KR20110099667A

KR20110099667A - 베리 칵테일 조성물을 함유하는 화장료의 제조방법

Info

Publication number: KR20110099667A
Application number: KR1020110072484A
Authority: KR
Inventors: 이진욱; 김종일
Original assignee: 해브앤비(주)
Priority date: 2011-07-21
Filing date: 2011-07-21
Publication date: 2011-09-08
Also published as: KR101073107B1

Abstract

본 발명은 베리 칵테일 조성물을 함유하는 화장료의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아사이베리(acaiberry), 블루베리(blueberry) 및 고지베리(gojiberry)를 주요성분으로 함유하는 베리 칵테일 조성물을 제조한 후 이를 화장료에 적용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 화장료는 종래의 화장료 조성물에 비하여 주름개선 및 우수한 미백효과를 나타내고 피부자극 등 부작용이 거의 없으며, 자외선 등의 자극 또는 화장품 사용에 따른 피부자극을 예방할 수 있는 효능이 있어 다양한 피부 개선용 화장료에 사용될 수 있다.

Description

베리 칵테일 조성물을 함유하는 화장료의 제조방법{manufacturing method for cosmetics containing berry cocktail composition}

본 발명은 베리 칵테일 조성물을 함유하는 화장료의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아사이베리(acaiberry), 블루베리(blueberry) 및 고지베리(gojiberry)를 주요성분으로 함유하는 베리 칵테일 조성물을 제조한 후 이를 화장료에 적용하는 방법에 관한 것이다.

피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 과도한 자외선이나 오염물질 등에 노출되면 홍반, 부종, 가려움 등의 피부자극 및 염증반응이 유발된다. 이러한 피부 트러블은 미관상 문제가 될 뿐만 아니라, 염증 반응과정에서 생성되는 물질들이 부수적으로 피부의 색소 침착을 일으키고, 피부 탄력섬유의 붕괴를 촉진시켜 피부 주름의 증가에까지 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

한편, 현대 사회에서는 남녀 노소를 불문하고 많은 사람들이 화장품을 사용하고 있는데, 일부 민감성 피부의 경우, 화장품의 사용으로 인해 피부자극 및 염증이 유발되기도 한다. 특히, 화장료 성분 중 각질제거, 피부주름 개선 및 예방 등을 목적으로 하는 기능성 제품의 원료로 사용되는 레티노이드류나 과일산 및 제형화를 위해 첨가되는 계면활성제들이 피부에 트러블을 일으키는 주된 물질들로서, 이들 물질을 최대한의 효능을 나타낼 수 있는 농도로 사용하는 데에는 많은 제한이 있었다.

따라서, 각종 스트레스원에 의한 피부 자극 및 염증을 감소시키고, 화장품 사용으로 인한 부작용을 줄이기 위해서는, 항염증 및 피부자극 완화 효능이 있는 물질을 개발하는 것이 절실히 요구된다. 이에, 피부 자극 및 염증의 생성을 줄일 수 있는 방법에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.

한편, 베리류는 수분, 탄수화물, 단백질, 그 밖의 다량의 식이섬유소와 칼륨, 망간, 철분으로 이루어져 있으며, 달고 신맛이 강하며 붉은빛의 갈색을 띤다. 베리류 등이 갖고 있는 특유한 색의 붉은색과 푸른빛을 띄는 페놀안토시아닌, 기타 플라보노이드와 같은 식물성영양소(phytochemical) 성분은 항암, 항염증, 항산화 작용을 한다고 보고되어 있다. 이러한 베리류들은 슈퍼과일(Super fruit)로 분류되고 피부세포의 건강을 증진하는 식물성영양소, 비타민 및 미네랄 성분, 염증을 치료하는 플라보노이드 성분과 피부세포의 성장을 돕는 필수 아미노산 및 콜라겐을 유지시키는 식물성스테롤(phytosterol)을 함유하고 있어 각각의 유효성분에 따른 피부 개선에 도움을 주는 효과가 있다.

아사이베리(acaiberry)는 열대나무 아사이에서 수확하는 매우 강력한 항산화 과실로서, 아사이베리에는 필수지방산인 오메가3, 오메가6(리놀산)과 오메가9(올레인산)가 다량 함유되어 있으며, 또한 콜레스테롤 레벨을 조절하는데 도움을 주고, 비타민과 미네랄 등 각종 식물성 영양분이 고루 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

또한, 아사이베리는 눈의 피로를 풀어주고 시력을 향상시켜 망막염을 회복하는데 도움을 줄 뿐만 아니라 저혈당지수의 식품으로 당뇨환자에게 유익한 영양식품이며, 특히 노화방지와 피부미용에 탁월한 효과를 발휘하는 항산화 물질인 안토시아닌의 함유량이 지금까지 발견된 지구상의 식품 중 가장 높은 것으로 밝혀져 있다. 적포도주 또는 자주색 포도에 비해 33배, 블루베리의 6배의 안토시아닌를 함유하고 있으며 강력한 항산화작용으로 심장질환과 뇌졸중의 위험을 줄여주고, 아스피린보다 10배나 강한 소염작용을 한다는 연구결과도 보고되고 있다.

블루베리(blueberry)는 스트로베리, 블랙베리, 빌베리, 크란베리 등과 함께 베리(berry)류에 속하는 과실로서 미국, 유럽 등지에서 광범위하게 재배되며 8 내지 9월경에 집중적으로 수확되고 있다. 블루베리는 비타민 A, 비타민 C, 나이아신, 안토시아닌(Anthocyanin) 색소, 칼륨, 칼슘 등 인체의 생리기능상 필요한 유효물질들을 다량 함유하고 있으며, 특히 안토시아닌 색소를 다른 과일들에 비해 많이 함유하고 있는 것으로 알려져 있다.

안토시아닌은 보통 배당체(配糖體, glycosides)로서 존재하며, 주로 여러 과일의 특유한 색깔을 나타내는데 기여하는 수용성 색소이다. 안토시아닌 색소의 생리작용에 대한 연구는 수십 년 전부터 유럽 및 미국 등지에서 활발하게 연구되어 발표되었다. 예를들어, 1964년 최초의 임상실험을 통해 망막적응곡선의 현저한 개선과 희미한 빛속에서의 시력 개선효과가 확인되었으며, 그 후 1976년에는 이탈리아에서 의약품으로의 허가를 취득하여 현재 이탈리아, 프랑스 등의 유럽과 일본, 한국 등 아시아에서 의약품으로 이용되고 있다. 또한, 미국에서는 십여년 전부터 눈의 영양보조식품으로서 널리 사용되고 있다.

인체 안구내부와 망막에는 시각에 관여하는 로돕신(Rhodopsin)이라는 색소체가 있는데, 이 로돕신은 빛의 자극에 의하여 분해되지만 순간적으로 재합성되어 그 연소작용이 뇌의 시각영역에 전달됨으로써 물체가 보이게 된다. 그런데, 블루베리의 안토시아닌 색소는 이러한 로돕신의 재합성 과정을 활성화시키는 기능을 갖고 있는 것으로 연구결과 밝혀졌으며, 안토시아닌 색소를 1일 적정량(120 내지 250mg) 섭취함에 따라 눈의 피로가 덜어지고 시야가 훨씬 넓어지며 어둠에서 눈이 익숙해지는 시간이 대단히 빨라지는 것으로 보고되었다.

블루베리는 앞에서 설명한 시력개선기능 이외에도 생체대사에 유효한 여러가지 기능, 예를들어 바이러스나 세균을 죽이는 물질을 포함함으로써 항염증기능, 강한 항산화기능, 모세혈관을 강하게 하는 혈관보호기능 등을 갖고 있는 것으로 밝혀졌다.

고지베리(gojiberry)는 매우 강력한 항노화제 식품으로 불린다. 고지베리는 ORAC(Oxygen Radical Absorbance Capacity) 크기가 250 단위인 매우 큰 항산화제로서 산소의 자유 라디칼을 흡수하는 능력이 뛰어나다. 통상 ORAC 3,000이 기준 단위로 평가된다. 아울러, 고지베리는 많은 비타민 C, 베타카로틴, 철 성분을 갖고 있으며, 기타 다양한 미네랄 성분, 필수 아미노산, 비타민, 지방산 등을 함유하고 있다.

이에, 본 발명자들은 다양한 베리 성분 중 아사이베리, 블루베리 및 고지베리로 이루어진 베리 칵테일을 제조하고, 이들이 항산화, 티로시나아제 활성 억제, 멜라닌 생성 억제, 엘라스틴 합성 및 엘라스테이즈 활성저해효과가 뛰어나 다양한 화장료에 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 베리 칵테일을 주요성분으로 하여 항산화 성분을 함유하고 주름개선 및 피부 미백효과가 뛰어난 베리 칵테일 조성물을 제조한 다음, 이를 화장료에 적용하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 70% 발효주정 100중량부에 아사이베리 15~25중량부, 블루베리 5~15중량부 및 고지베리 5~15중량부를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물을 상온에서 3일간 숙성시키는 단계; 상기 숙성된 혼합물을 5~10㎛ 투과사이즈를 갖는 여과지로 여과하여 추출액을 제조하는 단계; 상기 추출액을 농축한 후 건조시켜 베리 칵테일 조성물을 제조하는 단계; 및 상기 베리 칵테일 조성물을 화장품 제형에 0.5 내지 5중량% 함유시키는 단계;를 포함하는, 베리 칵테일 조성물을 함유하는 화장료의 제조방법을 제공한다.

이때, 상기 베리 칵테일 조성물은 상기 화장품 제형에 리포좀 형태로 함유되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 베리 칵테일 조성물을 함유하는 화장료는 종래의 화장료 조성물에 비하여 주름개선 및 우수한 미백효과를 나타내고 피부자극 등 부작용이 거의 없으며, 자외선 등의 자극 또는 화장품 사용에 따른 피부자극을 예방할 수 있는 효능이 있어 다양한 피부 개선용 화장료에 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용되는 베리 칵테일은 아사이베리, 블루베리 및 고지베리 성분으로 구성되는데, 아사이베리는 Euterpe Oleracea Fruit Extract로서 가장 강력한 항산화 효과를 나타내고, 블루베리는 Vaccinium Angustifolium (Blueberry) Fruit Extract로서 항염증 효과를 갖고 있으며, 고지베리는 Lycium Chinense Fruit Extract로서 식물성영양소(Phytonutrient)를 공급하는 기능을 한다.

항산화 능력 수치(Oxygen Radical Absorbance Capacity : ORAC)에 대해 미국 농무성에서는 하루에 3,000~4,000 ORAC를 권장하고 있는데, 신체 중 성인 평균 체중의 16%를 피부가 차지하고 있어 피부에 480~800 ORAC의 영양성분이 공급되는 것이 바람직하며, 그 중 인체의 피부면적 중 9%를 머리와 목이 차지하기 때문에 43.2~72 ORAC가 얼굴부위에 공급될 필요가 있다.

본 발명에 사용되는 베리류의 ORAC 함량을 하기 표 1에 나타내었다.

Fruits	ORAC unit per gram
Acai Berry	3,800
Goji Berry	250
Blue Berry	24

먼저, 70% 발효주정 100중량부에 아사이베리 15~25중량부, 블루베리 5~15중량부 및 고지베리 5~15중량부를 혼합하여 혼합물을 제조하며, 바람직하게는 70% 발효주정 100중량부에 아사이베리 20중량부, 블루베리 10중량부 및 고지베리 10중량부를 혼합하는 것이 좀더 바람직하다.

다음은 상기 혼합물을 상온에서 3일간 숙성시킨 후 상기 숙성된 혼합물을 5~10㎛ 투과사이즈를 갖는 여과지로 여과하여 추출액을 제조한다.

다음은 상기 추출액을 농축시킨 후 건조시켜 베리 칵테일 조성물을 제조한다.

상기 농축은 60℃ 이하에서 감압 농축하는 것이 바람직하며, 45~60℃인 것이 더욱 바람직하다.

또한, 상기 건조는 감압 건조하는 것이 바람직하다.

상기와 같이 제조된 베리 칵테일 조성물에는 약 2000 ORAC unit per gram이 존재하며, 따라서 화장품 제형에 0.5 내지 5중량% 첨가하여 얼굴부위에 사용하였을 때 하루 권장량을 충분히 만족할 수 있을 것으로 판단되며, 2 내지 4중량% 첨가되는 것이 좀더 바람직하다.

또한, 상기 베리 칵테일 조성물은 화장품 제형에 리포좀(liposome) 형태로 함유되는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 시험예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.

<실시예 1~6> 베리 칵테일의 제조

아사이베리, 블루베리, 고지베리를 하기 표 2의 함량으로 혼합한 다음 70% 발효주정 1리터에 넣어 상온에서 3일간 혼합추출을 실시하였다. 추출한 후 8㎛ 투과사이즈를 갖는 여과지로 여과하였다. 상기 여과된 추출액을 60℃ 이하에서 감압 농축한 후 감압건조기를 이용하여 완전히 건조시켜 베리 칵테일 조성물 20g을 제조하였다.

	단위	acaiberry	gojiberry	blueberry
실시예 1	g	200	-	-
실시예 2		-	200	-
실시예 3		-	-	200
실시예 4		100	50	50
실시예 5		50	100	50
실시예 6		50	50	100

<실시예 7> 베리 칵테일의 제형 안정화

불안정한 생리활성 물질의 안정한 영양소 전달체 및 수분 전달체로서 Nanofludics Technology를 도입하여 생체막 모델구조의 시스템과 유사성을 이용하여 화학적 결합 없이 생리활성 물질들을 포집할 수 있다. 또한 피부에서 선택적 투과성과 지연성이 우수하여 방출속도 조절 시스템의 특징을 갖는다고 할 수 있다.

이를 위하여, 고압균질기를 이용하여 유화타입의 리포좀을 형성하여 제형의 안정화를 유도하였다.

<시험예 1> 프리라디칼 소거효과

0.2mM 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)메탄올용액 0.5㎖에 상기 실시예 1~6의 베리 칵테일 조성물 각각 1㎖을 첨가하고 섞은 다음 37℃에서 10분간 방치 후 517㎚에서 흡광도를 측정하여 하기 표 3에 나타내었다.

프리라디칼 소거능의 계산식의 하기와 같다.

* 프리라디칼 소거능(%) = ( 1 - 시료첨가구의 흡광도 / 무첨가구의 흡광도 ) × 100

	단위	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5	실시예 6
프리라디칼 소거능	%	72	66	56	84	80	75

상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이 단일성분의 베리류의 경우보다 혼합하였을 경우 프리라디칼 소거능이 우수함을 알 수 있으며, 실시예 4의 경우에 가장 우수하게 나타났다.

다음은 상기 실시예 4의 조성물을 농도를 달리하여 각각의 10% 에탄올용액을 상기와 같은 방법으로 프리라디칼 소거능과 프리라디칼을 50% 감소시키는 농도(SC₅₀)를 측정하여 하기 표 4에 나타내었다.

시료농도(중량%)	0.2	0.4	0.8	1.2	1.6	2.0	3.0
프리라디칼소거능(%)	45	55	80	88	91	95	94
SC₅₀	0.3

상기 표 4에서 알 수 있듯이 시료 2중량% 정도에서 최대능을 나타냈으며 SC₅₀은 0.3중량%로 나타났다. 이것은 다른 어느 물질보다도 우수한 효과가 있는 것이다.

<시험예 2> 이화학성분 분석

1) 폴리페놀화합물 함량

베리 칵테일의 폴리페놀화합물의 함량은 페놀성 물질이 sodium molybdate와 반응하여 청색을 나타내는 현상을 이용한 Folin-Denis법에 따라 약간의 방법을 변형하여 측정하였다. Folin-Ciocalteu's reagent(FCR)은 Fluka Folin-Ciocalteu's phenol reagent를 사용하였다. 폴리페놀화합물의 측정을 위해 증류수 1.5㎖에 FCR 0.1㎖와 sodium carbonate 포화용액 0.2㎖을 첨가한 후 10배 희석한 실시예 4의 베리 칵테일 0.1% 용액을 0.2㎖ 첨가해 총 부피를 2㎖로 하여 실온에서 20분간 방치한 후 3,000rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 이 상등액을 spectrophotometer를 이용해 725㎚에서 흡광도를 측정하였고, gallic acid를 이용하여 얻은 표준곡선으로부터 폴리페놀화합물의 함량을 구하였다. 그 결과를 하기 표 5에 기재하였다.

2) 플라보노이드 함량

실시예 4의 베리 칵테일 0.1% 용액 0.11㎖에 1㎖의 diethylene glycol을 가하여 혼합한 후 1N NaOH 0.01㎖을 첨가하였다. 37℃ 항온 수조에서 1시간 동안 반응시킨 후 spectrophotometer를 이용해 420㎚에서 흡광도를 측정하였고 rutin을 이용하여 얻은 표준곡선으로부터 플라보노이드의 함량을 구하였다. 그 결과를 하기 표 5에 기재하였다.

3) 환원당 함량

환원당에 의하여 3,5-dinitrosalicylic acid(DNS)가 환원되어 생성된 3-amino-5-dinitrosalicylic acid의 흡광도를 측정하여 당을 정량분석하였다. 상기 반응은 알칼리성에서 일어나므로 반응용액을 알칼리성으로 만들어 발색을 증가시키고, 생성된 3-amino-5-dinitrosalicylic acid의 안정화를 위해 DNS 시약에 NaOH, Rochelle salt, phenol 및 Na₂S₂O₅를 첨가하였다. 실시예 4의 베리 칵테일 0.1% 용액 0.5㎖에 DNS 시약 1.5㎖을 가하여 혼합한 후 끓는 물에 5분간 반응시킨 다음 상온으로 냉각시켰다. Spectrophotometer를 이용해 550㎚에서 흡광도를 측정하였고 glucose를 이용하여 얻은 표준곡선으로부터 환원당의 함량을 구하였다. 그 결과를 하기 표 5에 기재하였다.

성분	함량
폴리페놀화합물(㎎/g)	120
플라보노이드(㎎/g)	100
환원당(㎎/g)	650

<시험예 3> 베리 칵테일의 신경교세포주, U373 MG에서 물질 P 자극에 의한 IL-6 생합성 억제 효능 평가

상기 실시예 4에서 제조한 베리 칵테일의 사람의 신경교세포주 U373 MG를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 MEM(Minimum Essential Media, GIBCO BRL, Life Technologues社) 배지로 96-웰 시험 플레이트의 각 웰에 2×10⁴ 개씩 세포를 부착시켜 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후, 인산염완충용액(phosphate buffered saline, PBS) 200㎕로 1회 세척하고, FBS가 함유되지 않은 MEM 배지 200㎕에 평가하고자 실시예 4의 추출물을 하기 표 6에 나타낸 농도 만큼씩 처리하여 5시간 동안 배양시켰다. 배양액 25㎕를 취하여 IL-6 ELISA(Pharmingen社, OptEIA Human IL-6 set 사용)를 통해 물질 P에 의한 IL-6 유리 억제 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. substance P를 처리하지 않은 U373 세포와 substance P를 처리한 U373 세포의 IL-6 생성량 차이를 기준으로 계산하였다.

성분	칵테일 농도(중량%)	IL-6(pg/10⁶ cell)	% 억제율
(-)기질(substance) P + 부형제(vehicle)	-	10.3±23	-
(+)SP(1 μM) + 부형제(vehicle)	-	992.5±46	-
(+)SP(1 μM) + 베리 칵테일	2%	202.6±33	89.6

상기 표 6로부터, 베리 칵테일은 사람의 신경교세포 U373에서 물질 P 자극에 의한 염증 매개 물질인 IL-6의 생합성을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

<시험예 4> 자동산화 억제 효과

본 시험예는 자동산화가 잘 되는 물질인 리놀산을 이용하여 자동산화를 억제하는 정도를 상호 비교한 것이다. 8㎖ 캡튜브에 10mM 리놀산용액 3㎖와 4㎎/㎖로 조정한 실시예 4의 베리 칵테일 시료 0.075㎖를 첨가한 후 4℃에 방치하였다. 상기의 혼합액 0.1㎖를 24시간 후에 75% 에탄올수용액 4.7㎖에 첨가하여 교반한 후, 30% 티오시안산암모늄 용액 0.1㎖와 염화제1철 시약 0.1㎖를 첨가하고 3분간 방치한 후 발색시켜 500㎚에서 흡수파장을 측정, 시료를 넣지 않은 대조군과 비교하여 항산화효과를 백분율로 측정했다. 리놀산 자동산화를 이용한 항산화효과 시험에서 실시예 4에 의해 제조된 베리 칵테일은 항산화효과가 비타민 E(42.3%)에 비해 우수한 항산화효과(44%)를 가진 것으로 나타났다(표 7).

	실시예 4의 베리 칵테일	비타민 E
저해율(%)	54	41.8

<시험예 5> 티로시나제 효소 억제 효과

본 시험예는 실시예 4에 의해 제조된 베리 칵테일의 미백효과를 알아보기 위해 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 기능억제되는 정도를 보고 미백효과를 판단한 것이다. 티로시나제는 생체내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소이다. 본 시험예에서는 이 효소의 기능을 억제하여 티로신이 산화되어 멜라닌이라는 흑색의 고분자를 형성하는 것을 억제하는 정도를 측정하는 방법(Pomerantz S. H., J. Biochem., 24, 161-168 (1996))을 응용해 미백효과로 판정하였다. 상백피추출물(원액, 10, 1, 0.1, 0.01의 증류수에 대한 v/v%), 베리 칵테일(원액, 0.2, 0.05, 0.005, 0.0005의 증류수에 대한 v/v%), 유용성 감초추출물, 코직산, 알부틴, 하이드로퀴논(1, 0.1, 0.01, 0.0001,0.0001의 증류수에 대한 v/v%)을 시료로 사용하여 티로시나제 활성 억제효과를 조사하였다. 티로시나제에 대한 저해활성은 시료 15 ㎕를 마이크로플레이트(96웰)에 넣고, 0.1M 인산완충액(pH 6.86) 150㎕, 1.5mM L-티로신용액 25㎕를 넣은 후, 2,380단위/㎖ 머쉬룸 티로시나제(Sigma, USA)(0.05M 인산완충액, pH 6.86) 7㎖를 첨가하여 30℃에서 10분간 반응시킨 후 마이크로플레이트를 사용하여 490㎚에서 측정하였다. 티로시나제에 대한 저해율(%)은 하기식에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 효소활성 저해율 50%에 달하는 저해물질의 농도이다(표 8).

* 저해율(%)= {[(D-C)-(B-A)]/(D-C)}×100

A : 저해제를 넣은 것의 반응 전 흡광도

B : 저해제를 넣은 것의 반응 후 흡광도

C : 저해제를 넣지 않는 것의 반응 전 흡광도

D : 저해제를 넣지 않는 것의 반응 후 흡광도

티로시나제 활성 억제작용 시험결과 베리 칵테일의 IC₅₀값은 0.1% 이하로 나타났다. 수치상으로 볼 때 다른 물질과 유사한 것으로 나타났으나, 코직산, 하이드로퀴논 등과 같이 순수 정제된 물질이 아니라 추출물임을 감안한다면 우수한 효과를 가지는 것으로 판단된다.

물질	머쉬룸 티로시나제(IC50)
코직산	0.039%
하이드로퀴논	0.008%
알부틴	0.39%
베리 칵테일	0.1% 이하
상백피추출물	10% 이하
감초추출물	0.0015%

<시험예 6> 방성균의 멜라닌 생성 억제 효과

본 시험예는 방선균에 대한 멜라닌 생성 억제작용을 측정한 것으로 사용된 방선균(Strepthomyces bikiniensis NRRL B-1049)은 한국과학기술연구원 부설 유전공학연구소(KCTC)로부터 분양받아 사용하였다. 방선균을 papavizas' VDYA 한천 슬랜트 배지(V-8 쥬스 200㎖, 포도당 2g, 효모추출물 2g, CaCO3 1g 한천 20g, 증류수 800㎖, pH 7.2)에서 2주간 28℃로 배양시킨 포자를 생성시킨 후 멸균수로 포자 현탁액을 만들었다. 0.2%의 효모추출물은 첨가한 ISP No. 7 평판배지에 포자 현탁액 0.2㎖씩을 도포한 후 배지표면에 실시예 4의 시료를 적신 페이퍼 디스크에 시료양을 30㎍/페이퍼 디스크로 도포하고 28℃에서 배양하였다. 48시간 배양 후 생성된 멜라닌 생성 저해환의 크기를 멜라닌생성 저해물질로 알려진 4-하이드록시아니솔을 대조군으로 하여 멜라닌생성 저해여부를 관찰하였다(표 9).

베리 칵테일의 방선균에 대한 멜라닌생성 저해활성은 30mm의 멜라닌 생성저해환을 나타내었다. 이러한 저해활성은 강력한 멜라닌 생성저해제인 p-메톡시페놀과 유사한 매우 우수한 활성을 나타내었다.

물질	방상균 저해 환지름(㎜)
코직산	0
하이드로퀴논	26
알부틴	0
베리 칵테일	30
상백피추출물	11
감초추출물	14
p-메톡시페놀	31
4-하이드록시아니솔	26

<시험예 7> 피부미백 효과

본 시험예는 베리 칵테일의 피부미백효과를 알아보기 위해 실험실수준에서 관찰한 것이다. 본 시험에 사용된 B16멜라노마 세포는 마우스에서 유래한 세포균주이며 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교평가하였다. 본 시험예에 사용된 B16-F1 멜라노마 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양받아 사용하였다. B16-F1 멜라노마 세포의 멜라닌 생합성 저해도 판별은 다음과 같이 행하였다. B16-F1 멜라노마 세포를 5×10³ 세포/㎖의 농도로 10% 소태아혈청을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(Gibco, USA))에 현탁시켰다. 현탁세포 5㎖를 조직배양 플라스크에 넣고 검정 시료를 0.1% 첨가한 후, 5% 이산화탄소-95%공기조건으로 37℃에서 배양하였다. 4일간 배양 후 배양액의 색으로 멜라닌생성 정도를 1차 판별하고, 세포를 인산완충액으로 씻은 후 트립신처리하여 세포를 플라스크로부터 분리하였다. 세포를 튜브에 모은 후 인산완충액으로 씻고, 원심분리하여 튜브 아래쪽에 침전된 멜라닌 생성량을 기존의 미백제로 알려지고 있는 몇개의 시료와 박추출물과의 멜라닌색소분비억제 정도를 비교한 것이다. 평가방법은 세포배양중에 아무것도 처리하지 않은 것과 각 시료를 처리했을 때의 검은 멜라닌색소 분비정도에 따라 색상이 변화되는 정도를 육안관찰하여 상호비교 평가하였다. 결과적으로 박추출물이 멜라닌 색소분비를 효과적으로 억제한다는 결과를 얻었다(표 10).

	베리 칵테일 (실시예 4)	상백피추출물	호야초추출물	알부틴
색소분비억제정도	상	하	중	상

<시험예 8> 세포증식효과

베리칵테일의 피부 세포(skin cell) 증식효과를 보기위해 인체 정상 섬유아세포(Fibroblast)를 96-웰 마이크로 플레이트(96-well microplate)의 각 웰(Well)에 1X10⁴ 세포가 되도록 접종하여 디엠이엠(DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's Medium)배지에서 24시간 배양한다. 배양후 상기에서 제조한 실시예 4의 조성물을 최종 농도 50~500㎍/㎖ 되도록 조정한 혈청이 없는 디엠이엠 배지로 교체한 후 24시간 더 배양한다. 배양 후 MTT(3-(4,5-디메틸씨아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움, 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium:5㎎/㎖) 용액 10㎕을 첨가하여 4시간 방치 후 반응액을 제거한다. 각 웰당 100㎕의 디메틸 설폭사이드용액을 가하여 염색된 세포를 용해시킨 후 마이크로 플레이트 리더로 570㎚에서의 흡광도를 측정하였다.

상기 과정을 실시하여 하기식으로부터 세포증식효과를 구해 그 결과를 표 11에 나타내었다.

* 세포증식효과(%) = ((추출물처리시의 흡광도-대조군의 흡광도)/대조군의 흡광도) X 100

시료(㎍/㎖)	세포증식효과(%)
50	35.3
100	52.9
200	67.3
300	72.2
500	81.3

상기 표 11에 의하면, 베리칵테일은 세포증식효과가 뛰어나 피부 주름 개선에 효과가 있음을 확인할 수 있다.

<시험예 9> 엘라스틴 합성효과

105개의 신생아 피부로부터 분리된 인체 정상 섬유아세포를 6-웰 플레이트에서 24시간 배양한후, 실시예 4의 조성물을 50 ~ 500㎍/㎖로 처리하였다. 24∼48시간 배양한후, 섬유아세포가 새롭게 합성 분비한 엘라스틴의 양을 상업적으로 입수가능한 엘라스틴 키트(Fastin™ elastin assay kit)를 이용하여 측정하였다.

그 엘라스틴량을 세포수 또는 단백질량으로 보정하였다. 그 결과를 표 12에 나타내었다.

시료(㎍/㎖)	엘라스틴 합성증가(%)
50	17.6
100	32.6
200	60.4
300	75.3
500	82.4

상기 표 12에 의하면, 베리칵테일이 엘라스틴 합성 증가에 우수한 효과를 보이고 있어 이를 통한 피부주름개선 효과가 있음을 확인할 수 있다.

<시험예 10> 엘라스테이즈 활성저해 효과

엘라스틴을 분해하는 효소인 엘라스테이즈가 활성을 나타내는 경우, 탄성 섬유인 엘라스틴이 분해되어 피부 주름 형성이 가속화된다. 따라서, 본 시험예에서는 실시예 4의 조성물의 엘라스테이즈 억제율을 측정하였다. 엘라스테이즈의 기질인 N-석시닐-(알라닌)-3-p-니트로아닐라이드가 분해되면 p-니트로아닐린이 되는데, 이것은 노란색을 띈다. 이 발색정도를 분광분석기를 이용하여 흡광도로 측정하여,엘라스테이즈 활성 억제율을 평가하였다(The synthesis and analytical use of a high sensitive and convenient substrate of elastase, Biochemical Medicine 11, 350-357, 1974). 엘라스테이즈의 활성 억제율의 계산방법은 아래의 식과 같으며, 세부적인 방법은 위 문헌에 기재된 바와 같다. 그 결과는 표 13에 나타내었다.

* 엘라스테이즈 활성 저해율(%) = (1-B/A) × 100

A: 억제제 부재하의 OD 400

B: 억제제 존재하의 OD 400

시료(㎍/㎖)	엘라스테이즈 활성저해효과(%)
50	12.5
100	20.1
200	35.9
300	60.2
500	68.7

상기 표 13에 의하면, 베리칵테일 추출액은 엘라스테이즈 합성 저해 효과가 우수하여 이를 통해서 피부 주름개선 효과가 있음을 확인할 수 있다.

<시험예 11 내지 13> 화장료 비교 테스트

본 시험예는 실시예 4에 의해 제조된 베리 칵테일을 함유한 화장료의 비교실험을 행하였다. 비교실험에 사용된 크림의 조성은 표 14에 나타내었다. 우선 하기 표 14에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존하였다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(시험예 11~13, 비교예)을 조제하였다. 표 14의 각 크림을 실험자(20~35세의 여성) 5명의 얼굴 오른쪽에 1일 2회 연속 1개월간 도포하였다. 실험완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포부위 피부를 화상분석기로 얼굴색을 비교하여 가장 어두운 색을 5, 중간색을 3, 가장 환한 색을 1로 정하고 그 중간정도를 어림잡아 평가하였다. 표 15는 시험예 12의 조성으로 된 크림을 사용한 실험자의 안면피부색을 비교예의 조성으로 된 크림을 사용한 실험자의 안면사용부위와 비교한 것이다. 표 15에서와 같이 베리 칵테일을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면에서 미백효과가 나타난 것을 알 수 있다.

성분		시험예(중량%)			비교예(중량%)
성분		11	12	13	비교예(중량%)
가	스테아릴알콜	8	8	8	8
	스테아린산	2	2	2	2
	스테아린산콜레스테롤	2	2	2	2
	스쿠알렌	4	4	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6	6	6
	폴리옥시에틸렌알콜에스테르	3	3	3	3
	글리세틸모노스레아린산에스테르	2	2	2	2
나	베리 칵테일	0.5	2	5
	플로필렌글리콜	5	5	5	5
	정제수	적량을 가하여 100 중량%로 한다.

실험인원	a	b	c	d	e
오른쪽 피부(시험예 8 조성의 크림 사용)	2.0	2.0	2.5	2.0	1.5
왼쪽 피부(비교예 조성의 크림 사용)	3	2.5	3	3	2.5

즉, 상기한 바와 같이 피부개선에 우수한 효과를 나타내었으며 피부미용 효과를 나타내었다.

하기 표 16 내지 표 19에서는 베리 칵테일 조성물을 이용한 여러 제형의 화장료 조성물의 예시를 나타내었다.

<제형예>

제형예 1 : 유연화장수

성분	함량(중량%)
베리 칵테일	0.5~5
글리세린	6.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
PEG1600	1.0
알라토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
벤조페논-9	0.04
소듐히아루로네이트	5.0
에탄올	10.0
옥틸도데세스-16	0.2
폴리솔베이트20	0.2
방부제, 향, 색소	미량
증류수	잔량
합계	100

제형예 2 : 수렴화장수

성분	함량(중량%)
베리 칵테일	0.5~5
글리세린	2.0
1,3-부틸렌글리콜	2.0
알라토인	0.2
DL-판테놀	0.2
EDTA-2Na	0.02
벤조페논-9	0.04
소듐히아루로네이트	3.0
에탄올	15.0
폴리솔베이트20	0.3
우치하젤추출물	2.0
구연산	미량
방부제, 향, 색소	미량
증류수	잔량
합계	100

제형예 3 : 영양 화장수

성분	함량(중량%)
베리 칵테일	0.5~5
글리세릴스테아레이트SE	1.5
스테아릴알콜	1.5
라놀린	1.5
폴리솔베이트	1.3
소르비탄스테아레이트	0.5
경화식물유	1.0
광물유	5.0
스쿠알란	3.0
트리옥타노인	2.0
디메치콘	0.8
초산토코페롤	0.5
카르복시비닐폴리머	0.12
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
소듐히아루로네이트	5.0
트리에탄올아민	0.12
방부제, 향, 색소	미량
증류수	잔량
합계	100

제형예 4 : 영양 크림

성분	함량(중량%)
베리 칵테일	0.5~5
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0
스테아린산	1.6
밀납	1.0
폴리솔베이트	1.6
소르비탄 스테아레이트	0.6
경화식물유	1.0
스쿠알란	3.0
광물유	5.0
트리옥타노인	5.0
디메치콘	1.0
글리세린	5.0
트리에탄올아민	1.0
소듐히아루로네이트	4.0
방부제, 향, 색소	미량
증류수	잔량
합계	100

이러한 시험 결과들로부터, 베리 칵테일 조성물을 화장료로 사용하는 본 발명의 경우에 피부 자극 및 염증을 유발하는 인자들을 억제할 수 있고, 이를 통해 다양한 피부 미용용 화장료로 사용가능하다.

Claims

70% 발효주정 100중량부에 아사이베리 15~25중량부, 블루베리 5~15중량부 및 고지베리 5~15중량부를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
상기 혼합물을 상온에서 3일간 숙성시키는 단계;
상기 숙성된 혼합물을 5~10㎛ 투과사이즈를 갖는 여과지로 여과하여 추출액을 제조하는 단계;
상기 추출액을 농축한 후 건조시켜 베리 칵테일 조성물을 제조하는 단계; 및
상기 베리 칵테일 조성물을 화장품 제형에 0.5 내지 5중량% 함유시키는 단계;를 포함하는, 베리 칵테일 조성물을 함유하는 화장료의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 베리 칵테일 조성물은 상기 화장품 제형에 리포좀 형태로 함유되는 것을 특징으로 하는, 베리 칵테일 조성물을 함유하는 화장료의 제조방법.