KR20110105722A

KR20110105722A - 바이오칩

Info

Publication number: KR20110105722A
Application number: KR1020110023941A
Authority: KR
Inventors: 김상효
Original assignee: 경원대학교 산학협력단
Priority date: 2010-03-19
Filing date: 2011-03-17
Publication date: 2011-09-27
Also published as: KR101288244B1; US20130011914A1; US9081005B2

Abstract

본 발명은 셀 어레이 기판 위에 금속나노입자층을 포함함으로써 별도의 태그(Tag) 없이도 간편하게 바이오물질을 정성 및 정량 분석할 수 있는 바이오칩에 관한 것이다.
셀 어레이 기판 위에 금속나노입자층을 포함하고 CMOS 이미지 센서를 이용하는 본 발명에 따른 바이오칩은 별도의 태그(tag)를 사용할 필요가 없고 검출 방식이 단순하여 사용이 편리할 뿐만 아니라 재사용이 가능한 경제적인 바이오칩을 제공할 수 있다.

Description

바이오칩 {Biochip}

본 발명은 셀 어레이 기판 위에 금속나노입자층을 포함함으로써 별도의 태그(Tag) 없이도 간편하게 바이오물질을 정성 및 정량 분석할 수 있는 바이오칩에 관한 것이다.

바이오칩은 생물에서 유래한 효소, 단백질, 항체, DNA, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포 및 기관, 신경세포 등과 같은 생체 유기물과 반도체나 유리 같은 무기물을 조합하여 기존의 반도체칩 형태로 만든 혼성소자(Hybrid device)이다. 생체분자의 고유한 기능을 활용하고 생체의 기능을 모방함으로써 감염성 질병을 진단하거나 유전자를 분석하고 새로운 정보처리용 신기능 소자의 역할을 하는 특징이 있다.

바이오칩의 종류는 생물분자와 시스템화된 정도에 따라 DNA칩, RNA칩, 단백질 칩, 세포칩, 뉴런칩 등으로 구분될 수 있으며, 시료의 전처리, 생화학 반응, 검출, 자료 해석까지 소형 집적화되어 자동분석기능을 갖는 실험실칩(Lab on a chip)과 같은 각종 생화학물질의 검출 및 분석 기능을 할 수 있는 바이오센서를 포함하여 광범위하게 정의될 수 있다.

한편 바이오칩의 분석은 주로 분석시료를 형광물질과 같은 태그(tag)로 라벨링하여 외부 여기 광을 조사하여 나오는 발광 파장과 세기를 측정함으로써 이루어진다. 그러나 형광물질을 이용한 분석 시스템의 경우 검출 방식이 복잡하고 고가의 분석 장치가 필요해 비용이 많이 들 뿐만 아니라 형광체의 발광 효율이 낮고 수명이 상대적으로 짧아 장시간 측정이 어려운 문제가 있다.

본 발명은 바이오물질을 정성적으로 또는 정량적으로 분석함에 있어서 별도의 태그를 사용할 필요 없이 검출 방식이 비교적 간단하여 사용이 편리하고 재사용이 가능한 바이오칩을 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 기판, 기판 위에 부착된 금속나노입자층 및 각 셀 내의 금속나노입자층 위에 부착된 유전층(dielectric layer)을 포함하는 셀 어레이; 및 CMOS 이미지 센서(CIS, CMOS Image Sensor);를 포함하는 바이오칩을 제공한다.

또한 본 발명은 기판, 기판 위에 부착된 금속나노입자층, 각 셀 내의 금속나노입자층 위에 부착된 유전층(dielectric layer) 및 유전층이 없는 금속나노입자층 위에 부착된 충전층을 포함하는 셀 어레이; 및 CMOS 이미지 센서;를 포함하는 바이오칩을 제공한다.

셀 어레이 기판 위에 금속나노입자층을 포함하고 CMOS 이미지 센서를 이용하는 본 발명에 따른 바이오칩은 별도의 태그(tag)를 사용할 필요가 없고 검출 방식이 단순하여 사용이 편리할 뿐만 아니라 재사용이 가능한 경제적인 바이오칩을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 셀 어레이의 구조를 보여주는 도면이다.
도 2 는 도 1의 A-A' 단면의 구조를 보여주는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오칩의 구조를 보여주는 도면이다.
도 4 는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오칩의 유전층에 분석대상 물질이 결합된 상태를 보여주는 도면이다.
도 5 는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 바이오칩을 이용하여 1차 및 2차 항체의 결합에 의한 광자수의 변화를 디지털 아웃풋 숫자로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 도 5의 결과를 바탕으로 단백질의 결합 효율을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 도 6의 결과를 바탕으로 인듐 나노입자층의 두께에 따른 단백질의 결합 효율을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8 은 항체 처리 전후의 셀 어레이 표면의 형태를 FE-SEM으로 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 9 는 항체 처리 전후의 셀 어레이 표면의 형태를 AFM으로 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 10 은 항원-항체 반응을 형광현미경으로 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.

본 발명은 기판, 기판 위에 부착된 금속나노입자층 및 각 셀 내의 금속나노입자층 위에 부착된 유전층(dielectric layer)을 포함하는 셀 어레이; 및 CMOS 이미지 센서;를 포함하는 바이오칩을 제공한다.

본 명세서에서 "셀"이란 분석하고자 하는 시료 물질이 반응할 수 있는 공간을 의미하며, "셀 어레이"란 다수의 셀이 배열된 집합체를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 셀 어레이는 각 셀이 별도의 구획으로 분획되어 있는 것일 수도 있고, 별도의 구획 없이 각 셀에 해당하는 금속나노입자층 위에 유전층을 각각 분리하여 부착시킴으로써 형성되는 것일 수도 있다.

본 발명의 일실시예들에 따른 바이오칩은 셀 어레이의 기판 위에 부착된 금속나노입자층을 포함함으로써, 인듐 슬라이드 면역분석방법(ISI, Indium Slide Immunoassay)과 같이 별도의 태그(tag) 없이도 바이오물질간 상호작용에 의해 바이오물질이 부착된 셀의 광산란(light scattering) 변화를 이용해 빛의 강도(intensity) 변화를 측정함으로써 검출하고자 하는 바이오물질의 종류와 양을 쉽게 분석할 수 있다. 즉, 금속나노입자층에 바이오물질이 결합하면 이러한 결합이 CMOS 이미지 센서로 들어가는 광자를 막기 때문에 CMOS 렌즈로 흡수되는 광자수가 감소되면서 빛의 강도가 감소하게 되는데, 이러한 빛의 강도 변화를 측정함으로써 정량적인 분석이 가능하게 된다. 이때 사용할 수 있는 광원의 종류는 특별히 한정되지 않으나, 본 발명에 따르면 가시광원을 이용하여서도 바이오물질을 쉽게 정성 및 정량적으로 분석 가능하다는 장점이 있다.

본 발명은 셀에서 발생하는 광신호를 검출하여 디지털 전기 신호로 변환하는 센서로서 CMOS 이미지 센서(CIS, CMOS Image Sensor)를 포함함으로써, 구동 방식이 간편하고 다양한 스캐닝(scanning) 방식으로 구현할 수 있으며 신호 처리 회로를 단일칩에 집적할 수 있어 제품의 소형화가 가능하다. 또한 CMOS 공정 기술을 호환하여 사용할 수 있어 제조 단가를 낮출 수 있으며, 전력 소모 또한 매우 낮아 배터리 용량이 제한적인 제품에도 적용이 용이하다.

CMOS 이미지 센서의 원리는 다음과 같다. 센서 내에 단일 광다이오드가 있어서 이 영역에서 빛의 흡수 및 다른 신호로 변환하는 작업을 거치게 되고 이는 광전효과 원리에 따르고 있다. 광자가 전하의 형태로 축적되어 전자로부터 변환될 때 이 양은 광자가 CMOS 이미지 센서에 닿아 검출되는 숫자에 비례한다. 축적된 전하들은 아날로그 전압 형태로 증폭되고 이는 디지털 숫자로 변환된다. 디지털 아웃풋에 표시되는 숫자들은 광자가 이미지 센서에 검출되는 숫자에 비례한다. 만약 이미지 센서 표면에 다른 물질이 있어 광자의 지나감을 방해하게 된다면, 디지털 아웃풋 숫자는 감소하게 된다.

본 발명에 있어서 셀 어레이와 CMOS 이미지 센서를 결합하여 바이오칩을 제조하는 것은 당업계에 공지된 방법에 의하여 수행할 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 셀 어레이와 CMOS 이미지 센서는 서로 다른 기판에서 별개의 공정에 의하여 형성된 후 패키징(packaging)되어 단일 바이오칩으로 제조할 수 있다. 구체적으로, 셀 어레이와 CMOS 이미지 센서가 서로 다른 제조 공정에 의하여 형성된 후, 반도체 소자의 제조 공정 등에서 사용되는 멀티-스택 패키지(multi-stack package) 공정 등을 이용하여 하나의 바이오칩으로 패키징되어 완성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

셀 어레이에 있어서 기판의 종류는 유리 기판, 실리콘 기판, 플라스틱 기판, 화합물 반도체 기판, 석영기판, 사파이어기판 등 특별히 한정되지 않고 바이오칩에 일반적으로 사용되는 기판이 다양하게 사용될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 셀 어레이의 기판 위에 부착된 금속나노입자층은 인듐(indium) 또는 금(gold) 나노입자층일 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며 이외에도 당업계에 공지된 다양한 금속나노입자층을 포함하는 것으로 해석된다.

금속나노입자의 크기는 유전체로 사용되는 바이오물질의 종류에 따라 달라질 수 있으나, 보통 수십나노미터 내지 수백나노미터 정도의 직경을 가질 수 있다. 이는 금속나노입자가 바이오물질의 부착 후 바이오물질의 크기로 인하여 가시광의 파장보다 큰 크기의 입자로 되면서 불투명 해지기 때문이다.

하기 실시예에 따르면, 기판 위에 부착된 금속나노입자의 크기 및 금속나노입자층의 두께가 바이오물질의 결합 효율에 영향을 미치며, 이로 인해 CMOS 센서의 민감도가 달라질 수 있음을 확인하였다. 즉, 감마-인터페론을 유전체로 사용하여 1차 항체 및 2차 항체의 결합에 따른 신호를 측정한 결과, 금속나노입자층의 두께가 10 nm, 20 nm 이고 금속나노입자의 직경이 각각 70-100 nm, 150-200 nm 범위인 경우에 항체 결합 효율이 높아 민감도가 높은 것을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명의 한 구체예에 따르면, 상기 금속나노입자의 크기는 60~300 nm, 60~250 nm, 70~250 nm 또는 70~200 nm 일 수 있다.

또한 본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 금속나노입자층의 두께는 5~30 nm, 5~25 nm, 7~30 nm, 7~25 nm, 9~30 nm 또는 9~25 nm 일 수 있다.

인듐 또는 금과 같은 금속을 진공 상태에서 기판 위에서 증발시키면 금속 원자들이 기판 위에서 작은 입자들로 응결된다. 이때 증발되는 금속의 양 또는 기질의 온도에 따라 금속 입자의 크기가 결정될 수 있다.

금속나노입자의 부착은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어 Giaever et al. A New Assay for Rheumatoid Factor, CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 30, No. 6, 1984 에 개시된 바와 같이, 인듐 금속(Indium Corp. of America, Utica, NY 13503)을 감압 증발관(reduced-pressure evaporator)의 유리 기판 위에서 10^-6 mmHg 압력 하에 감압증착시킴으로써 나노입자 형태로 증착시킬 수 있다. 보통 350 ℃ 내지 700 ℃에서, 10^-8 mmHg 내지 10^-4 mmHg 정도의 압력 하에 1 내지 10분 정도 감압증착시킴으로써 금속 입자의 크기를 수십 나노미터 내지 수백나노미터의 직경으로 증착시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 각 셀 내의 금속나노입자층 위에 부착된 유전층은 DNA, RNA, 단백질, 효소, 항원, 항체, 펩타이드, 탄수화물 및 지질로 이루어진 군에서 선택되는 바이오물질로 이루어진 층일 수 있다. 예를 들어, 분석하고자 하는 항체(antibody) 단백질에 특이적으로 결합하는 항원(antigen) 단백질을 프로브 단백질로 이용하여 각 셀 내의 금속나노입자층 위에 유전층을 형성하도록 부착시킬 수 있다.

다양한 종류의 바이오물질을 각 셀 내에 부착시킴으로써, 각 바이오물질에 특이적으로 결합하는 분석대상 물질을 정성적으로 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 각 반응 셀의 광신호를 측정함으로써 정량적인 분석까지 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 바이오칩을 이용하여 분석 가능한 분석대상 물질은 유전층으로 사용한 바이오물질에 특이적으로 결합하는 물질로서, 예를 들어 DNA, RNA, 단백질, 효소, 항원, 항체, 펩타이드, 탄수화물 및 지질로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

바이오물질은 바이오물질을 포함하는 용액을 이용하여 슬라이드에 부착시킨다. 슬라이드를 세척하고 건조하면 바이오물질은 금속나노입자층 위에 단일층으로 부착되며, 이렇게 부착된 바이오물질은 유전층(dielectric layer)으로 작용한다. 금속나노입자층이 유전층으로 덮이면 금속나노입자들에 의한 빛의 산란이 증가하며 투과되는 빛의 세기가 변화하여 유전층이 부착된 부분은 정성적으로 확인이 가능하다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 셀 어레이는 유전층이 없는 금속나노입자층 위에 부착된 충전층을 추가로 포함할 수 있다. 즉, 유전층으로 덮이지 않은 금속나노입자층 위의 나머지 부분에 별도의 충전층을 부착시킴으로써, 기판, 기판 위에 부착된 금속나노입자층, 각 셀 내의 금속나노입자층 위에 부착된 유전층(dielectric layer) 및 유전층이 없는 금속나노입자층 위에 부착된 충전층을 포함하는 셀 어레이; 및 CMOS 이미지 센서;를 포함하는 바이오칩을 제작할 수 있다. 상기 충전층은 유전층에는 부착되지 않고 금속나노입자층에만 단일층으로 부착될 수 있다. 즉, 유전층에 해당하는 바이오물질에는 결합하지 않는 불활성 단백질을 기판 위의 유전층을 제외한 남은 표면상에 부착시킴으로써 기판의 표면을 균일하게 만들 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 충전층은 이에 한정되는 것은 아니지만 금속단백질일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "금속단백질"이란 철, 구리, 아연 등의 금속이온과 결합한 단백질 복합체를 의미한다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 금속단백질은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 알돌라아제(aldolase)일 수 있다.

상술한 바와 같이 균일한 표면 특성을 갖는 셀 어레이 위에 분석시료를 접촉시킴으로써 바이오물질의 정성분석 및 정량분석을 수행할 수 있다. 예를 들어, 분석시료 내의 항체 단백질이 특정 바이오칩의 특정 셀 내의 항원 단백질과 항원 항체 반응에 의해 특이적으로 결합하게 되면 해당 부위의 광산란에 변화를 일으키게 되고, 항체 단백질이 결합하지 않아 광산란 변화가 없는 나머지 부위와 정성적으로 식별 가능하여 분석시료 내 항체 단백질의 종류를 정성적으로 쉽게 분석할 수 있다. 뿐만 아니라 결합하는 단백질의 양이 많아질수록 셀 어레이를 투과(transmit)하는 빛의 강도가 약해지는바, CMOS 이미지 센서를 이용하여 투과된 빛의 강도 변화를 측정함으로써 결합된 단백질의 양을 정량하거나, 시각을 통하여(visual inspection) 단백질의 양을 추정함으로써 정량적인 분석도 가능하다.

또한 본 발명에 따른 바이오 칩은 상기와 같은 단백질 분석을 수행한 후에 셀 어레이 표면을 세척하여 프로브 단백질에 결합된 항체 단백질을 탈착시킨 후 재사용 할 수도 있다.

이하, 본 발명에 대하여 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 그러나 하기의 설명은 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로 하기 설명에 의해 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 셀 어레이의 구조를 보여주는 도면이다.

본 발명에 따른 셀 어레이(100)는 기판(10), 기판 위에 부착된 금속나노입자층(20) 및 각 셀 내의 금속나노입자층 위에 부착된 유전층(dielectric layer)(30)을 포함한다.

도 1은 각 셀을 별도로 분획하지 않고 각 셀에 해당하는 위치에 유전층(30)을 부착시킴으로써 셀 어레이(100)를 형성한 것을 도시하였으나, 각 셀을 별도의 구획으로 분획하는 것도 가능하다.

도 2는 상기 도 1의 A-A' 단면의 구조를 나타낸다. 도 2는 유전층(30)이 없는 금속나노입자층(20) 위에 추가적으로 부착된 충전층(40)을 도시한다. 도 2에 예시된 셀 어레이는 금속나노입자층(20) 위에 유전층(30) 및 충전층(40)이 단일층으로 부착되어 균일한 표면층을 형성하고 있음을 알 수 있다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오칩의 구조를 나타낸다. 앞서 설명한 도 1의 셀 어레이(100)에 CMOS 이미지 센서(200)가 결합된 바이오칩을 도시하고 있다.

도 4는 본 발명에 따른 바이오칩의 유전층에 분석대상 물질이 결합된 상태를 나타낸다.

셀 어레이(100)에 분석시료를 접촉하여 특정 셀 내의 유전층(30)인 바이오물질에 특이적인 분석대상 물질(50)이 결합하면, 광원으로부터 해당 셀을 투과하는 빛의 강도에 변화가 생긴다. 이러한 빛의 강도 변화를 CMOS 이미지 센서(200)가 전기 신호로 바꾸어 디스플레이로 표시함으로써 분석시료에 포함된 분석대상 물질의 종류 및 양을 정성적 및 정량적으로 분석할 수 있다. 이때 각 이미지 픽셀 이상의 셀 어레이를 가지고 있으면, 분석 대상 물질이 결합하지 않은 대조군 셀과 분석 대상 물질이 결합한 각각의 셀에 대한 빛의 세기를 비교함으로써 바이오물질을 정성적으로 혹은 정량적으로 분석할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 바이오칩의 제작

인듐 비드(Sigma Aldrich)와 열증착기(Daeki Hi-Tech)를 이용하여 유리 기판의 표면 위에 서로 다른 크기의 인듐 나노입자를 서로 다른 두께로 증착시켰다. 여러 인자들을 조절하여 인듐 나노입자층을 원하는 두께 및 크기로 제조하였다. 본 실시예는 0.3 ~ 1 Pa 에 해당하는 가스 압력하에서 시행되었으며, 챔버 배출 압력은 10^-6 Torr 로 아르곤 가스를 이용하였고, mass flow controller 를 조작하여 총 가스 압력을 얻었다. 타겟과 기질 사이의 거리는 약 50~80mm로 유지하였다. 열증착기의 속도는 0.05 ~ 0.1 Å/s으로 조정하였으며 원하는 두께에 도달하였을 때는 열증착기를 정지시켰다.

금속나노입자층의 두께는 각각 5, 10, 20 및 40nm로 얻었으며, 두께에 따라 금속나노입자의 직경 또한 30~50, 70~100, 150~200 및 350~400nm 정도로 각기 달랐다.

CMOS 이미지 센서는 일반 핸드폰 카메라에 쓰이는 110,000 픽셀 단일 칩을 사용하였다. 이 CMOS 이미지 센서는 376 x 314의 픽셀 배열을 지니며 10bit ADC 의 온칩(반도체 위에 회로를 집적한) 형태이고, Siliconfile Technologies Inc. 로부터 공급 받았다.

실시예 2: 금속나노입자층의 두께 변화에 따른 단백질의 정량분석

유전체로서 사용한 재조합 감마-인터페론은, 1차 폴리클로날 감마-인터페론 항체(1°Ab) 및 2차 항체(FITC conjugated goat anti-globulin: 2°Ab) 는 Abcam 으로부터 얻었다. 모든 용액과 버퍼는 증류수와 함께 제조 및 준비하였다. 138mM NaCl 과 2.7mM KCl 을 함유하고 pH 7.4의 산성도를 지니는 PBS를 버퍼로 사용하였다. 감마-인터페론은 0.85% w/v NaCl 용액으로 희석하였고 최종 농도를 5 ㎍/ml로 제조하였다. 1차 항체는 1% BSA 용액으로 희석하였으며 최종 농도는 각각 1 ㎍/ml, 1ng/ml, 1pg/ml 및 1fg/ml 로 제조하였다. 2차 항체도 1차 항체와 같이 희석하였으며 최종 농도는 20 ㎍/ml으로 희석하였다.

CMOS 이미지 센서의 배경조명 밝기는 통합 시간 및 아날로그 량을 (analogue value) 수동으로 조절하면서 최고 수치로 조정 하였다. 빛의 최대 강도를 캘리브레이션 시켰다.; 그 후, 항원 항체가 결합된 셀 어레이에 순차적으로 빛을 가하면서 광자수를 측정하였다.

실시예 1에 따라 각각 5, 10, 20 및 40nm 의 두께를 갖도록 인듐 나노입자가 코팅된 기판을 각각 4조각으로 자른 후(총 16조각) 증류수로 세척 하였으며 각각의 크기는 5 x 5 mm 였다. 광자의 인풋과 아웃풋의 계산을 위하여 모든 기판들을 CMOS 이미지 센서의 렌즈에 노출시켰다.

세척된 16개의 기판을 감마-인터페론 항원(5μg/ml 농도)에 담궜으며 실온에서 60분 동안 배양하였다. 뒤이어 이 기판들을 증류수로 세척 후 건조 시켰다. 항원의 흡착과정 후 광자수를 분석하기 위하여 모든 16개의 기판들을 CMOS 이미지 센서에 노출시켰다.

각각 특정한 두께를 지니고 있는 기판 중 하나씩을 택하여 1μg/ml, 1ng/ml, 1pg/ml 및 1fg/ml 의 농도를 갖는 1차 항체를 포함하는 페트리 접시에 넣고 임의적으로 흔들어 3시간 동안 반응시켰다. 기판에 흡착되지 않은 1차 항체들을 분리하기 위하여 모든 기판들을 증류수로 세척하였고 공기압축기를 이용하여 건조시켰다. 1차 항체들이 부착된 모든 기판들을 20μg/ml 농도의 2차 항체에 넣어 그늘진 곳에서 한 시간 동안 배양하였다. 뒤이어 기판들을 증류수로 세척한 후 2차 항체의 결합으로 인한 광자 분석을 위하여 건조시켰다. 각각의 기판들을 CMOS 이미지 센서에 노출시켜 분석하였다.

도 5를 통해 알 수 있는 바와 같이, 인듐 나노입자층이 코팅된 기판에서 CMOS 렌즈를 통하여 관찰한 광자 흡수량의 수는 항원과 1차 및 2차 항체의 순차적인 결합에 따라 감소하였다. (A), (B), (C) 및 (D)는 각각 인듐 나노입자층이 5, 10, 20 및 40nm 의 두께로 코팅된 기판을 이용한 실험결과를 보여주는데, (A), (B), (C) 및 (D) 모두 기판에 항원(Ag), 1차 항체(1°Ab), 2차 항체(2°Ab)가 결합함에 따라 디지털 아웃풋 숫자가 현저히 감소됨을 알 수 있다. CMOS 센서에서 나오는 디지털 아웃풋 숫자는 CMOS 이미지 센서에 광자가 감지되는 숫자에 비례한다고 볼 수 있다. 이러한 광자수의 감소는 항원과 항체가 결합을 진행함으로써 CMOS 이미지 센서로 들어가는 광자를 막기 때문에 CMOS 렌즈로부터 흡수되는 빛의 강도가 감소되기 때문이다.

특히 본 발명에 따른 바이오칩을 이용하면 1 fg/ml의 펨토 단위의 농도까지 항원-항체 반응의 검출이 가능함을 확인할 수 있다.

실시예 3: 금속나노입자층의 두께 변화에 따른 단백질의 결합 효율 측정

도 6은 실시예 2의 실험 결과에서 항원과 1차 및 2차 항체가 각각 5, 10, 20, 40nm의 두께를 지니는 인듐 나노입자층에 상대적으로 결합하는 효율을 그래프로 나타낸 것이다. 항원의 상대적인 결합 효율은 인듐 나노입자층의 디지털 아웃풋 숫자에서 인듐 나노입자-항원 결합시의 디지털 아웃풋 숫자를 뺀 값으로 구하였다. 마찬가지로 1차 항체의 상대적인 결합 효율은 인듐 나노입자-항원 결합시의 디지털 아웃풋 숫자에서 인듐 나노입자-항원-1차 항체 결합시의 디지털 아웃풋 숫자를 뺀 값으로 구하였고, 2차 항체의 상대적인 결합 효율은 인듐 나노입자-항원-1차 항체 결합시의 디지털 아웃풋 숫자에서 인듐 나노입자-항원-1차 항체-2차 항체 결합시의 디지털 아웃풋 값을 값을 뺀 값으로 구하였다.

도 6을 통해 알 수 있듯이, 1차 항체 농도의 감소에 따라 결합 효율의 급격한 감소가 나타났으며, 이는 실시예 2의 도 5에서 1차 항체 농도의 감소에 따라 디지털 아웃풋의 감소폭이 줄어든 결과와도 일치하는 결과이다.

도 6을 통해 알 수 있는 또 한가지 특징은, 1차 항체의 결합 효율이 농도에만 의존하는 것이 아니라 항원과 금속나노입자층의 결합 정도에 영향을 받는다는 것이다. 모든 실험에서 항원은 같은 농도로 사용하였기 때문에 이론적으로는 항원과 금속나노입자가 결합하는 양이 모든 경우에 동일하고 균일해야 한다. 그러나 10 nm, 20 nm 두께를 지니는 인듐 나노입자층은 항원의 결합 효율이 10 전후임에 비해 5 nm, 40 nm 두께를 지니는 인듐 나노입자층은 항원의 결합 효율이 약 3 또는 6으로 현저히 낮았다. 그리고 이러한 항원과 금속나노입자층의 결합 효율은 이후 1차 및 2차 항체의 결합 효율에도 영향을 미침을 알 수 있다.

또한 도 7은, 감마-인터페론 항원과의 결합 효율의 최적조건을 확인 하기 위해 1차 항체의 농도와 상관없이 각 두께의 인듐 나노입자층과 단백질의 결합 효율을 나타낸다. 이는 도 6의 결합 효율을 두께별로 평균낸 결과이다. 10 nm, 20nm 두께를 지니는 인듐 나노입자층의 경우 결합 효율이 10~12의 높은 수치를 보였으나, 5 nm, 40nm 두께를 지니는 인듐 나노입자층의 경우에는 3~6 정도의 낮은 효율을 보였다. 이러한 현상들이 일어난 이유는 감마-인터페론 단백질의 크기가 10 nm, 20nm 두께를 지니는 인듐 나노입자(직경 70-100 nm, 150-200nm)에 최적 되어있기 때문이다.

따라서 상기 실험 결과를 종합해 볼 때 인듐 나노입자층과 항원의 친밀도는 인듐 나노입자의 직경 및 나노입자층의 두께에 의존하는 것으로 볼 수 있다. 이러한 사항을 고려해보면, 본 실험 결과 10 nm, 20nm 두께를 지니는 인듐 나노입자의 직경은 감마-인터페론 항원과 결합하기에 적합하며, 이와 같은 이유로 다른 5 nm, 40nm 두께를 지니는 인듐 나노입자 직경보다 1차 항체와 좋은 결합 효율을 나타내는 것으로 보인다.

결과적으로 실시예 2 및 3의 결과들은 본 발명에 따른 바이오칩이 다양한 농도 범위에서 항원-항체 상호작용을 감지 해낼 수 있음을 보여주며, 특히 1 fg/ml 농도까지 감지할 수 있는 민감도 높은 바이오칩임을 보여준다. 뿐만 아니라 기판 위에 형성되는 금속나노입자층의 두께가 약 10~20 nm 인 경우에 가장 민감하게 항원-항체 상호작용을 분석할 수 있음을 알게 해 준다.

실시예 4: 형태학적인 분석

4-1: FE - SEM 분석

단백질이 인듐 나노입자층 표면에 결합할 때 나노 크기의 표면에서 여러 현상들이 일어날 것으로 예상하고, 이를 확인 하기 위하여 Field Emission Scanning Electron Microscope (FE-SEM; JEOL-ISM-7500F) 로 인듐 나노입자층에 단백질을 처리한 전후 과정을 관찰하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, 항원을 처리하기 전의 금속나노입자층(Bare sub)은 대부분 균일한 입자를 형성하고 있는 반면, 항원 처리 후 1차 항체를 각각 ng/ml (Sub/Ag-Ab(ng)), μg/ml (Sub/Ag-Ab(μg))으로 처리한 후에는 금속나노입자들이 서로 연결되어 큰 입자를 형성하고 있음을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 균일하고 부드러운 표면으로 이루어진 금속나노입자층이 항원-항체 상호작용으로 인해 거친 표면으로 바뀐 것을 알 수 있다. 특히 금속나노입자층이 10nm, 20nm 두께인 구간에서 가장 큰 변화가 나타났으며, 이는 앞서 CMOS 이미지 센서로 실험한 여러 결과들과도 동일한 결과이다.

4-2: AFM 분석

Bio-Atomic Forece Microscope (AFM; Nanowizard II, JPK instrument)를 이용하여 단백질이 인듐 나노입자층에 (모든 기질의 2 x 2 um 넓이를 분석) 흡착할 시의 표면 거칠기를 관찰하였다.

도 9에 나타난 바와 같이, 항원을 처리하기 전의 금속나노입자층(Bare sub)은 대부분 균일한 입자를 형성하고 있는 반면, 항원 처리 후 1차 항체를 각각 ng/ml (Sub/Ag-Ab(ng)), μg/ml (Sub/Ag-Ab(μg))으로 처리한 후에는 금속나노입자들이 서로 연결되어 큰 입자를 형성하고 있음을 확인할 수 있었다. 특히 금속나노입자층이 10nm, 20nm 두께인 구간에서 가장 큰 변화가 나타났으며, 이는 앞서 실시예 4-1의 결과와도 일치하는 결과이다.

4-3: RMS 측정

인듐 나노입자층에 항원, 1차 항체 및 2차 항체를 첨가한 후의 표면 거칠기 값(RMS)을 측정하였다.

그 결과 하기 표 1에서 보는 것과 같이, 거칠기 값은 항원, 1차 항체 및 2차 항체를 차례로 첨가할수록 커졌으며, 특히 10 nm, 20nm 두께의 인듐 나노입자층에서 항원-항체 상호작용으로 인한 거칠기 차이가 확연히 드러났다.

기판	거칠기 값 RMS Rq (nm)
	InNP 기판 두께
	5nm	10nm	20nm	40nm
InNP	2.74	4.25	8.13	18.96
InNP/Ag	2.91	5.2	9.08	19.2
InNP/Ag/1°Ab
-μg/ml	3.52	7.09	11.72	19.91
-ng/ml	3.25	6.82	10.58	19.72
-pg/ml	3.11	6.19	10.09	19.53
-fg/ml	2.98	5.43	9.59	19.4
InNP/Ag/1°Ab/2°Ab
-μg/ml	3.6	7.57	12.17	20.23
-ng/ml	3.34	6.98	11.15	19.96
-pg/ml	3.26	6.49	10.86	19.68
-fg/ml	3.21	6.16	10.16	19.57

비교예 1: 형광현미경 분석

감마-인터페론 1차 항체 및 FITC 컨쥬게이션된 염소 항-글로불린 2차 항체를 처리한 인듐 나노입자-항원 기질의 형광성 강도를 측정하기 위하여 형광현미경을 이용하여 실험하였다.

도 10에 나타난 바와 같이, 1차 항체의 농도가 감소할수록 형광 강도 또한 같이 감소하였다. 그러나 1차 항체의 농도가 pg/ml 인 경우 형광이 거의 검출되지 않았으며, fg/ml 농도에서는 형광이 전혀 검출되지 않았다.

10: 셀 어레이 기판 20: 금속나노입자층
30: 유전층 40: 충전층
50: 분석대상 물질
100: 셀 어레이 200: CMOS 이미지 센서
210: CMOS 센서 렌즈 220: 광다이오드
300: 광원

Claims

기판, 기판 위에 부착된 금속나노입자층 및 각 셀 내의 금속나노입자층 위에 부착된 유전층(dielectric layer)을 포함하는 셀 어레이; 및
CMOS 이미지 센서;를 포함하는 바이오칩.
제1항에 있어서,
상기 셀 어레이는 유전층이 없는 금속나노입자층 위에 부착된 충전층을 추가로 포함하는 바이오칩.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 금속나노입자층은 인듐(indium) 또는 금(gold) 나노입자층인 바이오칩.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 유전층은 DNA, RNA, 단백질, 효소, 항원, 항체, 펩타이드, 탄수화물 및 지질로 이루어진 군에서 선택되는 바이오물질로 이루어진 층인 바이오칩.
제2항에 있어서,
상기 충전층은 금속단백질로 이루어진 바이오칩.
제5항에 있어서,
상기 금속단백질은 알돌라아제(aldolase)인 바이오칩.
제1항에 있어서,
상기 금속나노입자층은 두께가 5~30 nm 인 바이오칩.
제1항에 있어서,
상기 금속나노입자는 직경이 60~300 nm 인 바이오칩.