KR20110105428A - 상황버섯 발효산물을 유효성분으로 함유하는 골손실 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 골다공증 치료 및 예방에 관한 것으로, 구체적으로는 상황버섯 및 상황버섯 발효산물을 포함하는 골손실 예방용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 파골세포의 분화의 중요한 지표인 타타르산염내성 산성인산화 효소 (tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)의 활성을 저해하여 뼈의 흡수를 억제하여 골다공증 치료 또는 예방에 효과적으로 이용될 수 있는 기능성 식품의 원료가 될 수 있다.
[색인어]
상황버섯, 한방발효, 골다공증, 파골세포, 타타르산염 내성 산성인산화 효소
본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 파골세포의 분화의 중요한 지표인 타타르산염내성 산성인산화 효소 (tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)의 활성을 저해하여 뼈의 흡수를 억제하여 골다공증 치료 또는 예방에 효과적으로 이용될 수 있는 기능성 식품의 원료가 될 수 있다.
[색인어]
상황버섯, 한방발효, 골다공증, 파골세포, 타타르산염 내성 산성인산화 효소
Description
본 발명은 상황버섯 균사체 배양산물을 이용한 골손실 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
우리 몸의 골격계를 유지하는 가장 단단한 조직인 뼈는 중요한 장기를 보호하며, 조혈모세포를 저장하여 혈액세포들을 공급하는 신체 내 면역체계의 중요한 조직이다. 뼈는 신체내에서 계속해서 remodeling이 이루어지는 매우 동적인 상태를 유지하고 있는데, 뼈를 만드는 조골세포 (osteoblast)와 뼈를 흡수하는 파골세포 (osteoclast)의 균형 속에서 이루어진다. 그러나 이들 사이의 균형이 깨지면 골질환을 유발하게 되는데, 특히 파골세포의 활성화는 뼈를 약화시키며 이는 많은 골질환과 밀접한 관계가 있다.
대표적인 골소실 질환 중의 하나인 골다공증 (osteoporosis) 은 폐경 및 노화에 따른 성 호르몬의 변화로 파골세포의 활성이 높아져 정상적인 뼈의 리모델링 과정이 깨지게 되어 발병하게 되며, 특히 폐경기 이후 여성들에게서 빈발한다. 이외에도 갑상선 기능 항진, 부갑상선 기능 항진, 만성 신부전, 장기간 부신피질 호르몬 투여 등의 다양한 요인에 의하여 발생한다.
이외에도 파골세포의 활성화에 의해 유발되는 골질환들로는 관절염, 치주질환, 골전이암 등이 있다. 현재 골다공증 치료제는 년 평균 13％의 성장률을 나타내면서 2009년도에는 93억 달러의 규모에 이를 것으로 추정된다.
치료제 뿐만 아니라 골다공증에 관련된 건강식품들을 포함하여 골다공증의 세계시장 규모는 2012년에는 290억불에 이를 것으로 전망하고 있다. 그 외에 관절염, 치주질환, 골전이암 등에 관련된 치료제 시장을 합친다면 골질환 관련 세계시장 규모는 갈수록 그 규모가 커지고 있는 상황이라고 볼 수 있다.
골다공증은 연령이 많아지게 됨에 따라 자연적으로 나타나지만, 특히 여성의 경우 폐경기 등 호르몬 분비의 이상에 의해서도 매우 심화된다. 남성의 경우도 여성보다는 덜하나 노화와 함께 대부분 골다공증이 생기게 되며 질병이나 면역계통의 약화를 통하여도 젊은층에서도 나타나는 경우가 있다. 따라서, 골다공증 치료제 개발및 식품소재 개발이 매우 필요한 실정이다.
현재 골다공증 치료제로 사용되고 있는 비스포스포네이드(bisposphonate)계열의 약제들은 사용의 번거로움과 낮은 약효로 인해 사용에 많은 제한이 따르고 있다. 흡수율이 1-5％로 낮아서 복용 방법이 까다로우며, 식도 및 위장, 관에 궤양을 유발하는 부작용의 경우가 많다. 이와 같이 현재 개발, 판매되고 있는 골질환 치료 약물의 경우 정도의 차이는 있으나 대부분 부작용을 갖고 있다. 따라서 식품 등 천연소재로부터 탐색이 절실한 실정이다.
활성이 나타난 상황버섯은 소나무비늘버섯과의 진흙버섯속(Phellinus)에 속하며 주로 뽕나무와 활엽수의 줄기에 자생한다. 일반명칭은 목질 진흙버섯(Phellimus linteus)이라고 하는데 초기에는 노란 진흙덩이가 뭉친 것 같은 형태로 유지된다. 상황버섯은 소화기계통의 암인 위암, 식도암, 십이지장암, 결장암, 직장암을 비롯한 간암 수술 후 화학요법을 병행할 때 면역기능을 증강시키며, 자궁출혈 및 대하, 월경불순, 장출혈, 오장기능을 활성화 시키고 해독작용을 하는 것으로 알려져 있으며, 특히 상황버섯에서 추출된 다당체의 항종양작용에 대한 기작은 확실히 밝혀지지 않았으나, 이들은 주로 대식세포나 보체시스템 등의 면역체계를 활성화 시켜 항종양 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다. 2003년 3월 식품의약품 안정청 에서 식용버섯으로 허가됨에 따라 이를 이용한 기능성 식품 및 소재로 주목되고 있음
한편, 골손실 예방을 위한 다양한 조성물이 개발되고 있으나, 상황버섯 발효액을 이용한 골손실 예방을 위한 조성물에 대해서는 아직까지 제시된바 없다.
[문헌 1] Boyle, WJ. Osteoclast differentiation and activation. Nature 2003 423:337-342.
[문헌 2] Dong Sun Lee. Effects of the dietary mixture of eucommia ulmoides oliver on osteoporosis. Korean J. Biotechnol. Biol. 2001 16: 614-619
[문헌 3] Lee Hyo-Jung. Inhibition effects of natural products on osteoclast differentiation. Korean J. Food Sci. Technol. 2005 37: 997-1004)
본 발명의 목적은 골 흡수 저해 작용을 나타내는 상황버섯 발효물을 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물을 배양하는 방법과 효과를 제공한다.
이에 본 발명은 상황버섯 배양액을 이용한 골손실 예방을 위한 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 설탕 1.0∼3.0％(w/v) 및 대두분 0.1∼1.0％(w/v)을 함유하는 배지에 상황버섯 (본연구진 보유 미국 NCBI에서 새로운 Phellinus linteus(수여번호: AF357604)인정)을 접종하여 배양하고 수득한 발효액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 골손실 예방을 위한 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명의 과제 해결 수단에 대해 상세히 설명하고자 한다.
본 발명은 효율적으로 골손실 예방 효과가 있는 발효액을 제조하기 위해 우선 상황버섯을 배양하기 위한 배지의 조성을 확립하였는데, 탄소원으로 설탕 1.0∼3.0％(w/v), 질소원으로 대두분 0.1∼1.0％(w/v)를 배지에 첨가하였을 때, 상황버섯의 균체 증식 속도나 균체량이 우수한 것을 본 발명의 실험예로부터 확인할 수 있었으며 또한 상황버섯 발효 추출물의 파골세포 저해 효과를 확인하였다.
1) 마우스 골수에서 파골세포 분리
6주령 ICR 마우스의 경추를 탈골하고 무균적으로 마우스의 대퇴골과 경골을 적출하여 근육 등 이물질을 제거하였다. 1mm 주사기를 이용하여 골내에 α-최소 기본 배지 (α-minimum essential medium, α-MEM)를 분주하여 골수세포를 획득하였다. 획득된 골수세포는 파이펫을 이용하여 뭉쳐진 세포들을 각각 하나의 세포로 떨어지게 한 후에 PBS (phosphate buffered saline) 완충용액을 첨가한 후 1,200 rpm에서 약 5분간 원심분리 하였다.
상등액을 제거하고 트리스-염산 완충 용액 (0.9％ 염화암모늄, pH 7.5) 10 mL 첨가하여 상온에서 5분간 방치하여 적혈구를 파괴하였다. 1,200 rpm에서 약 5분간 원심분리하여 결과적으로 골수세포만을 얻었다.
2) 상황버섯 발효액 시료의 준비
상기 실시예 1에서 제조한 발효액을 10 mg/mL의 농도로 증류수에 녹인 후에 10％ FBS가 첨가된 α-MEM 분화배지 (150ug/mL TRANCE, 60ug/mL M-CSF)로 20, 5, 2 ug/mL로 각각 희석하여 준비하였다.
3) 파골세포 형성 저해 실험
골수세포에 M-CSF를 20 ng/mL로 넣어준 후, 2일 동안 배양한 세포를 96-well 플레이트에 각 well당 2×104 cells/200 uL로 분주하고 TRANCE과 상황버섯 발효액 시료를 처리하여 3일간 배양한다. 파골세포의 분화 표지인자인 TRAP 효소 활성을 측정하기 위하여 배지를 제거하여 PBS로 세척한 다음 substrate solution (1.36 mg/mL 4-nitrophenyl phosphate disodium salt, 10 mM tartrate, 50 mM citrate buffer buffer)을 100 uL씩 분주하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 새로운 plate에 50 uL씩 분주하고 0.1 N NaOH로 반응을 중지시켜 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 성숙한 파골세포의 수를 측정하기 위하여 TRANCE과 상황버섯 발효액 시료를 처리하여 3일간 배양한 플레이트에 10％ 포르말린을 첨가하여 고정한 후에 PBS 용액으로 수세 후 건조하였다. 여기에 TRAP 염색액을 100 uL 첨가한 후 상온에서 20분간 방치하였다. 염색액을 버리고 PBS로 수세한 후 염색된 5개 이상의 다핵을 가진 분화된 파골세포의 수를 측정하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 골손실 예방 조성물은 파골세포 형성저해에 직접적으로 관련 있는 타타르산염 내성 산성인산화 효소 활성 을 증가시킴으로써 골손실 예방효과를 보여준다. 이에, 본 발명자들은 골다공증을 예방 및 치료할 수 있는 식품용 천연신소재를 탐색하여 상황버섯 발효물을 포함하는 골손실 방지 효과가 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
도 1은 상황버섯(Phellinus linteus) 고체배지(포테이토덱스트로스아가) 사진이다.
도 2는 상황버섯 발효액이 파골세포 저해 효과를 나타내는 타타르산염 내성 산성인산화 효소 염색 사진이다.
도 2는 상황버섯 발효액이 파골세포 저해 효과를 나타내는 타타르산염 내성 산성인산화 효소 염색 사진이다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예]
실시예 1: 상황버섯의 발효를 위한 탄소원 및 질소원의 최적 첨가량을 확립하였다.
탄소원, 질소원의 첨가량 확립
배지에 탄소원으로 설탕 0.5％(w/v), 1.0％(w/v), 1.5％(w/v), 2.0％(w/v), 2.5％(w/v), 3.0％(w/v)를, 질소원으로 대두분을 0.01％(w/v), 0.1％(w/v), 0.5％(w/v), 1.0％(w/v), 2.0％(w/v)을 사용하였다. '7L-Jar fermentor'에서 5L를 'working volumn'으로 하여 상기 농도의 설탕 및 대두분을 각각 조합하여 배지를 조성한 후 발효조에 각각 넣고, 121℃에서 40분간 멸균하고, 미리 배양한 상황버섯을 1％의 농도로 첨가하여, 통기량 1vvm, 150rpm으로 배양하면서 시간에 따라 시료를 채취하여 최적 함량을 결정하였다.
그 결과, 탄소원으로 설탕 1.0∼3.0％(w/v), 질소원으로 대두분 0.1∼1.0％(w/v)를 넣어준 배지에서 균체의 증식 속도나 균체량이 가장 우수함을 확인할 수 있었다. 본 발효물을 건조 시킨 후 조성물로 사용하였다.
실시예 2: 상황버섯 발효 추출물의 파골세포 저해 효과
1) 마우스 골수에서 파골세포 분리
6주령 ICR 마우스의 경추를 탈골하고 무균적으로 마우스의 대퇴골과 경골을 적출하여 근육 등 이물질을 제거하였다. 1mm 주사기를 이용하여 골내에 α-최소 기본 배지 (α-minimum essential medium, α-MEM)를 분주하여 골수세포를 획득하였다. 획득된 골수세포는 파이펫을 이용하여 뭉쳐진 세포들을 각각 하나의 세포로 떨어지게 한 후에 PBS (phosphate buffered saline) 완충용액을 첨가한 후 1,200 rpm에서 약 5분간 원심분리 하였다.
상등액을 제거하고 트리스-염산 완충 용액 (0.9％ 염화암모늄, pH 7.5) 10 mL 첨가하여 상온에서 5분간 방치하여 적혈구를 파괴하였다. 1,200 rpm에서 약 5분간 원심분리하여 결과적으로 골수세포만을 얻었다.
2) 상황버섯 발효액 시료의 준비
상기 실시예 1에서 제조한 발효액을 10 mg/mL의 농도로 증류수에 녹인 후에 10％ FBS가 첨가된 α-MEM 분화배지 (150ug/mL TRANCE, 60ug/mL M-CSF)로 20, 5, 2 ug/mL로 각각 희석하여 준비하였다.
3) 파골세포 형성 저해 실험
골수세포에 M-CSF를 20 ng/mL로 넣어준 후, 2일 동안 배양한 세포를 96-well 플레이트에 각 well당 2×104 cells/200 uL로 분주하고 TRANCE과 상황버섯 발효액 시료를 처리하여 3일간 배양한다. 파골세포의 분화 표지인자인 TRAP 효소 활성을 측정하기 위하여 배지를 제거하여 PBS로 세척한 다음 substrate solution (1.36 mg/mL 4-nitrophenyl phosphate disodium salt, 10 mM tartrate, 50 mM citrate buffer buffer)을 100 uL씩 분주하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 새로운 plate에 50 uL씩 분주하고 0.1 N NaOH로 반응을 중지시켜 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 성숙한 파골세포의 수를 측정하기 위하여 TRANCE과 상황버섯 발효액 시료를 처리하여 3일간 배양한 플레이트에 10％ 포르말린을 첨가하여 고정한 후에 PBS 용액으로 수세 후 건조하였다. 여기에 TRAP 염색액을 100 uL 첨가한 후 상온에서 20분간 방치하였다. 염색액을 버리고 PBS로 수세한 후 염색된 5개 이상의 다핵을 가진 분화된 파골세포의 수를 측정하였다.
4) 결과 분석
상기 4)에서 측정된 성숙 분화된 파골세포의 수를 대조군과 비교하여 나타내었으며, 각 농도별로 3회 이상 파골세포 저해 실험을 반복하여 그 결과를 표1에 제시하였다.
표 1 상황버섯 발효액의 파골세포 형성 저해 효과
상기 표1에서 보는 바와 같이 상황버섯 발효액 추출물은 20, 5, 2 ug/mL의 농도에서 파골세포의 분화를 저해함을 확인하였다. 이는 골흡수를 담당하는 파골세포의 형성을 억제하여 골다공증의 치료와 예방에 효과가 있을 것으로 판단되었다.
실시예 3: 상황버섯 발효 추출물의 파골세포 독성 효과
1) 상황버섯 발효액 시료의 파골세포에 대한 세포독성 측정
상기 실시예 3에서 설명된 바와 같이 파골세포와 상황버섯 발효액 시료를 준비하고 세포독성을 측정하기 위해
3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) 실험을 실시하였다. 파골세포에 M-CSF를 20 ng/mL으로 넣어준 후, 2일 동안 배양한 세포를 96-well 플레이트에 각 well당 2×104 cells/200 uL 로 분주하고 24시간 배양 후 배지를 제거한다. 여기에 농도 별 상황버섯 발효액 추출물 혼합된 α - MEM 배지 200 uL를 각 well에 첨가하여 48 시간 배양한다. MTT (5 mg/mL) 용액 10 uL를 각 well에 첨가하고 5시간 동안 배양한다. 배양 후에 상등액을 제거하고 각 well에 100 uL의 DMSO를 첨가하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2) 결과분석
상기 1)에서 측정된 세포독성은 대조군의 흡광도에 대한 시료의 흡광도를 백분율로 나타내었다. 각 농도별로 3회 이상 파골세포에 대한 독성 실험을 반복하여 그 결과를 표2에 제시하였다.
표 2 상황버섯 발효액의 파골세포 독성 효과
상기 표2에서 보는 바와 같이 상황버섯 발효액 추출물은 20, 5, 2 ug/mL의 농도에서 파골세포에 독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 상기 표1과 2의 결과에서 상황버섯 발효액 추출물은 파골세포에 독성을 나타내지 않고 단지 골흡수를 담당하는 파골세포의 형성을 억제하여 골다공증의 치료와 예방에 효과가 있을 것으로 판단되었다.
Claims (2)
- 설탕 1.0∼3.0％(w/v) 및 대두분 0.1∼1.0％(w/v)을 함유하는 배지에 상황버섯을 접종하여 배양하여 수득한 발효액 1∼20 중량％ 함유하는 것을 특징으로 하는 실시예 2에 나타난 골손실 예방 효과를 가진 건조 식품 조성물
- 청구항 1에 의해서 얻어진 소재를 이용한 골손실 예방 음료
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|---|---|---|---|
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