KR20110090417A - 티올 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체를 포함하는 형광 센서 및 이를 이용한 티올 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 티올 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체를 포함하는 형광 센서 및 이를 이용한 티올 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 티올과 선택적으로 결합하여 녹색 형광 증강 효과를 나타내는 플루오레세인 유도체는 수용액에서 검출하거나, 체내에 주입하여 형광 강도를 측정함으로써 체내 티올 함유 물질을 실시간으로 정량 또는 정성 분석할 수 있다.

Description

티올 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체를 포함하는 형광 센서 및 이를 이용한 티올 검출방법{Fluorescein derivatives having selectivity for thiol and method for in vivo monitoring thiol using the same}
본 발명은 티올 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체를 포함하는 형광 센서 및 이를 이용한 티올 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 티올과 선택적으로 결합하여 녹색 형광 증강 효과를 나타내는 플루오레세인 유도체는 수용액에서 검출하거나, 체내에 주입하여 형광 강도를 측정함으로써 체내 티올 함유 물질을 실시간으로 정량 또는 정성 분석할 수 있는 티올 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체를 포함하는 형광 센서 및 이를 이용한 티올 검출방법에 관한 것이다.
시스테인(Cys), 호모시스테인(Hcy) 및 글루타티온(GSH)과 같은 세포내 티올은 생리적 매트릭스에서 많은 중요한 역할을 담당하고 있다. 예를 들어, Cys 및 Hcy는 생체시스템에서 세포 및 조직 생장에 요구되는 필수적인 생체분자들이다. 시스테인의 결핍은 다양한 건강상의 문제들, 예를 들어, 생장 지연, 모발 탈색, 기면, 간 손상, 근육 및 지방 소실, 및 피부 손상을 유발한다. 사람의 혈장에서 Hcy의 수준이 증가할 경우, 알츠하이머병, 심혈관 질환, 신경관 결손, 염증성 장질환, 및 골다공증에 대한 위험인자이다. 가장 풍부한 세포내 단백질 비구성원(non-proteinogenic) 티올인 GSH는 세포에서 환원환경(reducing environment)을 유지하고, 레독스 조절자로서 작용하는 중추적인 역할을 담당하고 있다. 그러므로, 생체시료에서 티올을 함유하는 물질의 검출 및 식별이 매우 중요하다. 지금까지, HPLC, 모세관 전기영동 및 UV-Vis 검출/비색 분석등의 몇몇 티올 검출방법들이 개발되었다. 이들 방법들이 인 비트로에서 티올을 모니터하기에는 유용하나, 생체내 연구에 대한 이들의 한계로 인해 세포 내 검출을 위해 사용할 수 있는 방법은 거의 없었다. 간단하고, 민감하며 효과적이므로 티올 검출을 위한 형광 방법들이 더 바람직하다. 과거 몇 년동안, 다른 메커니즘에 기반을 둔 티올에 대한 다양한 형광 프로브들, 예를 들어, 마이클 첨가(Michael addition), 알데히드를 이용한 고리형성, 티올에 의한 분리 반응 및 기타 등등이 개발된 바 있다.
본 발명의 목적은 수용액 또는 생체 내에서 티올에 대한 높은 선택성과 민감성을 갖는 신규한 플루오레세인 유도체 형광 프로브 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 식에서,
R1 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
R5는 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 하이드록시, 카르복실, CO(R6), 또는 CON(R6)이고, 여기서 R6은 C1-6 알킬, 또는 5 내지 12 환원의 아릴을 나타내고,
P, Q, Y 및 Z는 각각 독립적으로 산소원자 또는 황원자이고,
X는 산소, 황, 또는 NR7이고, 여기서 R7은 수소, 또는 C1-6 알킬을 나타내며,
n은 1 내지 4의 정수를 나타낸다.
본 발명은 또한 용매 하에서 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 및 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다:
[화학식 2]
Figure pat00002
[화학식 3]
Figure pat00003
[화학식 1]
Figure pat00004
상기 식에서,
R1 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
R5는 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 하이드록시, 카르복실, CO(R6), 또는 CON(R6)이고, 여기서 R6은 C1-6 알킬, 또는 5 내지 12 환원의 아릴을 나타내고,
P, Q, Y 및 Z는 각각 독립적으로 산소원자 또는 황원자이고,
X는 산소, 황, 또는 NR7이고, 여기서 R7은 수소, 또는 C1-6 알킬을 나타내며,
n은 1 내지 4의 정수이고,
R'는 4 내지 7환원의 시클로알케닐을 나타낸다.
본 발명은 또한 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 티올 검출용 센서 또는 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00005
상기 식에서,
R1 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
R5는 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 하이드록시, 카르복실, CO(R6), 또는 CON(R6)이고, 여기서 R6은 C1-6 알킬, 또는 5 내지 12 환원의 아릴을 나타내고,
P, Q, Y 및 Z는 각각 독립적으로 산소원자 또는 황원자이고,
X는 산소, 황, 또는 NR7이고, 여기서 R7은 수소, 또는 C1-6 알킬을 나타내며,
n은 1 내지 4의 정수를 나타낸다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 티올을 반응시키는 단계를 포함하는 티올을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 티올에 대한 높은 선택성과 민감성을 갖는 신규한 플루오레세인 유도체 형광 프로브를 제공하는 효과가 있다.
상기 형광 프로브는 수용액뿐만 아니라 생체 내에서도 효과적으로 티올을 검출할 수 있다.
도 1은 HEPES 완충용액에서 다양한 분석물질들에 대한 본 발명의 플루오레세인 유도체의 형광 스펙트럼(a) 및 UV/Vis 흡수 스펙트럼(b)을 나타낸 것이다.
도 2는 HEPES 완충용액에서 GSH를 농도별로 첨가함에 따른 본 발명의 플루오레세인 유도체의 형광(a) 및 흡수(b) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 CH3CN-HEPES 완충용액에서 저농도의 GSH를 첨가함에 따른 본 발명의 플루오레세인 유도체의 형광 적정 결과(a) 및 CH3CN-HEPES 완충용액에서 농도별 GSH를 첨가함에 따른 본 발명의 플루오레세인 유도체의 520 nm 에서 형광 강도 변화(b)를 나타낸 것이다.
도 4는 pH 별로 GSH 유무에 따른 본 발명의 플루오레세인 유도체의 520nm에서의 형광 강도를 나타낸 것이다.
도 5는 CH3CN/HEPES 용액에서 본 발명의 플루오레세인 유도체 및 GSH 간의 반응에 대한 Job's plot을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 플루오레세인 유도체 및 2-머캅토에탄올을 혼합하여 얻은 산물의 FAB 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 DMSO-d 6에서 2-머캅토에탄올의 유(하단) 무(상단)에 따른 본 발명의 플루오레세인 유도체의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 8은 포유동물 세포 및 기관들의 위상차 현미경 이미지 및 형광 이미지를 나타낸 것으로, (a)는 쥐의 P19 태아성 암세포에 본 발명의 플루오레세인 유도체를 처리한 결과이고, (b)는 P19 태아성 암세포를 NMM 에서 20분간 전처리한 후 본 발명의 플루오레세인 유도체를 처리한 결과이고(왼쪽: 위상차 현미경 이미지; 중간은 형광 이미지; 오른쪽은 병합 이미지임), (c)는 3일령된 제브라피쉬를 본 발명의 플루오레세인 유도체와 함께 배양한 결과이고, (d)는 3일령된 제브라피쉬를 NMM로 전처리한 후, 본 발명의 플루오레세인 유도체를 처리한 결과이다(상단: 위상차 현미경 이미지; 하단: 형광 이미지임).
도 9는 본 발명의 플루오레세인 유도체가 처리된 제브라피쉬의 기관들의 이미지를 나타낸 것이다(상단: 위상차 현미경 이미지, 하단: 형광 이미지).
도 10은 티올에 대한 높은 선택성과 민감성을 갖는 본 발명의 플루오레세인 유도체 및 이를 이용한 제브라피쉬에서의 생체 이미지를 도시한 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure pat00006
상기 식에서,
R1 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
R5는 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 하이드록시, 카르복실, CO(R6), 또는 CON(R6)이고, 여기서 R6은 C1-6 알킬, 또는 5 내지 12 환원의 아릴을 나타내고,
P, Q, Y 및 Z는 각각 독립적으로 산소원자 또는 황원자이고,
X는 산소, 황, 또는 NR7이고, 여기서 R7은 수소, 또는 C1-6 알킬을 나타내며,
n은 1 내지 4의 정수를 나타낸다.
본 발명의 화합물의 치환체 정의에 사용된 용어는 하기와 같다.
"할로"는 -F, -Cl, -Br 또는 -I이다.
"알킬"은 다른 기재가 없는 한, 탄소수 1 내지 30의 직쇄 또는 분지쇄 또는 고리형의 포화 탄화수소를 가리킨다. C1-30 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 이소헥실, 이소헵틸, 이소옥틸, 이소노닐 및 이소데실이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 또한 상기 알킬은 "시클로알킬"을 포함한다. 상기 시클로알킬은 다른 기재가 없는 한, 탄소수 3 내지 12의 비방향족, 포화 탄화 수소환으로서 단일환 및 융합환을 포함한다. C3-12 시클로알킬의 대표적 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 및 시클로옥틸이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
"알콕시"는 다른 기재가 없는 한, 상기 탄소수 1 내지 6, 예를 들어 탄소수 1 내지 4의 알킬기가 산소원자와 결합한 것을 나타낸다. C1-4 알콕시기의 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 및 부톡시가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
"시클로알케닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중결합을 함유하는 탄소수가 3 내지 10인 비-방향족의 모노 또는 멀티사이틀릭 환 시스템을 의미한다. 바람직한 시클로알케닐 환은 4 내지 7개의 환 원자를 함유한다. 시클로알케닐은 동일하거나 또는 상이할 수 있고 상기에서 정의한 바와 같은 하나 이상의 "환 시스템 치환체"로 임의 치환될 수 있다. 적합한 모노사이클릭 시클로알케닐의 비제한적인 예는 시클로펜테닐, 시클로헥세닐 등을 포함한다. 적합한 멀티사이클릭 시클로알케닐의 비제한적인 예로는 노르보르닐레닐이다.
"아릴"은 다른 기재가 없는 한, 5 내지 12-환원의 방향족 고리화합물을 가리킨다. 아릴기의 예로는 페닐, 비페닐, 나프틸 및 안트라세닐을 포함하나, 이들에 제한되지 않는다.
상기 화학식 1의 화합물은 보다 구체적으로
R1 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1-4 알킬, C1-4 알콕시, 또는 하이드록시이고,
R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-4 알킬, C1-4 알콕시, 또는 하이드록시이고,
R5는 수소, C1-4 알킬, C1-4 알콕시, 하이드록시, 카르복실, CO(R6), 또는 CON(R6)이고, 여기서 R6은 C1-4 알킬, 또는 5 내지 12 환원의 아릴을 나타내고,
P, Q, Y 및 Z는 산소원자이고,
X는 산소, 황, 또는 NR7이고, 여기서 R7은 수소, 또는 C1-4 알킬을 나타내며,
n은 1 내지 2의 정수를 나타낼 수 있다.
화학식 1의 화합물은 보다 구체적으로
R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, 또는 하이드록시를 나타내고,
P, Q, Y 및 Z는 산소원자이고,
X는 산소, 또는 NR7이고, 여기서 R7은 수소, 또는 C1-2 알킬을 나타내며,
n은 1 내지 2의 정수를 나타낼 수 있다.
화학식 1의 화합물은 가장 구체적으로
R1, R2, R3 및 R5는 수소이고,
R4는 하이드록시이고,
P, Q, X, Y 및 Z는 산소원자이고,
n은 2를 나타낼 수 있다.
본 발명은 또한 용매 하에서 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 및 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 1의 화합물의 제조방법에 관한 것이다:
[화학식 2]
Figure pat00007
[화학식 3]
Figure pat00008
[화학식 1]
Figure pat00009
상기 식에서,
R1 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
R5는 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 하이드록시, 카르복실, CO(R6), 또는 CON(R6)이고, 여기서 R6은 C1-6 알킬, 또는 5 내지 12 환원의 아릴을 나타내고,
P, Q, Y 및 Z는 각각 독립적으로 산소원자 또는 황원자이고,
X는 산소, 황, 또는 NR7이고, 여기서 R7은 수소, 또는 C1-6 알킬을 나타내며,
n은 1 내지 4의 정수이고,
R'는 4 내지 7환원의 시클로알케닐을 나타낸다.
상기 화학식 1의 화합물의 제조방법은
플루오레세인으로부터 알데히드기가 치환된 상기 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계; 및
용매 하에서 화학식 2의 화합물 및 화학식 3의 화합물의 베일리스 힐만 및 마이클 첨가 반응에 의해 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 화학식 2의 화합물은 플루오레세인 모노알데히드일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 화학식 2의 화합물은 J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 15949-15958에 개시된 방법에 따라 제조할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
일 구체예에 따르면, 화학식 2의 화합물로 플루오레세인 모노알데히드의 제조방법을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
플루오레세인, 메탄올 및 15-crown-5를 혼합하고 NaOH 용액을 첨가하여 반응시킨 다음 냉각 후 상기 혼합물을 산성화시키고, 침전물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 엷은 노란색의 고형체 상태의 화학식 2의 화합물을 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 제조방법에 있어서, 화학식 1의 화합물은 용매 하에서 상기 단계에서 수득한 화학식 2의 화합물 및 화학식 3의 화합물의 베일리스 힐만 및 마이클 첨가 반응에 의해 제조할 수 있다.
상기 화학식 3의 화합물로 2-사이클로펜텐-1-온을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 베일리스 힐만 및 마이클 첨가 반응은 상기 혼합물에 이미다졸을 추가로 첨가하여 실시한다.
상기 용매는 테트라하이드로퓨란, 디클로로메탄, 또는 아세톤니트릴 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
화학식 2의 화합물로부터 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
화학식 2의 화합물, 화학식 3의 화합물 및 이미다졸을 탈이온수에서 혼합하여 반응시킨 다음, 감압 증발 후 최종 혼합물을 용매추출하고, 유기층을 감압 하에서 농축한 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 노란색의 결정 형태의 화학식 1의 화합물을 얻을 수 있다.
일 예에 따르면, 화학식 1의 화합물은 하기 반응식 1에 따라 제조될 수 있다:
[반응식 1]
Figure pat00010

본 발명은 또한 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 티올 검출용 센서에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure pat00011
상기 식에서,
R1 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
R5는 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 하이드록시, 카르복실, CO(R6), 또는 CON(R6)이고, 여기서 R6은 C1-6 알킬, 또는 5 내지 12 환원의 아릴을 나타내고,
P, Q, Y 및 Z는 각각 독립적으로 산소원자 또는 황원자이고,
X는 산소, 황, 또는 NR7이고, 여기서 R7은 수소, 또는 C1-6 알킬을 나타내며,
n은 1 내지 4의 정수를 나타낸다.
본 발명의 화학식 1의 화합물의 티올 선택성에 대한 예상 메커니즘은 하기 반응식 2로 나타낼 수 있다. 즉, 수용액 내에서 화학식 1의 화합물은 티올 화합물과 반응하여 화학식 1의 화합물 내 α,β-불포화 케톤의 1, 4의 위치에 티올이 첨가되어 스피로 개환(spiro ring opeining)이 일어남으로써 형광을 나타내는 화학식 1의 화합물-티올 부가물이 형성되어 형광 증가 및 UV-Vis 스펙트럼 변화가 일어나므로, 화학식 1의 화합물은 티올에 대한 높은 선택성과 민감성을 갖는 형광 프로브로 사용할 수 있다.
[반응식 2]
Figure pat00012

본 발명의 화학식 1의 화합물은 100% 수용액에서 티올 첨가에 따라 농도 의존적으로 520 nm의 여기 파장에서 선택적인 형광 증가 효과를 나타내므로 "OFF-ON"타입의 형광 프로브로 사용하여 티올을 검출할 수 있는 것이다.
일 예에 따르면, 아미노산, 예를 들어, Gly, Phe, Ser, Glu, Lys, Arg, His, Ala, Gln, Met, Tyr 및 시스틴에 대해서는 형광 변화를 나타내지 않으나, 티올을 함유하는 아미노산인 시스테인(Cys), 호모시스테인(Hcy), 또는 글루타치온(GSH)에 대해서는 농도 의존적으로 큰 폭의 형광 변화를 나타낸다.
일 예에 따르면, 화학식 1의 화합물로 검출할 수 있는 티올 함유 물질, 예를 들어, 글루타치온의 농도는 50 내지 350 nM이다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 티올 검출용 조성물에 관한 것이다.
상기의 티올 검출용 조성물 또는 티올 검출용 센서는 화학식 1로 표시되는 화합물 외에 완충용액을 포함할 수 있다. 완충용액의 종류 및 농도는 특별히 제한되지 아니하나, 상기 티올 검출용 센서의 적용 용도에 따라 적절히 변경할 수 있을 것이다. 예컨대, 본 발명의 티올 검출용 센서를 생체 내 티올의 검출하기 위해 사용하고자 하는 경우 상기 완충용액은 생체 내 pH 농도에 상응하는 완충범위를 갖는 것이 바람직할 것이다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 티올을 반응시키는 단계를 포함하는 티올을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 수용액 또는 생체 내에서 티올 화합물을 검출할 수 있는 "OFF-ON" 타입의 센서로서 형광 강도가 낮은 상태(OFF)에서 티올을 감지하면 형광 강도가 커지는(ON) 사실을 센서화시킨 것이다.
수용액 상태에서 티올 화합물을 검출할 경우, 검출 가능한 형광 강도를 고려하여 상기 수용액의 pH는 5 내지 12 일 수 있다.
상기 티올 화합물은 티올기를 함유하는 물질이라면 특별히 제한하지는 않으며, 예를 들어, 시스테인(Cys), 호모시스테인(Hcy), 또는 글루타치온(GSH) 등의 티올 함유 아미노산일 수 있다.
또한, 생체 내에서 티올 화합물을 검출할 경우, 화학식 1의 화합물은 살아있는 세포와 혼합 배양하거나, 생체 내에 투여하여 세포 또는 생체 내 형광 강도를 측정하여 티올을 검출할 수 있다.
상기 생체는 제브라피쉬 등의 어류, 생쥐, 집쥐, 기니피그, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 원숭이, 비비, 또는 침팬지 등일 수 있다.
상기 티올 검출은 통상의 계측장치, 예를 들어 형광 현미경 등을 사용하여 형광 강도의 증가를 측정하여 실시할 수 있다.
본 발명에 따른 티올을 검출하는 방법은 형광 강도의 증가를 검출하는 것이다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 플루오레세인 유도체의 합성 및 티올 선택성 조사
플루오레세인 유도체의 합성 및 상기 유도체의 티올 선택성을 조사하기 위해 사용한 화합물들은 특별한 언급이 없는 한 구입하여 별도의 정제 없이 사용하였다.
크로마토그래피는 silica gel 60(230-400 mesh ASTM; Merck)에서 실시하였다. Thin layer chromatography(TLC)는 Merck 60 F254 플레이트(두께: 0.25 mm)를 사용하였다. Preparative TLC는 Merck 60 F254 플레이트(두께: 1 mm)를 사용하였다. 1H NMR 및 13C NMR 스펙트럼은 Bruker 250를 이용하여 기록하였다. 질량 스펙트럼은 Jeol JMS 700 high resolution mass spectrometer에서 얻었다. UV 흡수 스펙트럼은 UVIKON 933 Double Beam UV/VIS Spectrometer에서 얻었다. 형광 방출 스펙트럼은 RF-5301/PC Spectrofluorophotometer (Shimadzu)에서 얻었다.
<제조예 1> 플루오레세인 유도체의 합성
[반응식 1]
Figure pat00013
상기 식에서 플루오레세인 모노알데히드(2)는 이미 보고된 방법에 따라 합성하였다(J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 15949-15958). 플루오레세인(4 g, 12 mmol), 10 mL CHCl3, 6 mL MeOH 및 0.06 g 15-crown-5를 100 mL-플라스크에 넣었다. 20 g의 50% NaOH 용액(50%)을 주의하여 첨가하는 한편, 반응 온도는 55℃에서 유지하였다. 혼합물은 이 온도에서 5시간 동안 교반하였다. 냉각 후, 상기 혼합물에 10M H2SO4를 처리하여 산성화하였다. 침전물을 수집하고 진공 건조하였다. 실리카겔 크로마토그래피를 실시하고(15:85 EtOAc:DCM), CH3OH에서 결정화하여 엷은 노란색 고형체 산물 1.13 g을 얻었다(수율: 26%).
1H NMR (소량의 CD3OD를 포함한, 250 MHz) δ(ppm): 10.59 (1H, s), 7.95 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.69-7.56 (2H, m), 7.12 (1H, d, J = 7.5 Hz), 6.82 (1H, d, J = 9.0 Hz), 6.71 (1H, s), 6.55 (1H, d, J = 9.0 Hz), 6.54 (2H, s).
다음으로, 상기 식의 화합물 1을 제조하기 위해, 테트라하이드로퓨란 (THF, 10 mL)에 녹인 플루오레세인 모노알데히드(360 mg, 1 mmol), 2-사이클로펜텐-1-온(164 mg, 2 mmol) 및 이미다졸(68 mg, 1 mmol) 용액과 탈이온수(10 mL)를 혼합하였다. 상기 혼합물은 실온에서 72시간 동안 교반하였다. 감압 하에서 증발한 후, 최종 혼합물은 에틸 아세테이트로 추출하였다(3×5 mL). 유기층을 감압 하에서 농축하였다. 에틸 아세테이트 및 헥산(60:40)을 용출용매로 사용하여 미정제 추출물의 실리카겔 크로마토그래피를 실시하고, CH3OH/H2O(50:50, v/v)를 이용하여 결정화하여 노란색의 화학식 1의 화합물 90 mg(수율: 21%)을 얻었다.
1H NMR (DMSO-d 6, 250 MHz) δ(ppm): 10.31 (1H, s), 8.75 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.88-7.78 (2H, m), 7.69 (1H, s), 7.37 (1H, t, J = 7.5 Hz), 6.79 (1H, d, J = 8.25 Hz), 6.80-6.76(2H, m), 6.67-6.65 (2H,m), 5.46 (1H, t, J = 8 Hz), 2.79-2.65 (2H, m), 2.20-2.00 (2H, m).
13C NMR (DMSO-d 6, 62.5 MHz) δ(ppm): 200.7, 168.4, 159.6, 156.2, 151.7, 151.4, 151.1, 149.1, 135.7, 131.8, 131.7, 131.4, 130.3, 129.0, 126.2, 124.7, 124.1, 120.0, 113.2, 112.6, 112.5, 110.4, 109.3, 109.0, 102.7, 82.3, 81.9, 75.6, 36.7, 27.4.
FAB MS m/z = 425.1026 [M + H]+, calc. for C26H17O6 = 425.1025.
상기에서와 같이, 형광 프로브 화학식 1의 화합물은 반응식 1에 나타난 바와 같이 합성하였다. 플루오레세인-모노알데히드는 THF에 녹인 이미다졸(Baylis-Hillman 및 분자내 Michael addition reactions)의 존재 하에서 2-사이클로펜테논(2-cyclopentenone)과 반응하여 상기 형광 프로브 1을 21% 수율로 합성하였다.
<제조예 2> 형광 실험을 위한 아미노산 용액의 제조
아미노산 및 다른 분석물질들, 즉, Cys, Hcy, GSH, Gly, Phe, Ser, Glu, Lys, Arg, His, Ala, Gln, Met, Tyr 및 시스틴(cystine)은 증류수에 녹여 스톡 용액(10 mM)을 제조하였다. 화합물 1의 스톡 용액(1 mM)은 아세토니트릴에 녹여 제조하였다. 하기 실험에서, 시험용액은 30㎕의 프로브 스톡 용액을 시험관에 넣고, 0.01 M HEPES (pH 7.4)를 첨가하여 3 mL로 희석하고, 각 분석물질 스톡 용액의 적절한 완충용액을 첨가하여 제조하였다. 일반적으로, 여기 파장은 485 nm로 하였다. 여기 및 방출 슬릿의 너비는 1.5nm/1.5 nm이다. 형광 스펙트럼은 5분 동안 분석물질 첨가 후 측정하였다.
GSH의 저 농도 적정을 위해, GSH를 5분 동안 첨가 후 형광 스펙트럼을 측정하였고, 여기 및 방출 슬릿 너비는 각각 3 nm 및 1.5 nm로 하였다.
<실험예 1> 본 발명의 플루오레세인 유도체(화학식 1의 화합물)의 수용액 내 티올 검출
도 1은 HEPS 완충용액(20 mM, pH 7.4, 1% CH3CN)에서 다양한 분석물질들(100 mM), 즉, Cys, Hcy, GSH, Gly, Phe, Ser, Glu, Lys, Arg His, Ala, Gln, Met, Tyr 및 시스틴에 대한 화학식 1의 화합물(10μM)의 형광 스펙트럼 (λex = 485 nm, slit: 1.5 nm/1.5 nm) (a) 및 UV/Vis 흡수 스펙트럼(b)을 나타낸 것이다.
도 1에 나타난 바와 같이, 화학식 1의 화합물은 HEPES 완충용액에서 티올 함유 분석물질(Cys, Hcy 및 GSH)의 존재 하에서 형광(λmax = 520 nm), 및 UV-Vis 스펙트럼의 증가를 나타냈다. 그러나, 티올이 없는 분석물질(Gly, Phe, Ser, Glu, Lys, Arg, His, Ala, Gln, Met, Tyr 및 시스틴)은 같은 조건에서 형광 강도 및 UV-Vis 스펙트럼에서 거의 변화가 없었다.
또한, 10 당량의 Cys, Hcy 및 GSH를 화학식 1의 화합물에 첨가한 후 관찰된 형광 증가는 각각 95.46 및 61 배 정도 컸다.
다음으로, 화학식 1의 화합물의 형광 반응을 추가로 실험하기 위해 전형적인 생물학적 티올인 GSH를 사용하였다. 도 2는 HEPES 완충용액(20 mM, pH 7.4, 1% CH3CN)에서 농도별 GSH(0, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 40 및 100 μM) 에서 화학식 1의 화합물(10μM)의 형광(a) 및 흡수(b) 스펙트럼을 나타낸 것으로(λex= 485 nm, slit: 1.5 nm/1.5 nm), 각 스펙트럼은 화학식 1의 화합물에 GSH를 첨가한 후 5분째에 기록한 것이다.
화학식 1의 화합물은 GSH가 없는 상태에서 전혀 형광을 나타내지 않았다. 그러나, GSH 첨가 시 형광 스펙트럼에서의 극적인 변화가 일어났다. 520nm에서 새로운 강한 방출 피크가 나타났고, 61배까지 형광강도의 증가가 관찰되었다. 부수적으로, 454nm에서 점차적인 흡수 피크의 감소가 있었고, GSH 첨가 시 500 nm 주변에서 새로운 흡수 피크가 관찰되었다(도 2b). 467 nm에서 뚜렷한 등흡광점이 확인되었다. 이는 화학식 1의 화합물과 GSH 처리 시 새로운 산물이 형성되었음을 뜻하는 것이다(vide infra).
GSH에 대한 화학식 1의 화합물의 검출 한계를 조사하기 위해, CH3CN-HEPES 완충용액(0. 02 M, pH 7.4) (1:99, v/v)에서 저농도의 GSH를 첨가함에 따른 화학식 1의 화합물(1μM)의 형광 적정 결과(a) (여기파장: 485 nm, slit: 3 nm/1.5 nm)와, CH3CN-HEPES 완충용액(0. 02 M, pH 7.4) (1:99, v/v)에서 농도별 GSH(50 ~ 350 nM)를 첨가함에 따른 화학식 1의 화합물(1μM)의 520 nm 에서 형광 강도 변화(b)를 도 3에 나타내었다.
화학식 1의 화합물의 형광 강도는 GSH 농도(0 - 350 nM)에 직선으로 비례하였고, 53 nM의 낮은 농도의 GSH일 때 시그널 대 노이즈 비가 3을 갖는 화학식 1의 화합물을 이용하여 검출하였다.
티올에 대한 화학식 1의 화합물의 시간별 형광 반응을 pseudo-first-order kinetic 조건 하에서(10 μM 화학식 1의 화합물 및 500 μM 티올) 520 nm에서 모니터하였다.
이들 조건 하에서, pH 7.4에서 관찰된 속도 상수(k obs)는 Cys, Hcy 및 GSH에 대해 각각 36.5, 8.0 및 11.5 min-1 인 것으로 나타났다.
티올에 대한 화학식 1의 화합물의 형광 반응에 대한 pH의 효과를 조사하기 위해, 티올에 의해 유도된 화학식 1의 화합물의 형광 강도 변화를 pH 별로 측정하였다. 도 4는 다른 pH에서 GSH 유무에 따른 화학식 1의 화합물의 520nm에서의 형광 강도를 나타낸 것이다(CH3CN-H2O(1:99, v/v) 시스템에서 10 μM의 화학식 1의 화합물; λex= 485 nm; Slit: 1.5 nm/1.5 nm).
GSH가 없는 경우, 화학식 1의 화합물은 Ph 2.5-11.3 범위에서 형광 강도 변화는 거의 없었다(도 4). 프로브에 GSH를 첨가한 경우, pH 5 이상에서 강한 형광이 검출되었으며, 이는 생리학적 조건(pH 7.4) 하에서 화학식 1의 화합물이 분석물질에 대해 반응함을 의미하는 것이다.
검출 메커니즘에 있어서, 프로브에서 α,β-불포화 케톤에 티올의 1,4-첨가 후 플루오레세인의 스피로 개환이 일어나는 것이 형광 증가 및 UV-Vis 스펙트럼 변화에 영향을 주는 것 같다(반응식 2). 이러한 메커니즘이 타당한지를 시험하기 위해, 우선 티올과 화학식 1의 화합물 간의 결합 이벤트의 화학양론학을 측정하였다. 도 5는 CH3CN/HEPES (20 mM) (1:99, v/v) 용액(pH 7.4)에서 화학식 1의 화합물 및 GSH 간의 반응에 대한 Job's plot을 나타낸 것으로, 화학식 1의 화합물 및 GSH의 총 농도는 10μM에서 일정하게 유지되게 하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, Job's plot 으로부터 얻은 결과에 따르면, 1 및 GSH 간의 화학양론은 1:1이었다.
또한, CH2Cl2에서 화학식 1의 화합물과 2-머캅토에탄올 간의 반응으로부터 얻은 산물의 질량 스펙트로메트리 분석에 의해 화학식 1의 화합물-티올 부가물의 형성이 뒷받침될 수 있다.
도 6은 화학식 1의 화합물 및 4 당량의 2-머캅토에탄올을 혼합하여 얻은 산물의 FAB 질량 스펙트럼을 나타낸 것으로, 즉, [1-머캅토에탄올 + H+]+에 해당하는 503.12에서의 피크가 명확히 관찰되었다.
또한, NMR 분광 분석 역시, 화학식 1의 화합물의 α,β-불포화 케톤의 1,4-티올 첨가에 대한 증거를 제공한다. DMSO-d 6에서 화학식 1의 화합물에 4 당량의 2-머캅토에탄올을 첨가할 경우, 2-사이클로펜테논에 의해 에테르화된 플루오레세인의 페놀 그룹이 티올에 의한 친핵성 공격으로 인해 방출되었다(반응식 2, 도 7). 최종 플루오레세인 형광단은 수용 메디아에서 강항 형광을 나타냈다.
<실험예 2> 화학식 1의 화합물의 포유동물 세포에서의 티올 검출
쥐의 P19 태아성 암세포(Murine P19 carcinoma embryonic cells)는 배양 배지(10% FBS, 50 unit/mL 페니실린, 및 50 g/mL 스트렙토마이신이 포함된 DMEM)에서 37℃에서, 항습배양기에서 배양하고, 매일 신선한 배지로 배양 배지를 교체하였다. 상기 세포를 배양 배지 1mL 당 104 세포수의 밀도로 3-웰 플레이트에 씨딩하였다. 24시간 후, 상기 세포에 50μM NMM를 배양배지에 첨가하거나 그렇지 않고 37℃에서 20분 동안 처리하였다. PBS(phosphate buffered saline)로 세척하여 남아있는 NMM를 제거한 후, 배양 배지에 20μM 화학식 1의 화합물을 첨가하여 37℃에서 30분 동안 추가로 배양하였다. 상기 세포는 형광 현미경에서 이미지화 하였다(Nicon Eclipse TE2000; 여기 필터; 450-490 nm, 방출 필터; 520 nm).
<실험예 3> 화학식 1의 화합물의 제브라피쉬에서의 티올 검출
제브라피쉬를 28℃에서 유지하고, 최적 번식 조건에서 유지하였다. 교미를 위해, 수컷 및 암컷 제브라피쉬를 한 탱크 내에 유지하고, 28℃, 12시간/12시간 명암주기를 유지하였으며, 산란은 아침에 광 자극을 제공하여 유도하였다(Yang et al. Nat. Protocols 2007, 2, 1740-1745). 거의 모든 알들이 즉시 수정되었다. 3일령 제브라피쉬를 E3 배아 배지(15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 0.15 mM KH2PO4, 0.05 mM Na2HPO4, 0.7 mM NaHCO3, 10-5% 메틸렌 블루; pH 7.5)에서 유지하였다. 상기 제브라피쉬는 40μM NMM의 유무에 따라 E3 배지에서 28℃에서 30분간 배양하였다. E3 배지로 세척하여 남아있는 NMM을 제거한 후, 상기 제브라피쉬는 E3 배지에서 20μM 화학식 1의 화합물과 함께 28℃에서 30분 동안 추가로 배양하였다. E3 배지로 세척한 후, 상기 제브라피쉬는 형광 현미경 하에서 이미지화 하였다.
<실험예 4> 화학식 1의 화합물의 제브라피쉬 기관에서의 티올 검출
성체 제브라피쉬(확인 가능한 기관이 형성되어 있는 3월령 된 것)는 E3 배지에서 5μM 화학식 1의 화합물에 28℃에서 5분 및 60분 동안 노출하였다. E3 배지로 세척하여 남아있는 화학식 1의 화합물을 제거한 후, 상기 제브라피쉬를 절개하여 조직 및 기관들을 분리하고, 형광 현미경 및 해부 현미경(Stemi 2000-C, ZAISS, Germany)에서 이미지화 하였다.
상기 실험예 2 내지 4에 있어서, 화학적 및 분광학적 특징때문에, 화학식 1의 화합물은 생체 세포 및 기관에서 티올을 확인하기에 적합하다. 이를 시험하기 위해, 쥐의 P19 태아성 암세포 및 3일령된 제브라피쉬와 화학식 1의 화합물(20μM)과 함께 배양하였다. 도 8은 포유동물 세포 및 기관들의 위상차 현미경 이미지 및 형광 이미지를 나타낸 것으로, (a)는 쥐의 P19 태아성 암세포에 20μM의 화학식 1의 화합물을 30분 동안 처리한 결과이고, (b)는 P19 태아성 암세포를 50μM NMM 에서 20분간 전처리한 후 20μM의 화학식 1의 화합물을 30분 동안 처리한 결과이고(왼쪽: 위상차 현미경 이미지; 중간은 형광 이미지; 오른쪽은 병합 이미지임), (c)는 3일령된 제브라피쉬를 20μM의 화학식 1의 화합물과 함께 배양한 결과이고, (d)는 3일령된 제브라피쉬를 40μM NMM과 30분 동안 전처리한 후 20μM 화학식 1의 화합물을 1시간 동안 처리한 결과이다(상단: 위상차 현미경 이미지; 하단: 형광 이미지임).
세포 및 제브라피쉬에서 강한 형광이 나타났다 (도 8a 및 8c). 그러나, 세포 및 제브라피쉬를 티올 종의 트랩핑 제제인 N-methylmaleimide (NMM) (40 - 50μM)로 전처리할 경우, 형광 강도의 현저한 감소가 관찰되었고, 이는 화학식 1의 화합물에 의한 티올의 특이 검출을 뜻하는 것이다 (도 8b 및 8d).
또한, 화학식 1의 화합물을 이용하여 제브라피쉬에서 티올을 분석하였다. 제브라피쉬는 5μM 화학식 1의 화합물에 1시간 동안 노출되었으며, 절개하여 조직 및 기관을 분리하고 형광 현미경을 이용하여 시험하였다. 화학식 1의 화합물에 의해 눈, 담낭, 알 및 지느러미에서 티올 종이 강하게 검출되었고, 뇌에서는 약하게 확인되었다(도 9). 이들 in vivo 실험 결과 화학식 1의 화합물은 세포막과 어류에 침투하고 티올과 반응하여 형광 산물을 형성할 수 있음을 나타내는 것이다.
상기 결과로부터, 본 발명은 티올 함유 물질 검출을 위한 높은 선택성과 민감성을 갖는 신규한 플루오레세인 유도체 형광 프로브를 제공하며, 형광 증가 및 UV-Vis 스펙트럼 변화는 형광 프로브 내 α,β-불포화 케톤의 1,4번 위치에 티올이 첨가됨으로써 티오에테르를 형성한 탓으로 사료된다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure pat00014

    상기 식에서,
    R1 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
    R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
    R5는 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 하이드록시, 카르복실, CO(R6), 또는 CON(R6)이고, 여기서 R6은 C1-6 알킬, 또는 5 내지 12 환원의 아릴을 나타내고,
    P, Q, Y 및 Z는 각각 독립적으로 산소원자 또는 황원자이고,
    X는 산소, 황, 또는 NR7이고, 여기서 R7은 수소, 또는 C1-6 알킬을 나타내며,
    n은 1 내지 4의 정수를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1-4 알킬, C1-4 알콕시, 또는 하이드록시이고,
    R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-4 알킬, C1-4 알콕시, 또는 하이드록시이고,
    R5는 수소, C1-4 알킬, C1-4 알콕시, 하이드록시, 카르복실, CO(R6), 또는 CON(R6)이고, 여기서 R6은 C1-4 알킬, 또는 5 내지 12 환원의 아릴을 나타내고,
    P, Q, Y 및 Z는 산소원자이고,
    X는 산소, 황, 또는 NR7이고, 여기서 R7은 수소, 또는 C1-4 알킬을 나타내며,
    n은 1 내지 2의 정수를 나타내는 화합물.
  3. 제2항에 있어서,
    R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, 또는 하이드록시를 나타내고,
    P, Q, Y 및 Z는 산소원자이고,
    X는 산소, 또는 NR7이고, 여기서 R7은 수소, 또는 C1-2 알킬을 나타내며,
    n은 1 내지 2의 정수를 나타내는 화합물.
  4. 제3항에 있어서,
    R1, R2, R3 및 R5는 수소이고,
    R4는 하이드록시이고,
    P, Q, X, Y 및 Z는 산소원자이고,
    n은 2를 나타내는 화합물.
  5. 용매 하에서 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 및 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 1의 화합물의 제조방법:
    [화학식 2]
    Figure pat00015

    [화학식 3]
    Figure pat00016

    [화학식 1]
    Figure pat00017

    상기 식에서,
    R1 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
    R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
    R5는 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 하이드록시, 카르복실, CO(R6), 또는 CON(R6)이고, 여기서 R6은 C1-6 알킬, 또는 5 내지 12 환원의 아릴을 나타내고,
    P, Q, Y 및 Z는 각각 독립적으로 산소원자 또는 황원자이고,
    X는 산소, 황, 또는 NR7이고, 여기서 R7은 수소, 또는 C1-6 알킬을 나타내며,
    n은 1 내지 4의 정수이고,
    R'는 4 내지 7환원의 시클로알케닐을 나타낸다.
  6. 제5항에 있어서,
    용매는 테트라하이드로퓨란, 디클로로메탄 및 아세톤니트릴로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  7. 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 티올 검출용 센서:
    [화학식 1]
    Figure pat00018

    상기 식에서,
    R1 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
    R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
    R5는 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 하이드록시, 카르복실, CO(R6), 또는 CON(R6)이고, 여기서 R6은 C1-6 알킬, 또는 5 내지 12 환원의 아릴을 나타내고,
    P, Q, Y 및 Z는 각각 독립적으로 산소원자 또는 황원자이고,
    X는 산소, 황, 또는 NR7이고, 여기서 R7은 수소, 또는 C1-6 알킬을 나타내며,
    n은 1 내지 4의 정수를 나타낸다.
  8. 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 티올 검출용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00019

    상기 식에서,
    R1 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
    R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
    R5는 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 하이드록시, 카르복실, CO(R6), 또는 CON(R6)이고, 여기서 R6은 C1-6 알킬, 또는 5 내지 12 환원의 아릴을 나타내고,
    P, Q, Y 및 Z는 각각 독립적으로 산소원자 또는 황원자이고,
    X는 산소, 황, 또는 NR7이고, 여기서 R7은 수소, 또는 C1-6 알킬을 나타내며,
    n은 1 내지 4의 정수를 나타낸다.
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물과 티올을 반응시키는 단계를 포함하는 티올을 검출하는 방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00020

    상기 식에서,
    R1 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
    R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 또는 하이드록시이고,
    R5는 수소, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 하이드록시, 카르복실, CO(R6), 또는 CON(R6)이고, 여기서 R6은 C1-6 알킬, 또는 5 내지 12 환원의 아릴을 나타내고,
    P, Q, Y 및 Z는 각각 독립적으로 산소원자 또는 황원자이고,
    X는 산소, 황, 또는 NR7이고, 여기서 R7은 수소, 또는 C1-6 알킬을 나타내며,
    n은 1 내지 4의 정수를 나타낸다.
  10. 제9항에 있어서,
    수용액 내에서 화학식 1의 화합물과 티올 화합물을 반응시키는 티올을 검출하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    수용액의 pH가 5 내지 12인 티올을 검출하는 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    화학식 1의 화합물을 생체 내에 투여하여 생체 내 형광 강도를 측정하는 티올을 검출하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    생체는 어류, 생쥐, 집쥐, 기니피그, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 원숭이, 비비, 또는 침팬지인 티올을 검출하는 방법.
  14. 제9항에 있어서,
    티올 검출은 형광 강도의 증가를 측정하는 것인 티올을 검출하는 방법.
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