear) 기전을 조절하는 메커니즘은 아직 정확하게 완전히 밝혀지지 않았다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, Hades가 미토콘드리아에 위치하여 p53과 세포질에서 결합하는 것을 확인하였으며, 또한 종양 세포에서 Hades 단백질이 과발현되고, 상기 과발현된 Hades 단백질이 p53의 DNA 결합 도메인과 상호작용하여 p53의 기능을 억제하는 것을 처음으로 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 Hades 단백질과 p53의 상호작용을 억제하는 효과를 갖는 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제를 유효성분으로 함유하는 종양 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 Hades와 p53의 상호작용을 저해하는 항암제의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 스크리닝 방법에 의해 스크리닝된 약제를 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제를 유효성분으로 함유하는 종양 억제용 조성물을 제공한다. 본 발명에서는 Hades가 p53의 음성적 조절자임을 밝힘으로써 상기 Hades의 발현이나 작용을 억제하면 p53의 기능을 촉진하여 종양 억제를 강화할 수 있음을 처음으로 제시하였다.

상기 Hades는 p53에 결합하는 단백질로써, N-말단에 TM(transmembrane) 도메인 또는 단일 펩타이드 영역, 중간 부분에 두 번째 TM 도메인 및 C-말단에 RING-finger 도메인(예컨대, E3 ligase 도메인)을 가지고 있으며, 미토콘드리아에 위치한다.

본 발명에 따르면, 상기 Hades는 종양 세포에서 과발현되는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로 본 발명의 실시예에서는, 인간 종양 조직에서 Hades의 발현 수준을 관찰하였으며, 종양 조직에 인접한 정상 조직에 비해 종양 조직에서 2배 이상 높은 Hades mRNA 발현이 관찰되었다 (도 5k 참조).

본 발명에 있어서, 상기 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제는 기존에 단백질의 발현이난 작용을 억제하기위해 알려진 어떤 물질이나 방법도 사용될 수 있으나, 바람직하게는 Hades 유전자의 전사 또는 번역을 하향조절하거나, Hades 단백질의 작용을 억제하는 것을 특징으로 하는 종양 억제용 조성물을 제공한다. 여기서, Hades 유전자의 전사 또는 번역을 하향조절한다는 것은 Hades 유전자의 프로모터에 결합하여 전사를 하향조절하거나, 전사후 mRNA를 분해하거나, 번역을 저해하는 등의 모든 하향조절을 포함한다. 또한, Hades 단백질의 작용을 억제한다는 것은 상기 단백질의 활성을 억제하거나, 상기 단백질과 상호작용하는 단백질의 결합 부위에 경쟁적으로 결합하여 작용을 방해하는 것 등을 포함한다.

상기 Hades 단백질의 발현 억제제의 예로는, Hades 유전자의 RNA 간섭(RNA interference)을 이용한 siRNA(short interfering RNA) 또는 shRNA(short hairpin RNA)를 들 수 있다. RNA 간섭(이하 “RNAi”로 약칭함)은 많은 진핵생물에서 보존된 전사후 유전자 조절의 한 방법이다. RNAi는 세포에 존재하는 짧은 이중나선 RNA(dsRNA) 분자에 의해서 유도된다 [Fire et al., Nature 391: 806-811 (1998)]. “siRNA”라고도 불리우는 이러한 짧은 dsRNA 분자는 단일가닥으로 분리된 후 “RNA-유도 침묵 복합체(RNA induced silencing; RISC)”에 결합하여 표적화된 mRNA를 절단하거나 번역을 저해한다 [Elbashir et al., Genes Dev, 15: 188-200 (2001)].

그러므로, 본 발명은 Hades 유전자의 mRNA를 표적화하는 약 17 개의 뉴클레오티드 내지 약 25 개의 뉴클레오티드로 이루어진 짧은 이중쇄 RNA를 포함하는 분리된 siRNA를 제공한다. 상기 siRNA는 센스 RNA 가닥과 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하고, 이들 두 가닥은 표준 왓슨-크릭 염기쌍 상호작용에 의해서 서로 결합(annealing)한다. 상기 센스가닥은 표적 mRNA 내의 표적서열에 동일한 핵산서열을 포함한다. siRNA의 표적서열을 선택할 수 있는 기술은 예컨대, 문헌 [Tuschl et al., "The siRNA User Guide" revised Oct. 11 (2002)]에 기재되어 있다.

본 발명의 siRNA를 제조하는데 사용된 Hades 표적 서열은 Hades mRNA 3' 부근의 비번역 부분 중 5'-GGGAUUUUUAUCUCGAGGC-3' 및 5'-CGUGUGUGUAGAGGACAAA-3'의 두 부분이여, 이에 해당하는 Hades siRNA 서열은 전자는 5'-GCCUCGAGAUAAAAAUCCCtg-3'(안티센스 서열: 서열번호 4) 및 5'-GGGAUUUUUAUCUCGAGGCtt-3'(센스 서열)이며, 후자는 5'-UUUGUCCUCUACACACACGtg-3'(안티센스 서열: 서열번호 5)과 5'-CGUGUGUGUAGAGGACAAAtt-3'(센스 서열) 이다. siRNA는 double strand의 형태를 가지고 있으며, 이중 타겟하는 유전자 서열 부분과 결합할 수 있는 strand를 anti-sense strand라 표현하며, 그렇지 않는 strand를 sense strand라 표현한다. siRNA를 세포내 주입하기 위해서는, 반드시 double strand 형태로 합성하여야 하며, 그렇지 않으면 세포내에서 siRNA를 인식하지 못하게 된다.

본 발명의 siRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 두 개의 상보적이고, 단일쇄(single-stranded)의 RNA 분자를 포함하거나, 두 개의 상보적 부분이 염기쌍을 형성하고 단일쇄의 “머리핀(hairpin)”영역에 의해서 공유결합된 단일 분자를 포함할 수 있다. 상기 후자의 경우를 shRNA(short hairpin RNA)라고 하며, 상기 shRNA는 single strand로 약 50-70 뉴클레오티드(nucleotide) 길이이며, in vivo 상에서 stem-loop 구조를 이루고 있다. 5-10 뉴클레오티드의 loop 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29 뉴클레오티드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 stem을 형성한다. shRNA는 일반적으로 in vivo 상에서 Pol Ⅲ promoter에서부터 상보적인 DNA sequence의 전사에 의해 합성된다. Pol-Ⅲ로 유도된 전사는 well-defined start site에서 시작되어 4개 이상의 티미딘(thymidine)으로 이루고 있는 선상(-TTTT-)의 second residue에서 종결되어 non-poly(A) transcript를 생성한다. Pol Ⅲ promoter는 모든 세포에서 활성되며 shRNA의 발현이 가능하다. 전사 후 shRNA는 Dicer에 의해 loop가 절단되고 siRNA처럼 RISC와 작용하게 된다 [참조, Tuschl et al., Cell 110(5): 56374 (2002)].

본 발명의 siRNA는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 알려진 많은 기술을 이용하여 획득될 수 있다. 예컨대, siRNA는 본 발명이 속하는 분야에서 알려진 방법을 이용하여 화학적으로 합성되거나 재조합 방법에 의해서 생산될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 siRNA는 화학적으로 합성하여 얻을 수 있다. 즉, 염기를 차례로 하나한 화학적으로 붙여나가면서 만들며, 이후 PAGE 정제를 수행하여 고순도의 siRNA만을 최종적으로 얻는다.

siRNA는 상보적이고 분리된 두 개의 RNA 분자 또는 두 개의 상보적인 영역을 가지는 하나의 RNA 분자로서 합성될 수 있다. 또한 다른 방법으로서, siRNA는 적절한 프로모터를 이용하여 재조합 DNA 플라스미드로부터 발현될 수 있다. 플라스미드로부터 본 발명의 siRNA를 발현시키는데 적절한 프로모터는 예컨대, U6 또는 H1 RNA pol Ⅲ 프로모터 서열 및 거대세포바이러스 프로모터를 포함한다. 또한 본 발명의 재조합 플라스미드는 특정 조직 또는 특정 세포내 환경에서 siRNA를 발현시키기 위해서 유도성 또는 조절가능한 프로모터를 포함할 수 있다.

본 발명의 siRNA는 재조합 플라스미드로부터 상보적이고 분리된 두 개의 RNA 분자 또는 두 개의 상보적인 영역을 가지는 하나의 RNA 분자로서 발현될 수 있다. 본 발명의 siRNA를 발현시키는데 적절한 플라스미드의 선택, siRNA를 발현시키기 위한 핵산서열을 플라스미드 내로 삽입하는 방법 및 재조합 플라스미드를 목적하는 세포로 전달하는 방법은 본 발명이 속하는 분야의 기술 범위 내에 있다. 예컨대, 문헌 [Tuschl et al., Nat. Biotechnol, 20: 446-448 (2002)]; [Brummelkamp et al., Science 296: 550-553 (2002)]; [Miyagishi et al., Nat. Biotechnol. 20: 497-500 (2002)]; [Paddison et al., Genes Dev. 16: 948-958 (2002)]; [Lee NS et al., Nat. Biotechnol. 20: 500-505 (2002)]; 및 [Paul et al., Nat. Biotechnol. 20: 505-508 (2002)]를 참고할 수 있다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 Hades 단백질의 발현 억제제는 Hades 유전자의 mRNA와 상보적인 염기서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 4 또는 5의 염기서열을 갖는 Hades siRNA(short interfering) 또는 이를 전사하는 유전자인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 종양 억제 조성물에 있어서, 상기 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제는 상기 Hades와 p53의 상호작용(interaction)을 저해하는 것을 특징으로 한다. 상기 Hades와 p53 상호작용 억제제의 예로는 Hades의 p53-결합부위(C-말단 RING-finger 도메인)와 특이적으로 결합할 수 있는 항-Hades-항체 등이 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 Hades와 p53의 상호작용은 p53의 DNA 결합, 전사 활성, 스트레스-유발 세포 사멸 및 p53-유발 세포 사멸을 저해하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예에서는, 구체적으로 Hades와 p53의 상호작용에 의해 상기 열거된 것과 같은 p53의 기능을 저해하는 것을 밝혀내었다. 여기서, “p53의 기능”이란 세포내에 DNA 손상이 유발된 경우, 세포의 성장을 세포 주기 G1 기에 멈추게 하여 DNA 손상을 복구(repair)하는 과정이 이루어지게 함으로써 암세포가 생성되지 못하도록 작용하는 것은 물론, 이미 암세포가 성장하여 급격히 커진 경우, 형질전환된 세포가 스스로 사멸되도록 하는 프로그램(programmed cell death; PCD)을 작동시켜 이상 세포를 조직 내에서 제거하는 세포 사멸(apoptosis)이 유발되도록 작용하여 암이 진행되는 것을 막는 것을 포함하는 당업계에 공지된 p53의 전반적인 항암 기작을 모두 포함한다.

또한, 상기 Hades와 p53의 상호작용은 p53의 유비퀴틴화(ubiquitination)를 유도하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예에서는, Hades가 p53과 세포질에서 상호작용하는 것을 확인하였으며, 상기 상호작용에 의해 Hades가 cytoplasmic p53의 분해를 유도하고, 특히 N-말단 24 번째 라이신(lysine) 잔기를 타켓으로 p53의 유비퀴틴화를 유도하는 것을 확인하였다 (도 3j 참조).

본 발명에 있어서, 상기 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제는 Hades의 C-말단 RING-finger 도메인을 표적하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예에서는, Hades의 C-말단 RING-finger 도메인이 p53의 DNA-결합 도메인과 결합함을 밝혀내었다 (도 1f 참조). 따라서, 상기 Hades의 p53 결합부위를 표적하여 특이적으로 결합하여 Hades와 p53의 상호작용을 경쟁적으로 저해할 수 있는 펩타이드를 디자인할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) Hades 단백질을 발현하는 동물세포에 임의의 약제를 처리하는 단계; 및

(b) 상기 동물세포에서 약제를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 Hades 단백질의 발현이 감소되는지 여부를 결정하는 단계.

상기 (a) 단계에서, 상기 동물세포는 의도적으로 Hades를 과발현하는 플라스미드로 형질전환 시킬 수도 있다. 상기 (b) 단계에서, 발현 감소여부는 RT-PCR을 통한 RNA 수준 또는 웨스턴 블롯팅 등을 통한 단백질 수준에서 측정할 수 있다.

하기의 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법:

(a) 시험 약제의 존재하에 p53-결합부위를 함유하는 Hades 단백질 또는 그 단편과 p53을 접촉시키는 단계; 및

(b) 시험 약제가 없는 대조군과 비교하여 Hades와 p53의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계.

본 발명의 상기 “상호작용을 저해하는 항암제”는 Hades가 p53의 기능을 저해하는 것을 억제하여, 암을 치료 및 예방하는 것을 의미한다.

또한, 상기 “상호작용을 저해”는 Hades와 p53 간의 상호작용을 억제, 제거하는 것을 모두 포함하며, 상호작용 저해에는 Hades와 p53 상호간의 작용 자체를 저해할 수도 있으나 Hades와 p53 각각에 별도로 작용하여 상호간의 작용을 저해하는 것도 포함된다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 Hades의 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 p53-결합부위(C-말단의 RING-finger 도메인)을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 Hades와 p53의 상호작용은 Hades의 p53-결합부위(C-말단의 RING-finger 도메인)와 p53의 DNA-결합 도메인 사이에서 일어나는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 Hades와 p53의 상호작용은 면역침전(immunoprecipitation) 분석, GST 풀-다운(pull-down) 분석 및 콜로니(colony)-형성 분석에 의해 측정하는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지 않으며 당업계에 공지된 다양한 방법으로 응용하여 측정할 수 있다.

상기 “면역침전(immunoprecipitation) 분석”은 현재 널리 사용되고 있는 면역화학적 기술 중 하나로써, 항원과 항체의 친화성을 이용하여 용액으로부터 항원(또는 항원과 친화성을 가진 물질)을 특이적으로 분리하는 기술이다. 이 기술은 항원의 분자량의 결정, 단백질의 상호작용 연구, 특정 효소 활성의 측정, 단백질의 전사후 변화 모니터링과 단백질의 양과 존재 유무 등을 알 수 있는 기술이며, 탐지하기 어려운 소량의 단백질도 면역침강으로 10,000 배까지 농축할 수 있어 탐지가 가능하다. 면역침전 분석 방법은, 세포나 조직에서 적절한 용해 버퍼(lysis buffer)를 이용하여 단백질들을 추출한 다음, 일차 항체와 Protein A-, G- 또는 L-agarose 또는 2차 antibody-agarose와 결합시킨다. 상기 2차 antibody-agarose 결합 기술은 특정 단백질의 항체와 결합하지 않은 다른 단백질과의 분리를 가능하게 한다. 여기서, agarose의 선택은 원하는 단백질(항원)에 대한 일차 항체의 isotype과 종 기원에 의해 결정된다. 또한 면역침강 분석은, non-denaturing 조건에서 특정 단백질과 결합하는 다른 단백질을 검출할 목적으로 사용되기도 한다.

상기 “GST 풀-다운(pull-down) 분석”은 tagged protein 이나 the bait (예컨대, GST, His6, biotin 등)와 다른 단백질(test protein, or prey) 간의 상호작용을 시험하기 위한 간단한 기술이다. bait는 적절한 발현 시스템(eg, Escherichia coli)에서 정제된 것으로 글루타치온 친화성 겔에서 고정된다. bait는 새로운 단백질 파트너를 구별해내거나 이전에 단백질 파트너로 예상되었던 단백질을 확인하기 위해 2차 친화성 지지체로 쓰인다.

상기 “콜로니(colony)-형성 분석”은 하나의 세포가 콜로니를 형성하도록 성장하는 능력에 기초하여 세포의 성장능력을 분석 및 시험하기 위한 기술이다. 이때, 콜로니는 50개 이상의 세포로 구성됨으로 정의한다. 특히 암세포의 경우 무한 증식을 할 수 있는 특징을 가지고 있으며, 특정 유전자를 암세포내에 도입한 후, 도입된 세포만을 선택적으로 배양시켜 콜로니의 형성 유무 및 갯수를 측정하여 유전자의 암세포 성장 억제 능력을 평가할 수 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 의해 스크리닝된 약제를 유효성분으로 포함하는 항암제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 항암제 조성물은 Hades와 p53의 상호작용을 저해할 수 있는 물질이라면 어떤 것이든 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로 Hades와 p53의 상호작용을 제거, 억제하기 위한 어떤 것이든 포함될 수 있다. 항암제 조성물은 Hades와 p53 상호간의 작용 자체를 저해하거나, Hades와 p53 각각에 별도로 작용하여 상호간의 작용을 저해하는 것도 포함된다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제,향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 종양내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 심근내 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 뇌암, 두경부암 및 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테터 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연력, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직하게는 siRNA의 경우 2-5 mg/kg을 투여하는 것이 바람직하고, Hades 작용 억제제의 경우 0.1-1 g/kg을 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물은 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사2요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기를 포함하는 Hades와 p53의 상호작용을 저해하는 항암제의 스크리닝 키트를 제공한다:

(a) Hades의 p53-결합부위(C-말단 RING-finger 도메인)를 함유하는 폴리펩타이드;

(b) p53의 DNA-결합 도메인을 함유하는 폴리펩타이드; 및

(c) 상기 폴리펩타이드들 사이의 상호작용을 검출하는 시약.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 바람직하게는 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서 (a) 단계 전에, Hades의 p53-결합부위와 시험약제 사이의 결합 친화성(binding affinity)을 측정하여 항암제 가능성이 높은 약제를 선별하는 단계를 더 포함할 수도 있는바, 상기 단계를 포함하는 스크리닝 방법을 구현하기 위하여 사용될 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명자들은 과발현된 Hades가 p53과 상호작용하여 p53의 핵방출(exonuclear) 기전을 저해함으로써, p53의 종양 억제 기능을 저해시키고, 또한 Hades의 제거(knockdown)는 p53의 발현을 증가시키는 것을 확인함으로써, Hades가 p53의 부정적(negative) 조절자임을 처음으로 밝혀내었다. 따라서 종양 세포에서 과발현하는 Hades의 기능을 억제하면 p53에 의한 종양 억제 기능이 효과적으로 일어날 것이다. 즉, Hades 단백질의 발현을 조절하거나, Hades의 작용을 억제하는 억제제를 개발할 수 있으며, 뿐만 아니라 Hades와 p53의 상호작용을 저해하는 신약 후보물질을 도출하여 항암제로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

도 1a는 p53과 상호작용하는 파트너를 확인하기 위해 사용된 스크리닝 절차의 모식도를 나타낸 도면이며, 도 1b는 cDNA 라이브러리를 이용한 p53과 상호작용하는 In vitro 형질전환된 ³⁵S-labeled 단백질들을 나타낸 도면이며, 도 1c는 Hades의 도메인을 나타낸 도면이며, 도 1d는 U2OS 세포에서 Hades의 위치를 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이며 (upper panel: Control GFP plasmid; lower panel: 형질전환 시킨 GFP-Hades), 도 1e는 In vitro 풀-다운 분석으로 p53과 Hades의 상호작용을 확인한 결과이며, 도 1f는 Hades의 p53 결합 영역을 확인하기 위해 N-말단 또는 C-말단과 p53의 상호작용을 측정한 결과이며, 도 1g는 In vitro 풀-다운 분석으로 MCF7 세포에서 Hades와 p53의 상호작용을 확인한 결과이며 (lane 2: GST로 배양; lane 3: GST-Hades로 배양), 도 1h는 In vivo 면역침강 분석으로 H1299 세포에서 Hades와 p53의 상호작용을 확인한 결과이며, 도 1i는 In vivo 면역침강 분석으로 MCF10A 및 NHLF 세포에서 Hades와 p53의 상호작용을 확인한 결과이며, 도 1j는 공초점 현미경을 통해 Hades와 p53이 공존(colocalized)함을 보여주는 결과를 나타낸 도면이다.
도 2a는 Hades의 발현량에 따른 p53의 발현 수준 변화를 나타낸 도면이며, 도 2b는 MCF10A 및 NHLF 세포에서 Hades의 발현량에 따른 p53의 발현 수준 변화를 나타낸 것이며, 도 2c는 Hades의 자가-유비퀴틴화 활성을 나타낸 도면이며, 도 2d는 Hades의 RIN-finger 도메인의 p53 발현 감소 활성을 확인한 결과이며, 도 2e는 Hades에 의한 p53 발현 감소가 MG132 처리에 의해 회복되는 결과를 보여주는 도면이며, 도 2f는 Hades shRNA를 이용하여 Hades를 제거(knockdown) 시키는 경우 p53의 발현이 회복되는 결과를 보여주는 도면이며, 도 2g는 CHX를 처리한 세포에서 Hades silencing에 의한 p53 안정화의 역학적 분석 결과를 나타낸 도면이며, 도 2h는 Hades를 제거(knockdown) 시키는 경우 핵과 세포질에서의 p53 발현 수준을 측정한 도면이며, 도 2i는 Hades에 의해 발현이 감소된 p53이 LMB 처리에 의해 회복되는 결과를 보여주는 도면이며, 도 2j는 Hades의 발현에 따른 야생형 p53 및 돌연변이 p53에서의 p53 발현 수준 변화를 나타낸 도면이다.
도 3a는 Hades가 돌연변이 p53과도 상호작용함을 보여주는 도면이며, 도 3b는 Hades가 p53을 유비퀴틴화 시킴을 보여주는 도면이며, 도 3c는 In vitro 유비퀴틴화 분석을 통해 Hades 또는 Mdm2에 의해 p53의 유비퀴틴화가 유도됨을 보여주는 도면이며, 도 3d는 In vitro 유비퀴틴화 분석 및 면역블롯팅 분석을 통해 p53의 유비퀴틴화가 Hades에 의해 유도됨을 보여주는 도면이며, 도 3e는 In vivo 유비퀴틴화 분석을 통해 Hades에 의해 p53의 유비퀴틴화가 유도됨을 보여주는 도면이며, 도 3f는 Hades에 의한 p53의 분해는 Mdm2에 의존적이지 않음을 보여주는 도면이며, 도 3g는 GST-Hades RP가 존재하는 MEF p53^-/-;mdm2^-/- 세포에서 Hades에 의한 p53의 유비퀴틴화가 일어남을 보여주는 도면이며, 도 3h는 Hades에 의한 p53의 유비퀴틴화에서 Mdm2가 영향을 미치지 않음을 보여주는 도면이며, 도 3i는 Hades에 의한 p53의 유비퀴틴화에서 p53 라이신 잔기가 영향을 미치는지 여부를 보여주는 도면이며, 도 3j는 Hades에 의한 p53의 유비퀴틴화에서 p53의 N-말단 24 번째 라이신 잔기가 영향을 미침을 보여주는 도면이며, 도 3k는 Hades에 의한 유비퀴틴화는 돌연변이 p53 K24R에서는 영향을 미치지 않음을 보여주는 도면이다.
도 4a는 Hades에 의해 p53-의존적 전이활성이 억제됨을 보여주는 도면이며, 도 4b는 LMB(leptomycin B)가 존재하는 상태에서는 Hades에 의한 p53-의존적 전이활성이 억제되지 않음을 보여주는 도면이며, 도 4c는 전이활성이 결핍된 돌연변이 p53의 분해는 Hades에 의해 매개되므로 Hades에 의한 p53의 분해는 전이활성과 무관함을 보여주는 도면이며, 도 4d는 과발현된 Hades에 의해 p53의 세포 성장 억제(growth suppression) 기능을 저해함을 보여주는 도면이며, 도 4e는 콜로니-형성 분석을 통해 Hades가 p53의 세포 성장 억제 기능을 저해함을 보여주는 도면이며, 도 4f는 콜로니-형성 분석을 통해 Hades 제거(knockdown)에 의한 p53의 회복을 관찰한 도면이며, 도 4g는 Hades 제거(knockdown)는 다양한 스트레스 조건에서 세포 생존 능력(cell viability)을 저해함을 보여주는 도면이다.
도 5a는 pEYFP-mito-p53로 형질전환된 U2OS 세포에서 pEYFP-mito-p53이 미토콘드리아에 위치함을 보여주는 도면이며, 도 5b는 과도하게 발현된 Hades에 의해 pEYFP-mito-p53 및 Bcl-2 사이의 상호작용이 저해됨을 보여주는 도면이며, 도 5c는 콜로니-형성 분석을 통해 pEYFP-mito-p53로 형질전환된 H1299 세포에서 과발현된 Hades에 의해 콜로니 형성이 저해됨을 보여주는 도면이며, 도 5d는 콜로니-형성 분석을 통해 돌연변이 pEYFP-mito-p53(K24R)로 형질전환된 MEF 세포(p53^-/-;Mdm2^-/-)에서 과발현된 Hades에 의해 콜로니 형성이 저해되지 않음을 보여주는 도면이며, 도 5e는 Hades가 CPT에 의해 유도된 p53 발현 수준을 감소시킴을 보여주는 도면이며, 도 5f는 CPT 처리된 세포에서 p53 및 Bcl-2 사이의 상호작용을 억제함을 보여주는 도면이며, 도 5g는 CPT 처리에 의해 유도된 세포 사멸(apoptosis)을 Hades가 억제함을 보여주는 도면이며, 도 5h는 CPT 처리된 세포에서 Hades의 제거(knockdown)는 p53 및 Bcl-2 사이의 상호작용을 저해하지 못함을 보여주는 도면이며, 도 5i는 CPT 처리된 세포에서 Hades의 제거(knockdown)는 세포 사멸(apoptosis)을 저해하지 못함을 보여주는 도면이며, 도 5j는 CPT 처리된 세포에서 Hades의 제거(knockdown)는 CPT에 의해 유도되는 미토콘드리아 손상을 자극함을 보여주는 도면이며, 도 5k는 HCC(human primary hepatocellular carcinoma) 조직과 인접한 정상 조직에서의 Hades 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 시약 및 실험방법

1-1. 세포 배양 및 형질전환( transfection )

본 실험에서 사용될 MCF7, A549, U2OS 및 HeLa 세포를 Korean Cell Line Bank(Korea)에서 구입하였으며, MEF p53^-/- 및 MEF p53^-/-;Mdm2^-/- 세포는 Dr. Wei Gu(Columbia University, USA)로부터 조달받았다. MCF7, 293, 293T, HCT116 p53^+/+, HCT116 p53^-/- 세포들과, MEF p53^-/- 및 MEF p53^-/-;Mdm2^-/- 세포를 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM 배지에 유지시켰다. 그리고, 안정한 pSuper-Hades MCF7 세포를 10% FBS 및 500 μg/ml G418(neomycin)이 보충된 DMEM에 유지시켰다. 일시적 주입법(transient transfection)은 제조사의 지시에 따라 Hilymax(Invitrogen)를 이용하여 수행하였다. 이후 siRNA 형질전환을 위해, RNAimax(Invitrogen)을 제조사의 지시에 따라 사용하였다. Hades를 위한 siRNA 및 mock siRNA는 Ambion(USA)으로부터 얻었으며, 그의 서열은 다음과 같다: Hades siRNA, GGGAUUUUUAUCUCGAGGC 및 CGUGUGUGUAGAGGACAAA; mock siRNA, AUGAACGUGAAUUGCUCAAG.

1-2. 항체(Antibodies) 및 시약(Reagents)

p53(Do-1), 튜뷸린(tubulin; B7), Bcl-2(C2) 및 유비퀴틴(P4D1)에 대한 각각의 마우스 단클론 항체 및 라민(lamin; C20)에 대한 염소 다클론 항체인 anti-goat IgG-HRP (sc-2020), normal mouse IgG (sc-2025), anti-mouse IgG-Texas Red (sv-2781) 및 protein A agarose (sc-2001)와 protein G agorose (sc-2002)는 Santa Cruz Technologies(USA)로부터 구매하였다. Hades에 대한 토끼 다클론 항체는 N-SGERPKGIQETEEM-C 및 N-SRAKPEDRESLKSAC-C의 펩타이드 서열을 이용하여 Labfrontier(Korea)로부터 제조하였다. Anti-β-actin 항체 (A5441)는 시그마(Sigma)로부터 구매하였으며, anti-mouse IgG-HRP (7076)는 Cell Signaling Technology(USA)로부터 구매하였으며, anti-cytochrome C (556433) 및 Tom 20 (612278) 항체는 BD Pharmingen(USA)로부터 구매하였으며, polyubiquitin chain(FK-1) 항체는 BioMol(USA)로부터 구입하였다. In vitro 유비퀴틴화 분석을 위해, E1 (Ube1), E2 (UbcH1, UbcH2, UbcH3. UbcH5a, Ubc5Hb, Ubc5Hc, UbcH6, UbcH7, UbcH8, UbcH9, UbcH10) 및 His-ubiquitin을 Boston Biochem(USA)로부터 구입하였다. 캄토테신(Camptothecin; CPT), 엑티노마이신 D(Actinomycin D), 크리스탈 바이올렛(crystal violet), 프로피디움 요오드화물(propidium iodine) 및 DAPI는 Sigma로부터 구입하였으며, Biopure(Canada)로부터 시클로헥시미드(cycloheximide)를, Calbiochem(USA)로부터 MG132 (474791)를 구입하였다. JC-1 염색 키트 및 Nutlin 3은 Cayman Chemical(USA)로부터 구입하였다. 아넥신 V(Annexin V)는 BD Pharmingen(USA)로부터, 렙토마이신 B(Leptomycin)는 Alexis Biochemical(USA)로부터 구입하였다.

1-3. 플라스미드( Plasmid ) 제조

하기의 프라이머를 이용하여 RT-PCR로 HeLA 세포 cDNA로부터 Hades 유전자를 분리하고, 다음의 벡터 내로 subcloning 하였다.

[표 1. 벡터 및 프라이머]

RING 비활성 돌연변이(C302S/C305S)를 제조하기 위해, 점변이 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 pGEX-Hades Ring protein(RP) 또는 pEGFP-Hades를 이용하여 수행하였으며, 이때 사용된 프라이머는 하기 표 2와 같다.

[표 2. 점변이 돌연변이 위한 프라이머]

Hades를 타켓하는 shRNA 발현 플라스미드를 제조하기 위해, shRNA에 해당하는 올리고머를 pSuper-GFP-neo vector에 subcloning 하였으며, 이때 사용된 프라이머는 하기 표 3과 같다. 상기 서브클로닝된 shRNA 발현 플라스미드를 세포 내에 삽입시키게 되면, 플라스미드가 자체적으로 shRNA 만을 과도하게 생성하게 된다. 더 구체적으로, 일단 shRNA에 해당하는 DNA 서열을 벡터에 클로닝한 후, 합쳐진 벡터를 세포내로 주입하게 되면 shRNA가 생성된다. 이러한 방법으로 shRNA 벡터를 만든 이유는 siRNA를 이용할 때의 추가적인 합성 비용을 절감할 수 있으며, 동시에 shRNA 벡터가 주입된 세포만을 선택적으로 배양시킬 수 있기 때문이다.

하기 두 종류의 프라이머를 사용한 이유는, 한 종류의 프라이머만을 사용하였을 때보다 Hades의 발현 억제 효과가 높았기 때문이다.

[표 3. shRNA 발현 플라스미드 제조위한 프라이머]

p53 단편(1-185 및 185-393)을 포함하는 pcDNA HA-p53 플라스미드는 Dr. Gerald M. Cohen(Leicester University, UK)로부터 제공받았다.

또한 pcDNA-p53 Myc/His, pEYFP mito-p53 및 pEGX-p53은 PCR로 pcDNA HA-p53을 이용하여 subcloning을 수행하였으며, 이때 사용된 프라이머는 하기 표 4에 나타내었다.

[표 4. 프라이머]

p53 돌연변이(C135Y)는 Dr. Carl G. Maki(University of Chicago, USA)로부터, p53 라이신(lysine) 돌연변이는 Dr. Randy Y. C. Poon(Hong Kong Iniversity of Science and Technology, Hong Kong)로부터 제공받았다. 그리고, p53 N24KR 돌연변이는 pcDNA p53-FLAG(forward: GACCTATGGAGACTACTTCCTG, reverse: CAGGAAGTAGTCTCCATAGGTC)를 이용하여 PCR로 점 돌연변이(point mutagenesis)를 유발하여 제조하였다. pGL3-Bax 리포터(reporter) 플라스미드는 Dr. Anastasis Stephanou(Unuversity College London, UK)로부터, pPV-PUMA FLAG2-Luc는 Dr. Bert Vogelstein(Johns Hopkins Medical Institutions, USA)로부터, pCI-Bcl-2는 Dr. Hiroyuki Osada(Discovery Research Institute, RIKEN, Japan)로부터 제공받았다.

1-4. 인간 full-length cDNA 라이브러리의 제조

먼저, 전체 RNA를 제조사의 지시에 따라 TRIZOL 시약(Invitrogen, USA)을 이용하여 HeLa 및 정상 간세포(Chang cell)로부터 분리하였다. 표준화된 full-length cDNA 라이브러리를 제조하기 위해, SMART cDNA library construstion kit(Clontech, USA) 및 TRIMMER-cDNA normalization kit(Evrogen, Russia)를 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 이후 cDNA를 CHROMA SPIN-400 column(Contech)을 이용하여 분류하였다. 500 bp 이상의 모든 cDNA를 MCS에 삽입하기 위해 두 개의 서로 다른 SfiI 제한 효소 자리를 변형시키고, pcDNA3.1(+) 벡터(Invitrogen) 내로 연결(ligation)하였다. 이후 TOP10 Escherichia coli(Invitrogen) 내로 형질전환시켰다.

1-5. p53 -상호작용 단백질의 스크리닝

HeLa 및 정상 간세포(Chang cell)로부터 얻은 모든 유전자를 갖는 인간 cDNA를 ³⁵S-methionine(Perkin Elmer, USA) 존재 하에서 TnT Coupled Reticulocyte Lysate System(Promega, USA)를 이용하여 in vitro 전사 및 번역하였다. In vitro binding assay에서 단백질 pool이 양성으로 확인되었을 때, 해당되는 cDNA pool을 구획 분할하고, 단일 양성 cDNA 클론(clone)이 얻어질때까지 동일한 방법으로 다시 수행하였다. 이후, 양성 클론을 시퀀싱(Bionics, Korea)하고, NCBI 유전자 데이터베이스를 서치하여 알려진 서열과 비교하였다.

1-6. GST-융합 단백질 정제

BL21 세포에서 GST-융합된 재조합 p53, Hades(WT, FL, RP, 및 RP MT) 및 Mdm2 단백질의 발현은 상기 세포에 0.1 mM IPTG를 37 ℃에서 2 시간 동안 또는 25 ℃에서 밤새도록 처리함으로써 유도하였다. 이후, 세포를 세균 용해 버퍼(30 mM TrisCl pH 8, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 및 1% NP40)에 넣고 초음파 처리하여 용해시킨 후, 글루타치온(glutathione)-세파로즈(Sepharose)(Amersham Bioscience)를 이용하여 단백질을 정제하였다.

또한 His-tagging p53 및 p53(K24R) 돌연변이의 발현은 BL21 세포를 0.1 mM IPTG로 37 ℃에서 4 시간 동안 처리하여 유도한 후, His-tagging p53 및 p53 돌연변이를 Ni-NTA 비즈(beads)를 이용하여 정제하였다.

1-7. In vitro binding assay

In vitro 전사/번역으로 얻은 ³⁵S-labeled 단백질을 결합 버퍼(binding buffer; 30 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% NP-40, and 0.5 mM PMSF)에 넣고 5 μg의 글루타치온-세파로즈 4B-결합된 GST, GST-p53 또는 GSE-Hades 재조합 단백질로 37 ℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후, 5번 세척하고, SDS-sample 버퍼(60 mM Tris-Cl pH6.8, 25% glycerol, 2% SDS, 14 mM 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue)에서 중탕하였다. 이후, 결합된 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, 자기방사법(autoradiography)으로 관찰하였다.

1-8. 유비퀴틴화 분석(Ubiquitination assay)

In vitro p53 유비퀴틴화 분석을 위해, in vitro 전사된 ³⁵S-labeled 단백질 1 μl를 1 μg의 indicated E3 ligase, 150 ng의 purified E1, 150 ng의 E2 enzymes, 및 10 μg의 ubiquitin을 포함하는 유비퀴틴화 버퍼(ubiquitination buffer; 25 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 0.06 % NP40, 5 mM MgCl₂, 및 15 μM ZnCl₂) 20 μl에 넣고 30 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후, 반응 조성물을 SDS-PAGE로 분석한 후, 자기방사법(autoradiography) 또는 면역블로팅검사법(immunoblotting)으로 분석하였다.

또한, 내생적(endogenous) p53 유비퀴틴화 분석을 위해, MCF7 세포를 수집하고 유비퀴틴화 버퍼에 분산시켰다. 분산된 시료를 잠시동안 초음파 처리한 후 원심분리하였다. 이후 상층액을 동일한 양의 GST, GST-Hades 또는 GST-Hades MT로 30 ℃에서 2 시간 동안 배양시킨 후, 항-p53 항체를 이용하여 면역침강(immunoprecipitation) 시키고, 항-유비퀴틴 항체를 이용하여 면역침전물(immunoprecipitate)을 면역블로팅검사하였다.

그리고, MEF p53^-/-;Mdm2^-/-세포에서 p53 유비퀴틴화 분석을 위해, 세포를 pcDNA myc/His-p53 발현 플라스미드로 48 시간 동안 형질전환 시킨 후 용해물을 얻어내었다. 이후 용해물을 GST, GST-Hades 또는 GSTHades MT로 30 ℃에서 2 시간 동안 배양시켰다. 이후 항-p53 항체로 면역침강하여 면역침전물을 획득하거나, Ni⁺-결합된 비즈(beads)로 풀-다운(pull-down) 시킨 후, 면역블로팅검사로 분석하였다.

In vivo p53 유비퀴틴화 분석을 위해, HCT116 p53^-/- 또는 H1299 세포를 GFP, GFP-Hades 또는 GFP-Hades RING MT로 48 시간 동안 형질전환 시켰다. 형질전화 완료 후, 세포를 10 μM의 MG132로 4 시간 동안 처리하였다. 이후 세포를 SDS-함유하는 용해 버퍼로 용해시키고, 10 분 동안 가열하였다. 이후 항-p53 항체로 면역침강시키기 위해 NP40 용해 버퍼로 10 번 희석한 후, 면역침강 시켰다. 항-p53 면역침전물을 항-폴리유비퀴틴(polyubiquitin) 항체를 이용하여 면역블로팅검사로 분석하였다.

1-9. 면역침강(Immunoprecipitation) 및 면역블로팅검사(Immunoblotting)

세포를 SDS-함유하는 버퍼(20 mM Tris-Cl pH 7.4, 1% SDS, 및 2 mM EDTA)로 5분 동안 아이스(ice) 상태에서 용해시켰다. 용해물을 재현탁 버퍼(20 mM Tris-Cl pH 7.4 NP40 0.5%, 150 mM NaCl, 및 2 mM EDTA)로 10배 희석한 후, 30 분 동안 1,200 rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 항체(분석하고자하는 유전물질에 대한 항체)로 4 ℃에서 밤새도록 배양시켰다. 배양 후, 단백질 A 또는 단백질 G가 결합된 아가로스(agarose)로 2 시간 동안 배양한 후, 비즈(beads)를 재현탁 버퍼로 6번 세척한 후, SDS-sample 버퍼를 첨가하여 10 분 동안 중탕하였다.

면역블로팅 분석은 이전에 설명된 방법 [Brooks et al., Molecular Cell 21, 307-315 (2006)]과 동일하게 수행하였다.

1-10. 정량적 실시간 PCR( Quantitative real - time PCR )

인간 HCC에서 Hades mRNA의 발현 수준을 측정하기 위해, 윤리 위원회의 승인을 받은 Seoul National University School of Medicine(Seoul, Korea)에 있는 환자로부터 28 HCC, 인접 간조직 및 정상 간조직을 획득하였다. RNA를 제조사의 지시에 따라 RNeasy mini kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 조직으로부터 분리하였다. 이후 Hades mRNA의 발현 값은 IQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad, USA) 및 CFX96 real time system(Bio-Rad)를 이용하여 real-time PCR으로 정량하였다. 간경화(cirrhosis) 및 간섬유증(fibrosis)을 제외한 5 개의 서로 다른 정상 간 조직으로부터 분리한 동일양의 RNA 혼합물을 real-time PCR에 더 포함시켰으며, 18S rRNA는 RT-PCR 및 real-time PCR 분석에서 참조 제어(reference control)로써 사용되었다. Hades mRNA는 다음의 프라이머를 이용하여 증폭하였다: Forward; GATCATTCATCAGAGGACCAACACAG 및 Reverse; AGCACTCGCACAGCCACATC. 그리고 18S rRNA 서열은 다음의 프라이머를 이용하여 증폭하였다: Forward; GGAGAGGGAGCCTGAGAAACG 및 Reverse TTACAGGGCCTCGAAAGAGTTC. 이후, Hades mRNA의 발현 수준은 CFX Manager Sofrware(Bio-Rad)로 분석하였다.

1-11. 면역형광 분석(Immunofluorescence assay)

유리 덮개(glass coverslip) 위에 성장시킨 형질전환된 세포를 상온(room temperature)에서 5 분 동안 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정시켰다. 이후 PBS로 두 번 세척하고, 투과 버퍼(permeabilization buffer; 0.5% Triton X-100 in PBS)로 3 분 동안 배양하였다. 배양 완료 후, 세포를 5% BSA 및 2% Goat serum이 함유된 PBS로 30 분 동안 정지시키고, 항-p53 항체(1:200 in PBS)로 4 ℃에서 밤새도록(overnight) 배양하였다. 배양 완료 후, PBS로 세 번 세척하고, 플루오레세인 텍사스 red-labeled 이차 항체(fluorescein Texas red-labeled secondary antibodies; 1:500 in PBS)로 1 시간 동안 더 배양하였다. 이후, 유리덮개를 뒤집고, 슬라이드 위에 Vectashield(Vector Laboratories, USA)를 장착한 후, 네일 폴리시(nail polish)로 고정시켰다. 이후, 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscopy; FV-1000 spectral, Olympus, Japan)을 이용하여 형광을 관찰하였다.

1-12. 아세포 분류( Subcellular fractionation )

PBS로 세척하여 세포를 수집하고 펠렛(pellet)으로 만든 후, 세포를 CLB 버퍼(10 mM HEPES, 5 mM NaHCO₃, 10 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM KH₂PO₄, 0.5 mM MgCl₂, 및 5 mM EDTA)에 분산시켰다. 이후, 아이스(ice) 상태에서 5 분 동안 세포를 팽창시킨 후, NP40을 0.5%의 최종농도(final concentration)로 보충하여 2 분 동안 아이스 상태에서 배양하였다. 세포 용해물을 1,300 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 얻어진 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 담아 12,000 rpm에서 30 분 동안 다시 원심분리하였다. 상기 두 번째 원심분리로부터 얻은 상층액을 세포질 분획(cytoplasmic fraction)으로 수거하였다. 정제하지 않은 핵 펠렛(nuclear pellet)을 1 ml의 CLB 버퍼에 분산시키고, 세 번 세적하였다. 얻어진 핵 및 세포질 분획을 SDS-sample 버퍼에 넣었다. 그리고 미토콘드리아의 분획화는 이전에 설명된 것 [Shirangi et al., FASEB J. 16, 420-422 (2002)]과 같이 수행하고, 얻어진 미토콘드리아 분획(펠렛)을 동일한 버퍼로 세 번 세척한 후, SDS-sample 버퍼에 넣고, 100 ℃에서 10 분 동안 중탕하였다. 이후 면역블롯팅검사로 분석하였다.

1-13. 세포 생존력 분석( Cell viability assay )

MTS 분석을 위해, 세포를 CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay reagent(Promega, USA)로 1 시간 동안 배양한 후, 490 nm에서 O.D를 측정하였다. 세포사멸(apoptosis), DNA 함량 및 미토콘드리아 막 전위는 이전에 설명된 것 [Shirangi et al., FASEB J. 16, 420-422 (2002)]과 같이 각각 annexin V-PE, 프로피디움 요오드화물(propidium iodine) 및 JC-1 staining을 이용하여 유세포분석(flow cytometry)으로 측정하였다.

1-14. 콜로니 형성 측정( Colony formation assay )

5×10³ 또는 1×10⁴의 HCT 116 p53^+/+ 또는 HCT 116 p53^-/-, H1299 또는 p53^-/-;Mdm2^-/- 세포를 60-mm 디쉬(dish)에 도말한 후, 500 ng의 표지된 각각의 플라스미드로 24 시간 동안 형질전환 시켰다. 이후 세포를 500 μg/ml의 G418로 14일 동안 selection한 후, 고정시키고 콜로니 계수를 위해 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하였다.

1-15. 루시퍼라제 분석( Luciferase assay )

5×10⁴ 세포를 24-웰(well) 플레이트에 접종한 후, 각각의 웰에 500 ng의 Bax 및 Puma에 대한 프로모터 p53 결합 부위를 함유하는 pGL 플라스미드, 100 ng의 p53 플라스미드 및 200 ng의 Hades 또는 Hades MT 플라스미드를 첨가하여 형질전환 시켰다. 형질전환 48 시간 후, 세포를 수집하고, 50 μl의 간접 용해 버퍼(Passive lysis buffer, Promega)를 첨가하여 세포 추출물을 제조하였다. 이후 루시퍼라제 활성은 Biotek synergy HT microplate reader를 이용하여 측정하였으며, 상대적 루시퍼라제 활성은 Luminescent β-galactosidase detection kit II(Takara-Clontech)를 이용하여 β-galactosidase 활성을 측정함으로써 표준화하였다.

1-16. 통계 분석( Statistical analysis )

통계 분석은 two-tailed Student’ t test를 이용하여 수행하였으며, 통계적 유의성은 P<0.05 일때로 측정하였다.

실시예 2. 실험결과

2-1. p53 결합 단백질

p53 결합 단백질을 확인하기 위해, 본 발명자들은 HeLa 및 정상 간 세포로부터 인간 full-length cDNA 라이브러리를 분리하였다. p53 결합 단백질을 스크리닝하기 위해 상기 cDNA 라이브러리로부터 in vitro 전사 및 번역된 단백질 pool을 사용하였으며, 이때 변형된 SMART technology(도 1a)을 이용하였다. 100 이상의 서로 다른 단백질들을 ³⁵S-labeled 단백질 pool에 포함시켰다. 9600 개의 서로 다른 ³⁵S-labeled 단백질을 체계적으로 확인하고, GST-p53과 상호작용을 위해 양성 cDNA pool을 분리하였다. 단백질 pool에서 잠재적으로 p53과 상호작용하는 단백질을 확인한 후 (pool #D5 in 도 1b), 이에 대응하는 cDNA pool을 점차적으로 세분화하고, 상기와 동일한 방법을 계속 수행하여 단일 양성 cDNA 클론을 얻어내었다. 상기 분리된 양성 cDNA 클론들 중 하나의 클론을 p53-결합 파트너로 결정하였으며, 상기 단백질을 “Hades”라 명명하였다. 상기 Hades는 예측된 기능적 도메인을 포함한다 (도 1c): N-말단에서 TM(tansmembrane) 도메인 또는 단일 펩타이드, 단백질 한가운데에는 두 번째 TM(tansmembrane) 도메인 및 C-말단에는 RING-finger 도메인(예컨대, signature E3 ligase domain). Hades의 위치를 관찰하기 위해, 대조군 GFP 플라스미드(upper panel) 및 GFP-Hades(lower panel)를 미토트랙커(Mitotracker)와 함께 U2OS 세포에 공동-형질전환(co-tranfection) 시킨 후 공초점 현미경을 통해 관찰하였다. 그 결과 Hades가 미토콘드리아에서 뚜렷하게 위치되어 있음을 관찰하였다 (도 1d).

이후, 본 발명자들은 Hades 단백질이 In vitro 및 In vivo에서 bona fide p53-상호작용 단백질임을 증명하였다. 먼저, In vitro 형질전환된 ³⁵S-labeled p53을 GST-Hades와 상호작용시키고 (left panel), In vitro 형질전환된 ³⁵S-labeled Hades를 GST-p53과 상호작용시킨(right panel) 후, In vitro 풀-다운 분석으로 분석한 결과, 도 1e에 보이는 바와 같이 GST-p53은 In vitro 형질전환된 Hades와 상호작용하며, GST-Hades는 in vitro 형질전환된 p53과 상호작용하는 것을 알 수 있다. 또한, p53 및 Hades 사이의 결합 사이트를 확인하기 위해, In vitro 형질전환된 ³⁵S-labeled N-말단 p53(aa 1-186) 또는 C-말단 p53(aa 187-393)을 GST-Hades(GST-tagged full-length Hades)와 상호작용시킨 후, 자기방사법(autoradiography)으로 결합 단백질을 검출한 결과, GST-N-p53(aa 1-186)은 고정화된 GST-Hades와 상호작용하지만, GST-C-p53(aa 187-393)은 GST-Hades와 상호작용 하지 않음을 확인하였다 (도 1f). 뿐만 아니라, MCF7 세포 용해물을 GST(lane2) 또는 GST-Hades(lane 3)로 배양한 후, p53의 발현 수준을 항-p53 항체를 이용하여 면역블롯팅 분석하고 In vitro GST 풀-다운 분석한 결과, MCF7 세포에서 Hades와 p53이 상호작용함을 확인하였다 (도 1g). Hades 및 p53 사이의 In vivo 상호작용을 확인하기 위해, H1299 p53 null 세포를 p53 및 GFP-Hades 발현 플라스미드로 24 시간 동안 공동-형질전환시킨 후, 항-GFP 항체로 면역침강시키고 항-p53 항체를 이용하여 면역블롯팅을 수행한 결과, GFP-Hades 결합 복합체가 면역침강됨을 관찰하였으며, 이를 통해 Hades가 p53과 In vivo 상호작용함을 확인하였다 (도 1h). 그리고, p53 및 Hades 사이의 In vivo 상호작용은 MG132를 12 시간 동안 처리한 MCF10A(정상 유방 세포) 및 NHLH(normal human lung fibroblast) 세포의 용해물을 항-p53 항체 또는 항-Hades 항체로 면역침전시킨 후, 면역블롯팅으로 Hades 및 p53 발현을 관찰하여 확인하였다. 그 결과, 상기 두 세포 모두에서 Hades 및 p53의 상호작용이 관찰되었다 (도 1i). 또한, U2OS 세포를 GFP-Hades 발현 플라스미드로 24 시간 동안 형질전환시키고, 정상 조건(upper panel) 또는 MG132 존재(lower panel) 하에서 4 시간 동안 배양한 후, 배양된 세포를 항-p53 항체로 고정 및 탐지하고, Texas Red-컨쥬게이트된 마우스 이차 항체를 이용하여 세포 내의 p53 발현을 시각화 하고 이를 공초점 현미경을 이용하여 이미지화한 결과, p53은 MG132-처리된 Hades 비형질전환된 U2OS 세포에서 핵 내에 주요하게 분포하지만, 도 1j의 병합된 이미지에 보이는 바와 같이 다수의 p53이 핵 외부에도 위치되어 있음을 알 수 있다. 정량적으로, MG132-처리된 Hades 발현 세포에서 p53과 Hades는 30% 이상 공존(co-localize)하는 것으로 분석되었다 (도 1j bottom). 상기의 결과는 Hades 및 p53이 미토콘드리아에 공존함을 의미한다.

총체적으로, 상기의 결과들은 Hades 및 p53이 In vitro 및 In vivo 모두에서 상호작용함을 보여주는 결과이다.

2-2. RING ligase 활성에 의한 p53 의 발현 수준

p53에 대한 Hades의 조절 기능의 가능성을 연구하기 위해, U2OS 세포에서 내재성(endogenous) p53 발현 수준에 대한 Hades의 효과를 측정하였다. 먼저, U2OS 세포 내로 Hades 발현 플라스미드(GFP(green fluorescent protein)-Hades 플라스미드)를 24 시간 동안 형질전환시켜 Hades의 발현을 과도하게 유도하고, 항-GFP 및 항-p53 항체로 면역블롯팅 수행하여 내재성 p53의 발현 수준을 평가한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 과도하게 발현된 Hades에 의해 p53의 발현 수준이 감소되는 것을 확인할 수 있으며, 이는 GFP-Hades의 처리량에 의존적이다. 이러한 p53의 발현 감소는 GFP, GFP-tagged wild-type Hades 또는 GFP-tagged 돌연변이 Hades로 형질전환 시킨 MCF10A 및 NHLF 세포에서도 관찰되었다 (도 2b).

또한, Hades의 E3 ligase 활성이 p53 발현의 감소를 매개하는 지에 대해 알아보기 위해, Hades, Hades RING peptide(RP), 돌연변이 Hades 및 Mdm2의 자가유비퀴틴화(autoubiquitination) 활성을 연구하였다. 먼저, GST, GST-Hades, GST-Hades RING peptide, GST-Hades RING-mutant peptide(C302S/C305S) [Wu et al., Nat Genet. 14, 430-440 (1996)] 및 GST-Mdm2를 유비퀴틴화 버퍼에 넣고 E1/E2(UbcH5c)의 존재 또는 부재하에서 30 ℃, 2 시간 동안 배양시킨 후, 글루타치온-비즈에 결합된 단백질을 유비퀴틴화 버퍼로 6번 세척하고 항-유비퀴틴 항체를 이용하여 면역블롯팅을 수행한 결과, RING 돌연변이 Hades를 제외하고 E1/E2가 존재하는 상태에서 모두 유비퀴틴화 활성을 보였다 (도 2c). 또한, H1299 세포를 p53, GFP-tagged Hades 또는 FLAG-tagged mutant Hades를 발현하는 플라스미드로 24 시간 동안 형질전환시킨 후 항-p53 항체로 면역블롯팅 수행하여 p53 발현 수준을 관찰하는 경우, RING 돌연변이 Hades는 p53의 발현 수준을 저해하지 못함을 확인하였다 (도 2d). 따라서, RING 돌연변이 Hades는 Hades에 의해 유도되는 p53의 분해를 유도하지 못하며, 야생형(wild type; WT) Hades는 p53의 기능을 하향조절(downregulated) 함을 알 수 있다.

본 발명자들은 p53을 하향조절시키는 Hades의 기능을 더 자세히 분석하기 위해, Hades에 의한 p53의 안정성 조절을 관찰하였다. 먼저, H11299 세포를 각각의 플라스미드로 24 시간 동안 형질전환 한 후, 10 μM의 MG132로 4 시간 동안 처리 또는 미처리 한 결과, Hades에 의한 p53 발현 감소가 MG132의 처리에 의해 회복됨을 알 수 있다 (도 2e). 또한, Hades shRNA를 이용하여 Hades를 제거(knockdown)시킨 안정한 MCF7 세포를 제조하기 위해, 상기 세포를 pSuper Hades 1 또는 2(Hades를 타겟하는 shRNA의 발현 플라스미드)로 형질전환시킨 후, G418을 함유하는 배지(500 μg/ml)로 14일 동안 selection하여 RT-PCR로 Hades mRNA 발현을 측정하고, 동시에 항-p53 및 항-Hades 항체를 이용하여 면역블롯팅을 수행한 결과, Hades shRNA에 의한 Hades의 silencing으로 인해 p53이 안정화됨을 확인하였다 (도 2f). 뿐만 아니라, Hades shRNA를 이용하여 Hades를 제거(knockdown)시킨 안정한 MCF7 세포에 시클로헥시미드(cycloheximide; CHX, 150 μg/ml)를 처리하는 경우, 대조군(upper panel)과 비교하여 pSuper-Hades로 형질전환된 세포(lower panel)에서 p53 단백질의 반감기(half-life)가 더 높았다 (도 2g).

이후, 본 발명자들은 Hades를 제거(knockdown)한 세포에서의 p53 위치를 관찰하였다. Hades를 제거(knockdown)시킨 안정한 MCF7 세포에서 p53의 발현이 대조군에 비해 높음을 확인한 후(upper panel), 상기 안정한 MCF7 세포의 분획별 추출물에서 p53의 발현을 측정한 결과, 핵 및 세포질 모두에서 p53이 축적됨을 확인하였다 (도 2h). 그리고, 핵 외부에서 p53 및 Hades가 공존함(도 1j)을 확인한 후, p53과 Hades의 세포질 공존시 p53의 발현 수준 감소에 있어서 Hades가 영향을 미치는지에 알아보기 위해, H1299 세포를 p53 및 GFP, GFP-Hades 또는 GFP-Hades 돌연변이를 발현하는 플라스미드로 형질전환 시킨 후, Crm1 억제자인 렙토마이신 B(leptomycin B; LMB)로 처리하는 경우, Hades에 의한 p53 발현 감소(lane 2)가 LMB 처리로 인해 회복됨(lane 5)을 확인하였다 (도 2i). 이는 LMB의 처리로 Hades에 의해 매개되는 p53의 핵방출이 차단되고 p53의 발현이 회복된 것으로 사료된다. 또한, 이전 연구에서 p53 돌연변이(C153Y)를 암호화(encoding)하는 p53 발현 플라스미드를 이용하는 경우, p53이 주로 세포질에 위치해 있고 핵에는 위치되어 있지 않음을 확인하였다 [Nie et al., J Biol Chem. 282, 14616-14625 (2007)]. 이에 본 발명자들은 과발현된 야생형(WT) p53 및 돌연변이 p53(C135Y)의 면역블롯 분석을 수행하였다. H1299 세포를 0.5 μg 야생형 p53 또는 돌연변이 p53(C135Y) 플라스미드와 GFP-Hades 플라스미드(0, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 또는 4.0 μg)로 24 시간 동안 공동-형질전환시킨 후 면역블롯팅으로 과발현된 야생헝 p53 및 돌연변이 p53의 발현 수준을 측정한 결과, 동일양의 GFP-Hades 플라스미드로 형질전환시킨 상태에서 야생형 p53을 발현하는 H1299 세포에서보다 돌연변이 p53(C135Y)을 발현하는 H1299 세포에서 p53 발현 수준이 더 낮았다 (도 2j).

상기의 결과들은 Hades가 유비퀴틴-의존적인 분해 경로를 통해 세포질 p53을 하향조절함을 의미한다.

2-3. Hades 에 의한 p53 의 폴리유비퀴틴화 ( polyubiquitination ) 촉진

본 발명자들은 Hades가 p53 유비퀴틴화(ubiquitination)에 직접적으로 관여하는지에 대해 알아보기 위해, 상기 실시예 2-2에서 자가유비퀴틴화 분석(auto-ubiquitination assay)을 수행하였다. 그 결과, 고정된 full-length Hades(lane 2, GST-Hades) 및 RING-finger 도메인(aa 271-351)을 포함하는 펩타이드(lane 4, GST-Hades RP)는 자가유비퀴틴화를 보이는 반면, RING 돌연변이 펩타이드(lane 6, C302S/C305S; GST-Hades RP MT)는 자가유비퀴틴화를 보이지 않음을 확인하였다 (도 2c).

이후, 본 발명자들은 돌연변이 p53과 Hades의 상호작용을 확인한 후, In vitro 유비퀴틴화 분석을 수행하였다. 먼저, In vitro 형질전환된 ³⁵S-labeled 야생형 p53(laen 1-3) 또는 돌연변이 p53(5NKR: lane 4-6; 6NKR: 7-9; 및 K24R: lane 10-12)을 GST 또는 GST-Hades로 배양한 후, GST 풀-다운 분석을 수행한 결과, Hades가 여러 돌연변이 p53과 상호작용 함을 밝혀내었다 (도 3a).

이후, 본 발명자들은 이전의 연구를 통해 E2-결합 효소가 유비퀴틴에 의해 매개되는 분해에 관여함 [Smalle et al., Annu Rev Plant Biol. 2004, 555-590 (2004)]을 확인하고, 본 발명에서 E2 효소가 Hades에 의한 p53의 유비퀴틴화에 관여하는지를 확인하였다. In vitro 형질전환된 ³⁵S-labeled p53을 ATP, His-tagged 유비퀴틴 E1 및 여러 E2 효소 중 하나가 존재하는 상태에서 GST-Hades RING-finger peptide(GST-Hades RP)와 배양한 후, 자기방사법 및 SDS-PAGE로 분석한 결과, ³⁵S-labeled p53이 UbcH5a 또는 UbcH5c가 존재하는 상태에서 폴리유비퀴틴화됨을 확인하였다 (lanes 5 and 7, 도 3b). 또한, In vitro 형질전환된 ³⁵S-labeled p53을 ATP, His-tagged 유비퀴틴 E1 및 E2(UbcH5c)가 존재하는 상태에서 GST, GST-Hades RP 또는 GST-Mdm2로 배양한 후, 항-p53 항체를 이용하여 면역블롯팅으로 p53의 유비퀴틴화를 분석한 결과, Hades에 의한 p53의 유비퀴틴화는 Mdm2에 의해 매개되는 유비퀴틴화와 유사하게 일반적인 유비퀴틴에 의해 매개되는 분해에 관여함을 확인하였다 (도 3c). 그리고, p53 유비퀴틴화에서 Hades의 직접적인 역할을 확인하기 위해, In vitro 형질전환된 ³⁵S-labeled p53을 ATP, His-tagged 유비퀴틴 E1 및 E2(UbcH5c)가 존재하는 상태에서 GST, GST-Hades, GST-Hades RP 또는 GST-Hades RP 돌연변이로 배양한 후, 항-p53 항체를 이용하여 면역블롯팅으로 p53의 유비퀴틴화를 분석한 결과, p53의 유비퀴틴화는 Hades에 의해서만 유도됨을 확인하였다 (도 3d). 또한, 본 발명자들은 In vivo 유비퀴틴화 분석을 위해, p53 null H1299 세포를 p53(2 μg) 및 GFP-Hades 또는 GFP-Hades MT (4 μg)를 발현하는 플라스미드로 24 시간 동안 공동-형질전환시킨 후, 정상 조건 또는 MG12(10 μM)이 존재하는 조건에서 4 시간 동안 더 배양하였다. 이후 세포를 용해하고, 전체 세포 추출물을 항-p53 항체로 면역침강시키고, 유비퀴틴-컨쥬게이트된 p53 단백질을 항-폴리유비퀴틴 항체를 이용하여 면역블롯팅을 수행하였다. 그 결과, 폴리유비퀴틴화된 p53은 MG132를 처리한 GFP-Hades 형질전환된 세포에서만 검출되었다 (도 3e).

본 발명자들은 Hades에 의한 p53 유비퀴틴화 메커니즘이 Mdm2에 의한 p53 유비퀴틴화와 다른지 확인하기 위해, p53(1 μg)과 GFP-Hades 또는 GFP-Hades MT (1 μg)를 발현하는 플라스미드를 p53 및 Mdm2 모두 결핍된 MEF 세포(MEF p53^-/-;mdm2^-/- 세포)에 형질전환시킨 후, p53 발현 수준을 면역블롯팅으로 측정한 결과, GFP-Hades로 24 시간 동안 형질전환된 MEF p53^-/-;mdm2^-/- 세포에서 p53의 발현 수준이 감소됨을 확인하였다 (도 3f, lane 2). 또한, MEF p53^-/-;mdm2^-/- 세포를 His-p53 플라스미드로 24 시간 동안 형질전환 시킨 후, 세포 용해물을 수집하고, GST, GST-Hades RP 또는 GST-Hades RP MT를 포함하는 용해물로 2 시간 동안 In vitro 유비퀴틴화 분석을 수행하였다. 이때, p53을 Ni⁺ 컨쥬게이트된 비즈로 풀-다운 시키거나(left panel), 항-p53 항체를 이용하여 면역침강시켰다(right panel). 그 결과, MEF p53^-/-;mdm2^-/- 세포를 GFP-Hades RP로 형질전환시킨 경우에는 p53이 유비퀴틴화 되었으나, GFP-Hades RP MT로 형질전환시킨 경우에는 p53이 유비퀴틴화 되지 않았다 (도 3g). 뿐만 아니라, MEF p53^-/-;mdm2^-/- 세포를 p53, GFP-Hades 및 Mdm2를 발현하는 각각의 플라스미드로 24 시간 동안 형질전환 시키는 경우, GFP-Hades 및 Mdm2 플라스미드로 공동-형질전환시킨 세포에서 GFP-Hades 단독 형질전환 시킨 세포보다 p53 유비퀴틴 효과가 더 좋게 나타났다 (도 3h). 상기의 데이터들을 통해 Hades에 의한 p53의 유비퀴틴화에서 Mdm2가 관여하지 않음을 알 수 있다.

이전의 연구에 따르면, p53의 C-말단에서 Mdm2에 의해 유비퀴틴화되는 주요 부위가 6 개의 특이적 라이신(lysine) 잔기임이 밝혀졌다 [Rodriguez et al., Mol Cell Biol. 20, 8458-8467 (2000)]. 이에, 본 발명자들은 Hades에 의해 매개되는 p53의 유비퀴틴화에 대해서 라이신 잔기가 중요하게 관여하는지 확인하였다. 먼저 도 3i에 나타낸 바와 같이, p53 라이신 돌연변이를 제조하였다: 5NKR, 5 개의 N-말단 라이긴 잔기(aa 101, 120, 132, 139, 164) 돌연변이; 6NKR, 6 개의 N-말단 라이신 잔기(aa 24, 101, 120, 132, 139, 164) 돌연변이; 6CKR, 6 개의 C-말단 라이신 잔기(aa 370, 372, 373, 381, 382, 386) 돌연변이; 및 N24KR, N-말단 라이신 잔기(aa 24) 돌연변이. 이후, In vitro 형질전환된 p53(WT, 5NKR, 6NKR 또는 6CKR)을 GST 또는 GST-Hades RP로 유비퀴틴 버퍼에서 배양한 후, 면역블롯팅으로 p53 발현 수준을 측정하였다. 그 결과, 상기 6 개의 C-말단 라이신 잔기 중 어느 하나도 Hades에 의한 유비퀴틴-의존적 분해에 필수적이지 않았으며, 6 개의 라이신 잔기로 돌연변이된 6CKR도 여전히 유비퀴틴화될 수 있는 형태의 p53 이었다 (도 3j). 하지만, N-말단에서 5 또는 6 개의 라이신으로 치환한 p53 돌연변이(5NKR 또는 6NKR)와 비교하는 경우, p53의 N-말단에서 24 번째 라이신 잔기가 Hades에 의한 유비퀴틴화 및 p53 분해에 있어서 중요한 역할을 함을 확인하였다 (도 3j). Hades에 의한 p53 유비퀴틴화에서 상기 24 번째 라이신 잔기의 영향을 구체적으로 확인하기 위해, In vitro 형질전환된 ³⁵S-labeled 야생형 p53 또는 24 번째 라이신 잔기를 아르기닌(arginine)으로 치환한 돌연변이 p53(N24KR)를 GST, GST-Hades RP 또는 GST-Hades RP MT로 유비퀴틴 버퍼에서 배양한 후, SDS-PAGE 및 자가방사법으로 분석하였다. 그 결과, 야생형 p53은 Hades에 의해 유비퀴틴화 되었으나, 돌연변이 p53(N24KR)은 Hades에 의해 유비퀴틴화 되지 못함을 확인하였다 (도 3k의 (A)). 또한 GST 풀-다운(pull-down) 분석 결과, p53 K24R 돌연변이의 비-유비퀴틴화가 관찰되었으며, 이는 Hades와 상호작용을 하지 못하기 때문인 것으로 사료된다 (도 3k의 (B)).

상기의 결과들은 Hades에 의해 매개되는 p53의 폴리유비퀴틴화에 있어서 Mdm2가 관여하지 않으며, p53의 24 번째 라이신 잔기는 유비퀴틴-의존적인 p53의 분해에 중요한 역할을 함을 나타낸다.

2-4. p53 -의존적 성장 억제( growth suppression ) 및 세포 사멸( apoptosis )에 대한 Hades 의 영향

E3 리가아제(ligase) 활성은 p53 유비퀴틴화에 대해 필수적이며, p53의 기능도 조절하는 것으로 알려져있다 [Dornan et al., Nature 429, 86-92 (2004); Leng et al., Cell 112, 779-791 (2003)]. 이에 본 발명자들은 p53-의존적 성장 억제에 대하여 Hades가 미치는 영향을 조사하였다. 첫째로, 루시퍼라제 리포터 분석(luciferase reporter assay)을 이용하여 Hades가 p53에 의해 매개되는 전사 활성에 영향을 미치는 지에 대해 확인하기 위해, H1299 세포를 p53 및 GFP, GFP-Hades 또는 GFP-Hades MT를 발현하는 플라스미드와 bax(Bax-luc) 또는 puma(Puma-luc) 리포터 플라스미드로 함께 24 시간 동안 혼합 형질전환 시킨 후, 루미노미터로 상대적인 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 그 결과 도 4a에 나타낸 바와 같이, Bax-luc 및 PUMA-luc의 활성이 Hades에 의해 감소됨을 확인하였으며, 이를 통해 p53에 의해 매개되는 전이활성(transactivation)이 Hades에 의해 저해됨을 알 수 있다. 하지만, H1299 세포를 p53 및 GFP, GFP-Hades 또는 GFP-Hades MT를 발현하는 플라스미드와 bax(Bax-luc) 또는 puma(Puma-luc) 리포터 플라스미드로 함께 24 시간 동안 혼합 형질전환 시킨 후, 루시퍼라제 활성을 측정하기 전에 LMB(20 nM)로 4 시간 동안 처리하는 경우, LMB 처리로 Hades에 의한 p53 전이활성이 감소되지 않았으며, 돌연변이 Hades에 의해서도 p53 하위(downstream) 유전자인 BAX 및 PUMA의 발현이 감소되지 않았다 (도 4b). 또한, H1299 세포를 p53 돌연변이(전이활성 결핍) 및 GFP, GFP-Hades 또는 GFP-Hades MT를 발현하는 플라스미드와 bax(Bax-luc) 또는 puma(Puma-luc) 리포터 플라스미드로 함께 24 시간 동안 혼합 형질전환 시킨 후, 루시퍼라제 활성 및 p53 발현 수준을 측정한 결과, 전이활성이 결핍된 돌연변이 p53의 분해는 Hades에 의해 매개되는 것을 확인할 수 있으며, 따라서 Hades에 의한 p53의 분해는 전이활성과 무관함을 알 수 있다 (도 4c).

p53의 축적은 세포의 성장 억제(growth suppression)를 유도한다고 연구되어 있어 [Finlay et al., Cell 57, 1083-1093 (1989)], 본 발명자들은 Hades가 p53-의존적 성장 억제(growth suppression)를 조절하는 지에 대해 MTS 분석을 이용하여 연구하였다. 각각의 세포(HeLa, MEF p53^-/-;mdm2^-/-, MCF7 및 H1299)를 500 ng의 p53 및 GFP, GFP-Hades 또는 GFP-Hades MT를 발현하는 플라스미드로 72 시간 동안 공동-형질전환시킨 후, MTS 세포 증식 분석을 수행한 결과, Hades가 p53에 의해 매개되는 세포 성장 억제(growth suppression)를 저해하는 것으로 나타났다 (도 4d). 또한 H1299 세포를 p53 및 GFP 또는 GFP-Hades를 발현하는 플라스미드로 공동-형질전환 시킨 후, G418(500 μg/ml)을 포함하는 배지로 14일 동안 배양시킨 세포를 콜로니-형성 분석으로 관찰한 결과, Hades가 p53에 의해 매개되는 세포 성장 억제를 저해함을 확인하였다 (도 4e).

다음으로, RNA 간섭 시스템을 이용하여 Hades가 p53에 의한 성장 억제를 감소시키는지에 대해 확인하였다. HCT116 p53^+/+ 및 p53 null HCT116 p53^-/- 세포를 1 μg의 pSuper 또는 pSuper-Hades로 형질전환 시킨 후, G418(500 μg/ml)을 포함하는 배지로 14일 동안 배양시킨 세포를 콜로니-형성 분석으로 관찰한 결과, Hades의 제거(knockdown)로 인해 HCT116 p53^+/+ 세포에서 p53-의존적 성장 억제가 회복되는 반면, HCT116 p53^-/- 세포에서는 회복시키지 못하였다 (도 4f). 또한, Hades를 제거(knockdown)한 안정한 MCF7 세포(gray bar) 및 대조군 MCF7 세포(black bar)를 H2O2(10 μM), 액티노마이신 D(actinomycin D, 1 μM) 또는 독소루비신(doxorubisin, 500 nM)로 처리하여 24 시간 동안 배양한 후, MTS 세포 증식 분석을 수행한 결과, Hades를 제거한 MCF7 세포에서 Hades에 의한 p53의 세포 성장 억제 활성이 회복되었음을 확인하였다 (도 4g).

따라서 p53은 다양한 세포 신호에 대한 반응에서 세포 사멸 및 세포 주기 정지를 유도하기 위한 중앙 스위치로써 역할을 하며 [Dulic et al., Cell 76, 1013-1023 (1994); Lowe et al., Nature 362, 847-849 (1993); Lane DP, Nature 358, 15-16 (1992)], 상기 데이터들을 통해 Hades는 p53-의존적 성장 억제를 부정적으로(negatively) 조절함을 알 수 있다. 따라서 Hades는 p53의 부정적 조절자(negative regulator)로써 역할을 하며, 다양한 스트레스 조건에 의한 세포 사멸로부터 세포를 보호하는 역학을 한다.

2-5. Hades 에 의한 p53 의 핵방출 ( exonuclear ) 기전 조절

최근의 연구에 따르면, p53은 정상 상태에서 핵 및 세포질에 걸쳐 분포되어 있는 것으로 나타났다 [Shaulsky et al., Oncogene 5, 1707-1711 (1990); Martinez et al., Genes Dev. 5, 151-159 (1991)]. 게다가 본 연구에서도 Hades가 핵 외부에 존재하는 p53과 상효작용함을 보였다 (도 1j). 특히, 세포질 및 미토콘드리아 p53은 Bcl-2 family와의 상호작용에 의해 다양한 스트레스 하에서 세포 사멸을 유도하며 [Green et al., Nature 458, 1127-1130 (2009)], 이는 Hades가 p53에 의해 매개되는 세포 죽음을 조절하기 위한 특정 조건에서 p53과 상호작용함을 의미한다.

따라서 본 발명자들은 pEYFP(enhanced yellow fluorescent protein)-mito-p53로 형질전환된 U2OS 세포를 이용하여 Hades가 미토콘드리아의 p53을 조절하는지에 대해 관찰하였다. U2SO 세포를 pEYFP-mito-p53으로 24 시간 동안 형질전환시킨 후, 세포를 공초점 현미경을 관찰하였다. 그 결과, pEYFP-mito-p53이 미토콘드리아 내에 위치함을 확인하였다. 이후, p53과 Hades 간의 상호작용을 확인하기 위해, HEK293 세포를 FLAG-Hades 및 FLAG-Hades MT가 존재 또는 부재한 상태에서 EYFP-mito-p53 및 pCI-Bcl-2 발현 플라스미드로 공동-형질전환 시킨 후, 세포 용해물을 Bcl-2 항체로 면역침강시킨 결과, MG132 처리한 상태에서 Hades가 p53과 Bcl-2의 상호작용을 저해함을 확인하였다 (도 5b, lane 3). 하지만, RING-finger 도메인을 제거한 돌연변이 Hades로 형질전환 시킨 세포에서는 p53과 Bcl-2 사이의 상호작용에 영향을 끼치지 못하였다 (도 5b, lane 4).

본 발명자들은 또한, 세포 증식(cell proliferation)에 대한 Hades의 영향을 콜로니-형성 분석을 통해 관찰하였다. H1299 세포를 EYFP-mito-p53을 발현하는 플라스미드와 GFP 또는 GFP-Hades 발현 플라스미드로 공동-형질전환 시킨 후, 세포를G418(500 μg/ml)을 포함하는 배지로 14일 동안 배양하였다. 이후 콜로니-형성 분석을 수행한 결과, EYFP-mito-p53 및 GFP-Hades 발현 플라스미드로 형질전환된 세포의 콜로니 형성이 감소됨을 확인하였다 (도 5c). 또한, MEF p53^-/-;mdm2^-/- 세포를 EYFP-mito-p53 또는 EYFP-mito-p53 돌연변이(K24R) 발현 플라스미드와 GFP 또는 GFP-Hades 발현 플라스미드로 14일 동안 공동-형질전환 시킨 후, 콜로니-형성 분석을 통해 세포 성장을 확인한 결과, EYFP-mito-p53 돌연변이를 발현하는 세포에서는 Hades에 의한 세포 성장 억제가 저해되지 않음을 확인하였다 (도 5d).

이전 연구에서는, p53의 핵방출(exonuclear) 기전이 CPT(camptothecin)를 처리하는 경우 빠르게 미토콘드리아로 전위되는 것으로 나타났다 [Mihara et al., Molecular Cell 11, 577-590 (2003)]. 이에 본 발명자들은 CPT 처리에 의한 p53의 핵방출(exonuclear) 기전이 Hades에 의해 약화되는지에 대해 알아보았다. MCF7 세포를 GFP 또는 GFP-Hades 발현 플라스미드로 24 시간 동안 형질전환 시킨 후, 세포를 1 μM 또는 5 μM의 CPT로 6 시간 동안 처리한 결과, CPT 처리로 축적된 p53 발현이 Hades에 의해 저해되었다 (도 5e, upper panel). 또한 MCF 세포를 GFP 또는 GFP-Hades RING MR 발현 플라스미드로 24 시간 동안 형질전환 시킨 후, 세포를 5 μM의 CPT로 6 시간 동안 처리한 후, 핵 및 세포질 분획을 수집하여 p53 발현 수준을 측정한 결과, CPT 처리로 p53 발현이 핵 및 세포질에 축적되었으며, Hades에 의해 p53의 세포질 발현이 감소되었다 (도 5e, lower panel). 그리고, MCF 세포를 GFP 또는 GFP-Hades RING MT 발현 플라스미드로 24 시간 동안 형질전환 시킨 후, 세포를 1 μM의 CPT로 24 시간 동안 처리한 후, 세포 용해물을 항-p53 항체를 면역침강 시키고, 면역블롯팅을 통해 Bcl-2 및 p53 발현 수준을 측정한 결과, CPT 처리에 의해 p53 발현 축적이 관찰되었으며, Hades에 의해 Bcl-2 및 p53 사이의 상호작용이 저해되었다 (도 5f). CPT에 의해 유도되는 세포 사멸에 대한 Hades의 영향을 확인하기 위해, MCF7 세포를 GFP 또는 GFP-Hades 발현 플라스미드로 24 시간 동안 형질전환 시킨 후, 1 μM의 CPT로 24 시간 동안 세포에 처리한 후, 유세포 분석기를 통해 세포 사멸 수를 관찰하였다. 그 결과, CPT에 의해 유도된 세포 사멸이 Hades에 의해 저해됨을 확인하였다 (도 5g).

다음으로, RNA 간섭 시스템을 이용하여 상기의 효과들을 확인하였다. MCF7 세포를 pSuper 또는 pSuper-Hades로 형질전환 시킨 후, 세포를 1 μM의 CPT로 24 시간 동안 처리하였다. 이후 세포 용해물을 항-p53 항체로 면역침강 시키고, 항-Bcl-2 및 항-p53 항체를 이용하여 면역블롯팅 검사를 수행하였다. 그 결과, p53-Bcl-2 복합체의 발현이 대조군 세포보다 Hades 제거시킨 안정한 MCF7 세포에서 CPT 처리 후 더 증가되었으며 (도 5h, lane 3 vs 4), p53의 발현도 상당히 증가되었다. Hades 제거(knockdown) MCF7 세포에 1 μM CPT 처리 후, 미토콘드리아 분획으로부터 시토크롬 C(cytochrome C)의 방출을 항-시토크롬 C 항체를 이용하여 면역블롯팅으로 분석한 결과, CPT 처리 후 미토콘드리아로부터 시토크롬 C의 방출이 유도됨을 확인하였다 (도 5h, lower panel).

본 발명자들은 p53-의존적 세포 사멸에 대한 Hades의 부정적 역할을 FACS 분석을 이용하여 더 관찰하였다. MCF7 세포를 pSuper 또는 pSuper-Hades로 형질전환 시킨 후, 세포를 1 μM의 CPT로 24 시간 동안 처리한 후, MCF7 세포의 sub-G0 분획을 FACS로 분석한 결과, 대조군 세포에 비해 Hades를 제거(knockdown)시킨 MCF7 세포에서 CPT 처리로 세포 사멸 세포(apoptotic cell)가 더 많이 관찰되었다 (도 5i). 또한, HCT116 p53^+/+ 및 HCT116 p53^-/- 세포를 40 nM의 pSuper 또는 pSuper-Hades로 24 시간 동안 형질전환 시킨 후, 1 μM의 CPT로 24 시간 동안 처리한 후, 세포를 수집하고 30분 동안 JC-1로 염색하여 FACS로 분석한 결과, p53이 존재하는 세포에서는 CPT 처리 후 탐지가능한 미토콘드리아 막 전위의 손실이 유도되었으나, p53이 부재한 세포에서는 유도되지 않았다 (도 5j). 이러한 결과는 CPT를 처리한 세포에서 Hades가 p53과 빠르게 상호작용하고, Bcl-2 및 p53 사이의 상호작용을 저해함으로써 p53의 핵방출(exonuclear) 기전을 약화시킴을 의미한다.

이전 연구에 따르면, p53의 핵방출(exonuclear) 기전은 종양 억제의 기능을 수행하고 [Talos et al., Cancer Res. 65, 9971-9981 (2005)], 다른 리가아제들은 다른 종양 조직에서 높게 발현된 p53을 유비퀴틴화시킨다고 알려져 있다 [Dornan et al., Cancer Res. 64, 7226-7230 (2004); Wenrui et al., Journal of the National Cancer Institute 96, 1718-1721 (2004)]. 이에 본 발명자들은 인간 종양 조직에서 Hades의 발현 수준을 관찰하였다. Hades mRNA의 발현 수준은 정량적 RT-PCR로 HCC(human hepatocellular carcinoma) 및 인접한 정상 조직으로부터 28 쌍의 간 생체검사(liver biopsies)로 평가하였다. 그 결과, 2 배 이상의 높은 Hades mRNA 발현이 인접한 정상 조직과 비교하여 HCC에서 관찰되었다 (도 5k). 상기 결과는 발현이 증가된 Hades는 p53 활성을 감소시킴으로써 간 종양 형성에 영향을 미칠 것 이라는 가설과 일치하였다. 이와 함께, 상기 결과들은 p53의 유비퀴틴화 후 프로테아좀 분해를 통한 p53의 핵방출(exonuclear) 종양 억제 기전을 Hades가 억제함을 나타낸다.

본 발명자들은 p53과 상호작용하는 단백질로써 Hades를 발견하였으며, 상기 Hades는 p53의 핵방출(exonuclear) 기전에 대한 E3 리가아제(ligase)로써 기능하며, 유비퀴틴-의존적 경로를 통해 p53을 분해한다. 이전 연구에 따르면, Hades는 미토콘드리아에 주로 위치하는 RING-finger 도메인이며 (도 1d), 미토콘드리아의 활동을 조절하는 Drp-1(dynamin-related protein 1)을 서모화(sumoylation)시키는 것으로 알려졌다 [Li et al., PLOS ONE 3, e1487 (2008); Braschi et al., EMBO Rep. 10, 748-754 (2009)]. 최근에는, JNK 경로를 통해 Hades에 의해 유도된 세포 독성이 보고되었다 [Zhang et al., Cell Res. 18, 900-1000 (2008)]. 하지만, 본 발명자들은 Hades가 p53을 조절하는 기능을 갖음을 새롭게 발견하였다. 본 발명의 실시예 중 면역형광 검사를 통해 Hades가 핵 외부에 존재하는 p53과 상호작용함을 관찰할 수 있으며 (도 1j), 과발현(ectopic expression)된 Hades는 세포질 p53의 분해를 유발한다 (도 5e, lower panel). 관찰된 결과들을 기초로, 본 발명자들은 세포질에서 Hades에 의한 p53 유비퀴틴화는 세포질 및 미토콘드리아 구획 모두에서 p53의 발현 수준을 감소시킴을 제시하였다.

p53을 타겟하는 Mdm2를 포함하는 몇몇 E3 리가아제(ligase)에 대해 연구되었음에도 불구하고 [Dornan et al., Nature 429, 86-92 (2004); Leng et al., Cell 112, 779-791 (2003)], 본 발명자들은 다음의 이유로 Hades가 Mdm2에 대한 다른 메커니즘을 갖는 것으로 제시한다. 첫째, Mdm2는 핵 내에서 p53 발현을 감소시키지만 [Shirangi et al., FASEB J. 16, 420-422 (2002)], Hades는 세포질에서 p53의 발현을 감소시키고 (도 5e, lower panel), Mdm2-비의존적 방법에 의해 p53을 유비퀴틴화 시킨다 (도 3f). 두 번째, p53의 N-말단 라이신 잔기(24 번째 lysine 잔기)는 Mdm2에 의한 유비퀴틴화에서 연구되지 않고, Hades에 의한 유비퀴틴화에 매우 중요한 잔기임을 본 발명에서 확인하였다 (도 3k의 (A)). 세 번째, Hades는 부정적 피드백 루프(negative feedback loop)를 갖지 않는다. p53의 UV 발광 또는 과발현(ectopic expression)은 A549 또는 HCT119 세포에서 Hades mRNA의 증가를 유도하지 않는다.

p53을 타켓하는 몇몇의 세포질 E3 리가아제(ligase)는 ARF-bp1 및 p300을 포함하는 정상 상태에서 E3 리가아제로써 연구되었다 [Chen et al., Cell 121, 1071-1083 (2005); Shi et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16275-16280 (2009)]. 그러나, 본 발명자들은 다른 E3 리가아제 경로 또한 Hades에 의해 매개되는 p53 조절에 기여할 것이라는 가능성을 배제하지 않았다.

흥미롭게도, 본 발명자들은 Hades를 제거시키는 경우 핵 및 세포질에서 p53의 축적이 나타남을 발견하였다 (도 2h). p53의 단백질 안정성 및 전이활성이 다양한 생물화학적 메커니즘에 의해 강하게 조절되는 것은 잘 알려져 있다. 최근 연구에 따르면, 유비퀴틴화된 세포질 p53은 위치화(localization)에 의해 안정화된다. p53의 유비퀴틴화 형태는 핵으로의 수송을 위한 임포틴(importin)과 상호작용하지 않으며 [Marchenko et al., Cell Death Differ. 17, 255-267 (2010)], Usp 10에 의한 p53의 탈유비퀴틴화(deubiquitination)는 p53 핵 수송 및 활성의 결과를 초래한다. 이는, 본 발명의 Hades의 제거에 의해 핵 및 세포질에서 p53이 축적되는 것과 유사하다 (도 2h).

본 발명의 결과에서 가장 중요한 부분은, Hades가 p53의 핵방출(exonuclear) 기전을 조절한다는 것이다. Hades는 미토콘드리아에 위치한 p53의 종양 억제 기능을 저해하며, 형질전환된 모델에서 p53과 Bcl-2의 상호작용을 방해한다 (도 5b). 최근의 연구는 세포질 및 미토콘드리아 p53이 CPT에 대한 반응으로 Bcl-2 family의 구성원과 결합하고, 미토콘드리아에서 세포 죽음을 직접적으로 촉진시킴을 보였다 [Mihara et al., Molecular Cell 11, 577-590 (2003)]. 하지만, 본 연구에서는 Hades가 CPT에 의해 유도된 p53의 축적을 저해하고 (도 5e), p53과 Bcl-2 사이의 상호작용을 차단함을 확인하였다 (도 5f). 또한 이전의 연구에서는 p53과 Bcl-2 단백질의 상호작용을 확인하였으며, 상호작용 후 미토콘드리아 막 전위의 손실은 p53에 의해 활성화된 전사-비의존적 세포 죽음 메커니즘의 특징임을 확인하였다 [Tomita et al., J Biol Chem. 281, 8600-8606 (2006)]. 본 발명에서는 Hades를 제거시킨 세포에 CPT를 노출시키는 경우 미토콘드리아로부터 시토크롬 C(cytochrome C)의 방출 (도 5h) 및 HCT116 p53^+/+ 세포에서 미토콘드리아 막 전위의 손실을 확인하였으며, HCT116 p53^-/- 세포에서는 막 전위 손실이 야기되지 않음을 확인하였다 (도 5j). 또한, FACS 분석을 통해 대조군과 비교하여 Hades를 제거한 안정한 MCF7 세포에 CPT를 노출시키는 경우, sub-G0 세포 분획에서 세포 사멸(apoptotic)이 증가됨을 확인하였다 (도 5i). 그리고 본 발명은 Hades가 유비퀴틴에 의존적인 프로테아좀에 의한 분해를 통해 p53의 핵방출(exonuclear) 기전을 억제시킴으로써 CPT에 의해 유도되는 세포 죽음을 보호할 수 있음을 보였다. 상기의 결과에 기초하여 본 발명자들은 Hades가 p53의 핵방출 기전을 부정적으로 조절하는 것으로 제안한다.

세포질 p53의 과도한 유비퀴틴화 형태는 신경모세포증(neuroblastoma)과 같은 일부 암에서 보고되었다 [Becker et al., Cell Death Differ. 14, 1350-1360 (2007)]. 특정 조건하에서 p53의 종양 억제 역할을 명확히 하기 위해 p53에 대한 핵방출(exonuclear) 기전을 충분히 연구한 결과, 유비퀴틴화에 의한 p53의 핵방출 기전의 저해는 종양형성(tumorigenesis)과 관련되는 것으로 나타났다 [Talos et al., Cancer Res. 65, 9971-9981 (2005); Palacios et al., Cell Cycle 7, 2584-2590 (2008)]. 본 발명자들은 HCC 환자의 간 생체검사에서 정상 조직에 비해 2 배 이상의 Hades mRNA의 발현을 확인하였다 (도 5k). 이는 p53의 핵방출 기전의 조절이 종양형성에 영향을 미침을 나타내는 첫 번째 증명 결과이다. 비록 본 발명자들은 과도한 Hades 발현이 p53의 핵방출 기전을 억제시킴으로써 종양 형성을 촉진시킨 정확한 메커니즘에 대해서는 현재까지 밝혀내지 못하였지만, p53 종양 억제 활성에 대한 Hades의 대체 기능을 발견하였다.

결론적으로, 본 발명은 Hades가 p53 종양 억제에 대한 E3 리가아제(ligase)임을 제시하며, 세포질에서의 p53 조절 및 p53의 핵방출(exonuclear) 기전 조절에 대한 다섯가지 결과를 제시하였다. Hades는 p53의 핵방출 경로에서 고유의 역할을 하며, 이는 p53-의존적 미토콘드리아 세포 죽음 경로에서 새로운 조절자로서의 역할인 것이다. 더 나아가 Hades의 생리학적 기능에 대한 연구가 더 필요할 것이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Use of Hades as a target for tumor suppressor <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1059 <212> DNA <213> p53 binding gene <400> 1 atggagagcg gagggcggcc ctcgctgtgc cagttcatcc tcctgggcac cacctctgtg 60 gtcaccgccg ccctgtactc cgtgtaccgg cagaaggccc gggtctccca agagctcaag 120 ggagctaaaa aagttcattt gggtgaagat ttaaagagta ttctttcaga agctccagga 180 aaatgcgtgc cttatgctgt tatagaagga gctgtgcggt ctgttaaaga aacgcttaac 240 agccagtttg tggaaaactg caagggggta attcagcggc tgacacttca ggagcacaag 300 atggtgtgga atcgaaccac ccacctttgg aatgattgct caaagatcat tcatcagagg 360 accaacacag tgccctttga cctggtgccc cacgaggatg gcgtggatgt ggctgtgcga 420 gtgctgaagc ccctggactc agtggatctg ggtctagaga ctgtgtatga gaagttccac 480 ccctcgattc agtccttcac cgatgtcatc ggccactaca tcagcggtga gcggcccaaa 540 ggcatccaag agaccgagga gatgctgaag gtgggggcca ccctcacagg ggttggcgaa 600 ctggtcctgg acaacaactc tgtccgcctg cagccgccca aacaaggcat gcagtactat 660 ctaagcagcc aggacttcga cagcctgctg cagaggcagg agtcgagcgt caggctctgg 720 aaggtgctgg cgctggtttt tggctttgcc acatgtgcca ccctcttctt cattctccgg 780 aagcagtatc tgcagcggca ggagcgcctg cgcctcaagc agatgcagga ggagttccag 840 gagcatgagg cccagctgct gagccgagcc aagcctgagg acagggagag tctgaagagc 900 gcctgtgtag tgtgtctgag cagcttcaag tcctgcgtct ttctggagtg tgggcacgtt 960 tgttcctgca ccgagtgcta ccgcgccttg ccagagccca agaagtgccc tatctgcaga 1020 caggcgatca cccgggtgat acccctgtac aacagctaa 1059 <210> 2 <211> 352 <212> PRT <213> p53 binding protein <400> 2 Met Glu Ser Gly Gly Arg Pro Ser Leu Cys Gln Phe Ile Leu Leu Gly 1 5 10 15 Thr Thr Ser Val Val Thr Ala Ala Leu Tyr Ser Val Tyr Arg Gln Lys 20 25 30 Ala Arg Val Ser Gln Glu Leu Lys Gly Ala Lys Lys Val His Leu Gly 35 40 45 Glu Asp Leu Lys Ser Ile Leu Ser Glu Ala Pro Gly Lys Cys Val Pro 50 55 60 Tyr Ala Val Ile Glu Gly Ala Val Arg Ser Val Lys Glu Thr Leu Asn 65 70 75 80 Ser Gln Phe Val Glu Asn Cys Lys Gly Val Ile Gln Arg Leu Thr Leu 85 90 95 Gln Glu His Lys Met Val Trp Asn Arg Thr Thr His Leu Trp Asn Asp 100 105 110 Cys Ser Lys Ile Ile His Gln Arg Thr Asn Thr Val Pro Phe Asp Leu 115 120 125 Val Pro His Glu Asp Gly Val Asp Val Ala Val Arg Val Leu Lys Pro 130 135 140 Leu Asp Ser Val Asp Leu Gly Leu Glu Thr Val Tyr Glu Lys Phe His 145 150 155 160 Pro Ser Ile Gln Ser Phe Thr Asp Val Ile Gly His Tyr Ile Ser Gly 165 170 175 Glu Arg Pro Lys Gly Ile Gln Glu Thr Glu Glu Met Leu Lys Val Gly 180 185 190 Ala Thr Leu Thr Gly Val Gly Glu Leu Val Leu Asp Asn Asn Ser Val 195 200 205 Arg Leu Gln Pro Pro Lys Gln Gly Met Gln Tyr Tyr Leu Ser Ser Gln 210 215 220 Asp Phe Asp Ser Leu Leu Gln Arg Gln Glu Ser Ser Val Arg Leu Trp 225 230 235 240 Lys Val Leu Ala Leu Val Phe Gly Phe Ala Thr Cys Ala Thr Leu Phe 245 250 255 Phe Ile Leu Arg Lys Gln Tyr Leu Gln Arg Gln Glu Arg Leu Arg Leu 260 265 270 Lys Gln Met Gln Glu Glu Phe Gln Glu His Glu Ala Gln Leu Leu Ser 275 280 285 Arg Ala Lys Pro Glu Asp Arg Glu Ser Leu Lys Ser Ala Cys Val Val 290 295 300 Cys Leu Ser Ser Phe Lys Ser Cys Val Phe Leu Glu Cys Gly His Val 305 310 315 320 Cys Ser Cys Thr Glu Cys Tyr Arg Ala Leu Pro Glu Pro Lys Lys Cys 325 330 335 Pro Ile Cys Arg Gln Ala Ile Thr Arg Val Ile Pro Leu Tyr Asn Ser 340 345 350 <210> 3 <211> 38 <212> PRT <213> Hades C-terminal RING-finger domain <400> 3 Cys Val Val Cys Leu Ser Ser Phe Lys Ser Cys Val Phe Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gly His Val Cys Ser Cys Thr Glu Cys Tyr Arg Ala Leu Pro Glu Pro 20 25 30 Lys Lys Cys Pro Ile Cys 35 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Hades siRNA anti-sense 1 <400> 4 gccucgagau aaaaauccct g 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Hades siRNA anti-sense 2 <400> 5 uuuguccucu acacacacgt g 21

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제를 유효성분으로 함유하는 종양 억제용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 Hades는 종양 세포에서 과발현되는 것을 특징으로 하는 종양 억제용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제는 Hades 유전자의 전사 또는 번역을 하향조절하거나, Hades 단백질의 작용을 억제하는 것을 특징으로 하는 종양 억제용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 Hades 단백질의 발현 억제제는 서열번호 4 또는 5의 염기서열을 갖는 Hades siRNA(short interfering RNA) 또는 이를 전사하는 유전자인 것을 특징으로 하는 종양 억제용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제는 Hades와 p53의 상호작용(interaction)을 저해하는 것을 특징으로 하는 종양 억제용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 Hades와 p53의 상호작용은 p53의 DNA 결합, 전사 활성, 스트레스-유발 세포 사멸 및 p53-유발 세포 사멸을 저해하는 것을 특징으로 하는 종양 억제용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 Hades와 p53의 상호작용은 p53의 유비퀴틴화(ubiquitination)를 유도하는 것을 특징으로 하는 종양 억제용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제는 Hades의 C-말단 RING-finger 도메인을 표적하는 것을 특징으로 하는 종양 억제용 조성물.
하기의 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법:
(a) Hades 단백질을 발현하는 동물세포에 임의의 약제를 처리하는 단계; 및
(b) 상기 동물세포에서 약제를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 Hades 단백질의 발현이 감소되는지 여부를 결정하는 단계.
하기의 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법:
(a) 시험 약제의 존재하에 p53-결합부위를 함유하는 Hades 단백질 또는 그 단편과 p53을 접촉시키는 단계; 및
(b) 시험 약제가 없는 대조군과 비교하여 Hades와 p53의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계.
제 10항에 있어서, 상기 Hades의 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 p53-결합부위(C-말단의 RIGN-finger 도메인)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제의 스크리닝 방법.
제 10항에 있어서, 상기 Hades와 p53의 상호작용은 Hades의 p53-결합부위(C-말단의 RING-finger 도메인)와 p53의 DNA-결합 도메인 사이에서 일어나는 것을 특징으로 하는 항암제의 스크리닝 방법.
제 10항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 Hades와 p53의 상호작용은 면역침전(immunoprecipitation) 분석, GST 풀-다운(pull-down) 분석 및 콜로니(colony)-형성 분석에 의해 측정하는 것을 특징으로 하는 항암제의 스크리닝 방법.
제 9항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 스크리닝 방법에 의해 스크리닝된 약제를 유효성분으로 포함하는 항암제 조성물.
하기를 포함하는 Hades와 p53의 상호작용을 저해하는 항암제의 스크리닝 키트:
(a) Hades의 p53-결합부위(C-말단 RING-finger 도메인)를 함유하는 폴리펩타이드;
(b) p53의 DNA-결합 도메인을 함유하는 폴리펩타이드; 및
(c) 상기 폴리펩타이드들 사이의 상호작용을 검출하는 시약.