CN110389212A - 筛选p53ptc通读协同抗肿瘤药物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种筛选P53PTC通读协同抗肿瘤药物的方法，包括：以含有p53PTC‑GFP融合载体的E.coli系统初筛出候选化合物；以及利用舜转或者稳转的H1299p53PTC‑GFP细胞对候选化合物进行二次筛选。通过这种筛选方法发现G418不仅可以通读p53PTC，而且与抗肿瘤药物DOX具有协同作用，这为降低临床使用药物的毒性提供了一种新的途径。

Description

筛选P53PTC通读协同抗肿瘤药物的方法
技术领域
本发明涉及药物领域，更具体地，涉及筛选P53PTC通读协同抗肿瘤药物的方法。
背景技术
p53蛋白作为肿瘤抑制因子在癌症预防中起着重要作用。突变型p53蛋白经常引发细胞癌变，癌细胞转移、增殖和存活。在p53突变中，PTCs与p53PTC蛋白高度相关。PTCs导致合成截短的p53蛋白(p53PTC蛋白)，而p53PTC蛋白无抑制癌细胞增殖的功能。研究发现癌细胞中有60％超过了15个p53PTC突变。因此，通过回复突变p53PTC来促进细胞周期阻滞是一种可行的抗癌策略。
目前为止，很少有化合物能够通过蛋白质合成机制通读mRNA终止密码子，包括p53PTC。在这些化合物中，包括庆大霉素、geneticin和kanamycin在内的氨基糖苷类比其它化合物更能有效地增强p53PTC的通读效应。这些氨基糖苷类化合物减少了同源和类同源tRNA之间的分子区别，并可通过在终止密码子处插入一个氨基酸以继续翻译。除提高此类化合物的通透效率外，我们但仍需探索新的化合物，加速发现治疗p53PTC突变体癌症有效治疗新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选P53PTC通读协同抗肿瘤药物的方法，以促进抗肿瘤药物的发现。
本发明的实施例提供了一种筛选P53PTC通读协同抗肿瘤药物的方法，包括：
以含有p53PTC-GFP融合载体的E.coli系统初筛出候选化合物；以及
利用舜转或者稳转的H1299p53PTC-GFP细胞对候选化合物进行二次筛选。
本申请提供了一种高效的p53PTC蛋白通读化合物筛选策略，首先以含有p53PTC-GFP融合载体的E.coli系统高通量初筛出候选化合物，然后利用舜转或者稳转的H1299p53PTC-GFP细胞对候选化合物进行二次筛选。此外，通过这种策略我们发现G418不仅可以通读p53PTC，而且与抗肿瘤药物DOX具有协同作用，这为降低临床使用药物的毒性提供了一种新的途径。
附图说明
图1a示出了p53-GFP融合蛋白的表达情况。
图1b示出了用His单克隆抗体通过Western-blot方法检测全长p53R213X蛋白的表达，其中，FL：全长p53蛋白；TR：截断p53蛋白。
图2a示出了p53WT-GFP融合蛋白的瞬时表达引起细胞形态变化。
图2b示出了G418显著提高全长p53蛋白的产量，其中，p53WT-GFP融合蛋白为对照。
图2c示出了p53R213X-GFP稳态表达细胞株筛选。
图2d示出了4号p53R213X稳态表达细胞检测庆大霉素、卡那霉素和G418的通读效率，其中，氨苄青霉素为对照。
图3示出了流式细胞技术分析G418和DOX对细胞周期的协同作用。G1期:蓝色；S期:灰色；G2期:红色。(a)H1299细胞；(b)H1299p53R213X细胞；(c)用200μg/mL G418处理H1299p53R213X细胞；(d)1μg/mL DOX处理H1299p53R213X细胞；(e)0.25μg/mL DOX处理H1299p53R213X细胞；(f)0.25μg/mL DOX和200μg/mL G418处理H1299p53R213X细胞。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买所得。
本申请以绿色荧光蛋白(GFP)为探针，旨在开发一种有效的筛选p53PTC回复突变药物的方法。筛选出的化合物对此类癌症的协同给药效果需进行进一步地研究。首先连接p53PTC基因与GFP基因，构建p53PTC-GFP融合基因。接下来证实细菌蛋白生物合成体系是否适合p53PTC回复突变药物的快速筛选。将融合基因克隆到pET28蛋白表达载体，转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株。当p53PTC基因在药物处理后被通读时，完整长度的p53PTC蛋白即为带有GFP标记的融合蛋白，可以通过GFP荧光检测出。应该理解，本文中的p53PTC回复突变药物是指能够让突变的具有提前终止密码子的P53得以继续翻译的药物。
p53PTC-GFP融合蛋白表达载体的构建
为利用E.coli蛋白质表达系统建立筛选模型，本申请引入了两种不同的蛋白表达载体，即分别具有卡那霉素和氨苄青霉素抗性的pET28b(+)和pET15b。首先将pET28b(+)中的凝血酶切位点改为Tev酶切位点，然后通过BamHI和EcoRI限制性内切酶位点将His6-GFP亚克隆至此改良后的载体中，构建pET28-GFP载体。GFP基因以pK33-GFP质粒为模板，通过PCR扩增技术放大。最后将野生型p53(p53WT)基因通过NcoI和BamHI限制性内切酶位点亚克隆至pET28-GFP质粒。由此，在构建的p53WT和GFP融合基因(p53WT-GFP)前后分别引入了一个His6标签。可用His抗体通过免疫印迹法鉴定p53蛋白。
为检验上述方法的可行性，首先检测了野生型p53-GFP融合蛋白(p53-GFP)的表达情况。如图1a所示,最佳可溶性p53WT-GFP融合蛋白的表达温度为18℃，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)添加量为0.4mM。虽然包涵体中存在一些融合蛋白，可溶性p53WT-GFP融合蛋白足以被荧光检测系统捕捉到。
为证明E.coli蛋白生物合成体系是否适于快速筛选氨基糖苷抗生素类p53PTC回复突变药物，我们从11种无义突变(表1)型中选取了3个p53PTC突变株，构建了p53PTC-GFP融合蛋白表达质粒。其中p53R213X和p53R196X突变在癌细胞中发生率较高。这两种无义突变均位于DNA结合域，直接影响p53-DNA之间的相互作用。另一种突变株p53R317X处于寡聚区，影响p53的四聚化。因此，目前的工作主要集中在这三种p53PTC-GFP融合基因的构建，即p53R196X-GFP,p53R213X-GFP,p53Q317X-GFP。
表1
使用定点突变试剂盒(Stratagen，美国)进行定点突变，以p53WT-GFP基因为模板分别构建p53R196X、p53R213X和p53Q317X三个无义突变体，PCR扩增后分别克隆到pET15b。同时将p53WT GFP基因和p53R213X无义突变体分别克隆至pLenti-CMV载体。所有重组质粒均经DNA测序证实。
三种p53PTC-GFP融合载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)，过夜培养。挑单菌落，接种至不含抗生素的1mL L培养基，在200rpm，37℃条件下过夜培养。1:100接种于10ml不含抗生素的LB培养基中，在200rpm条件下培养4～5h，至OD600nm＝1.5。将培养液分装至96孔板中每孔200μL，分别加入0,10,20、30,40,50、60,70g/ml卡那霉素、庆大霉素和G418，在37℃条件下继续振荡培养3h后，温度降至18℃，加0.4mM IPTG诱导72h。用BieTek荧光仪测定荧光强度。荧光检测后，收集细胞，用免疫印迹法检测p53蛋白的表达。
这些细胞经过不同剂量的庆大霉素、卡那霉素和G418分别处理48h后产生了显著的荧光信号，且对不同的p53PTC分别表现出不同的荧光增强效果。
庆大霉素和G418对三种p53PTC突变体的作用不同，而卡那霉素对三种p53PTC突变体的作用相似。G418和卡那霉素对p53R196X和p53R213X的通读效应比庆大霉素高。卡那霉素和庆大霉素对p53Q317X的通读效应比G418高。此外，卡那霉素和G418的剂量对三种p53PTC突变体的通读有显著影响。与卡那霉素相比，不同剂量的G418对三种p53PTC突变体的通读均有影响。使p53R213X通读量达到最高水平，G418的浓度需增至50-60μg/ml，而卡那霉素则需高于60μg/ml。p53R196X和p53R213X最通读量达到最高时所需的卡那霉素浓度为40-50μg/ml,而使p53Q317X通读量达最高则需要更高剂量的卡那霉素(>60μg/ml)。另一方面，这三种氨基糖苷类抗生素对p53WT-GFP蛋白表达水平也有不同的影响。庆大霉素在高浓度时抑制蛋白表达，而卡那霉素和G418则促进蛋白合成。综上所述，这三种氨基糖苷类抗生素及其剂量对p53PTC及其突变体的通读有不同的影响。
此外，上述系统表达的全长p53蛋白也通过Western-blotting方法得以证实。如图1b所示，在p53R213X前后末端同时添加His标签，用His单克隆抗体可以检测到全长p53R213X-GFP和截断p53R213X-GFP的表达水平。在不添加氨基糖苷类抗生素的情况下，含p53R213X-GFP的E.coli细胞表达出大小约为36kDa的截断p53蛋白(TR，图1b)。添加不同浓度的氨基糖苷类抗生素后，可以检测出约70kDa的蛋白条带(全长p53-GFP融合蛋白为70kDa)(FL，图1b)。以上结果说明E.coli蛋白生物合成机制具有通读p53-GFP的能力，且产量随着卡那霉素和G418浓度的增加而显著增加(庆大霉素除外)。
该系统可能存在缺陷，即p53PTC-GFP克隆在了一个表达细菌氨基糖苷磷酸酶(kanR)的卡那霉素耐药表达载体中。因此，在细胞培养过程中应避免使用卡那霉素。为排除酶kanR的影响，我们将p53PTC-GFP基因克隆至氨苄青霉素抗性的载体中，研究该酶是否影响p53PTC的通读。在低浓度的氨基糖苷类抗生素条件下(例如10μg/ml)，庆大霉素和G418增大了p53PTC通读量。继续增加氨基糖苷类抗生素浓度，庆大霉素对p53PTC通读效果显著降低，而卡那霉素和G418完全失去通读效果。氨苄则完全没有影响。很可能是kanR参与了E.coli的p53PTC通读机制。综上所述，E.coli蛋白生物合成机制与p53PTC-GFP融合基因为PTC-回复突变药物的筛选提供了可行性。
接下来我们用哺乳动物细胞蛋白生物合成机制进一步验证此方案的可行性。实验选用不含p53基因的非小细胞肺癌细胞H1299作为模型。为了证明概念，我们将重点放在p53R213X突变体上。首先，我们将pLenti-p53WT-GFP和pLenti-p53R213X-GFP质粒分别转染至H1299细胞。用10％胎牛血清(Gibco,USA)的DMEM(Gibco,USA)培养基，在37℃，5％CO2条件下培养293T和H1299细胞。用Lipo 2000(Invitrogen,USA)分别将pLenti-CMV-p53WT-GFP及pLenti-CMV-p53R213X-GFP质粒转染至H1299细胞，36h后加入不同浓度的G418(50,100,150,200μg/ml)。收集细胞，用免疫印迹法检测p53蛋白的表达。
如图2a所示，与含有p53R213X-GFP质粒的H1299细胞相比p53WT-GFP融合蛋白的过表达导致了H1299细胞的形态变化。分别用三种氨基糖苷处理36h后，p53R213X-GFP的全长蛋白仅在一定剂量的G418条件下表达(图2b)。卡那霉素和庆大霉素处理的细胞未发生p53R213X-GFP的通读。
接下来,我们用pLenti质粒建立了表达p53R213X-GFP融合蛋白的H1299稳态细胞。为了构建稳定表达p53R213x绿色荧光蛋白的H1299细胞，首先用293T细胞制备逆转录病毒。用转染试剂磷酸钙将pLenti-CMV-p53R213X-GFP载体、pMDL和pSP载体(1∶1∶1)混合后共转染至293T细胞。48h后，收集293T细胞中的逆转录病毒，并转至H1299细胞。H1299细胞继续培养48h后，用培养基将其稀释。分装至10cm的细胞培养皿中，每孔约20个细胞。继续培养，约两周后出现菌落。用胰蛋白酶-EDTA(GiBCO，美国)滤纸将单克隆分离到24孔板中。PCR检测稳定表达p53R213X-GFP的H1299细胞。
稳态细胞选用His抗体，通过Western-blotting实验筛选。用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液重悬并裂解H1299细胞。用Bradford比色法测定细胞总蛋白含量，加入SDS-PAGE上样缓冲液后95℃加热10min。将E.coli BL21(DE3)全细胞浓度校准至OD600nm＝2.0后，加入SDS-PAGE上样缓冲液，95℃加热10min。将上述蛋白质样品在12000rpm/min条件下离心10min，用12％SDS-PAGE胶分离。然后将分离胶蛋白转印至硝酸纤维素膜。在室温下，用含有5％脱脂奶粉的TBS缓冲液将膜封闭1h。将鼠His抗体(BioNu，中国)以1:5000比例稀释后与上述封闭膜孵育，检测His标签。同时为了检测p53蛋白和β-肌动蛋白，将封闭膜与兔p53抗体(Life Science,USA)1:400稀释液及鼠β-肌动蛋白抗体(ProteinTech,USA)1:2000稀释液孵育。室温孵育2小时后，用TBST缓冲液洗涤5次。然后，在室温下分别用鼠His-tag二抗标记辣根过氧化物酶的鼠IgG抗体(ProteinTech，1:10000稀释液)，以及兔p53二抗辣根过氧化物酶标记的兔IgG抗体(ProteinTech，1：10000稀释液)孵育45min。TBST缓冲液洗涤5次，ECL蛋白质印迹检测试剂盒(Takara，日本)显色。
如图2c所示，在7株稳态细胞中，有3株可表达p53R213X蛋白，其中4号产量最高。因此，后续实验采用4号细胞系(以下简称H1299p53R213X)评价氨基糖苷类抗生素对p53R213X通读的影响。
如图2d所示，一定剂量的G418可使p53R213X产生通读，而卡那霉素和庆大霉素不能使p53R213X产生通读，即使将浓度提升至200μg/ml。与原核系统相反，在没有添加药物的情况下，细胞不能产生全长p53-GFP蛋白。这表明，与原核生物合成机制相比，真核生物合成机制更严格地控制了PTC的通读。
由于在p53缺陷型肿瘤细胞中，增高活性p53蛋白的表达不可逆阻滞细胞周期可诱导肿瘤细胞衰退或凋亡，因此想确定G418是否对临床批准的抗癌药物有协同作用。我们选择阿霉素(Doxorubicin,DOX)作为模型。DOX是一种常用的抗肿瘤药物，在高剂量的情况下可将细胞阻滞于G2/M期，以达到治疗目的。然而，DOX对正常细胞毒性很大，对肿瘤细胞缺乏特异性。如图3中的a和b，流式细胞仪检测结果显示H1299细胞和H1299p53R213X细胞在细胞周期中无明显差异。H1299细胞及H1299-p53R213X-GFP稳态细胞接种至6孔板，接种密度为1.4x105个/孔，孵育12h后，加入G418、DOX及AZD9291。G418的最终浓度分别为50,100和200μg/mL，DOX终浓度分别为0.25、0.5、1μg/Ml，AZD9291的终浓度为240μg/mL。培养24h后更换含药物的新鲜培养基继续培养24h。以碘化丙啶(PI)为显色剂，用BD Accuri C6流式细胞仪检测荧光。
用200μg/ml G418处理H1299p53R213X细胞后发现细胞被阻滞于G1期，此外G2期细胞略有增加(图3中的c)。相反，如图3中的d所示，当用更高剂量的DOX处理H1299p53R213X细胞时，细胞大多被高效阻滞于G2期。当将DOX剂量减少到0.25μg/ml时，G2期细胞显著减少(图3中的e)，效果明显下降。然而，在低剂量的DOX情况下与G418联合给药，H1299p53R213X细胞可重新被阻滞于G2期，与高剂量DOX的药效相当(图3中的f)。在我们的对照实验中，针对非小细胞肺癌细胞的EGF受体靶向化合物AZD9291对H1299p53R213X细胞周期没有影响，即使与G418联合使用亦无影响。由此可知，氨基糖苷类药物(如G418)在通读p53PTC机制中与DOX有协同作用，这种协同作用可能具有细胞周期靶向性。
综上，我们设计了一种策略，利用p53-GFP融合蛋白表达系统筛选通读p53PTC的抗癌药物。本实验以氨基糖苷化合物为药物模型，用E.coli细胞和乳腺细胞表达系统筛选p53PTC通读化合物。通读的全长p53PTC蛋白均被GFP蛋白所标记，通过荧光系统快速检测出。
因此,本申请提供了一种高效的p53PTC蛋白通读化合物筛选策略，首先以含有p53PTC-GFP融合载体的E.coli系统高通量初筛出候选化合物，然后利用舜转或者稳转的H1299p53PTC-GFP细胞对候选化合物进行二次筛选。此外，通过这种策略我们发现G418不仅可以通读p53PTC，而且与抗肿瘤药物DOX具有协同作用，这为降低临床使用药物的毒性提供了一种新的途径。
本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。

Claims (1)

1.一种筛选P53PTC通读协同抗肿瘤药物的方法，包括：
以含有p53PTC-GFP融合载体的E.coli系统初筛出候选化合物；以及
利用舜转或者稳转的H1299p53PTC-GFP细胞对候选化合物进行二次筛选。
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