KR20110081147A - 시험관 내 진단 및 생체 내 이미지화, 진단 및 치료를 위한 박테리아 베타-락타마제의 용도 - Google Patents

시험관 내 진단 및 생체 내 이미지화, 진단 및 치료를 위한 박테리아 베타-락타마제의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 병원성 박테리아 또는 이와 연관된 병태생리학적 상태를, 형광성, 발광성 또는 비색성 검출제, 예컨대 박테리아 효소들, 케이징된 루시페린 및 형광성 단백질, 루시퍼라제 및 재조합 박테리아에 의해 발현된 효소들에 대한 플루오로제닉 기질들을 사용하여 검출, 진단 및 이미지화시키는 이미지화 방법을 제공한다. 박테리아의 존재 하에서 형광성, 발광성 또는 비색성 검출제에 의해 방출된 신호들은 대조군과 비교하여서 병원성 박테리아를 검출 및 위치확인시킨다. 또한, 잠재적 치료제의 존재 및 부재 하에서 검출제로부터 방출된 형광물질 또는 발광물질을 측정함으로써 병태생리학적 상태들을 치료하는 치료제들을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 또한, 병원성 박테리아의 다른 효소 또는 단백질, 또는 베타-락타마제에 대한 양전자-방출 또는 감마-방출 기질을 사용하는 PET 또는 SPECT 이미지화를 통한 병원성 박테리아를 검출하는 방법. 또한, 플루오로제닉 기질들 CNIR-7 또는 CNIR7-TAT 또는 방사선-표지화된 기질들이 제공된다.

Description

시험관 내 진단 및 생체 내 이미지화, 진단 및 치료를 위한 박테리아 베타-락타마제의 용도{USE OF BACTERIAL BETA-LACTAMASE FOR IN VITRO DIAGNOSTICS AND IN VIVO IMAGING, DIAGNOSTICS AND THERAPEUTICS}
관련 출원 참조
본원의 국제특허출원은, 본원에 전반적으로 인용하고 있는, 미국 35 U.S.C. §119(e) 하에서 2008년 12월 24자로 출원되어 현재 포기된 가출원 61/203,605 및 2008년 8월 6일자로 출원되어 현재 포기된 가출원 61/188,112의 우선권을 주장한다.
본 발명은 일반적으로 약물, 병원성 미생물학 및 이미지화 기술 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 대상물의 생체 내 이미지화 동안 박테리아 병원체를 검출하고 및 위치확인시키는데 유용한 화합물 및 리포터에 관한 것이다.
전세계에 걸쳐 다수의 박테리아 감염들이 상당한 치사율을 초래하고, 대부분의 중요한 박테리아 종은 베타-락타마제 포지티브이며, 이들은 페니실린-유사 항생제에 대한 내성을 갖게 한다. 이들 다수의 감염 및 페니실린 내성의 존재의 진단은 흔히 어려우며, 감수성 측정 전에 광범위한 진단 실험실 배양이 요구된다.
예를 들면, 현재 결핵은 전세계 인구의 대략 1/3에 영향을 미치고, 중대한 대중적 건강 위협으로 남아 있다. 전세계적으로, 쉽게 치료되지 않는 다중 약물 내성과 극도의 약물 내성 균주의 연속적인 존재를 고려할 경우 크게 관심이 증대된다. 실험실 내, 조직 배양 세포 및 감염 중 동물 모델 및 인간의 결핵의 생존성을 정량화 및 평가하는 현존 방법은 집락수(colony forming unit)(CFU)의 측정 및/또는 조직 및 타액의 현미경검사로 한정된다. 이들 방법은 시간-소모적이며, 흔히는 해석하기 어렵고 상대적으로 민감하지 못하다. 대부분의 방법에는 동물 및 인간의 경우에 사후에 실시되어야 하는 침투적 절차들이 요구된다. 이들 불충분한 점들은 동물 모델과 환자 모두에서 질병 진행, 백신 효능 및 치료 성과를 추적하기 어렵게 만든다. 광학적 이미지화 방법들에 의하면, 질병을 앓는 동안 살아있는 동물들을 비침투성 방식으로 사용하여 실시간으로 감염 동안의 결핵 생존성, 치료의 효능 및 박테리아의 위치확인의 직접적인 관찰이 가능하게 된다.
따라서, 당해 분야에서는 박테리아 질병의 이미지화를 위한 개선된 방법이 필요함이 인식되어 있다. 더욱 구체적으로는, 종래 기술에서는, 박테리아 감염을 진단하고 및 위치확인시키는 살아있는 대상물 및 실험관 내에 사용되어 신규 치료제에 대해 신속하게 스크리닝하고 신규 약물 표적을 동정할 수 있는 베타-락타마제 포지티브 박테리아에 대한 민감하고 특이적인 실시간의 광학적 이미지화 방법이 부족하다.
본 발명은 시험관 내 진단 및 생체 내 이미지화, 진단 및 치료를 위한 박테리아 베타-락타마제의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 대상물 내의 병원성 박테리아를 실시간으로 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 대상물 또는 그로부터의 생물학적 샘플 내에 병원성 박테리아의 베타-락타마제에 대한 형광성, 발광성 또는 비색성 기질을 도입시키는 단계; 및 기질 상의 베타-락타마제 활성으로부터의 생성물에 대해 대상물 또는 샘플을 이미지화시키는 단계를 포함한다. 베타-락타마제 생성물에 의해 방출된 신호들이 파장에서 획득되며, 이에 의해 대상물 내의 병원성 박테리아를 검출하게 된다. 본 발명은 방출된 신호의 3D 재구성을 생성시켜서 대상물 내의 병원성 박테리아의 위치를 결정하는 것을 추가로 포함하는 관련 방법에 관한 것이다. 본 발명은 측정된 대조 신호보다 큰 방출된 신호 세기에 기초하여 병원성 박테리아와 연관된 병태생리학적 상태를 실시간으로 진단하는 것을 추가로 포함하는 또 다른 관련 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 대상물 내의 병원성 박테리아와 연관된 병태생리학적 상태를 진단하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 대상물에 투여하거나, 또는 그로부터 유도된 생물학적 샘플을 병원성 박테리아의 베타-락타마제에 대한 플루오로제닉과 접촉시키는 단계; 및 기질 상의 베타-락타마제 활성의 생성물에 대해 대상물을 이미지화시키는 단계를 포함한다. 형광성, 발광성 또는 비색성 신호 세기는, 병태생리학적 상태의 진단이 측정 대조 신호보다 큰 형광성, 발광성 또는 비색성 신호 세기와 관련되도록 생성물에 의해 방출된 형광성, 발광성 또는 비색성 신호 세기를 파장에서 실시간으로 측정된다. 본 발명은 신호의 3D 재구성을 생성시켜서 미생물 병원체의 위치를 결정하는 것을 추가로 포함하는 관련 방법에 관한 것이다. 본 발명은 효과적인 하나 이상의 치료 화합물을 투여하여 병태생리학적 상태를 치료하는 것을 추가로 포함하는 또 다른 관련 방법에 관한 것이다. 본 발명은 플루오로제닉 기질을 대상물에 다시 투여하거나, 대상물을 다시 이미지화시키거나 또는 그로부터 유도된 생물학적 샘플을 상기 플루오로제닉 기질과 접촉시키는 단계; 및 대상물 또는 생물학적 샘플을 이미지화시켜서 치료 화합물의 효능을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하되, 진단시 신호와 비교해서 방출 신호에서의 감소가 병태생리학적 상태에 대한 치료 효과를 지시하는 다른 관련 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 대상물 내의 병원성 박테리아와 연관된 병태생리학적 상태를 치료하는데 효과적인 치료 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 병원성 박테리아에 대한 잠재적 치료 화합물을 선택하는 단계; 박테리아 세포를 형광성, 발광성 또는 비색성 검출제와 접촉시키는 단계; 및 박테리아 세포를 잠재적 치료 화합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 박테리아 세포에 의해 생성된 형광성, 발광성 또는 비색성 신호는, 잠재적 치료 화합물의 부재 하에서의 신호에 비교하여 상기 잠재적 치료 화합물의 존재 하의 신호에서의 감소가 병원성 박테리아에 대한 화합물의 치료 효과를 지시하도록 잠재적 치료 화합물의 존재 및 부재 하에서 측정된다.
본 발명은 또한 병원성 박테리아를 이미지화시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 병원성 박테리아를 플루오로제닉 기질의 베타-락타마제 효소에 대한 기질과 접촉시키는 단계; 기질 상의 베타-락타마제 활성의 생성물에 대한 여기 파장을 병원성 박테리아에 전달하는 단계; 및 생성물로부터 방출된 형광성, 발광성 또는 비색성 신호들을 획득하는 단계를 포함한다. 획득된 신호들의 3D 재구성이 생성되며, 이에 의해 병원성 박테리아를 이미지화시킨다.
본 발명은 또한 CN-7 또는 CNIR7-TAT인 박테리아 베타-락타마제에 대한 플루오로제닉 기질에 관한 것이다.
본 발명은 또한 대상물 내의 병원성 박테리아를 실시간 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 감마 방출과 연관된 동위원소로 방사선-표지화된 기질을 대상물 내에 도입시키되, 상기 기질은 병원성 박테리아에 특이적인 다른 효소 또는 단백질, 또는 베타-락타마제를 위한 것인 단계를 포함한다. 상기 대상물은 방사선-표지화된 기질로부터 감마 방출에 대해 그의 활성 동안 이미지화되고, 방출된 감마선에 의해 생성된 신호들이 획득된다. 감마선 생성된 신호들의 세기에 기초하여 방사선-표지의 대상물 내의 농도의 3D 재구성이 생성되며, 이에 의해 대상물 내의 병원성 박테리아가 검출된다. 본 발명은 병원성 박테리아와 연관된 병태생리학적 상태를 그의 검출에 기초하여 실시간으로 진단하는 것을 추가로 포함하는 관련 방법에 관한 것이다. 본 발명은 효과적인 하나 이상의 치료 화합물을 투여하여 병태생리학적 상태를 치료하는 것을 추가로 포함하는 관련 방법에 관한 것이다. 본 발명은 방사선-표지화된 기질을 대상물에 다시 투여하는 단계; 및 대상물을 다시 이미지화시켜 치료 화합물의 효능을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하되, 진단시 감마 방출과 비교해서 감마 방출에서의 감소는 병태생리학적 상태에 대한 치료 효과를 지시하는 또 다른 관련 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본원에서 기재되는 바와 같이 PET 또는 SPECT 이미지화에 적합한 박테리아 베타-락타마제에 대한 방사선-표지화된 기질에 관한 것이다.
기타 및 추가의 목적, 특징 및 장점들은 개시의 목적으로 제시되고 있는 본 발명의 이하 바람직한 실시양태들에 대한 하기 설명으로부터 분명해질 것이다.
본 발명에 따르면 시험관 내 진단 및 생체 내 이미지화, 진단 및 치료를 위한 박테리아 베타-락타마제의 용도를 제공할 수 있다.
따라서, 이하 분명해지게 되는 앞서 인용된 특징, 장점 및 목적, 및 다른 것들, 더욱 구체적으로는 앞서 간단하게 요약된 발명의 설명은 첨부된 도면에서 예시되는 특정 실시양태를 참조하여 획득되며 상세하게 이해될 수 있다. 이들 도면은 명세서의 한 부분을 형성한다. 그러나, 첨부된 도면은 발명의 바람직한 실시양태들을 예시하며 따라서 이들의 범위를 한정하는 것으로 간주되지 않음을 주의한다.
도 1A 내지 1C는 베타-락타마제에 의한 가수분해 전 및 후의 CC1 및 CC2(도 1A), CHPQ(도 1B) 및 CR2(도 1C)의 구조들을 도시한다.
도 2A 내지 2B는 CNIR1, CNIR2, CNIR3, 및 CNIR4 및 베타-락타마제에 의한 이들의 가수분해의 구조(도 2A) 및 CNIR9 및 CNIR10의 구조(도 2B)를 도시한다.
도 3A 내지 3C는 근적외선 기질 CNIR5를 제조하기 위한 합성 도식(도 3A), 베타-락타마제의 존재 및 부재 하에서의 CNIR5의 형광성 세기 대 파장(도 3B) 및 CNIR5 내지 QSY22의 구조(도 3C)를 도시한다.
도 4A 내지 4D는 QSY21의 구조(도 4A), QSY21 다이설폰에이트의 구조(도 4B) 및 QSY22 다이설폰에이트의 구조(도 4C) 및 QSY22 다이설폰에이트의 화학적 합성(도 4D)을 도시한다.
도 5A 내지 5B는 CNIR7의 구조(도 5A) 및 이의 화학적 합성(도 5B)을 도시한다.
도 6A 내지 6B는 Bluco의 화학적 합성(도 6A) 및 베타-락타마제의 연속 리포터 바이오발광성 검정(sequential reporter bioluminescent assay)(SREL) 이미지화를 위한 Bluco의 사용(도 6B)을 도시한다.
도 7은 CNIR5를 사용하는 대장균 내의 B1a 활성의 검출을 도시한다. 대조군은 형질전환된 대장균이 없는 LB 매질 및 CNIR5를 함유한다.
도 8A 내지 8D는, 10분 동안의 Bla를 사용하는 분할 전후의, CNIR4(도 8A), CNIR5(도 8B), CNIR9(도 8C) 및 CNIR10(도 8D)에 대한 방출 스펙트럼을 도시한다.
도 9A 내지 9B는 CNIR4(도 9A) 및 CNIR5(도 9B) 기질들을 사용하는 대장균 TEM-1 베타-락타마제 및 미코박테리움 결핵 B1a-C 베타-락타마제의 동력학을 도시한다.
도 10A 내지 10H는 CNIR4(도 10A, 10E), CNIR5(도 10B, 10F), CNIR9(도 10C, 10G) 및 CNIR10(도 10D, 10H)과 함께 매질 중에 단독으로 미코박테리움 결핵 박테리아의 형광성 혼입율 및 분배율의 동력학(도 10E 내지 10H)을 도시한다.
도 11A 내지 11H는 CNIR4(도 11A, 11E), CNIR5(도 11B), CNIR9(도 11C, 11G), 및 CNIR10(도 11D, 11H)과 함께 미코박테리움 결핵 박테리아 감염된 대식세포의 미코박테리움 결핵 박테리아의 형광성 혼입율(도 11A 내지 11D) 및 분배율(도 11E 내지 11H)의 동력학을 도시한다.
도 12는 미코박테리움 결핵 감염된 대식세포 내로의 CNIR4의 세포간 혼입을 제시하는 형광성 현미경검사 이미지들을 도시한다. DAPI 염색(청색)은 감염된 세포의 핵을 나타내고, 녹색 형광물질은 GFP 표지화된 M. 결핵으로부터 초래되고, 적색 형광물질은 분할된 CNIR4로부터 초래된 것이다.
도 13A 내지 13E는 108(각각의 마우스에 대한 왼쪽 뒷부분), 107(왼쪽 앞부분), 106(오른쪽 앞부분)으로부터 다양한 농도로 CNIR4(도 13A), CNIR5(도 13B), CNIR9(도 13C) 및 CNIR10(도 13D)의 피내 접종에 의해 미코박테리움 결핵으로 감염된 마우스로부터의 형광물질을 도시한다. 도 13E는 감염에 사용된 박테리아의 각 농도에서 각 화합물에 대한 백그라운드(background)에 대한 신호를 비교한다.
도 14A 내지 14E는 CNIR4(도 14A), CNIR5(도 14B), CNIR9(도 14C) 및 CNIR10(도 14D)에 대해 측정된 에어로졸 접종 및 형광물질 신호에 의한 폐에서의 미코박테리움 결핵으로 감염되어 있는 마우스로부터의 형광물질 이미지이다. 각 도 8A 내지 8D에서, 각 판넬에서의 왼쪽 마우스는 미감염되고, 왼쪽에서 2번째는 blaC 유전자에서 돌연변이된 M. 결핵으로 감염되고, 각 판넬에서 오른쪽 2마리 마우스는 야생형 M. 결핵으로 감염된다. 각 판넬의 오른쪽 3마리 마우스는 이미지화 24시간 전 CNIR4, CNIR5, CNIR9 또는 CNIR10 정맥 내로(i.v.) 제공된다. 도 14E는 등쪽 이미지에서 폐 영역에서의 각 화합물에 대한 신호 대 백그라운드의 그래프이다.
도 15A 내지 15F는 M. 결핵으로 에어로졸에 의해 감염된 마우스로부터의 형광물질 이미지이며, 1시간(도 15A), 18시간(도 15B), 24시간(도 15C) 및 48시간(도 15D)에서 기질 CNIR5를 사용하여 이미지화된다. 배측, 복측 또는 우측 및 좌측 도면 각각에서, 좌측의 마우스는 미감염되고, 우측의 마우스는 감염된다. 모든 마우스는 지적된 시점에서 이미지화 전에 CNIR5를 사용하여 정맥 내 감염되었다. 도 15F는 도 15A의 상부 판넬에서 원으로 그려진 해당 영역으로부터 수득된 형광성 신호를 정량화한 그래프이다.
도 16A 내지 16B는 에어로졸에 의해 M. 결핵으로 감염된 마우스(도 16A) 또는 미감염된 마우스(도 16B)의 형광물질 이미지화를 도시하며, 반사(reflectance)가 아닌 트랜스일루미네이션(transillumination)을 사용함으로써 이미지화시켜 백그라운드 신호를 감소시킨다.
도 17A 내지 17D는 좌측 어깨에서 이종이식된 야생형 C6 종양 및 우측 어깨에서 cmv-bla 안정하게 핵산도입된 C6 종양을 갖는 누드 마우스 내의 CNIR5(7 nmol)를 사용하는 Bla 발현의 이미지화를 도시한다. 도 17A는 지적된 시점들에서 중복된 형광 및 밝은 필드 이미지를 나타낸다. 도 17B는 각 종양의 평균 세기 대 시간의 플롯을 나타낸다. 도 17C는 절개된 종양 및 기관의 이미지를 도시한다. 도 17D는 각 종양들로부터의 추출물 내의 Bla의 CC1 검정의 결과를 나타낸다.
도 18A 내지 18C는 좌측 어깨에서 이종이식된 야생형 C6 종양 및 우측 어깨에서 cmv-bla 안정하게 핵산도입된 C6 종양을 갖는 누드 마우스 내의 CNIR6(7 nmol)을 사용하는 Bla 발현의 이미지화를 도시한다. 도 18A는 CNIR6의 화학적 구조이다. 도 18B는 지적된 시점들에서 겹쳐진 형광 및 밝은 필드 이미지를 나타낸다. 도 18C는 각 종양의 평균 세기 대 시간의 플롯을 나타낸다.
도 19A 내지 19B는 4시간(도 19A) 및 24시간(도 19B) 후의 다양한 조직에서 7.5 nmol CNIR5의 생체분배(biodistribution)를 도시한다.
도 20A 내지 20B는 이미지화제로서 정맥 내 CNIR5를 사용하여 M. 결핵으로 감염된 마우스(도 20A) 및 미감염된 대조 마우스(도 20B)의 생체 내 이미지들이다.
도 21A 내지 21C는 CNIR 프로브를 사용하는 SREL에 대한 검출의 역치를 도시한다. 도 21A는 SREL 이미지화로 베타-락타마제 CNIR 프로브를 사용하여 검출될 수 있는 100마리 미만의 박테리아를 도시하는 막대 그래프이다. 도 21B 내지 21C는 미감염된(도 21B) 또는 M. 결핵으로 감염된(도 21C) 살아있는 마우스의 생체 내 이미지이다.
도 22는 IRDye800 시리즈 플루오로포어(fluorophore)의 구조를 도시한다.
도 23은 세포페라존 및 제안된 CNIR 프로브의 구조를 도시한다.
도 24는 Bluco 기질들의 작은 바이어스드 라이브러리를 구축하는 도해이다.
도 25는 3'-위치에서 알릴 연결기를 함유하는 신규 프로브의 구조들을 열거한다.
도 26는 3'-위치에서 카밤에이트 연결기를 함유하는 신규 프로브의 구조들을 도시한다.
본원의 명세서에서 사용되는 바와 같이, "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원의 청구의 범위(청구항)에서 사용되는 바와 같이, 표현 "포함하는(comprising)"과 결합하여 사용되는 경우, "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "또 다른(another)" 또는 "그 밖의(other)"는 동일 또는 다른 청구 요소 또는 이의 구성요소의 적어도 제 2 또는 그 이상을 의미할 수 있다. 더욱이, 문구에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하며, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 특허청구범위에서의 용어 "또는"은, 개시내용이 단지 대체물들 및 "및/또는"만을 지칭한다는 정의를 지지할지라도, 대체물만을 지칭하거나 또는 그 대체물들이 상호 배타적인 것으로 분명하게 지적되지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "접촉시키는(contacting)"은 PET 또는 SPECT 이미지화에 적합한 플루오로제닉 화합물, 형광성, 발광성 또는 비색성 단백질 또는 방사선-표지화된 기질을 병원성 박테리아, 예컨대 비제한적으로 미코박테리움 결핵(Mbt) 및 미코박테리움 보비스(bovis)(M. 보비스)와 접촉시키는 임의의 적합한 방법을 지칭한다. 생체 내 또는 생체 외에서, 이는 적합한 매질에서 하나 이상의 박테리아 세포를 플루오로제닉 화합물 또는 형광성, 발광성 또는 비색성 단백질에 노출시킴으로써 달성된다. 박테리아 세포는 대상물로부터의 수득된 샘플 내에 존재하며, 상기 샘플은 박테리아를 가질 수 있는 혈액, 타액, 뇨 및 변을 포함하는 흉수 및 기타 체액을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 생체 내 적용을 위해, 본원에 기재되는 바와 같이, 플루오로제닉 화합물, 형광성, 발광성 또는 비색성 단백질 또는 방사선-표지화된 기질의 임의의 공지된 투여 방법이 적합하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "플루오로제닉 기질(fluorogenic substrate)"은 적절한 파장으로 여기 상태에 따라 형광성, 발광성 또는 비색성 신호를 방출 또는 발생하는 생성물을 발생하는 화합물 또는 단백질 또는 펩타이드 또는 기타 생물학적 활성 분자를 지칭한다. 예를 들면, 그리고 이에 국한되지 않고서, 플루오로제닉 기질은 베타-락타마제 또는 루시퍼라제의 존재 하에서 형광성, 발광성 또는 비색성 생성물을 생성시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "방사선-표지화된 기질(radiolabeled substrate)"은 양전자 방출 단층촬영법(Positron Emission Tomography)(PET)을 위한 양전자 또는 단일 광자 방출 계산 단층촬영법(Single Photon Emission Computed Tomography)(SPECT)을 위한 감마선을 방출하는 단명의 방사선동위원소에 부착 또는 이에 연결되거나, 또는 달리 이들로 혼입된 화합물 또는 단백질 또는 펩타이드 또는 기타 생물학적 활성 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "베타-락타마제 포지티브 박테리아(beta-lactamase positive bacteria)"는 질병의 기간 동안 자연스럽게 베타-락타마제 효소를 분비하거나 또는 베타-락타마제를 획득하는 병원성 박테리아를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상물(subject)"은 치료의 임의의 표적을 지칭한다. 바람직하게는, 대상물은 포유동물이며, 더욱 바람직하게는, 대상물은 가축 또는 인간이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 대상물 내의 병원성 박테리아를 실시간 검출하는 방법으로서, 대상물 또는 그로부터의 생물학적 샘플 내에 병원성 박테리아의 베타-락타마제에 대한 형광성, 발광성 또는 비색성 기질을 도입시키는 단계; 기질 상의 베타-락타마제 활성으로부터의 생성물에 대해 대상물 또는 샘플을 이미지화시키는 단계; 및 베타-락타마제 생성물에 의해 방출된 신호들을 파장에서 획득하며, 이에 의해 대상물 내의 병원성 박테리아를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
이 실시양태에 덧붙여, 상기 방법은 방출된 신호의 3D 재구성을 생성시켜서 대상물 내의 병원성 박테리아의 위치를 결정하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 측정된 대조 신호보다 큰 방출된 신호 세기에 기초하여 병원성 박테리아와 연관된 병태생리학적 상태를 실시간으로 진단하는 것을 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 형광성 기질은 플루오로제닉 기질일 수 있다. 플루오로제닉 기질의 예로는 CNIR2, CNIR3, CNIR4, CNIR5, CNIR5-QSY22, CNIR7, CNIR9, CNIR10, CNIR7-TAT, 케이징된 루시페린, 비색성 시약 또는 이들의 유도체들이 있다. 또한, 특정 실시양태에서, 이미지화 파장은 약 540 내지 약 730 nm이다. 또한, 방출된 신호는 약 300 내지 약 900 nm일 수 있다. 모든 실시양태에서, 이미지화 파장은 약 300 내지 약 900 nm이다. 특정 실시양태에서, 비색성 지시는 색 변화에 의해 육안으로 확인할 수 있거나, 또는 장비에 의해 측정하여서 할당된 수치 값을 결정할 수 있다. 더욱이, 상기 병원성 박테리아는 박테로이데스(Bacteroides), 클로스트리디움(Clostridium), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스테필로코쿠스(Staphylococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 하에모필루스(Haemophilus), 레지오넬라(Legionella), 미코박테리움(Mycobacterium), 에스체리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella) 또는 리스테리아(Listeria)의 박테리아 종을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 대상물 내의 병원성 박테리아와 연관된 병태생리학적 상태를 진단하는 방법으로서, 대상물에 투여하거나, 또는 그로부터 유도된 생물학적 샘플을 병원성 박테리아의 베타-락타마제에 대한 플루오로제닉 또는 발광성 기질과 접촉시키는 단계; 기질 상의 베타-락타마제 활성의 생성물에 대해 대상물을 이미지화시키는 단계; 및 생성물에 의해 방출된 형광성, 발광성 또는 비색성 신호 세기를 파장에서 실시간으로 측정하되, 병태생리학적 상태의 진단이 측정 대조 신호보다 큰 형광성, 발광성 또는 비색성 신호 세기와 관련되어 있는 방법이 제공된다.
이 실시양태에 덧붙여, 상기 방법은 신호의 3D 재구성을 생성시켜서 미생물 병원체의 위치를 결정하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 효과적인 하나 이상의 치료 화합물을 투여하여 병태생리학적 상태를 치료하는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 플루오로제닉 기질을 대상물에 다시 투여하고, 대상물을 다시 이미지화시켜서 치료 화합물의 효능을 모니터링하되, 진단시 신호와 비교해서 방출 신호에서의 감소가 병태생리학적 상태에 대한 치료 효과를 지시하는 것을 포함한다. 모든 실시양태에서, 병태생리학적 상태, 병원성 박테리아, 플루오로제닉 기질들 및 여기 상태 및 방출 파장들은 앞서 기재된 바와 같다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 대상물 내의 병원성 박테리아와 연관된 병태생리학적 상태를 진단하는 방법으로서, 대상물로부터 수득된 샘플을 병원성 박테리아의 베타-락타마제에 대한 비색성 기질과 접촉시키는 단계를 포함하되, 기질 상의 베타-락타마제 활성의 생성물이 육안에 보이는 색의 변화를 초래하며 이에 의해 진단을 지시하는 방법이 제공된다. 상기 기질은 스트립(strip), q-tip, 백그라운드 또는 기타 가시적 지시자들에 대해 위치할 수 있다. 상기 색 변화는 육안에 보일 수 있으며, 외부 에너지원으로부터 임의의 여기 상태 또는 장비 없이 확인 가능하다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 대상물 내의 병원성 박테리아와 연관된 병태생리학적 상태를 치료하는데 효과적인 치료 화합물을 스크리닝하는 방법으로서, 병원성 박테리아에 대한 잠재적 치료 화합물을 선택하는 단계; 박테리아 세포를 형광성, 발광성 또는 비색성 검출제와 접촉시키는 단계; 박테리아 세포를 잠재적 치료 화합물과 접촉시키는 단계; 및 잠재적 치료 화합물의 존재 및 부재 하에서 박테리아 세포에 의해 생성된 형광성, 발광성 또는 비색성 신호를 측정하되, 잠재적 치료 화합물의 부재 하에서의 신호에 비교하여 잠재적 치료 화합물의 존재 하의 신호에서의 감소가 병원성 박테리아에 대한 화합물의 치료 효과를 지시하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 이 실시양태에서, 병태생리학적 상태 및 병원성 박테리아는 앞서 기재된 바와 같다.
이 실시양태의 한 양태에서, 병원성 박테리아는, 박테리아를 형광성, 발광성 또는 비색성 검출제와 접촉시키는 단계가, 야생형 박테리아를 형광성, 발광성 또는 비색성 검출제가 포함된 발현 벡터로 형질전환시키는 것을 포함하는 재조합 박테리아일 수 있다. 이 양태에서, 형광성, 발광성 또는 비색성 검출제는 형광성 단백질을 포함할 수 있다. 형광성 단백질의 예로는 mPlum, mKeima, Mcherry 또는 tdTomato가 있다. 또한, 이 양태에서, 발현 벡터는 상기 방법이 베타-갈락토시다제 효소의 존재 하에서 형광성 신호를 방출하는데 효과적인 플루오로포어와 재조합 박테리아 세포를 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 베타-갈락토시다제 유전자를 포함할 수 있다. 플루오로포어의 예로는 C2FDG, C12RG 또는 DDAOG가 있다. 또한, 이 양태에서, 발현 벡터는 상기 방법이 재조합 박테리아 세포를 D-루시페린과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 루시퍼라제 유전자를 포함할 수 있다. 루시퍼라제의 예로는 개똥벌레(firefly) 루시퍼라제, 방아벌레 레드(click beetle red) 또는 rLuc8이 있다.
이 실시양태의 또 다른 양태에서, 형광성 검출제는 박테리아 베타-락타마제의 플루오로제닉 기질일 수 있다. 이 예에서, 병원성 박테리아는 생체 내에서 플루오로제닉 기질인 CNIR2, CNIR3, CNIR4, CNIR5, CNIR5-QSY22, CNIR7, CNIR9, CNIR10, CNIR-TAT, 케이징된 루시페린, 비색성 시약 또는 이들의 유도체와 접촉될 수 있다. 또 다른 예에서, 병원성 박테리아는 시험관 내에서 플루오로제닉 기질인 CC1, CC2, CHPQ, CR2, CNIR1 또는 CNIR6과 접촉될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 병원성 박테리아를 이미지화시키는 방법으로서, 병원성 박테리아를 플루오로제닉 기질의 베타-락타마제 효소에 대한 기질과 접촉시키는 단계; 기질 상의 베타-락타마제 활성의 생성물에 대한 여기 파장을 기 병원성 박테리아에 전달하는 단계; 생성물로부터 방출된 형광성, 발광성 또는 비색성 신호들을 획득하는 단계; 및 획득된 신호들의 3D 재구성을 생성시키며, 이에 의해 병원성 박테리아를 이미지화시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 이 실시양태의 양태들에서, 병원성 박테리아는 앞서 기재된 바와 같이 생체 내 또는 시험관 내에서 플루오로제닉 또는 발광성 기질들과 접촉될 수 있다. 또한, 이 실시양태의 모든 양태들에서, 병원성 박테리아 및 여기 상태 및 방출 파장들은 앞서 기재된 바와 같다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, CNIR-7 또는 CNIR7-TAT인 박테리아 베타-락타마제에 대한 플루오로제닉 기질이 제공된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 대상물 내의 병원성 박테리아를 실시간 검출하는 방법으로서, 감마 방출과 연관된 동위원소로 방사선-표지화된 기질을 대상물 내에 도입시키되, 상기 기질은 병원성 박테리아에 특이적인 다른 효소 또는 단백질, 또는 베타-락타마제에 대응하는 단계; 방사선-표지화된 기질로부터 그의 활성 동안 감마 방출에 대해 대상물을 이미지화시키는 단계; 방출된 감마선에 의해 생성된 신호들을 획득하는 단계; 기질 상의 베타-락타마제 활성으로부터의 생성물에 대해 대상물 또는 샘플을 이미지화시키는 단계; 및 감마선 생성된 신호들의 세기에 기초하여 방사선-표지의 대상물 내의 농도의 3D 재구성을 생성시키며, 이에 의해 대상물 내의 병원성 박테리아를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
이 실시양태에 덧붙여, 상기 방법은 병원성 박테리아와 연관된 병태생리학적 상태를 그의 검출에 기초하여 실시간으로 진단하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 효과적인 하나 이상의 치료 화합물을 투여하여 병태생리학적 상태를 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 방사선-표지화된 기질을 대상물에 다시 투여하는 단계; 및 치료 화합물의 효능을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하되, 진단시 감마 방출과 비교해서 감마 방출에서의 감소는 상기 병태생리학적 상태에 대한 치료 효과를 지시한다. 이들 추가 실시양태에서, 병태생리학적 상태는 결핵일 수 있다.
이들 모든 실시양태의 한 양태에서, 방사선-표지는 양전자-방출 동위원소일 수 있고, 이미지화는 양전자 방출 단층촬영법(positron emission tomography)(PET)에 의한 것일 수 있다. 또 다른 양태에서, 방사선-표지는 감마선을 직접 방출시키는 동위원소일 수 있고, 이미지화는 단일 광자 방출 계산 단층촬영법(single photon emission computed tomography)(SPECT)에 의한 것일 수 있다. 이들 실시양태의 모든 양태에서, 기타 효소 또는 단백질은 베타-락타마제-유사 효소 또는 페니실린-결합 단백질일 수 있다. 또한, 모든 실시양태에서, 박테리아 종류는 앞서 기재된 바와 같을 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, PET 또는 SPECT 이미지화에 적합한 박테리아 베타-락타마제에 대한 방사선-표지화된 기질이 제공된다. 이 실시양태에서, 방사선-표지는 불소-18, 질소-13, 산소-18, 탄소-11, 테크네튬(technetium)-99m, 요오드-123 또는 인듐-111인 기질일 수 있다.
본원에서는 박테리아 질병 및/또는 감염의 광학적 이미지화를 위한 시스템과 방법들이 제공된다. 이들 시스템과 방법들은 질병을 앓는 동안 박테리아의 정량화 및 위치확인을 위한 그리고 항균 약물 활성의 실시간 생체 내 분석을 위한 극도의 민감한 도구이다. 이들 시스템들은 단일 세포 수준에서 박테리아 병원체를 검출하는데 효과적인 것으로 생각된다. 이들 생체 내 이미지화(in vivo imaging)(IVI) 시스템과 방법들은 임상 설정에서 환자들에게 직접 적용될 수 있다.
본원의 상기 시스템 및 방법들은 베타-락타마제 활성을 자연스럽게 점유하거나 또는 획득하는 박테리아 종류에 적용할 수 있다. 국한되지 않고서, 베타-락타마제 포지티브 박테리아 종류의 예로는 박테로이데스, 클로스트리디움, 스트렙토코쿠스, 스타필로코쿠스, 슈도모나스, 하에모필루스, 레지오넬라, 미코박테리움, 에스체리키아, 살모넬라, 쉬겔라 또는 리스테리아가 있다. 미코박테리움, 예컨대 미코박테리움 결핵 및 미코박테리움 보비스의 진단, 위치 및 정량화가 특히 고려된다. 본원에 기재된 시스템과 방법의 장점들이 검출되는 박테리아 균주를 가공할 필요가 없는 것일지라도, 검출의 민감도를 개선시키기 위해서 베타-락타마제의 발현, 활성 및/또는 분비를 개선시키는 방법이 고려된다. 이와 같이, 베타-락타마제 박테리아 종류는 베타-락타마제 발현과 분비를 허용하는 임의의 적용가능한 방법에 의해 이의 민감도 검출을 허용하기에 충분한 수준에서 임의의 해당 박테리아 종류 또는 균주 내로 베타-락타마제를 도입시킴으로써 검출될 수 있음이 고려된다. 이는 포유동물 내로의 적합한 전달 비히클인 파아지를 사용하는 것이 포함되는 공지된 표준 전달 방법들을 사용하여 시험관 내 또는 생체 내에서 달성될 수 있다.
본 발명의 생체 내 이미지화 시스템들은 베타-락타마제 활성을 위한 기질로서 작용하는 화합물 또는 리포터에 의해 생산된 형광성, 발광성 또는 비색성 신호를 검출할 수 있다. 이미지화 시스템들은 당해 분야에 잘 공지되어 있고 시판 중에 있다. 예를 들면, 베타-락타마제 활성의 생성물들을 검출하기 위해서는 연속 리포터-효소 형광(sequential reporter-enzyme fluorescence)(SREF) 시스템, 연속 리포터-효소 발광(sequential reporter-enzyme luminescence)(SREL) 시스템 또는 생체발광성 시스템이 사용될 수 있다. 더욱이, 획득된 신호들은 박테리아 병원체를 위치확인시키는데 유용한 3D 표시를 생성시키는데 사용될 수 있다. 이들 시스템에서, 이미지화 기술에서 통상의 숙련자라면 사용된 화합물 및/또는 리포터 및 검출되는 신호의 유형에 기초하여 여기 및 방출 파장들을 용이하게 선택할 수 있다. 여기 신호의 예는 약 540 내지 약 730 nm 내일 수 있고, 방출 신호는 약 650 내지 약 800 nm 내일 수 있다. 또한, 본 발명의 생체 내 이미지화 시스템들은 또한 적합한 기질 또는 기타 검출제들에 따라 베타-락타마제 활성에 의해 생성된 임의의 검출가능한 또는 판독가능한 신호 또는 방사선에 의해 생성된 것과 같은 기타 신호를 검출할 수 있는 것으로 고려된다.
본 발명의 베타-락타마제 기질들은 화학 기질들 또는 양자(quantum) 도트(dot) 기질들일 수 있다. SREL 또는 SREF를 사용하는 이미지화를 위한 기질들은 예컨대 필요한 적용에 대해 가장 우수한 신호를 제공하는 플루오로포어, 케이징된 루시페린 또는 기타 형광성, 발광성 또는 비색성 화합물, 리포터 또는 기타 검출 시약들일 수 있다. 상기 기질은 임의의 조직 내에 우수한 투과를 허용는 수준에서 및 높은 신호 대 소음 비율에서 매우 낮은 독성 또는 무독성을 갖는다. 신호는 근적외선, 적외선 또는 적색광 신호, 예컨대 약 650 내지 약 800 nm일 수 있다.
예를 들면, 기질들은 시험관 내 또는 생체 내에서 베타-락타마제에 의해 분할에 따라 신호를 생성시키는 플루오로제닉 기질들 또는 양자 도트 기질들일 수 있다. 플루오로제닉 기질들은 FRET 공여체, 예컨대 인도사이아닌 염료, 예컨대 Cy5, Cy5.5 또는 Cy7 및 FRET 켄쳐(quencher), 예컨대 켄칭기(quenching group) QSY21, QSY21 다이설폰에이트, QSY22 또는 QSY22 다이설폰에이트를 포함할 수 있다. 또한, 플루오로제닉 기질들은 세포 투과성을 개선시키기 위해 과아세틸화된 D-글루코사민을 포함할 수 있고/있거나, 작은 펩타이드, 예컨대 비제한적으로 TAT에 연결될 수 있다. 또한, 기질은 이의 신호 세기, 조직 투과성, 특이성, 또는 모든 조직들 내에 잘 분배되는 능력을 개선시키기 위해 개질될 수 있다. 더욱이, 이들 기질과 협조되는 조직, 세포 또는 기타 화합물들에 대한 기타 표지화 방법들이 박테리아 병원체들의 민감도 및 검출을 개선시키는데 유용한 것으로 고려된다.
특히, 플루오로제닉 기질들은 시험관 내 박테리아 세포 배지에서 또는 단일 배양된 박테리아 세포에서 베타-락타마제 활성을 검출할 수 있다. 화학적 플루오로제닉 기질들의 예로는 CC1, CC2, CHPQ, CR2, CNIR1, 또는 CNIR6가 있다. 다르게는, 생체 내 이미지화 적용을 위해, 플루오로제닉 기질들은 CNIR2, CNIR3, CNIR4, CNIR5, CNIR5-QSY22, CNIR7, CNIR9, CNIR10 또는 CNIR-TAT일 수 있다. 이들 플루오로제닉 기질들은 연속 리포터-효소 형광(SREF) 시스템에 유용하다. 베타-락타마제 기질들이 시험관 내 또는 생체 내에서 단일 박테리아 세포를 검출하는데 효과적인 것으로 고려된다.
베타-락타마제의 생체 내 검출에 대한 플루오로제닉 기질의 또 다른 예로는 케이징된 루시페린, 예컨대 비제한적으로 Bluco, Bluco2 또는 Bluco3이 있다. 이 기질은 D-루시페린, 개똥벌레 루시퍼라제의 기질(Fluc), 및 베타-락탐, 베타-락타마제의 기질을 포함한다. 상기 효소에 의한 베타-락탐의 분할은 D-루시페린을 배출하며, 이는 Fluc에 의해 산화에 따라 냉광을 발한다. 케이징된 루시페린은 연속 리포터-효소 형광(SREL) 시스템 또는 기타 생체발광성 이미지화 시스템에 유용하다. 또한, 형광성 단백질은 시험관 내 및 생체 내에서 박테리아 병원체의 검출에 유용할 수 있다. 형광성 단백질(FP), 예컨대 mPlum, mKeima, Mcherry 및 tdTomato는 발현 벡터들로 클로닝된다. 해당 박테리아 병원체, 예컨대 M. 결핵은 FP 구조체로 형질전환된다. 박테리아에 의한 형광성 단백질의 발현은 이미지화에 따라 검출가능한 신호를 생성시킨다. 기타 이미지화 시스템들은 기타 효소들, 예컨대 베타-갈락토시다제를 분비시키도록 형질전환된 재조합 박테리아를 이용할 수 있으며, 이는 플루오로포어, 예컨대 C2FDG, C12RG 또는 DDAOG의 존재 하에서 형광성 신호를 생성시킨다. 또 다른 이미지화 시스템들은 기타 루시퍼라제, 예컨대 D-루시페린의 존재 하에서 신호를 생성시키는 방아벌레 레드 또는 rLuc8을 발현시키는 기타 재조합 시스템들을 이용한다.
다르게는, 양전자 방출 단층촬영법(PET) 또는 단일 광자 방출 계산 단층촬영법(SPECT) 이미지화 시스템들이 사용될 수 있다. 프로브는 베타-락타마제, 베타-락타마제-유사 효소 또는 기타 유사 효소 또는 본원에 기재된 병원성 박테리아의 단백질에 대한 기질을 포함할 수 있다. PET 및 SPECT 이미지화 기술들은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. PET 이미지화 기질 프로브는 양전자-방출 방사선동위원소, 예컨대 비제한적으로 불소-18, 산소-18, 탄소-11 또는 질소-13로 표지화될 수 있다. SPECT 이미지화, 기질 프로브는 감마-방출 방사선동위원소, 예컨대 비제한적으로 테크네튬(technetium)-99m, 요오드-123 또는 인듐-111로 표지화될 수 있다. PET 및 SPECT 프로브는 표준의 공지된 화학적 및 방사선화학 합성 기술들을 사용하여 합성 및 표지화될 수 있다.
프로브의 디자인과 특이성은 베타-락타마제 효소 포켓(pocket)을 모델링하기 위해 작은 분자들, 예컨대 세페로페라존을 사용하여 최대화될 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 이 높은 처리율의 작은 분자 시스템을 사용하면, 기질들은 현존하는 이미지화 장비로 검출가능한 깊은 조직으로부터 투과하고 기타 박테리아 종류와 교차-반응성을 방지하기에 효과적인 신호를 생성시키기 적합하고 진단 목적에 크게 민감하게 디자인될 수 있다. 또한, 이러한 민감하고 특이적인 기질 프로브는 단일 박테리아의 수준에서 효과적이며, 수득되는 신호의 양을 100 내지 1000배로 증가시킬 수 있다. 또한, M. 결핵 내의 베타-락타마제 이외의 베타-락타마제-유사 효소들 및 페니실린-결합 단백질들은 프로브 특이성을 개선시키도록 디자인될 수 있는 것으로 고려된다.
본원에 기재된 시스템과 방법은 실시간으로 박테리아 병원체의 생존성을 검출, 위치, 정량화 및 측정하는데 효과적이다. 이미지화는 시험관 내에서 세포 배지 또는 단일 배양된 세포와 함께, 또는 생체 외에서 SREL 또는 SREF를 사용하는 임상용 샘플 또는 시료와 함께, 또는 생체 내서 임의의 개시된 이미지화 시스템들을 사용하여 대상물 내에서 실시될 수 있다. 시험관 내에 사용된 샘플은 박테리아 병원체를 가질 수 있는 혈액, 타액, 뇨 및 변을 포함하는 생검, 흉수 및 기타 체액을 포함할 수 있지만 이에 국한되지 않는다. 따라서, 본원에 제공된 시스템과 방법들은 병태생리학적 상태, 예컨대 박테리아 병원체와 연관된 질병 또는 감염을 진단하는데 효과적이다. 단일 박테리아를 비롯해 매우 낮은 수준이 검출될 수 있기 때문에, 현존하는 진단 방법들보다 즉각적이고 더 조속한 감염 시점에 진단될 수 있다. 본원에 기재된 시스템과 방법들은 박테리아 감염의 위험에 존재할 수 있는 건강관리 작업자들의 주기적 스크리닝 및 시험에 이용될 수 있다. 또한, 이들 시스템과 방법들은 또한 기기, 가정용품, 시설, 작업 표면, 의류 및 사람들에 대한 오염을 스크리닝 및 검출하는데 사용될 수 있다. 광범위한 약물-내성 결핵(XDR-TB) 스태프(staff) 감염들은 건강관리 작업자들의 40% 미만으로 존재하며, 감염의 주요 영역들이 과도한 세정에 의해 초래되는 비강 및 손의 균열들이기 때문에, 본 발명은 건강관리 센터 및 작업자에서의 박테리아 병원체에 대한 스크리닝 방법에 유용하다. 이들 시스템과 방법들은 필요에 따라 농업 및 동물원에서 베타-락타마제의 검출에 사용될 수 있다.
또한, 신호 강도와 박테리아의 양의 상호관계는 현존 이미지화 기술 범위 내에 있다. 따라서, 화합물, 약물, 약학 조성물 또는 기타 치료제의 효능은 실시간으로 모니터링될 수 있다. 이와 같이, 본원에 기재된 시스템과 방법들은 항균제를 스크리닝하기 위한 높은 처리율 시스템을 제공하게 된다. 베타-락타마제의 검출에는 박테리아 생존성이 요구되기 때문에, 하나 이상의 치료제의 존재 하의 효소 수준이 항미생물 활성의 척도를 제공한다. 특정 박테리아에 적절한 기질들의 사용으로 인해, 베타-락타마제 수준에서의 변화의 신속한 측정 및 치료제의 효과의 거의 즉각적인 측정이 가능하게 된다. 처리 시스템들은 마이크로플레이트 내에서 동시에 단일 샘플로부터 수천개까지에 대해 유용하다.
하기 실시예들은 발명의 다양한 실시양태들을 예시하고자 제시되며, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
배지에서 M. 결핵 내 Bla 의 검출
나이트로세핀(Nitrocefin)(칼바이오켐(Calbiochem)), CENTA Bla 기질(칼바이오켐), 플루오로실린 그린(Fluorocillin Green)(몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)), CCF2-AM(인비트로젠(Invitrogen)) 및 CCF4-AM(인비트로젠)을 비롯한 잠재적 플루오레제닉(fluoregenic) 화합물 및 공지 화합물을, 초기 대수기(log-phase)까지의 전체 세포 및 전체 세포 용해물을 사용하여 Mtb 내의 Bla의 검출을 위해 비교한다. 유의적인 신호를 생성하는 박테리아의 최소 개수 또는 용해물의 양을 측정하기 위해 이들 샘플 모두에 대해 희석물을 검정한다. 무손상 세포를 사용하는 검정의 전후 및 용해물에 대한 용해 전, 사용된 실제 CFU의 개수를 측정하기 위해 적정들을 실시한다. 37℃에서 15 내지 120분 동안 박테리아 배양 배지 내에서 96-웰 플레이트를 사용하여 4회 분광광도법으로 민감도 및 재생산성을 평가한다. 초기에, CNIR5에 대해 제조업자에 의해 권고된 농도, 2 nM, 즉 생체 내 이미지화에 사용되는 것에서 화합물을 사용한다. 최대 신호에 필요한 최소 농도를 결정하기 위해 배양 배지에서 가장 민감하고 재생산가능한 화합물의 여러 농도를 평가한다. 이들 실험들에 대한 대조군은 포지티브 대조군 엠 스메그마티스(M. smegmatis) 및 시판 중인 Bla(시그마(Sigma))를 포함하며, 네거티브 대조군은 Bla(1)이 부족한 Mtb blaC 돌연변이체(PM638, 파벨카 박사(Dr. M. Pavelka)에 의해 제공됨, 로체스터 대학(University of Rochester))이다. BCG에 의한 Bla의 생산이 또한 평가되는데, 이는 일부 경우 광범위한 이미지화 장비가 쉽게 구입가능한 BL2에서 IVI에 대해 BCG를 사용하기 때문이다.
blaC 돌연변이체 및 야생형 결핵 내의 재조합 Bla 구조체의 평가
Mtb 내 Bla의 발현을 위해 2개의 멀티-카피(multi-copy) 및 2개의 싱글-카피(single-copy) 벡터를 사용한다. 상기 멀티-카피 벡터들은 보통 수준에서 유전자들을 발현시키는 것으로 보여지는 pMV262로부터의 hsp60 프로모터(Phsp60)을 갖는 pJDC89에 기초한다. 이 벡터는 또한 하이그로마이신(hygromycin) 내성, Phsp60의 폴리링커(polylinker) 다운스트림, 복제의 대장균 기점 및 복제의 미코박테리아 pAL5000 기점을 갖는다. 이 벡터로부터의 발현을 증가시키기 위해, Phsp60은 L5 프로모터(PL5)로 교체되며, 이는 Phsp60보다 50 내지 100배 높은 수준에서 유전자들을 발현시킨다. 프로모터 둘다는 상대적으로 본질적인 구성이며, 대부분의 생체 내 조건 하에서 발현되어야 한다. 달리 언급이 없는 한, 대부분의 클로닝은, 해당 영역의 PCR에 사용되는 프라이머에 대해 상동성의 15 bp 최소 영역을 사용하는 임의의 선형화된 구조체 내로의 분절의 직접적 클로닝을 허용하는 인-퓨전(In-Fusion) 2.0 PCR 클로닝 시스템(클론테크(Clontech))를 사용하여 실시한다.
2개의 구조화된 벡터를, 각 프로모터의 좌측 및 우축 게이트웨이(Gateway) 재조합 서열 다운스트림 모두 및 ccdB 유전자를 함유하는 PCR 분절을 클로닝함으로써 게이트웨이(인비트로젠) 도너 벡터로 개질시킨다. 이 영역을 갖는 벡터들은, 이 영역을 유지시키는 ccdB 서바이버(Survivor) 균주 내에 유지되어야 하는 반면; 다른 대장균 균주에서, 이 영역은 치사성을 가질 것이며 클로닝 동안 비-재조합 벡터의 유지를 막는데 사용된다. 이들 프로모터들 및 관련 게이트웨이 영역들은 pYUB412 내로 클로닝되며, 이들은, 미코박테리아 염색체 내에서 attB 부위 내에서 통합되고 미코박테리아에 의해 싱글-카피로 안정하게 유지되도록, 하이그로마이신 내성, 복제의 대장균 기점, L5 파아지 부착 부위(attP) 및 L5 재조합효소를 갖는다. Mtb Bla는 게이트웨이 BP 반응을 통해 게이트웨이 재조합 서열을 갖는 프라이머를 사용하는 PCR(인비트로젠)에 의해 이들 벡터 각각 내로 클로닝된다. 이들 벡터는 앞서 기재된 바와 같이(2) 전기천공(electroporation)에 의해 Mtb 및 blaC 돌연변이체 내로 형질전환된다. 생성된 Mtb 균주들은, 네거티브 대조군으로서의 blaC 돌연변이체 및 적절한 벡터 주쇄를 단독을 갖는 야생형의 것과 비교하여, 내인성 Bla 및 신호 세기의 분석에 대해 기재된 시험관 내 검정을 사용하여 검출에 대해 평가한다.
CNIR5가 비록 높은 막 투과성이더라도, 박테리아 단독보다 넓은 표면적의 리포터를 갖고 화합물에 대한 접근성이 개선된 숙주 세포막에 대해 Bla를 표적화시킴으로써 신호의 강도는 증가될 수 있다. 미코박테리아 포식소체는 재순환성 엔도솜 내에 존재하는 일부 마커를 가질 뿐만 아니라 경로들을 재순환하는 일부 지질 및 수용기와 상호작용하여 정적 상태가 아니기 때문에, 적절하게 표적화된 단백질은 미코박테리아 포식소체를 통해 숙주 세포의 원형질막에 대한 접근성을 가져야 한다. Mtb Bl는 그의 아미노기 말단기 내에 위치하는 TAT 신호를 통해 박테리아로부터 분비하며, 이로 인해 이 단백질을 원형질막에 가하는 카복시 말단 태그가 생성된다. 글리코실포스파티딜리노시놀(GPI) 고정된 단백질, 예컨대 대식세포의 표면에 대해 잘 발현되는 CD14는 카복시-말단 신호 서열을 통해 원형질막에 국한시킨다.
융합(fusion)(Bla::GPI)은 CD14로부터의 카복시-말단 24 아미노산 GPI 고정 단백질 신호 서열 및 Mtb로부터의 Bla로 구성된다. 그 다음, 이 융합 단백질은 게이트웨이 시스템을 사용하여 Mtb에 대해 4개의 모든 발현 시스템들 내에서 위치확인시키고, 야생형 Mtb 및 blaC 돌연변이체 모두로 형질전환된다. Bla::GPI를 발현시키는 생성된 균주, 네거티브 대조군으로서의 blaC 돌연변이체 및 본래의 Bla는 세포간 검정을 사용하여 감염 대식세포의 표면에 대한 Bla의 수준에 대해 평가한다. 모든 미손상 감염 대식세포 및 0.1% 트리톤(triton)으로 용해된 것들을 검사한다.
가수분해 전후의 기질들의 형광성 스펙트럼
여기 및 방출 스펙트럼을 1 μM 농도에서 PBS 용액 1 mL 중에 수거한다. 이 용액에, 정제된 Bla 10 nM을 첨가하고, 추가 변화가 없을 때까지 여기 및 방출 스펙트럼을 수거한다. Bla 가수분해 후 프로브의 형광물질 신호에서의 증가는 피크 방출 파장인 690 nm에서 방출 세기를 비교함으로써 예측된다.
Bla 기질로서의 프로브의 시험관 내 효소 동력학
약 690 nm에서 형광 세기에서의 증가율(v)은 프로브 가수분해율의 척도로서 사용한다. 비율(v)은 Mtb Bla 1 nM의 농도에서 5, 10, 20, 50, 80 μM의 여러 농도에서 측정한다. 기질의 가수분해율(1/v) 대 기질 농도(1/[프로브])의 이중 역수 그래프(double-reciprocal plot)를 사용하여 Bla 가수분해에 대한 프로브의 kcat 및 Km의 값들을 예측한다.
기질의 생체안정성
생리학적 상태 하의 기질의 자발적 가수분해율은 또한 약 690 nm의 형광 세기에서의 증가율로부터 예측될 수 있다. 따라서, 수성 완충액 및 혈청 중의 기질의 안정성은 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후 형광 정량화함으로써 쉽게 평가될 수 있다.
배양된 세포의 Bla 발현 이미지화
공개된 이미지화 조건들(3)을 사용하여, 핵산감염된(transfected) Bla(cmv-bla) 및 야생형 Jurkat 및 C6 신경교종 세포주, 및 형광 현미경검사를 사용한 이미지로 기질을 시험한다.
mRNA 수준들과 NIRF 신호들 사이의 선형 관계
5x105/mL의 세포 밀도에서 다양한 비율로(10%, 20%, 40%, 60% 및 80%의 cmv-bla 세포) 야생형 및 cmv-bla Jurkat 세포들을 혼합한다. 세포들의 각 혼합물 중의 기질 5 μM를 30분 동안 항온처리한 후, 각 샘플을 차가운 PBS로 세척하고, 원심분리시키고, 용해시킨다. 최종 상청액에 대해 형광 측정한다. mRNA 및 Bla의 효소의 수준을 노던 분석을 사용하여 정량화한다. mRNA 농도 대 Cy5.5 형광 세기의 플롯에 의해, 이들 사이의 선형적 관계가 존재하는지에 대해 판명된다.
배양액 내의 결핵 베타- 락타마제의 위치확인 및 조정
Bla의 전사는 0.05의 O.D.에서 접종하고 정지상까지 성장하는 Mtb 성장 곡선에 걸쳐 qRT-PCR에 의해 검사된다(O.D. = 2). 전사 수준은, 동일한 배양액의 분취물들로부터 매일 RNA를 단리시킴으로써 평가되고, 모든 배양액은 3개씩 성장시킨다. RNA 단리(4) 및 SYBR Green을 사용하는 qRT-PCR(5)은 앞서 기재된 바와 같이 실시한다. RNA 수준은 성장 곡선에서 1 또는 2개의 주요 지점에서 노던 블로팅에 의해 확인하며, 모든 측정은 16S rRNA에 대해 정규화한다. 데이터는 전체 박테리아 및 전체 세포 용해물을 사용하여 동일한 조건 하에서 Bla 활성의 측정치에 대해 나이트로세핀으로 비교한다.
blaC를 유인하는 베타-락탐의 능력을 검사한다. RNA 전사는 성장 곡선 전반에 따라 동일한 방식으로 베타-락탐의 존재 및 부재 하에서 분석한다. Bla-네거티브 Mtb를 죽이는 카베니실린(carbenicillin) 50, 250 및 500 μg/ml를, 2시간 동안 초기 대수기까지 성장한 Mtb와 동시 항온처리하고, blaC 전사체의 수준을 전체 세포들 및 전체 세포 용해물 중의 Bla 활성에 따라 결정한다. Bla의 수준은 시판 중인 Bla(시그마)로 구성된 표준 곡선을 사용하여 정량화하고, 동일한 방식으로 성장시킨 Mtb blaC 돌연변이체는 Bla 활성에 대한 네거티브 대조군으로서 포함될 것이다.
대식세포 내의 Bla 검출
기본적으로, J774A.1 세포들을 96-웰 평탄한 바닥 플레이트에서 1 x 104 세포/웰로 씨딩하고, 37℃에서 밤새도록 항온처리한다. 초기 대수기까지 성장시킨 Mtb의 단일-세포 현탁액을 세포마다 1000 내지 0.001 박테리아의 다수의 감염으로 첨가하고, 30분 동안 37℃에서 항온처리한다. 그 다음, 웰을 PBS로 2회 세척하고, 신규 배지에 200 μg/ml 아미카신(amikacin)을 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 항온처리하여 세포 외 박테리아를 죽인다. 그 다음, 웰을 PBS로 세척하고, 60 내지 180분 동안 여러 농도의 시험 화합물과 더불어 신규 매질 중에 항온처리한 후, 분광계로 신호를 측정한다. 이중 웰들을 0.1% 트리톤 X-100으로 용해시킨 후, 화합물을 첨가하여 수득된 측정치에서의 숙주 세포 투과성의 역할을 평가한다.
모든 시점에서, 세포와 연관된 CFU의 수를 측정하는데 4개의 미처리된 웰을 사용한다. 신호의 위치확인은 가장 효과적인 것으로 증명되는 화합물에 대해 형광성 현미경검사에 의해 확인한다. 현미경검사 검정은, 신호를 위치확인시키고, 포지티브 신호로 박테리아의 백분율을 결정하고 위치확인된 신호의 세기를 평가하도록 8-웰 챔버 슬라이드를 사용하는 것을 제외하고는 유사한 방식으로 실시한다.
생검 및 약동력학
마취된 마우스를 주사 후 여러 시간 간격으로(30분, 240분, 12시간, 24시간, 48시간 및 72시간) 경추 탈구에 의해 희생시킨(각 시점에 3마리 마우스)다. 혈액 샘플을 심장천자(cardiac puncture)에 의해 수거하고, 조직(종양, 심장, 신장, 간, 방광, 위, 뇌, 이자, 소장, 대장, 폐 및 비장)을 형광계에 의해 근적외선 형광성을 측정하도록 신속하게 수확한다. 데이터는 조직의 그램당 형광성 단위(FU)로서 표기한다[FU/(g 조직)].
베타- 락타마제 활성 검정
하기 프로토콜을 사용하여 이종이식된 종양 내의 Bla의 효소 수준을 측정한다. 차가운 PBS를 2회 사용하여 수확된 종양을 세척하고; 프로메가(Promega)로부터 용해 완충액을 첨가하고(4 mL/g 조직), 조직 용액을 균질화시키고; 상기 균질화물을 3회 동결 및 해동시키고; 원심분리에 의해 상청액을 수거하고; 플루오로제닉 기질인 CC1을 사용하여 Bla 활성을 검정한다. 퀴아젠 인코포레이티드(Qiagen Inc.)으로부터의 RNA 추출 프로토콜에 따르고 RT-PCR 검정을 실시함으로써 cmv-bla 종양 내의 Bla의 mRNA를 확인한다. 이들 측정치에 의해, cmv-bla 핵산감염된 종양들 내의 관찰된 근적외선 신호가 Bla 활성과 관련되어 있는지에 대해 확인된다.
생체 내 Bla RNA 발현의 측정
결핵에 관한 표준 RNA 추출 프로토콜(6)을 사용하고 구성적 대조군 rRNA 유전자와 비교하는 qRT-PCR을 실시함으로써 생체 내 발현된 Bla RNA를 추출한다. 이들 측정치는 관찰된 IVI 신호의 수준들과 비교함으로써 모든 조질들 내의 Bla의 발현 수준들을 평가하는 수단을 제공한다. 수확된 RNA 수준들이 RT-PCR에 의해 검출가능한 수준 미만이며, 아직 정량가능한 CFU가 조직 내에 존재한다면, DNA를 높은 신뢰도의 선형 방식으로 증폭시키는 능력을 갖는 phi29 중합효소를 사용하는 RT-PCR(피델러티 시스템즈(Fidelity Systems)) 전에 cDNA를 증폭시키며, 이로 인해 주형 증폭-후의 진정한 정량화가 가능하게 된다.
생체 내 Bla 균주의 발현, 안정성 및 독성
4마리 Balb/c 마우스의 8개 군을 에어로졸에 의해 100 내지 1000 cfu/폐로 감염시킨다. 박테리아 균주를 -80℃ 스톡(stock)으로부터 해동시키고, 27G 주사기 바늘을 통해 2회 통과시켜 단일 세포 현탁액을 생성시키고, 에어로졸 감염에 사용한다. 폐 공간에 직접 소적을 전달하도록 디자인되어 있는, 위스콘신 대학(University of Wisconsin)에서 제조한 매디슨 챔버('Madison' chamber)를 사용하여 에어로졸 감염을 실시한다(7-10). 독성 결핵 균주를 취급하도록 디자인된 인증된 ABSL3 시설들에서 Mtb로의 감염을 실시한다. 감염된 마우스를 컴패러티브 메디슨(Comparative Medicine) 센터에서 ABSL3 봉쇄 시설 안에서 부검할 때까지 사육한다. 각각의 박테리아 균주(JBlaC 및 WT)에 대한 4마리 마우스의 한 군을 모든 시점에서 부검하여서(1, 14, 28 및 72일), 본원에 기재된 바와 같이 나이트로세핀(Nitrocefin)을 사용하여 CFU, 폐 및 비장 내의 blaC 및 Bla 활성에 대한 RNA 수준, RNA 전사 수준 및 Bla 활성을 측정한다.
IVI에 대한 징후를 나타내는 2개의 재조합 균주에 대하여 생체 내 재조합 Bla 발현의 독성에 대한 안정성 및 효과를 검사한다. 4마리 Balb/c 마우스의 12개 군을 본원에 기재된 바와 같이 에어로졸에 의해 100 내지 1000 cfu/폐로 감염시킨다. 각각의 박테리아 균주(야생형, 구조체 1 및 구조체 2)에 대한 4마리 마우스의 한 군을 모든 시점에서 부검하여서(1, 14, 28 및 72일) CFU를 측정할 것이며, 조직병리학적으로 실시하여서 폐 및 비장 내의 적절한 구조체 및 Bla 활성의 존재를 측정한다. CFU 적정 판들로부터 20개 이상의 개별 콜로니 상에서 실시된 Bla 검정들을 사용하여서 구조체를 갖는 박테리아 집단의 백분을 측정한다. 균질화된 조직에 대해 Bla 활성 검정들을 실시하여서 잔존하는 Bla의 모든 수준을 평가한다. 본원에 기재된 바와 같이, 나이트로세핀을 사용하여 Bla 활성을 평가할 것이다.
실시예 2
세포 이식 모델을 사용하는 생체( intra - vital ) 현미경검사 이미지화
다기능 도너 Tr, CD8+ T 세포, 단핵세포, 대식세포 및 가지세포를 BCG로 감염된 선천성 마우스 내에 이식하고, 시간 경과에 따른 이들 세포의 분배를 생체 내 생체발광 이미지화(bioluminescence imaging)(BLI) 및 이미지-가이드 생체 현미경검사(image-guided intravital microscopy)(IVM)로 이미지화시킨다. 베타-액틴 프로모터에 의해 루시퍼라제가 생성된 한 라인의 선천성 마우스는, 비선천성 동물들에게서 빛을 발하는 조직과 세포의 근원을 제공한다(11-12). 이 마우스 라인(L2G85)은, 개똥벌레 루시퍼라제로부터 밝은 생체발광(Fluc)을 나타내지만, 약한 GFP 형광을 나타내서, 림프구세포에서 강한 GFP 발현 및 형광을 나타내는 분리된 라인과 쌍을 이루었다. 다기능 도너 줄기 세포 및 기타 세포의 부분적 분배는 이것들이 확산되거나, 재분배되거나 또는 제거됨에 따라 수용체 내의 BLI를 뒷따를 수 있고, 검출된 세포는 후속적으로 GFP가 사용된 IVM에 의해 가시화될 수 있다.
L2G85 마우스를 FVB 백그라운드에서 구조화시켜서, FVB/NJ(잭슨 랩스(Jackson Labs)) 야생형 마우스를 L2G85로부터의 세포에 대한 수용체로서 사용하며, 이는 이식된 세포의 거부반응을 막는다. 총 80마리 FVB/NJ 마우스를 20 μl 염수 중의 BCG의 104 CFU로 비강 감염시킨다. 4마리 마우스를 24시에 희생시켜서 후감염 폐 속의 초기 CFU를 측정한다. 감염 후 14일, 추가로 4마리 마우스를 조직병리학적 시험을 위해 희생시키고 폐 및 비장 속의 CFU를 측정한다. 또한 14일에, 잔존하는 72마리 마우스를 4개의 군들로 나누며, 이들은 L2G85 Tr, CD8 T 세포, 단핵세포, 대식세포 또는 가지세포를 가지거나, 또는 세포를 갖지 않으며(대조군), 이들은 꼬리 정맥 I.V.에 의해 도입된다. 28, 42 및 56일, (대조군을 포함한) 4마리 마우스의 6개 군들을 앞서 기재된 바와 같이(12) D-루시페린의 존재 하에서 이미지화시킨다.
이미지화 후, 섬유 광학 대물 형광성 현미경(fiber optic confocal fluorescent microscope)(셀-비지오(Cell-viZio), 마우나 케아(Mauna Kea))을 사용하는 생체 현미경검사(IVM)에 의해 명백한 손상의 더욱 상세한 검사를 실시한다. IVM은 수만개의 광섬유로 구성된 가요성 미니-프로브를 사용한다. 일반적인 마취를 실시하고, 그 부위를 신속하게 치료하는 작은 절개를 통해 탐침하며, 이는 수술 후 동물을 희생시킬 필요가 없고 세포 수준에서의 가시화될 수 있다.
세포들이 도입된 마우스에서 신호가 발견되는 폐와 기타 기관 내의 CFU를 측정하기 위해 이미지화 후에 대조군 마우스를 희생시킨다. 광자 방출의 근원을 더욱 잘 측정하기 위하여 등, 배 및 2개의 측면 이미지들을 수득한다. 조직을 절개하고, D-루시페린 중에서 신규 조직들을 항온처리하며, 이들을 중첩된 조직들 없이 이미지화함으로써 하위세트의 동물들 중에서 추가로 확인한다. 형광성 현미경검사에 대해 명백하게 감염된 모든 조직에 대해 정밀한 조직병리학을 실시하여서, GFP 발현 이식 세포들을 가시화하고, 헤모톡실린(haemotoxylin) 및 에오신(eosin) 및 산-견뢰성 염색(acid fast stain)을 실시하여서 조직 내의 박테리아 및 세포를 동정한다.
육아종 형성 동안 개별 박테리아 및 면역 세포에 대한 생체 내 이미지화
이식 모델을 사용하여, 육아종 형성을 가시화할 수 있는 2개의 이식된 세포 유형을 선택하여서 살아있는 마우스와 함께 박테리아 및 숙주 세포 모두를 가시화하는데 사용한다. 3개의 시점들을 선택한다. 손상이 바로 가시화되고, 잘 형성되고, 가장 마지막으로 이식 세포로부터 신호가 관찰될 수 있는 3개의 시점을 선택한다. 총 32마리 FVB/NJ 마우스를 20 μl 염수 중 IVI 리포터, 예컨대 tdTomato를 발현하는 BCG의 104 CFU로 비강 감염시킨다. 4마리 대조군 마우스의 또 다른 군은 미감염시킨다. 4마리 실험 마우스를 24시에 희생시켜서 감염 후 폐 내의 초기 CFU를 측정한다. 감염 14일 후, 추가로 4마리 실험 마우스를 조직병리학을 위해 희생시키고 CFU 폐 및 비장 내 CFU를 측정한다. 또한, 14일, 잔존하는 24마리 마우스를 4개의 군으로 나누며, 이들은 대조군으로서 세포를 갖지 않는 12마리와 함께 이들 중 12마리 내에 꼬리 정맥 I.V.에 의해 도입된 육아종 형성을 가시화할 수 있는 L2G85 세포를 갖는다. 3개의 시점에서, 4마리의 마우스의 2개의 군들(세포가 있는 것 대 세포가 없는 것)을 D-루시페린의 존재 하에서 앞서 기재된 바와 같이(12) 이미지화시킨다.
이미지화 후, 섬유 광학 대물 형광성 현미경(셀-비지오, 마우나 케아)을 사용하는 생체 현미경검사(IVM)에 의해 명백한 손상의 더욱 상세한 검사를 실시한다. 일반적인 마취를 실시하고, 그 부위를 신속하게 치료하는 작은 절개를 통해 탐침한다. 세포들이 도입된 마우스에서 신호가 발견되는 폐와 기타 기관 내의 CFU를 측정하기 위해 이미지화 후에 대조군 마우스를 희생시킨다. 광자 방출의 근원을 더욱 잘 측정하기 위하여 등, 배 및 2개의 측면 이미지들을 수득한다. 동물의 하위세트에서, 조직을 절개하고, D-루시페린 중에서 신규 조직들을 항온처리하며, 이들을 중첩된 조직들 없이 이미지화함으로써 추가로 확인한다. 절개된 조직 내의 이식 세포들 및 박테리아 신호 모두에 대해 필터 세트를 사용한다. 형광성 현미경검사에 대해 명백하게 감염된 모든 조직에 대해 정밀한 조직병리학을 실시하여서, GFP 발현 이식 세포들 및 박테리아 리포터 신호를 가시화하고, 헤모톡실린 및 에오신 및 산-견뢰성 염색을 실시하여서 조직 내의 박테리아 및 세포를 동정한다.
이미지화 분석
수거된 이미지들은 제노젠 인코포레이티드(Xenogen Inc.)로부터의 시판 중인 소프트웨어 라이빙 이미지(Living Image)를 사용하여 PC 컴퓨터 상에서 처리한다. 해당 부위(Regions of interest)(ROI)를 전 몸체 형광 이미지에 대한 종양들에 걸쳐 도식화한다. IVIS 이미지화 시스템의 주요 특징들 중 하나는, 분광 방사상 소오스(spectral radiance source)를 추적할 수 있는 국립 표준 기술학회(National Institute of Standards and Technology)(NIST)에 대해 눈금표시된 것이다. 이 눈금표시는 이미지 시간 및 비닝(binning)을 설명함으로써 대상 표면에 대한 CCD 카메라 카운트의 방사상으로의 전환을 제공한다. 따라서, 생성된 이미지는 표면 방사상의 물리적 단위(광자/초/cm2/sr)로 표시한다. 미감염된 마우스, 대조군 마우스 및 정상 조직으로부터 ROI로부터의 통합된 신호(광자/초의 단위)는 여러 마우스와 비교한다(미감염:대조군:정상 조직 비율). 그래프패드 프리즘 3.0(GraphPad Prism 3.0)(그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software), 캘리포니아주 샌디에고 소재)을 사용하여 통계 분석을 실시할 것이다. 유의 수준은 P < 0.05로 설정한다.
실시예 3
베타- 락타마제 검출을 위한 플루오로제닉 기질
CC1 , CC2 , CHPQ 및 CR2
플루오로제닉 화합물 CC1, CC2, CHPQ 및 CR2는 시험관 내 및 단일 배양된 세포 내의 Bla 활성을 검출하는데 효과적이다. 이들 프로브는 Bla에 의해 가수분해 전에 형광성이 아니며 Bla 반응 후 형광성이 된다(도 1A 내지 1B). 광범위한 여러 형광 방출은 필요에 따라 선택되어서 CC1 및 CC2의 청색, CHPQ의 녹색, CR2의 적색으로 Bla를 검출할 수 있다. 이들 신규 플루오로제닉 기질들은 CCF2보다 작고, 제조하기 쉽고, 사용하기 간편하고, Bla 활성을 검출하기 위한 민감도가 높고, 다양한 생물학적 샘플에서 Bla 활성의 검출을 촉진시킨다.
락탐의 3' 탄소와 이탈기 사이의 올레핀 기의 삽입은 Bla에 의한 가수분해의 동력학적 효율을 개선시키는데 도움이 된다. 예를 들면, CC1에 대한 kcat의 값은 174 s-1이지만, 삽입된 이중결합 없이 그의 동종체의 kcat의 값은 단지 35 s-1이다. 촉매 효율에서 약 5배 증가가 있다. 이 디자인은 전체 동물 형광 이미지화를 위한 근적외선 기질을 포함하는 Bla에 대한 광범위한 플루오로제닉 기질을 창출하는 총체적인 전략으로서 제공될 수 있는 것으로 고려된다.
또한, 프로브가 신규 켄쳐 QC-1 및 근적외선 플루오로포어 IRDye 800CW로 개선될 수 있는 것으로 고려된다. 또한, IRDye-기초 프로브는 설폰에이트 기의 첨가에 의해 개질될 수 있다.
CNIR1 , CNIR2 , CNIR3 , CNIR4 , CNIR 5, CNIR9 및 CNIR10
전체 몸체 형광 이미지화를 사용하여 살아있는 동물들 내의 Bla 발현을 이미지화시키기 위해, 근적외선/적외선 플루오로제닉 기질은 적외선/근적외선 광이 더욱 잘 조직을 투과하고 가시광선보다 덜 광 산란을 가지며 헤모글로빈에 의해 크게 덜 흡수되기 때문에 유리하다(13). 화합물 CNIR1, CNIR2, CNIR3, CNIR4, CNIR5, CNIR9 및 CNIR10은 배양된 세포 내의 Bla 발현을 이미지화시키기 위한 일련의 근적외선 플루오로제닉 기질들이다(도 2A 내지 2B). 이들 화합물은 Bla에 대해 세포-투과가능한 근적외선 플루오로제닉 기질을 구축하기 위한 골격으로서 유용하며, 세포간 또는 동물들 내에서의 박테리아에 대한 프로브의 이용가능성에 대한 효과를 검사하는데 사용될 수 있다.
리포팅 Bla 활성은 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer)(FRET)에 기초한다. 프로브는 FRET 도너 및 FRET 켄쳐를 함유한다. 생체 내 이미지화를 위해, 플루오로포어는 650 nm 초과에서의 방출 및 낮은 독성을 이상적으로 가져야 한다. 인도사이아닌 염료(Cy5, Cy5.5 및 Cy7)는 650 내지 800 nm의 방출을 가지며, 리포팅된 부작용이 거의 없이 수만명의 환자에게서 사용되어 왔다. 따라서, Cy5는 FRET 도너로서 선택된다. 그 자체는 형광성이 아닌 켄칭기 QSY21은 660 nm에서 피크를 갖는 540 내지 730 nm의 넓은 흡수 스펙트럼을 가지며, Cy5의 방출에 대해 효과적인 켄쳐인 것으로 입증되어 있다.
CNIR1은 본질적으로 비형광성이지만, Bla로 처리함에 따라 660 nm의 파장에서 방출 세기에서의 57배 증가로 고도의 형광성 생성물을 생성시킨다(14). 그러나, CNIR1 자체는 세포-투과가 불가능하며, 이로 인해 생체 내 Bla를 이미지화할 수 없다. CNIR1의 막 투과성을 개선시키기 위해, CNIR1은 과아세틸화된 D-글루코사민과 공액결합되고, CNIR3은 우수한 세포-투과성이며 단일한 살아있는 세포에서 Bla 발현을 이미지화할 수 있다. QSY21에 대해 2개의 설폰에이트기를 첨가하여 가용성을 개선시키면 CNIR4가 산출된다.
CNIR5 및 CNIR6
CNIR1 내지 CNIR4는 모두 Cy5에 기초한다. 생체 내 동물 이미지화를 위해, Cy5.5가 더욱 바람직한데, 이는 그의 더욱 긴 방출 파장 때문이다. 따라서, Cy5는 Cy5.5로 대체하였고, CNIR5는 합성하였다(도 3A). 최종 생성물을 HPLC에 의해 정제하고, 질량 분광계에 의해 특성화시켰다(C122H123N11O39S10의 측정 질량: 2687.98; MALDI-MS 관찰된 [M+H]+: 2687.68). CNIR5 자체는 여기되는 경우 690 nm에서 약한 형광을 방출하지만, Bla의 처리에 따라, 세기는 9배 초과까지 증가한다(도 3B). Bla에 의한 그의 가수분해 동력학을 pH 7.1에서 포스페이트 완충 염수(PBS)에서 측정하였다: 촉매 상수 kcat = 0.62 ± 0.2 s-1, 및 미카엘 상수(Michaelis constant) Km = 4.6 ± 1.2 μM(값들은 가수분해율 대 기질농도의 이중 역수 그래프의 측량된 최소-제곱 피트(least-square fit)로부터 수득하였다). 이의 촉매 효율(kcat/km)은 1.36 x 105 M-1s-1이었다. CNIR5는 PBS 중에서 1.75 x 10-7s-1의 자발적 가수분해율로 매우 안정적이고, 마우스 혈청에서도 그러하였다. 즉, 12시간 항온처리 후에도 형광 증가는 거의 관찰되지 않았다. CNIR6은 과아세틸화된 D-글루코사민이 없는 CNIR5의 동종체이며, 대조군으로서 유용하다.
또한, CNIR5는 QSY21을 QSY22로 대체함으로써 합성할 수 있다(도 3C). 이 합성은 CNIR5의 것과 매우 유사하지만 문제가 되지는 않는다. QSY22의 합성은 이하 논의한다.
CNIR7
CNIR7은 Bla의 생체 내 이미지화에 대한 그의 민감도를 개선시키는 CNIR5의 개질된 형태이다. CNIR5에 사용된 켄칭기 QSY21 다이설폰에이트는 675 nm에서 최대 흡수치를 갖지만, Cy5.5는 690 nm에서 최대로 방출한다. 따라서, CNIR5에 대해서는, 켄칭 효율은 단지 90%이며, 이는 백그라운드 형광에 크게 영향을 미친다. QSY21과 Cy5(CNIR1)의 FRET 쌍에서, QSY21과 Cy5 사이의 우수한 스펙트럼 중복으로 인해, 켄칭 효율이 98% 초과이었다. 따라서, 690 nm에서 흡수할 수 있는 켄칭기는 Cy5.5를 더욱 잘 켄칭시키고, 백그라운드 신호를 감소시키게 된다. QSY21에 있어서, 인돌린이 테트라하이드로퀴놀린에 의해 대체되는 경우, 흡수 최대치는 14 nm까지 적색-이동된다(red-shift)고 보고되어 있다.
따라서, 신규 구조 QSY22 다이설폰에이트(도 4A 내지 4D)는 QSY21 내의 인돌린 기를 테트라하이드로퀴놀린으로 교체함으로써 합성하였으며, 이는 최대 흡수치에서 14 nm까지 유사하게 적색-이동하게 된다. 상기 2개 사이의 오직 구조적 차이가, QSY22가 6원 융합 고리를 함유하는 테트라하이드로퀴놀린을 사용하고, QSY21이 5원 인돌린을 사용하는 것에 있기 때문에, 설폰화 화학 방법이 사용되고, 벤젠 고리 상의 동일한 설폰화 위치(파라)가 예측된다. 따라서, QSY22 다이설폰에이트는 Cy5.5를 더욱 효율적으로 켄칭시키고, 더 낮은 백그라운드 신호를 초래하게 된다.
둘째, CNIR5에 대한 kcat의 값은 약 0.6 s-1이며, 이는 CC1 및 CCF2보다 크게 작다. 켄쳐와 Cy5.5 사이에 삽입된 이중결합도 또한 kcat에서의 증가를 초래하게 된다. 셋째, FRET 도너, Cy5.5 및 켄쳐 QSY22 다이설폰에이트 사이의 거리는 증가되어 에너지 전달 효율을 개선시킨다. CNIR5는 수송체(transporter)의 혼입을 위해 긴 연결기 함유 시스테인을 갖는다. 신규 CNIR7에서, 수송체는 Cy5.5 상의 기타 커플링 부위에 연결되며, 그에 따라 긴 연결기를 포함할 필요가 더 이상 없다. 더욱이, 2-아미노 싸이오페놀은 CNIR5 내의 4-아미노 싸이오페놀과 교체되며, Cy5.5와 켄쳐 사이의 거리를 더욱 짧게 한다. NIR 기질, CNIR7 및 이의 화학적 합성의 최종 디자인은 도 5A 내지 5B에 도시한다. 이의 합성은 더욱더 짧은 경로에서 완성될 수 있으며, CNIR5보다 용이하다.
CNIR7은 또한 짧은 양이온성 펩타이드, 예컨대 TAT 서열을 포함하여서 아세틸화된 D-글루코사민을 교체할 수 있다. D-아미노산은 L-아미노산 대신 사용하여 펩티다제 가수분해를 회피한다. 짧은 양이온성 펩타이드, 안테나페디아(Antennapedia)의 호메오도메인(homeodomain)의 3번째 헬릭스(15-16), HIV-1 Rev 단백질 및 HTLV-1 Rex 단백질 기본 도메인 및 HIV-1 Tat 단백질 기본 도메인은 세포의 원형질막을 투과할 수 있다고 입증되어 있다.
결핵 내 Bla 의 이미지화를 위한 케이징된 Bla 기질
Bla를 위한 케이징된 기질의 구조(Bluco)(도 6A)는 D-루시페린, 개똥벌레 루시퍼라제의 기질(Fluc), 및 베타-락탐, Bla의 기질을 포함한다. D-루시페린의 페놀 기는 Fluc에 의해 그의 산화에 치명적이다. 이 페놀 기는 에터 결합을 통해 세팔로스포린의 3' 위치에 직접 결합하는 경우, 생성된 공액결합체는 Fluc에 대해 불량한 기질이 되며, Bla에 대한 기질로 남는다. Bla에 의한 베타-락탐 고리의 개환은 자발적 분절화를 개시하며, 이로 인해 3' 위치에서 에터 결합의 분할을 초래하고 발광 반응에서 Fluc에 의해 산화될 수 있는 자유 D-루시페린을 방출하게 된다.
공액결합체의 안정성을 개선시키기 위해, 세팔로스포린의 설파이드를 설폭사이드로 산화시키며, 이로 인해 최종 구조 Bluco가 생성된다. Bluco의 제조는 다단계 유기 합성을 통해 달성될 수 있다(도 6B). Bluco의 크기가 CNIR 시리즈 프로브보다 크게 작기 때문에, M. 결핵 세포벽을 더욱 용이하게 투과할 수 있다. 7 아미노 위치에서 정의된 치환은 TB 내 Bla의 SREL 이미지화를 위한 TB-특이적 케이징된 발광성 기질을 디자인하도록 간편하게 이용할 수 있다. Bluco는 또한 이중결합의 삽입에 의해(Bluco2) 및 카밤에이트 연결기의 사용으로(Bluco3) 개선된 Kcat를 갖도록 합성될 수 있다.
실시예 4
CNIR4 , CNIR5 , CNIR9 & CNIR10 에 대한 FRET 및 형광 혼입 동력학
시험관 내 FRET
CNIR5 를 갖는 대장균에서의 Bla 활성의 검출
CNIR5가 살아있는 박테리아 내의 Bla 활성을 검출할 수 있는지에 대해 시험하는 예비 실험을 실시하였다. 대장균을 암피실린 내성 플라스미드로 형질전환시키고 30℃에서 밤새도록 성장시켰다. 세포들을 수거하고, 500 nM CNIR5를 첨가하기 전에 LB 배지로 2회 세척하였다. 형광 스펙트럼을 간격을 두고 수거하고(Ex: 640 nm), 데이터는 도 7에 제시하였다. 측정의 말단부에서(t = 160분), 정제된 Bla의 용액을 첨가하여 CNIR5의 완전한 가수분해를 입증하였다. 결과에서는, CNIR5가 대장균 내의 Bla를 검출할 수 있는 것으로 나타난다. 비교할 경우, 인비트로젠 인코포레이티드로부터의 플루오로제닉 기질인 CCF2/AM을 동일한 조건 하에서 사용하는 경우, LB 배지 내의 살아있는 대장균 내의 Bla는 검출되지 않았다
FRET 스펙트럼
도 8B 내지 8E는, 10분 동안 Bla를 사용한 분할의 전후, 각각의 프로브 CNIR4, CNIR5, CNIR9 및 CNIR10에 대한 FRET 방출 스펙트럼이다.
CNIR4 및 CNIR5 기질을 사용하는 대장균 TEM -1 및 M. 결핵 Bla -C의 동력학
표 1은 기질로서 CNIR4 및 CNIR5를 사용하는 대장균 TEM-1 및 M. 결핵 Bla-C 베타-락타마제의 동력학을 비교한다(도 9A 내지 9B).
Figure pct00001
이들 CNIR 프로브를 사용하는 M. 결핵 내로의 형광 혼입의 동력학을 측정하였다. CNIR4 및 CNIR5 프로브의 혼입 및 분배를 배지 내의 단독의 M. 결핵 중(도 10A 내지 10H) 및 대식세포로 감염된 M. 결핵 중(도 11A 내지 11H) 기질들로서 사용하였다.
M. 결핵 내로의 CNIR4 혼입
형광성 대물 현미경에서는, CNIR4가 M. 결핵 감염된 대식세포 내로 세포간 혼입된 것으로 입증된다(도 12). DAPI 균주(blue)는 감염된 세포의 핵을 나타내고, 녹색 형광은 GFP 표지화된 M. 결핵으로부터 초래되고, 적색 형광은 분할된 CNIR4로부터 초래한 것이다. CNIR4로부터의 형광은 감염된 세포들 내에서 형성되지만 미감염된 세포들은 형광을 나타내지 않음을 주의한다.
생체 내 CNIR 프로브 형광성 신호의 검출
마우스를 여러 농도에서 M. 결핵으로 피부 내 감염시킨다. 사분역 좌측 아래는 108 박테리아를 수용하고, 사분역 좌측 위는 107 박테리아를 수용하고, 사분역 우측 위는 106 박테리아를 수용한다. 각각의 CNIR4, CNIR5, CNIR9 및 CNIR10 프로브의 존재 하에서 형광을 측정한다(도 13A 내지 13D). CNIR5는 가장 큰 형광성 신호를 나타내고, 이노쿨룸(inoculum)의 농도에 따른 그 안의 증가는 CNIR10 및 CNIR9의 증가로 이어진다. CNIR4는 형광에서의 증가를 입증하지 못했다. 또한, CNIR4, CNIR5, CNIR9 및 CNIR10 프로브로부터의 형광은, 야생형 M. 결핵, 또는 에어로졸 접종에 의해 폐 내의 blaC 유전자에서의 돌연변이를 갖는 M. 결핵으로 감염된 마우스에서 측정한다(도 14A 내지 14D). CNIR10은 가장 높은 총 형광을 나타내며, CNIR9, CNIR5 및 CNIR4가 뒷따른다(도 14E).
CNIR5는, M. 결핵로 에어로졸에 의해 감염되고 CNIR5를 사용하여 이미지화시킨 마우스 및 대조군 마우스에서 시간 경과에 따라, 형광 혼입을 이미지화시키고 그의 동력학을 그래프화하는데 기질로서 사용하였다. 대조군으로부터 및 감염된 마우스로부터의 이미지를 1, 18, 24, 48 및 96시에서 수득하였다(도 15A 내지 15E). CNIR5의 피크 혼입을 에어로졸 감염 48시간 후 발생하였다(도 15E). 도 16A 내지 16B는 각각 미감염된 마우스 또는 M. 결핵으로 에어로졸에 의해 감염된 마우스의 형광 이미지들이며, 백그라운드 신호를 감소시키도록 반사보다는 투과조명(transillumination)을 사용하여 이미지화시켰다.
실시예 5
CNIR5 를 사용하는 생체 내 이미지화
마우스 종양 모델에서의 CNIR5
약 1 x 106개의 C6 랫 신경교종 세포들을 누드 마우스의 좌측 어께에 주사하고, cmv-bla로 안정하게 핵산감염된 동일한 개수의 C6 랫 신경교종 세포들을 동일한 누드 마우스의 우측 어깨에 주사하였다. 종양들의 크기가 약 6 mm에 도달하는 경우, 7.0 nmol의 CNIR5를 마취 하에서 꼬리 정맥을 통해 마우스 내에 주사하였다. 주사 후 여러 시간에서 Cy5.5 필터 세트(여기: 615 내지 665 nm; 방출: 695 내지 770 nm) 및 1초 획득 시간을 갖는 IVIS 200 이미지화기 내에서 마우스를 스캐닝하였다.
도 17A는 주사 전 및 주사 후 2, 4, 12, 24, 48 및 72시간에 일련의 대표적인 이미지들이다. 주사 후 초기 2시간, cmv-bla 종양들은 야생형(wt) C6 종양들보다 높은 형광 세기를 나타냈다. 콘트라스트는 24시에서 1.6의 가장 높은 값에 도달한 후, 48시 및 72시에 약 1.3까지 감소하기 시작하였다(도 17B). 이미지화의 말단부에서, 마우스를 희생시켜 생체 외 이미지화를 위한 및 생체분배(biodistribution) 연구를 위해 기관 및 종양들을 수거하여서 이미지화 데이터를 확인하였다. 도 17C는 CNIR5의 주사한 지 24시간 후 희생된 마우스로부터 수거된 종양 및 기관의 형광 이미지이며, 이는 wt C6 종양들보다 높은 절개된 cmv-bla 종양들로부터의 Cy5.5 방출을 입증하는 생체 내 이미지화와 일치하는 것이다. cmv-bla 종양들 내의 Bla의 발현을 입증하기 위해, CNIR5로 주사된 마우스로부터 절개된 종양들의 CC1 검정(도 17D)을 실시하였으며; 결과에서는 cmv-bla 종양들이 높은 수준의 효소 발현을 가진 반면, 야생형 종양들들은 거의 Bla 활성을 갖지 못한 것으로 나타났다.
관찰된 콘트라스트가 종양들에서 발현된 Bla에 의한 CNIR5의 활성화에 기인하는 것을 추가로 입증하기 위해, CNIR5의 동종체이지만 과아세틸화된 D-글루코사민이 없는 CNIR6을 대조군으로서 제조하였다(도 18A). CNIR6은 CNIR5에서와 같이 효율적으로 Bla에 의해 시험관 내에서 가수분해할 수 있지만, 세포를 투과하지 못하며, 그에 따라 CNIR6은 생체 내에서 Bla를 이미지화할 수 없다. 도 8B 내지 18C에서, 전체 이미지화 기간에 걸쳐 cmv-bla 종양들과 대조군 종양들 사이의 어떠한 유의적인 콘트라스트도 존재하지 않았다. 이는 CNIR5가 표적 세포들 내에 도입되고 Bla에 의해 활성화되었다는 것을 분명하게 나타낸다. 또한, 이 결과는 Bla 생체 내에서 Bla를 이미지화시키는데 있어서의 CNIR5에 대한 D-글루코사민 기의 중요성을 입증하는 것이다.
i.v. 접종 후 마우스 내의 CNIR5 의 생체분배 및 약동력학
CNIR5를 Balb/c 마우스 내에 주사하였다(i.v.). 마우스의 군들을 기관 수거 및 처리를 위해 희생시킨다. CNIR5의 존재를 시간 경과에 따라 각 기관 내의 형광 세기에 의해평가한다. 도 19A 내지 19B는 각각 주사 후 4 및 24시에서의 CNIR5 신호를 나타낸다. 안정한 신호가 모든 조직에서 관찰되며, 이는 24시간에 걸쳐 CNIR5가 이 시간에 걸쳐 크게 분해되지 않으면서 체계적임을 암시한다.
Bla 를 사용하는 마우스 내의 M. 결핵 감염을 위치확인시키는 생체 내 이미지화
실시예 1에 기재된 바와 같이, 4마리 Balb/c 마우스 각각의 6개 군을 100 내지 1000 cfu/폐로 에어로졸에 의해 감염시킨다. 모든 시점에서의 이미지화를 위해 4마리 마우스의 한 군을 사용하고, 각각의 시점에서 4마리 마우스의 또 다른 군을 희생 및 조직병리학에 대해 부검하여서 폐 및 비장 내의 cfu를 측정한다. 24시, 7일, 14일, 28일 및 72일에서, 제노젠(Xenogen) IVIS200 이미지화 스테이션을 사용하는 동일한 ABSL3 스위트(suite)에서 이미지화를 실시한다. 미분할된 화합물로부터의 백그라운드 형광에 대해 제어하기 위해 박테리아로 감염되지 않고서 검출 시약으로 주사된 4마리 동물의 대조군을 이미지화를 위해 사용한다. 동물들은 빛이 새지 않는 챔버에서 아이소플루오레인으로 마취하고, 640 nm에서의 여기상태로 이미지화시키고, 690 nm에서 이미지 캡쳐를 하였다. IVI에 충분한 것으로 제시되는 5 nmol의 CNIR5를 꼬리 정맥에 정매 내 주사한다. 화합물의 주사 전 및 1, 2 및 4시 주사 후에 이미지를 획득한다. 이들 임의의 시점에서 신호가 관찰된다면, 동물들을 후속적으로 신호의 소실에 따라 24, 48 및 72시간 후에 이미지화시켰다.
야생형 M. 결핵(도 20A) 및 대조군 마우스(도 20B)로 감염된 마우스의 생체 내 이미지들을 제시한다. 마우스 둘다를 이미지화시키기 전에 CNIR5로 주사한다(i.v.). 이 이미지는 감염된 마우스가 폐로부터 기인하는 신호를 갖는 것으로 나타난다. 신호의 3D 재구성에서는, 평균 신호 위치가 폐들 사이에 존재하는 것을 입증한다. 신호가 평균적이고 마우스가 2개의 폐를 갖고 있기 때문에, 이 위치가 가장 큰 지점 소오스인 것으로 예측된다. 따라서, 화합물 CNIR5는 살아있는 포유동물 내 M. 결핵의 위치를 측정하는데 사용할 수 있다. 제노젠/캘리퍼(Xenogen/Caliper) IVIS 스펙트럼 이미지화 시스템을 사용하여 이 이미지를 포획하였다.
Bla 를 사용하는 마우스 내 M. 결핵 검출의 역치 측정
베타-락타마제 CNIR 프로브는 실시간으로 마우스의 SREL 이미지화를 사용하여 100 이하의 M. 결핵 박테리아를 검출할 수 있다(도 21A). 대조군으로서 미감염된(도 21B) 또는 M. 결핵으로 감염된(도 21C) 살아있는 마우스에 대해 SREL 이미지화를 실시한다. 칼라 막대는 620 nm에서의 여기 후 680 nm에서의 방출의 수준을 나타낸다. 칼라는 Mtb로 감염된 폐로부터 기인하는 강한 신호의 존재를 나타내며, 이는 감염의 특정 위치를 입증한다. 슈도모나스, 스타필로코쿠스 및 레지오넬라에 대한 검출 역치들이 또한 측정될 수 있다.
Bla 를 사용하는 기니 피그 내 M. 결핵 감염의 생체 내 이미지화
4마리 기니 피그의 6개 군을 하기 내용을 제외하고는 마우스에 대해 기재된 바와 동일한 방식으로 감염 및 이미지화시킨다. 첫째, 감염 후 28일까지의 시점에서만 검사하는데, 이는 기니 피그가 이후의 시점에서는 상당히 죽어가기 시작할 것으로 예측되기 때문이다. 둘째, 마우스에서 필요한 것과 동일한 혈청 수준에 도달하기 위해서는 검출 시약의 20배 이상(CNIR5에 대해 약 100 nmol)이 기니 피그에게 필요하며, 측부 척골 정맥을 통해 화합물을 투여한다. 기니 피그를 ABSL3 시설에서 에어로졸에 의해 감염시키고, 이미지화할 때까지 봉쇄 하에서 유지시킨다. 24시간, 7일, 14일 및 28일에서 IVIS200 이미지화 스테이션을 사용하는 ABSL3 스위트에서 이미지화를 실시한다. 미분할된 화합물로부터의 백그라운드 형광에 대해 제어하기 위해 박테리아로 감염되지 않고서 검출 시약으로 주사된 4마리 동물의 대조군을 이미지화를 위해 사용한다.
이미지화 전, IVI에 충분한 것으로 제시되는 100 nmol의 CNIR5를 꼬리 정맥에 정매 내 주사한다. 화합물의 주사 전 및 1, 2 및 4시 주사 후에 이미지를 획득한다. 이들 임의의 시점에서 신호가 관찰된다면, 동물들을 후속적으로 신호의 소실에 따라 24, 48 및 72시간 후에 이미지화시켰다.
실시예 6
CNIR7 을 사용하는 생체 내 이미지화
마우스 조직들 내 CNIR7 의 생체분배
마우스 조직들 내 CNIR7의 생체분배를 생체 내 이미지화 전에 평가한다. CNIR7을 3마리 마우스 내에 정맥 내 주사한다(염수 완충액 100 μL 중 10 nmol의 투여량). 마취된 마우스를 주사 후 여러 시간 간격으로(30분, 240분, 12시간, 24시간, 48시간 및 72시간) 경추 탈구에 의해 희생시킨다(각 시점에 3마리 마우스). 혈액 샘플을 심장천자에 의해 수거하고, 조직(종양, 심장, 신장, 간, 방광, 위, 뇌, 이자, 소장, 대장, 폐 및 비장)을 형광계에 의해 근적외선 형광성을 측정하도록 신속하게 수확한다. 데이터는 조직의 그램당 형광성 단위(FU)로서 표기하며[FU/(g 조직)], 이들 조직 기관들 내의 가수분해된 CNIR7 생성물의 양을 나타낸다.
마우스 모델에서 CNIR7 을 사용하는 생체 내 이미지화
CNIR7 이미지화를 위해 누드 마우스에 C6 신경교종 종양 이종이식편을 사용하였다. 100% 산소 중 2% 아이소플루레인을 1 L/분의 낮은 비율로 흡입시킴으로써 마우스를 마취시킨다. 측부 꼬리 정맥에 PBS 완충액 100 μL 중 10 nmol의 CNIR7로 주사한다. IVIS200 광학 CCD 시스템(제노젠 인코포레이티드)을 사용하는 소형 동물 생체 내 형광 이미지화 시스템으로 3마리 마우스를 이미지화시킨다. 이 시스템은 생체발광 및 형광 생체 내 이미지화 모두에 적합하며, 형광 이미지화에 대해 1초 정도의 짧은 시간과 같은 단일 투영 동안 신속하게 소형 설치류를 스캐닝할 수 있다. 가시화를 위한 풀 소프트웨어 도구도 또한 이 시스템으로 이용 가능하다. Cy5.5를 사용하는 NIRF 이미지화를 위해, 여기 필터(640 ± 25 nm) 및 방출 필터(695 내지 770 nm)의 필터 세트를 사용한다. 형광 이미지들을 C-마운트 렌즈가 장착된 적색에 매우 민감한 흑백 CCD 카메라로 수거할 것이다. 마우스를 생체분배 연구를 위해 희생시킨다. 종양 조직 샘플의 일부를 Bla 활성의 평가를 위해 사용한다.
실시예 7
형광성 단백질
IVI 에 대한 형광성 단백질의 포텐셜 평가
형광성 단백질(FP) mPlum은 649 nm의 최대 파장 및 59 nm의 우수한 스토크스 쉬프트(Stokes shift)를 가지며, 이는 조직을 잘 투과하며 우수한 신호 대 소음 비율을 가질 것이라는 의미이다. EGFP만큼 밝지 않을지라도, 유사한 광안정성 및 그의 파장을 가지며, 스토크스 쉬프트는 시험관 내에서는 거동할 수 없을지라도 IVI 동안 이 차이에 대한 구성보다 더욱 클 것이다. 긴 파장(620 nm)을 갖는 제 2 FP는 mKeima이며, 이는 여기 파장에서의 중복으로 인해 백그라운드가 존재하게되는 염려가 거의 없는 180 nm에서 mPlum보다 우수한 스토크스 쉬프트를 갖는다. 그러나, mKeima는 mPlum와 유사한 밝기를 가지며, 이로 인해 IVI 동안 FP가 우수하게 거동할 것인지가 불명료하게 된다. mPlum 또는 mKeima보다 4배 밝은 비교적 긴 파장(610 nm)을 갖는 또 다른 FP는 mCherry이다. mCherry에 대한 스토크스 쉬프트는 단지 23 nm이어서, 더욱 큰 밝기 대신에 신호 대 소음 비율이 문제점으로 존재할 수 있다. FP tdTomato는 최소 파장(581 nm)을 갖지만, 이 또한 mPlum 및 mKeima보다 20배 밝은 밝기로서 가장 밝은 것이다.
4개의 FP, mPlum, mKeima, mCherry 및 tdTomato는 게이트웨이 PCR 클로닝을 사용하여 발현 벡터들 내에 클로닝시킨다. 이들 각각의 구조체를 Mtb 내에 형질전환시키고, 96-웰 플레이트 검정을 사용하여 시험관 내에서 평가한다. 이들은 표준 성장 조건 하에서 배양 배지 내에서 세포간 성장 검정으로 평가한다. 8-웰 챔버 슬라이드를 사용하는 현미경검사에 의해 분광도계로 모든 구조체를 평가한다. 분광도계 연구에서는 각 구조체에 대해 최선의 방출 파장뿐만 아니라 최선의 여기 파장을 평가한다. 박테리아 및 대식세포 자체로부터의 자가형광의 효과를 평가하기 위해 벡터 단독 및 긴 파장들에서의 방출에 대한 네거티브 대조군으로서 EGFP를 사용한다. 현미경검사로 인해, 박테리아 집단 내의 형광 백분율의 계산을 통해 배양 배지 내의 성장 후의 여러 벡터들의 신호 강도와 안정성에서의 변화를 평가할 수 있다.
FP 에 대한 시험관 내 평가 패널
아이소니아지드(isoniazid) 처리 동안 또는 그 후, 배양액에서의 안정성, 전사 및 해독의 효율, 검출의 한계 및 신호에 대해 FP 구조체를 평가한다. 신호 세기 및 구조체 안정성에서의 변화가 개별 FP 형질전환체에서 미리 관찰되기 때문에, 초기에는 평가를 위해 각 FP 구조체를 갖는 2개 이상의 형질전환체를 선택한다. 그 다음, 생체 내 연구를 위해 각 FP에 대한 최선의 단일 균주를 선택한다.
30일 성장 후 형광성이 잔존하는 박테리아의 백분율의 선택 및 측정 하에서 또는 이것 없이 각 균주의 성장에 의해 배양액의 안정성을 평가한다. 이는 적절한 항생제의 존재 및 부재 하에서 희석액을 플레이팅시켜서 플라스미드로부터의 선택가능한 마커를 갖는 배양액에서의 박테리아의 백분율을 평가함으로써 확인한다. 전사 및 해독 효율 연구는, 코돈 사용이 신호 세기에 영향을 미칠 수 있는 시점까지 해독에 미치는지 여부 및 각 구조체 내에서 프로모터가 적절하게 기능하는지 여부에 대한 통찰을 제공한다. 이는 각 FP 구조체를 갖는 Mtb로부터의 RT-PCR에 의해 평가하여서, 다른 리포터들을 발현시키는 구조체와 유도를 상관하는 여러 프로모터 및 싱글- 또는 멀티-카피 벡터들을 사용하는 절첩 유도를 비교한다. 이들 비율은 발현된 리포터와 관계없이 비교가능하다.
각각 분광도계 및 웨스턴 분석을 사용하여 형광성 세기 및 단백질 수준을 각 균주에 대해 측정 및 비교한다. 형광성 신호로의 단백질 대 RNA의 비율은 발현된 리포터 또는 발현된 RNA 전사체의 수준과 관계없이 비교가능하다. 일부 리포터가 비효율적으로 해독된다면, 단백질 대 RNA 전사체의 이들 비율은 유사하게 RNA 발현 수준의 증가에 따라 감소할 것이다. 이러한 관찰은 해독의 효율을 개선시키기 위해 그 FP에 대한 코동 사용의 수정에 대한 요구에 따라 해석한다. 그러나, 이는 과발현에 따른 봉입체 내의 단백질 불안정성 또는 격리의 결과일 수도 있다.
동시에 제조된 배양액들로부터의 제한된 희석액의 형광을 평가함으로써 검출의 한계를 측정한다. 이들 데이터를 CFU 및 형광성 현미경검사 정량화에 의해 CFU와 비교하여 평가하여서, 형광에 의해 수득된 수치가 생육가능한 박테리아와 직접 상관하는 지에 대해 확인한다. 96-웰 포맷(format) 검정에서 CFU 및 형광에 대해 미리 평가한 배양액에 1 μg/ml 아이소니아지드를 첨가함으로써 아이소니아지드(INH) 처치의 효과를 평가한다. CFU 및 형광 후, 실시간으로 37℃까지 항온처리 챔버 세트에서 분광도계를 사용하고, 첨가 후 곧바로 및 INH의 48시 후첨가까지의 여러 시점에 분취물을 CFU에 대한 플레이트에 위치시킨다. 이는 각 구조체에 대해 항생제 처리 후 동안의 신호 강도, 안정성 및 신호에 대한 통찰을 제공한다.
재조합 FP 선택에서의 독성에 대한 안정성 및 효과
독성 연구에서, 모든 균주를 야생형과 동시에 비교한다. 4마리 Balb/c 마우스의 2개의 군을 실시예 1에서 기재된 바와 같이 100 내지 1000 cfu/폐로 에어로졸에 의해 감염시킨다. 각 박테리아 균주에 대한 4마리 마우스의 한 군(야생형, FP1, FP2, FP3, FP4)을 모든 시점(1, 14, 28 및 72일)에서 부검하여서, CFU를 측정하고, 조직병리학을 실시하고, 폐 및 비장 내의 형광의 수준 및 적절한 구조체의 존재를 측정한다. CFU 적정판으로부터 20개 이상의 개별 콜로니 상에서 실시하는 형광 현미경검사에 의해, 구조체를 갖는 박테리아 집단의 백분율을 측정한다. 균질화된 조직들에서 형광 수준을 측정하여서 잔여 FP의 총 수준을 평가한다.
에어로졸에 의해 감염된 마우스 내의 형광성 단백질
mPlum, mKeima, mCherry 및 tdTomato 구조체 및 단독의 벡터 주쇄를 갖는 각 박테리아 균주로 에어로졸에 의해 4마리 Balb/c 마우스의 6개의 군 각각을 100 내지 1000 cfu/폐로 감염시킨다(총 30개 군). 박테리아 균주를 실시예 1에서 기재된 바와 같이 에어로졸 감염을 위해 해동시킨다. 4마리 마우스의 5개 군, 각 FP를 갖는 하나 및 벡터를 단독으로 갖는 하나를 모든 시점에서 이미지화를 위해 사용하고, 각 시점에서, 4마리 마우스의 또 다른 5개의 군을 조직병리학을 위해 희생 및 부검하여 폐 및 비장에서의 cfu를 측정한다. 24시, 7일, 14일, 28일 및 72일에서, 각 FP에 대해 최선의 여기 및 방출 필터를 사용하는 제노젠 IVIS 200 이미지화 스테이션을 사용하여 동일한 ABSL3 스위트에서 이미지화를 실시한다. IVIS에서 여러 세트의 필터의 사용이 FP에서 요구되는 경우, 동일한 필터 세트를 사용하는 각 동물 군에서 단독으로 자가형광에 대한 대조군까지 벡터도 또한 이미지화시킨다. 따라서, 박테리아 적재가 감염 후 시점들에서 매우 낮은 것(100 cfu/폐)으로부터 매우 높은 것(105 cfu/폐 초과)까지 실험 전반에 걸쳐 변할 것이기 때문에, 이 시스템의 민감도뿐만 아니라 IVI에 대한 각각의 FP가 인정된다. 백터 단독의 사용은 FP의 존재에 의해 초래된 독성에서의 잠재적 차이 및 자가형광에 대해 제어한다.
실시예 8
배양 배지 내의 결핵의 검출을 위한 방아벌레 레드( CBR )
미리 도입된 게이트웨이 재조합 부위를 사용하여 Bla에 묘사된 구조체 4개 모두 내로 CBR 유전자를 클로닝시킨다. 이들 플라스미드는 L5 및 hsp60 프로모터 둘다로부터 발현시킨다. D-루시페린의 존재 하에서 빛을 발하는 각 균주의 능력은, 안전 신호 감손 동력학뿐만 아니라 D-루시페린의 첨가 기간 동안 플래쉬 방출을 측정할 수 있는 주사기 및 발광성 검출 능력을 갖는 다중 방식 마이크로플레이트 판독기에서 96-웰 플레이트를 사용하여 성장 배지에서 비교한다. 모든 검정은 생육가능한 박테리아 수와 생성된 신호의 상관관계를 허용하는 박테리아의 희석 및 CFU의 측정을 제한하면서 4회 실시한다. 구조체의 안정성은 7일 동안 선택없이 성장시킨 후 분광도계 및 형광성 현미경검사 검사에 의해 평가한다. 이들 데이터는 CFU와 상관하여 신호/생육가능한 바실루스(bacillus)를 측정하며, 포지티브 신호를 생성시키는 박테리아의 백분율을 계산하는데 현미경검사를 사용한다. 이 구조체를 갖는 박테리아의 성장을 벡터를 단독으로 갖는 박테리아와 비교하여 플로팅시킴으로써, 박테리아 생존성에 대한 구조체의 효과를 이들 검정에서 평가한다.
마우스에서 CBR 발현, 안정성 및 독성의 평가
IVI에 대한 징후를 전개하는 2개의 균주에 대해 재조합 CBR의 독성에 대한 안정성 및 효과를 검사한다. 독성 연구에서, 모든 균주를 야생형과 동시에 비교한다. 4마리 Balb/c 마우스의 20개의 군을 실시예 1에서 기재된 바와 같이 100 내지 1000 cfu/폐로 에어로졸에 의해 감염시킨다.
각 박테리아 균주에 대한 4마리 마우스의 한 군(야생형, CBRl 및 CBR2)을 모든 시점(1, 14, 28 및 72일)에서 부검하여서, CFU를 측정하고, 조직병리학을 실시하고, 폐 및 비장 내의 발광의 수준 및 적절한 구조체의 존재를 측정한다. CFU 적정판으로부터 20개 이상의 개별 콜로니 상에서 실시하는 형광 현미경검사에 의해, 구조체를 갖는 박테리아 집단의 백분율을 측정한다. 균질화된 조직들에서 발광 수준을 측정하여서 잔여 FP의 총 수준을 평가한다.
마우스 내의 CBR 발현 결핵 및 BCG 균주의 이미지화
RLuc8 및 벡터 주쇄를 단독으로 갖는 각 박테리아 균주로 에어로졸에 의해 4마리 Balb/c 마우스의 6개의 군 각각을 실시예 1에서 기재된 바와 같이 100 내지 1000 cfu/폐로 감염시킨다(총 20개 군). 4마리 마우스의 2개 군, RLuc8를 갖는 하나 및 벡터를 단독으로 갖는 하나를 모든 시점에서 이미지화를 위해 사용하고, 각 시점에서, 4마리 마우스의 또 다른 2개의 군을 조직병리학을 위해 희생 및 부검하여 폐 및 비장에서의 cfu를 측정한다. 24시, 7일, 14일, 28일 및 72일에서, 제노젠 IVIS 200 이미지화 스테이션을 사용하여 동일한 ABSL3 스위트에서 이미지화를 실시한다. 이미지화 전, IVI에 충분한 것으로 제시된 1 내지 5 μmol의 D-루시페린을 꼬리 정맥을 사용하여 정맥 내 주사한다.
화합물의 주사 전 및 주사한 후 1, 2 및 4시간에 이미지를 획득한다. 이들 임의의 시점에서 신호가 관찰된다면, 24, 48 및 72시간 후 동물을 후속적으로 이미지화시키며, 신호의 소실이 뒷따른다. 매트릭스(Matrix) 시스템(제노젠(Xenogen))을 광 차단 챔버에서 사용하여 100% 산소 중 2% 아이소플루레인에서 아이소플루오레인 마취로 동물을 마취시키고, 10 화소 비닝으로 3 내지 5분 동안 통합 시간으로 이미지화시킨다. 이로 인해, 박테리아 적재가 감염 후 시점들에서 매우 낮은 것(100 cfu/폐)으로부터 매우 높은 것(105 cfu/폐 초과)까지 실험 전반에 걸쳐 변할 것이기 때문에, 이 시스템의 민감도뿐만 아니라 IVI에 대한 각각의 CBR의 이용이 인정된다. 백터 단독의 사용은 CBR 유전자의 존재에 의해 초래된 독성에서의 잠재적 차이 및 자가형광 둘다에 대해 제어한다.
실시예 9
IVI 에 대한 기타 루시퍼라제 시스템들의 포텐셜 평가
게이트웨이 PCR 클로닝을 사용하여 RLuc8 루시퍼라제를 전술된 미코박테리아 발현 시스템들로 클로닝시킨다. 구조체를 Mtb 내에 도입시키고, 전체 세포를 사용하여 박테리아 배양 배지 내에서의 이들의 광 생성에 대해 검사한다. 무손상 박테리아가 CBR에 대해 상당한 광을 발생시키면, 세포간 박테리아 시스템은 마우스에서 CBR와 견줄 수 있다. 그람-포지티브 및 그람-네거티브 박테리아 루시퍼라제 시스템들 둘다는 이들이 그들 자신의 기질을 생성시키는 장점을 갖는다. 모든 오페론은 제한 소화를 사용하여 발현 시스템들로 클로닝시켜 이들을 그들의 현존 벡터로부터 제거한 후, 게이트웨이 어댑터(adapter) 및 게이트웨이 재조합 클로닝에 대한 결찰이 뒷따른다. 박테리아 배지 내의 Mtb로부터의 광 생성에 대해 구조체를 검사한다. 생체발광에 대한 모든 검정은 Bla 시스템에 대해 기재된 바와 같이 96-웰 플레이트에서 실시하되, 광 생성은 분광도계를 위한 발광 세팅에 대해 측정될 것이다. 민감도는 모든 샘플에 대해 동시에 실시된 희석 및 CFU 측정을 제한함으로써 평가하여서, 광 생성을 CFU와 비교하여 계산할 수 있다.
루시퍼라제를 사용하는 대식세포 내 결핵 검출
대식세포 내 루시퍼라제 활성에 대한 막으로의 분비와 그 막에 대한 표적화의 효과를 검사한다. 미코박테리아로부터의 분비는, Mtb BlaC(BlaSS)로부터의 아미노-단부 TAT 신호 서열을 부착시키고, Mtb 내의 CBR을 최적으로 발현시키는 동일한 구조체 내에 이 융합을 위치확인시킴으로써 달성된다. 초기 대수기까지 성장된 CBR, BlaSS::CBR 및 벡터 단독 발현 Mtb 균주로부터의 전체 세포 및 배양 여액을 검정함으로써 분비를 확인한다. 이 균주로부터의 배양 여액은 CBR 발현 균주보다 크게 높은 광 생성을 가져야 하고, BlaSS::CBR로부터의 전체 세포는 CBR Mtb보다 동일하거나 또는 낮은 광 생성을 가져야 한다. Bla에 사용된 CD14로부터의 카복시 말단 GPI 앵커를 BlaSS::CBR에 부착시켜 융합 단백질 BlaSS::CBR::GPI를 생성시킨다.
Mtb 발현 BlaSS::CBR::GPI는, CBR 및 BlaSS::RLuc8을 발현시키는 균주와 비교함으로써, 세포간 대식세포 검정을 사용하여 광 생성에 대해 평가한다. J774A.1 대식세포를 96-웰 플레이트 중에 사용하여서 박테리아 및 여러 농도의 화합물의 적정을 검사할 수 있다. 모든 검정을 Bla에 대해 기재된 바와 유사한 방식으로 4회 실시한다. 이중 웰들을 0.1% 트리톤 X-100으로 용해시킨 후, D-루시페린을 첨가하여 수득된 측정치에서의 숙주 세포 투과성의 역할을 평가한다. 모든 시점에서, 세포와 연관된 CFU의 수를 측정하는데 4개의 미처리된 웰을 사용한다. CBR의 세포간 검출은 진핵 세포들 및 D-루시페린에 대한 미코박테리아 공포(vacuole)의 투과성에 의해 영향을 받을 수 있어서, 대식세포 내의 박테리아에 대한 그의 민감성은 극히 중요할 것이다. 그러나, 박테리아 루시퍼라제 시스템들은 세포간 박테리아의 성장에 의해 유의적으로 영향을 쉽게 받지는 않는다.
박테리아 루시퍼라제 시스템들 및 RLuc8 각에서의 광 생성은 세포간 검정을 사용하여 확인한다. 이중 벽을 0.1% 트리톤 X-100으로 용해시킨 후, 코엘렌테라진(coelenterazine)을 첨가하여서 RLucS에 대해 수득된 측정치에서 숙주 세포 투과성의 역할을 평가한다. 신호의 위치확인은 가장 효과적인 것으로 증명되는 화합물에 대해 형광성 현미경에 의해 확인한다. 이들 검정은, 신호를 위치확인시키고, 포지티브 신호로 박테리아의 백분율을 결정하고 위치확인된 신호의 세기를 평가하도록 8-웰 챔버 슬라이드를 사용하는 것을 제외하고는 유사한 방식으로 실시한다. 현미경검사에 의해, 위치확인, 포지티브 신호를 갖는 박테리아의 백분율의 측정 및 위치확인된 신호의 세기의 평가를 할 수 있다.
실시예 10
IVI 를 위한 화합물에 의한 Bgal 의 검출.
앞서 기재된 프로모터가 없는 Bgal 유전자(17)를 게이트웨이 어뎁터에 대한 제한효소 소화 및 결찰에 의해 미코박테리아 발현 벡터들으로 클로닝시킨다. 앞서 기재된 바와 같이(18), 96-웰 플레이트 중의 미코박테리아 투과성 형광성 시약 5-아세틸아미노-플루오렉신 다이-베타-D-갈락토피라노사이드(C2FDG)를 사용하여 박테리아 배양액에서 평가하기 위해 이들 벡터들을 Mtb 내에 전달한다. 이 화합물은 Bgal에 의해 분할될 때까지는 형광성이 아니며, 460 nm에서 여기되고 520 nm에서 방출한다. 가장 강한 형광성 신호를 생성시키는 벡터는 Bgal의 분비 및 숙주 세포 위치확인을 허용하는 추가 융합을 구성하는데 사용한다.
Bgal의 분비는 미코박테리아 투과성이 여러 화합물이 Bgal을 검출하는 능력에서의 역할을 담당하는 지에 대한 측정을 도와주는데 중요하다. Bgal을 분비하기 위해, Mtb BlaC(BlaSS)로부터의 아미노-말단 TAT 신호 서열이 부착되고, 이 융합은 Mtb 내의 Bgal을 최적으로 발현하는 동일한 구조체 내에 위치된다. 초기 대수기까지 성장된 Bgal, BlaSS::Bgal 및 벡터 단독 발현 Mtb 균주로부터의 전체 세포 및 배양 여액을 검정함으로써 분비를 확인한다. Bla에 사용된 CD14로부터의 카복시 말단 GPI 앵커를 BlaSS::Bgal에 부착시켜 융합 단백질 BlaSS::Bgal::GPI를 생성시킨다.
모든 Bgal 구조체는 C2FDG, 5-도데카노일아미노레소루핀 다이-베타-D-갈락토피라노사이드(C12RG) 및 9H-(1,3-다이클로로-9,9-다이메틸아크리딘-2-온-7-일)베타-D-갈락토피라노사이드(DDAOG)를 사용하여 형광성 검출의 민감도에 대해 평가한다. 모든 화합물은 인비트로젠 소속의 몰레큘라 프로브(Molecular Probe)로부터 시판 중이다. C2FDG가 효율적으로 Mtb 내의 Bgal에 도입 및 이를 검출하는 것으로 알려져 있기 때문에, 이 화합물은 포지티브 대조군을 제공하는 반면, 그의 방출 파장은 IVI에 유리하지는 않다. C12RG는 진핵 세포 내에 잘 진입하고 더 긴 방출 파장(590 nm)을 갖지만, 유사한 화합물 C12FDG는 Mtb 내의 Bgal을 잘 검출하지 못하며, 이는 박테리아 막을 잘 통과하지 못하는 것을 암시한다.
생성된 신호에 대한 투과성 및 위치확인의 효과를 확인하기 위해, 모든 균주에 대한 무손상 세포들 및 전체 세포 용해물 및 화합물에서 Bgal 활성을 측정한다. 화합물 DDAOG는 IVI에 대해 잘 작동하는 것으로 보여지는데, 이는 진핵 막들을 잘 통과하고 Bgal에 의한 분할 후 가장 긴 방출 파장(660 nm)을 갖기 때문이다. DDAOG는 Bgal 활성을 잘 검출하는 한 추가 연구를 위한 가장 우수한 화합물일 것으로 생각된다.
마우스 내의 Bgal 발현, 안정성 및 독성
IVI에 대한 징후를 나타내는 2개의 재조합 균주에 대하여 재조합 Bla 발현의 독성에 대한 안정성 및 효과를 검사한다. 독성 연구에서, 모든 균주를 야생형과 동시에 비교한다. 4마리 Balb/c 마우스의 12개의 군을 실시예 1에서 기재된 바와 같이 100 내지 1000 cfu/폐로 에어로졸에 의해 감염시킨다. 각 박테리아 균주에 대한 4마리 마우스의 한 군(야생형, Bgal1 및 Bgal2)을 모든 시점(1, 14, 28 및 72일)에서 부검하여서, CFU를 측정하고, 조직병리학을 실시하고, 폐 및 비장 내의 형광의 수준 및 적절한 구조체의 존재를 C2FDG로 측정한다. CFU 적정판으로부터 20개 이상의 개별 콜로니 상에서 실시된 C2FDG를 사용하는 Bgal 검정에 의해, 구조체를 갖는 박테리아 집단의 백분율을 측정한다. 균질화된 조직들에서 Bgal 수준을 측정하여서 각 시점에서 잔여 Bgal의 총 수준을 평가한다.
마우스 내의 Bgal -발현 결핵 균주의 이미지화
L2G85 마우스로부터의 모든 세포들이 ACTB 프로모터로부터 Fluc를 발현시키기 때문에, L2G85 마우스로부터의 골수 유도된 대식세포는 Mtb 균주 발현 Bgal로 감염되고, 벡터를 단독으로 갖는 동일한 균주와 비교된다. 대식세포 감염은 J774A.1 대식세포에서의 다른 세포간 성장 검정에 대한 것과 동일한 방식으로 감염된 L2G85 마우스로부터의 골수 유도된 대식세포를 사용하여 실시한다. 이중 벽을 0.1% 트리톤 X-100으로 용해시킨 후, Lugal을 첨가하여서 수득된 측정치에서 숙주 세포 투과성의 역할을 평가한다. 모든 시점에서, 세포와 연관된 CFU의 수를 측정하는데 4개의 미처리된 웰을 사용한다. 신호의 위치확인은 가장 효과적인 것으로 증명되는 구조체에 대해 현미경검사에 의해 확인한다. 현미경검사 검정은, 위치확인시키고, 포지티브 신호로 박테리아의 백분율을 결정하고, 위치확인된 신호의 세기를 평가하게 한다. IVI 연구는, Lugal을 검정을 위해 루시페린 대신에 사용하는 것을 제외하고는 CBR에 대해 기재된 바와 동일한 프로토콜을 사용하여 마우스에서 실시한다.
실시예 11
베타- 락타마제의 결정 구조 모델 및 기타 단백질 BlaC 효소 포켓 모델화에 기초한 프로브 디자인
M. 결핵 베타-락타마제(BlaC) 효소 포켓은 프로브 디자인 및 특이성을 개선시키도록 작은 분자를 사용하여 모델링한다. 작은 분자 라이브러리에서와 같은 작은 분자의 고출력 스크리닝은 BlaC의 활성 부위 틈새를 결합하는 화합물을 동정하는데 사용되고, 그로부터 결정 구조가 수득된다. 후보 프로브를 합성하고, 시험관 내에서 시험한다.
베타- 락타마제 -유사 효소들 및 페니실린-결합 단백질
M. 결핵 내의 2개의 주요 베타-락타마제-유사 단백질(BlaX) 및 2개의 주요 페니실린-결합 단백질(PBP)을 클로닝시키고, 과발현시키고, 정제시킨다. BlaX 및 PBP에 대한 Km 및 결합 상수를 세페로페라존, 페니실린 및 시프로플록사신을 사용하여 측정한다. 후보 단백질에 대한 결정 구조는 프로브 활성이 개선된 특정 프로브를 디자인하는데 설명 및 사용된다.
Mtb 효소들과 대장균 베타- 락타마제 TEM -1 사이의 구조 활성 관계
BlaC 및 TEM-1의 결정 구조는 세포페라존를 사용하여 설명된다. 세페르페라존에 기초한 프로브를 모델링하고, 디자인하고, 합성한다. 후보 프로브를 사용하여 BlaC 및 TEM-1에 대한 Km을 측정한다.
실시예 12
신규 켄쳐 및 염료를 통한 REF 민감도 개선
REF 이미지화에 사용된 종래 기질들은 마우스 내의 결핵의 폐 감염을 이미지화시키는데 성공적이었는데, 이는 이 전략이 큰 기대를 갖고 있음을 암시한다. 그러나, 폐 내의 검출 역치가 10,000 초과의 박테리아이기 때문에, REF 프로브의 민감도를 증가시킴으로써 검출을 개선시키는 것이 유리하다. 최근, 신규 염료 및 켄쳐가 800 nm 범위에서 작동하는 LiCor에 의해 개발되어 왔으며, 이는 본 화합물을 개선시키는 큰 기대를 제안한다. IRDye 800CW로 지칭되는 이 신규 염료는 Cy5.5보다 대략 10배 밝으며, 이의 긴 파장으로 인해, Cy5.5보다 크게 우수하게 포유동물 조직을 관통하게 된다. 이 염료 및 QC-1로 지칭되는 매칭된 켄쳐에 기초한 화합물들이 디자인된다. 이 염료 및 켄쳐에 기초한 화합물은 현존 REF 시스템에 대해 크게 개선시킨다. 2개의 IRDye800 염료, IRDye800RS 및 IRDye800CW(도 22)가 생체 내 이미지화 적용을 위한 FRET 도너로서 또한 조사된다. 둘다는 780 nm에서 여기하고 820 nm에서 방출하는 동일한 형광 스펙트럼을 갖지만, IRDye800CW가 IRDye800RS보다 많은 설폰에이트 기를 갖는 점에서 상이하다. 이 차이는 상이한 생체 내 생체분배를 초래할 수 있으며, 이로 인해 둘다 조사된다. IRDye800에 대해 높은 켄칭 효율을 갖는 상응하는 염료, IRDye QC-1는 플루오로제닉 프로브에서 FRET 어셉터(acceptor)로서 사용한다(도 22). 이들 분자의 프로브 내로의 혼입은, 앞서 기재된 바와 같이, NHS 에스테르와 아민 사이의 동일한 커플링 화학으로 CNIR5를 제조하는데 사용된 합성 절차와 동일하다. 우선, IRDye800 염료로 제조된 이들 CNIR 프로브의 가수분해 동력학은 TEM-1 Bla 및 Mtb BlaC 둘다를 특징으로 하며, 프로브는 피하 및 폐 감염에서 Mtb의 생체 내 이미지화에 대해 평가한다.
IRDye 800CW에 기초한 화합물은 우선 시험관 내에서 검사한 후, 피하 및 폐 감염에서 이를 입증하기 위해 세포간 연구 및 동물 모델 작업이 뒷따른다. 감염 부위에서의 형광 혼입은 전체 동물 수준에서 IVIS 이미지화 시스템을 사용함으로써 가시화되며, 조직 섹션 및 감염된 조직들의 형광성 대물 현미경검사 및 생체 현미경검사를 사용하여 형광계에서 조직 균질화물 내에서 확인된다. 이들 기술의 조합은 감염된 마우스 모델에서 검사된 모든 프로브에 적용하여서, 감염된 조직들의 표지화 특성 및 감염된 숙주 세포 내 프로브의 혼입의 상세한 특성화를 가능하도록 한다.
프로브의 구조적 개질화를 통한 SREL 및 REF 민감도 개선
현존 프로브가 Mtb BlaC 활성을 검출 및 이미지화할 수 있지만, Mtb BlaC에 대한 그의 활성은 최적이지 않다. Mtb BlaC로 효소 동력학이 개선된 프로브는 검출 및 이미지화 둘다에 더 큰 민감도를 제공한다. Mtb BlaC의 결정 구조는 기타 클래스 A 베타-락타마제와 크게 다른 것으로 보여지며, 이는 Mtb BlaC가 더 큰 활성 부위 포켓을 갖는다. 이 구조적 차이는 Mtb BlaC에 대해 동력학이 개선된 프로브를 디자인할 수 있음을 암시한다. 3가지 주요 접근방법은 세포페라존에 기초한 BlaC 프로브 개질의 구조를 개선시키고, 화합물의 제한된 라이브러리를 스크리닝하고, 이탈기를 개질시키기 위해 이용한다. 확인된 적절한 화합물은 피하 및 폐 경로에 의해 마우스 내의 세포간 박테리아 및 감염을 Mtb로 시험관 내 검정을 사용하여 추가로 특성화시킨다.
세포페라존의 구조에 기초한 합리적 접근.
TEM-1 Bla 및 Mtb BlaC에 의한 CNIR5의 동력학:
TEM-1 Bla, kcat=0.33 s-l, KM=1.9 μM, kcat/KM=1.74 x 105 s-1M-1;
Mtb BlaC, kcat=0.07 s-1, KM=5.9 μM, kcat/KM= 1.2 x 104 s-1M-1.
이 동력학 데이터에서는 CNIR5가 TEM-1 Bla에 대해서는 바람직한 기질이지만 Mtb BlaC에 대해서는 그렇지 않다고 지적한다. Mtb BlaC에 특이적인 활성에 요구되는 구조적 요소들을 확인하기 위해, 세팔로스포린 락탐 항생제(세포페라존, 세팔로틴, 세파졸린, 세프타지딤, 세폭시틴, 세파만돌, 세포탁심 및 세팔렉신)에 대한 동력학은 TEM-1 Bla 및 Mtb BlaC를 사용하여 측정한다. 결과에서는, 세포페라존(도 23)이 TEM-1 Bla와 비교하여 Mtb BlaC에 대해 바람직한 기질인 것으로 제시된다.
TEM-1 Bla, kcat=0.26 s-1, KM=262 μM, kcat/KM=1 x 103 s-1M-1;
Mtb BlaC, kcat=2.01 s-1, KM=76 μM, kcat/KM=2.6 x 104 s-1M-1.
Mtb BlaC에 대한 kcat/KM의 값(2.6 x 104 s-1M-1)은 is better than that of CNIR5의 것(1.2 x 104 s-lM-1)보다 우수하지만, TEM-1 Bla에 대한 kcat/KM의 값(1 x 103 s-1M-1)은 CNIR5의 것(1.74 x 105 s-1 M-1)보다 100배이다. 이 선택성에 대한 책을 갖는 주요 구조 기는 세포페라존 내의 7 아민에 연결된 벌키 기로부터 나타나는 것으로 가정되며, Mtb BlaC--BlaC의 X선 구조가 7 부위에서 큰 기질 결합 포켓을 갖는다는 발견에 의해 지지되는 것으로 보인다.
따라서, 세포페라존의 7 위치에서의 기는 CNIR5 내로 혼입되고, 효소 동력학이 개선된 것을 나타나는 Mtb BlaC 프로브를 생성시킨다(도 23). 이 프로브는, 시험관 내에서, 우선 1) 완충액 및 마우스 혈청 중의 그의 안정성에 대해, 2) 정제된 Mtb 및 세포간 Mtb의 존재 하에서의 그의 동력학에 대해, 및 3) 정제된 TEM-1 Bla의 존재 하에서의 그의 동력학에 대해 검사한다. 그 다음, 그의 막 투과성 특성은 CNIR5와 비교하여서, 이것이 본 출원이의 종래 프로브에 의해 전개된 것에 대해 견줄만하거나 또는 그보다 개선된 막 전달 및 보존 특성을 나타내는 지에 대해 평가한다. 그 다음, 피하 및 에어로졸 감염을 통한 동물 연구를 실시한 후, Mtb를 사용하여 이미지화시킨다.
세포페라존 CNIR 프로브의 구조와 활성 관계(SAR)를 더욱 이해하기 위해, BlaC에 대한 그의 결합의 컴퓨터를 이용한 모델화를 실시하였다. 동시에, 프로브를 BlaC과 코크리스탈라이제이션하여(cocrystalize) 복잡한 구조를 해결한다. 생성된 구조 정보는 개선된 프로브를 합리적으로 디자인화하는데 적용한다.
민감도가 개선된 프로브를 확인하기 위한 신속한 제한된 구조 라이브러리 분석
세포페라존 CNIR 프로브를 합성 및 시험한 후, X선 구조 연구에 의해 SAR 정제와 동시에 선택성을 개선시키고자 라이브러리 접근방법을 시도한다.
CNIR 프로브보다 아주 쉽게 Bluco를 제조하기 때문에, 효소 동력학에 대한 간편하고 신속한 판독을 제공하기 위해 Bluco-기초 기질들을 이용하였다. 세포페라존 동종체의 작은 바이어스드 라이브러리를 구정하는 주형으로서 Bluco를 이용한다. 이 라이브러리를 구성하고 다양성을 생성시키기 위해, 8 치환된 피페라진 2,3-다이온(A) 및 6 치환된 페닐글리실 메틸 에스테르(B)를 이용하며, 이들 모두는 시판 중이다. 이로 인해, 48개 멤버가 생성된다.
그 다음, 라이브러리를 Bluco 전구체(C)와 반응시켜서 Bluco의 최종 48개 동종체를 생성시킨다. D-루시페린 상의 카복실레이트 기를 통해 고체 지지체 상에서 라이브러리를 제조하였다. 본원의 라이브러리 제조에서의 이들 모든 화합물을 포함시키기 전, 각 멤버의 컴퓨터 모델화 연구는, BlaC의 활성 부위 포켓과 잠재적으로 정합하도록 BlaC의 X선 구조에 기초하여 실시하였다.
발광 마이크로플레이트 판독기를 사용하는 고출력 검정에서 라이브러리의 스크리닝을 실시하였다. 동력학 스크리닝 전, 제 1 단계는 완충액 중의 화합물의 안정성을 스크리닝하는 것이었다. 동시 항온처리의 초기 시점들에서 포지티브 대조군으로서의 본 출원인의 원래 Bluco 기질 및 루시페린와 발광성 수준을 비교함으로써 동력학을 평가하였다. 유리한 동력학을 갖는 화합물은 기질의 첨가 후 수분 내에 높은 수준의 발광을 나타내는루시페린의 신속한 가수분해 및 방출을 나타내는 반면; 본 출원인의 원래 Bluco 분자들은 동시 항온처리 수시간 후에 최대 수준의 발광을 나타낸다. 이들 연구에서는, BlaC로 개선된 동력학 및 광학 이미지화에 대한 더욱 큰 민감도를 나타내는 CNIR 및 Bluco 기질들에 대한 기초로서 사용될 수 있는 신규 화합물을 제공한다.
개선된 동력학을 위한 개질된 이탈기 .
3'-위치에서의 알릴 연결
페놀성 에터 사이의 이중결합은 페놀 기의 방출 동력학을 크게 증가시키는 것으로 알려져 있다[JACS, 2003, 125, 11146-11147]. 예를 들면, kcat는 페놀 이탈기에 대해 54 s-1까지 5배로 증가되었다. 이 관찰에 기초하여, 이중결합을 CNIR 프로브 내에 삽입하였다. 예를 들면, 도 22에 제시된 구조에 있어서, 상응하는 프로브가 도 25에 제시된다. 종래 예에서, 이중결합이 시스(cis) 배치구조를 갖는 반면, 본원에서의 배치구조는 매우 더욱 큰 알릴 기로 인해 트랜스(trans)인 것으로 예측된다. 유사하게, Bluco 내의 삽입된 이중결합은 Bluco2를 초래하며, 이는 Bluco보다 우수한 동력학을 갖는 것으로 예측된다(도 24).
3'-위치에서의 카밤에이트 연결기
3'-위치에서의 제 2 유형의 연결은 가수분해 후에 더 신속한 분전화를 제공하며 그에 따라 더욱 우수한 민감도를 제공한다. 이 디자인은 카밤에이트 연결기 및 D-루시페린의 아미노 동종체, 아미노 D-루시페린를 이용한다. 카밤에이트 연결기는 탁월한 이탈기로서 전구약물 디자인 내에 광범위하게 사용되어 왔다. Bla 분할은 카밤에이트를 방출하며, 이는 후속적으로 이산화탄소 및 자유 아미노 D-루시페린(도 26), 루시퍼라제에 대한 기질로 분해된다. 유사하게, 이 연결은 물론 CNIR 프로브에도 적용된다(도 26).
조직 분배의 평가를 통한 SREL 및 REF 민감도의 개선
조직 분배 연구는 CNIR 기질들의 형광을 사용하여 현재 농도를 측정함으로써 실시되어 왔다. 분할이 형광을 증가시키기 때문에, BlaC의 존재 하에서 항온처리하고 형광을 측정함으로써 미분할된 기질의 분배는 측정되고, 분할된 기질 농도는 직접적인 형광 평가에 의해 측정되었다. 이 방법이 조직들 내의 기질의 존재를 근사치로 접근할지라도, 조직 샘플 내의 자가형광으로 인해, 잠재적 억제제의 존재 및 기질의 자발적 가수분해가 수득된 데이터에 영향을 미칠지에 대해서는 명확하지 못하다. 더욱 상세한 조직 분배 데이터는 방사선-활성 표지화된 프로브의 분배의 검사를 통해 수득된다. CNIR5는 I125와 같은 방사선-활성 아이오딘으로 표지화되어서, 본 출원인이 생체 내 프로브의 분배를 용이하게 따를 수 있다. CNIR5 내의 방향족 기들은 단백질 내의 티로신을 표지화하는 프로토콜을 상요하여 유사하게 아이오딘화된다. 표지화된 프로브는 마우스 내에 주사되고, 역동적인 SPECT 이미지화가 수행된다. 여러 간격으로, 마우스를 희생시켜 기관을 수거하여서 방사선-활성을 계수한다. 동시에, 부검 후 수득된 가용성 단편들을 사용하는 HPLC를 사용하여 프로브의 자유 단편을 직접 평가한다. (전체 가용성) 조직 균질화물은, 차가운 프로브를 사용하고 HPLC에 의해 가용성인 형광에 의해 평가한 후, 뜨거운 프로브를 위해 단편들의 신틸레이션 검출(scintillation detection)을 실시한다. 동일한 실험을 신규 Mtb-특이적 프로브로 실시할 것이며, 이때 조직 분배를 개선시키려는 이들의 포텐셜에 대한 통찰을 제공하도록 이들이 개발 및 입증된다.
베타 갈락토시다제의 사용을 통한 SREL 및 REF 의 민감도 개선
여러 SREL/REF 효소 시스템이 더욱 우수한 효소 동력학 또는 기질들이 이용가능하기 때문에 BlaC보다 유의적 단점들을 가질 수 있기 때문에, 형광성(DDAOG)을 갖는 베타-갈락토시다제(lacZ) 또는 Mtb를 갖는 SREL/REF에 대한 발광성 기질들(Lugal)을 이용하였다. DDAOG 및 Lugal 둘다는 시험관 내에서의 이미지화에 성공적으로 이용하였고, Lugal은 마우스 내의 피하 감염을 이미지화시키는데 이용하였다. DDAOG가 시험관 내에서 희망적인 결과들을 제시할지라도, 본 출원인은 이를 생체 내 평가하지 않았다. 본 출원인에게는 DDAOG가 생체 내에서 Lugal만큼 민감한지에 대해 결정하는 것이 중요한데, 이는 기질과 함께 루시퍼라제가 전달되어야 하는 발광성 기질보다 몇몇 장점들을 갖기 때문이다. 이 시스템은 Bluco에 대한 것들과 유사한 문제점을 갖는다. DDAOG 또는 DDAOG에 기초하여 개선된 개질된 화합물은 궁극적으로 가장 민감한 시스템들 중 하나인 것으로 증명될 수 있으며, 본 출원인이 이것으로 살아있는 동물 내의 결핵 감염을 이미지화시키는데 성공적이면, 결핵을 앓는 집단에게 이 시스템을 즉각 가치가 있게 하려는 다수의 연구자들에 의해 이미 사용되는 다수의 비색성 리포터 시스템들이 존재한다.
실시예 13
큰 락탐을 사용하는 SREL 및 REF 프로브 특이성 개선
민감도가 개선된 프로브를 개발하는데 사용된 유사 전략은, 기타 박테리아 종 내에 존재하는 베타-락타마제보다 Mtb BlaC에 대해 선택적인 프로브를 개발하는데 사용된다. 이들 베타-락타마제 효소들의 가장 우수한 특성은 대장균 TEM-1이며, 이는 다수의 동력학 검정에 사용되며 진핵 시스템들에서 가치있는 리포터로서 사용되어 왔다. 민감도를 개선시키기 위해 비교하기 위해 사용된 접근방법에서의 주요 차이점은 Mtb BlaC와 대장균 TEM-1 사이의 동력학에서의 가장 큰 차이를 갖는 화합물에 대한 집중이다. 대부분의 베타-락탐들이 TEM-1 효소와 가장 우수한 동력학을 나타낼지라도, 3개의 베타-락탐들이 TEM-1보다 Mtb BlaC과 더욱 우수한 동력학을 나타내는 것으로 동정되어 왔다. 이들은 세포페라존, 세포탁심 및 세폭시틴이다. 이들 화합물은 이들의 동력학에서 유의적으로 변하지만, 세포페라존은 TEM-1 효소보다 Mtb 효소와 10 내지 100배 더 신속한 동력학을 나타내며, 이는 이것이 이 효소에 특이적인 프로브의 개발을 위한 우수한 후보물질임을 암시한다. CNIR 화합물은 세포페라존에 기초하여 구성되며, 이의 특이성은 판독자로서 형광과 함께 96-웰 포맷 내의 정제된 BlaC 및 TEM-1을 사용하는 이의 효소 동력학 파라미터들의 측정을 통해 검사된다.
제한된 구조적 라이브러리를 사용하는 SREL 및 REF 프로브 특이성 개선
실시예 12에서 개발된 화합물의 라이브러리는 또한 본 출원인의 SREL 및 REF 프로브의 특이성을 개선시키는데 사용될 수 있지만, 효소 동력학보다는 오히려 특이성에 집중된 변형된 고출력 스크린이 사용될 것이다. 기본적으로, 각 화합물은 앞서 기재된 바와 같이 Bluco-기초 기질로서 합성되고, 화합물은 본 출원인의 고출력 발광성 검정에서 정제된 BlaC 및 TEM-1의 존재 하에서 평가된다. 모든 화합물은 적중하는 표적을 동정하기 위해 BlaC로 스크리닝되고, 기타 효소들에 대해 불량한 기질인 것을 동정하기 위해 TEM-1 Bla로 스크리닝된다. 또한, 모든 화합물은 수중 37℃에서 안정성에 대해 미리 스크리닝하여서 향후 확실하게 오직 안정한 화합물만을 확인한다. 검정은 유사하게 실시되고, 모든 결과는 BlaC 대 TEM-1 발광의 비율로서 표기한다. 시작할 때, 본 출원인은 반응 30분 후에 BlaC 효소와 함께 10배 초과로 더욱 신속한 동력학을 나타내는 분자들에서의 역치를 세팅한다. 각각의 화합물은 BlaC 및 TEM-1 효소들의 결정 구조에 대해 컴퓨터 모델링하여서 견고한 구조-활성 관계(structure-activity relationship)(SAR)를 구축한다. 본 출원인이 이들 발견들을 REF에 사용된 CNIR 기질들로 해석할 수 있는 가정은 우선적으로 CNIR 및 Bluco-기초인 세포페라존 프로브의 활성을 비교함으로써 확인되었다. 본 출원인의 이들 데이터에서, 대식세포 내에서 세포간에서 성장되는 경우 및 피하 및 에어로졸 접종 후에 마우스 내에 감염 기간 동안, 우수한 특이성으로 동정된 락탐은 REF 프로브로 추가로 개발되고 시험관 내에서 Mtb 전체 세포들을 검출하는 이들의 능력에 대해 평가하였다.
실시예 14
살아있는 마우스에서의 이미지화를 위한 CBR 의 평가
본 출원인의 초기 연구들에서는, 방아벌레 레드(CBR) 루시퍼라제가 시험관 내 및 조직 배양 세포 내에서 Mtb에 대한 리포터로서 매우 잘 기능한다는 것을 발견하였다. CBR은 생성된 신호 및 시험관 내에서의 검출 역치에 관하여 개똥벌레 루시퍼라제(FFlux)와 견줄만하다고 발견되었다. 그러나, 마우스의 피하 및 폐 감염 기간 동안, CBR에 대한 검출 역치는 FFlux보다 유의적으로 더욱 우수하였다. 이 예비적인 관찰은 접종물에서의 차이, 생체 내 박테리아 대사에 대한 효과 또는 발광의 동력학에 기인할 수 있다. 이들 각각의 파라미터는 폐 및 피하 감염 기간 동안 Mtb의 생존성에 대한 리포터로서 CBR의 이용의 신중한 분석으로 검사된다. 발광의 동력학은 생체발광성 신호의 스펙트럼 언믹싱(unmixing)을 사용하여 해당 리포터를 입증하는 여러 부위 및 이들의 조합에서의 피하 접종을 사용하여 동일한 동물들에서 FFlux와 직접 평가 및 비교한다. 폐 감염은 상당한 수의 바실루스와 동시에 감염된 마우스 쌍들에서 개별적으로 평가한다. 낮은 산소 조건 하에서 시험관 내 신호 세기에 대한 효과를 검사함으로써 저산소 손상들 내의 CBR의 잠재적 민감도에 대해 간파한다. 생체 내에서 겪게 될 수 있는 기타 스트레스, 예컨대 낮은 pH 및 ROS 및 RNS의 존재를 검사한다.
치료 평가를 위한 CBR 이미지화의 분석
CBR 루시퍼라제 신호가 ATP의 존재에 의존적이기 때문에, 이 이미지화 시스템은 박테리아 생존성에 대한 치료 효과를 신속하게 평가할 수 있는 유일한 기회를 제공한다. 이 시스템에 관한 주요 의문점들 중 일부는 신호에서의 측정가능한 차이가 얼마나 신속하게 신속하게 수득될 것이며 이것이 MIC를 측정하는데 얼마나 정확하게 사용될 수 있는지에 관한 것이다. MIC는 아이소니아지드 및 리팜피신(rifampicin)에 대해 이 검정을 사용하여 Mtb에 대해 측정한다. 실험에서 측정된 MIC는 OD 및 CFU-기초 검정들에서 수득된 것과 비교된다. 신호 손실의 동력학은 항생제의 0.5x, 1x 및 5x MIC의 존재 하에서 전체 Mtb 검정을 사용하고 대식세포 내의 세포 사이에서 평가한다. 일단 동력학이 시험관 내에서 측정하고 CFU에 의해 생존성에서의 차이점들을 비교하면, 처리 후의 박테리아를 성장시키는 능력, 및 CFU와 발광 사이의 우수한 연관성이 남아있는지 여부를 평가한다. 일단 CFU와 발광 사이의 연관성이 시험관 내에서 성장한 박테리아에 대해 측정되면, 마우스 내의 피하 및 폐 감염 기간 동안 치료에 대한 발광 효과의 동력함을 검사한다. 폐 및 피하 환경에서의 박테리아의 접근성 사이에서 차이가 예측되기 때문에 접종 경로 둘다가 사용되며, 이로 인해 신호 손실의 동력학이 또한 쉽게 달라지게 될 것이다. 이들 연구에서는, 마우스에서의 치료의 신속한 평가를 위한 CBR의 이용에 대한 통찰이 제공된다. 이들 실험은 결과들이 신속하게 수득되게 하도록 급성 감염 단계에 집중하지만, 후속 실험들에서는 박테리아가 높은 비율로 복제하지 않을 경우의 치료도 또한 평가하는데 이 시스템이 유용할지에 대해 확립하도록 만성 감염 단계 동안 실시될 필요가 있을 것이다.
이중 CBR - REF 광학 이미지화 시스템의 개발
CBR 시스템은 박테리아 생존성에 대한 신속한 판독이 가능하기 때문에 유리하지만, 일부의 경우에는 이 유형의 시스템이 적합하지 않을 수 있다. 박테리아 대사율이 최대 광 생성을 허용하는데 충분하지 않은 상황에서, 루시퍼라제-기초 시스템들은 최적의 대사 조건 하에서와 같이 민감하지 않을 수 있다. CBR을 사용하여 치료 효과를 평가하며, 여러 정량화된 조직들 및 tREF 내의 바실루스를 사용하여 이들의 세포 위치를 측정한다. 여러 환경에서 박테리아의 평가를 위한 이들 2개의 시스템의 잠재적 이용에 대한 통찰을 얻기 위해, 폐의 피하 감염 후, CBR 및 REF 신호 손실 둘다의 동력학을 마우스에서 검사하였다. 발광은 항생제의 전달에 따라 즉각적으로 감소하며, REF 신호는 신호의 손실을 관찰하기 위해 24시간만큼 긴 시간이 요구된다. 대사 활성에 대한 CBR과 REF의 민감도에서의 차이는 대사 상태와 결부되어 실시간으로 박테리아를 평가할 수 있는 포텐셜을 제공한다. 이것은 개발하려는 중요한 시스템인데, 이는 모든 박테리아의 어떤 대사 상태가 동물 내의 Mtb 감염 기간 동안에 존재하는지 불명료하게 남아있기 때문이다. 이 이미지화 시스템은 신호 실시간으로 각 신호의 존재 또는 부재에 의해 살아있는 동물 내의 여러 환경으로의 전이를 직접 관찰하는 최초 수단을 제공한다. 이 능력은 치료를 평가하기 위한 특히 중요한 것으로 판명되는데, 이는 치료제가 이들이 다른 것들 중에 존재하지 않는 일부 환경에서 살균성을 나타낼 수 있기 때문이며, 이는 예비임상 연구의 연속성에 대한 중요한 고려사항이다.
하기 참조문헌은 본원에 인용되고 있다:
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이 명세서에서 언급된 임의의 특허 또는 공개문헌은 발명이 속하는 분야의 숙련자의 수준을 지적한 것이다. 이들 특허 및 공개문헌은 각각의 개별 공개문헌이 특별하게 그리고 개별적으로 참고로 인용되는 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 인용되고 있다.
당해 분야의 숙련자라면, 본 발명이 본원에 본래 개시된 것뿐만 아니라 목적을 수행하고 언급된 최종 목적 및 장점들을 수득하도록 잘 채택되는 것으로 쉽게 이해할 것이다. 발명의 취지 또는 범위로부터 벗어남 없이 본 발명을 실시하는데 있어 다양한 변경과 변형이 이루어질 수 있음이 당해 분야의 숙련자에게는 분명할 것이다. 청구의 범위에 의해 한정된 바와 같이 발명의 취지 내에 포함되는 그 안에서의 변화들 및 기타 용도들이 당해 분야의 숙련자에게 발생할 것이다.

Claims (49)

  1. 대상물 내의 병원성 박테리아를 실시간 검출하는 방법으로서,
    대상물 또는 그로부터의 생물학적 샘플 내에 병원성 박테리아의 베타-락타마제에 대한 형광성, 발광성 또는 비색성 기질을 도입시키는 단계;
    기질 상의 베타-락타마제 활성으로부터의 생성물에 대해 대상물 또는 샘플을 이미지화시키는 단계; 및
    베타-락타마제 생성물에 의해 방출된 신호들을 파장에서 획득하며, 이에 의해 대상물 내의 병원성 박테리아를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    방출된 신호의 3D 재구성을 생성시켜서 대상물 내의 병원성 박테리아의 위치를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    측정된 대조 신호보다 큰 방출된 신호 세기에 기초하여 병원성 박테리아와 연관된 병태생리학적 상태를 실시간으로 진단하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 병태생리학적 상태는 결핵인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 형광성, 발광성 또는 비색성 기질은 플루오로제닉(fluorogenic) 기질인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 플루오로제닉 기질은 CNIR2, CNIR3, CNIR4, CNIR5, CNIR5-QSY22, CNIR7, CNIR9, CNIR10, CNIR7-TAT, 케이징된 루시페린(caged luciferin), 비색성 시약 또는 이들의 유도체인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 병원성 박테리아는 박테로이데스(Bacteroides), 클로스트리디움(Clostridium), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스테필로코쿠스(Staphylococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 하에모필루스(Haemophilus), 레지오넬라(Legionella), 미코박테리움(Mycobacterium), 에스체리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella) 또는 리스테리아(Listeria)의 박테리아 종을 포함하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 이미지화 파장은 약 300 내지 약 900 nm인 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 방출된 신호들의 파장은 약 300 내지 약 900 nm인 방법.
  10. 대상물 내의 병원성 박테리아와 연관된 병태생리학적 상태를 진단하는 방법으로서,
    대상물에 투여하거나, 또는 그로부터 유도된 생물학적 샘플을 병원성 박테리아의 베타-락타마제에 대한 플루오로제닉 또는 발광성 기질과 접촉시키는 단계;
    기질 상의 베타-락타마제 활성의 생성물에 대해 대상물을 이미지화시키는 단계; 및
    생성물에 의해 방출된 형광성, 발광성 또는 비색성 신호 세기를 파장에서 실시간으로 측정하는 단계를 포함하되,
    병태생리학적 상태의 진단은 측정 대조 신호보다 큰 형광성, 발광성 또는 비색성 신호 세기와 관련되어 있는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    신호의 3D 재구성을 생성시켜서 미생물 병원체의 위치를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    효과적인 하나 이상의 치료 화합물을 투여하여 병태생리학적 상태를 치료하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    플루오로제닉 기질을 대상물에 다시 투여하거나, 또는 그로부터 유도된 생물학적 샘플을 상기 플루오로제닉 기질과 접촉시키는 단계; 및
    대상물 또는 상기 생물학적 샘플을 이미지화시켜서 치료 화합물의 효능을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하되,
    진단시 신호와 비교해서 방출 신호에서의 감소는 병태생리학적 상태에 대한 치료 효과를 지시하는 방법.
  14. 제 10 항에 있어서,
    상기 병태생리학적 상태는 결핵인 방법.
  15. 제 10 항에 있어서,
    상기 병원성 박테리아는 박테로이데스(Bacteroides), 클로스트리디움(Clostridium), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스테필로코쿠스(Staphylococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 하에모필루스(Haemophilus), 레지오넬라(Legionella), 미코박테리움(Mycobacterium), 에스체리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella) 또는 리스테리아(Listeria)의 박테리아 종을 포함하는 방법.
  16. 제 10 항에 있어서,
    상기 플루오로제닉 기질은 CNIR2, CNIR3, CNIR4, CNIR5, CNIR5-QSY22, CNIR7, CNIR7-TAT, CNIR9, CNIR10, 케이징된 루시페린, 비색성 시약 또는 이들의 유도체인 방법.
  17. 제 10 항에 있어서,
    상기 이미지화 파장은 약 300 내지 약 900 nm인 방법.
  18. 제 10 항에 있어서,
    상기 방출된 신호들의 파장은 약 300 내지 약 900 nm인 방법.
  19. 대상물 내의 병원성 박테리아와 연관된 병태생리학적 상태를 치료하는데 효과적인 치료 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,
    병원성 박테리아에 대한 잠재적 치료 화합물을 선택하는 단계;
    박테리아 세포를 형광성, 발광성 또는 비색성 검출제와 접촉시키는 단계;
    박테리아 세포를 잠재적 치료 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    잠재적 치료 화합물의 존재 및 부재 하에서 박테리아 세포에 의해 생성된 형광성, 발광성 또는 비색성 신호를 측정하는 단계를 포함하되,
    잠재적 치료 화합물의 부재 하에서의 신호와 비교하여 잠재적 치료 화합물의 존재 하에서의 신호의 감소는 병원성 박테리아에 대한 화합물의 치료 효과를 지시하는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서,
    상기 병원성 박테리아는 재조합 박테리아이되,
    박테리아를 형광성, 발광성 또는 비색성 검출제와 접촉시키는 상기 단계는, 야생형 박테리아를 형광성, 발광성 또는 비색성 검출제가 포함된 발현 벡터로 형질전환시키는 것을 포함하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 발현 벡터는 형광성 단백질을 포함하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 형광성 단백질은 mPlum, mKeima, Mcherry 또는 tdTomato인 방법.
  23. 제 18 항에 있어서,
    상기 발현 벡터는 베타-갈락토시다제 유전자를 포함하되,
    상기 방법은 재조합 박테리아 세포를 베타-갈락토시다제 효소의 존재 하에서 효과적인 플루오로포어(fluorophor)와 접촉시켜서 형광성 신호를 방출시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 플루오로포어는 C2FDG, C12RG, DDAOG 또는 이들의 유도체인 방법.
  25. 제 18 항에 있어서,
    상기 발현 벡터는 루시퍼라제 유전자를 포함하되,
    상기 방법은 재조합 박테리아 세포를 D-루시페린과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 루시퍼라제는 개똥벌레(firefly) 루시퍼라제, 방아벌레 레드(click beetle red) 또는 rLuc8인 방법.
  27. 제 18 항에 있어서,
    상기 형광성 검출제는 박테리아 베타-락타마제의 플루오로제닉 기질인 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 병원성 박테리아를 생체 내에서 플루오로제닉 기질인 CNIR2, CNIR3, CNIR4, CNIR5, CNIR5-QSY22, CNIR7, CNIR9, CNIR10, CNIR-TAT, 케이징된 루시페린, 비색성 시약 또는 이들의 유도체와 접촉시키는 방법.
  29. 제 18 항에 있어서,
    상기 병원성 박테리아를 시험관 내에서 플루오로제닉 기질인 CC1, CC2, CHPQ, CR2, CNIR1, CNIR6 또는 이들의 유도체와 접촉시키는 방법.
  30. 제 18 항에 있어서,
    상기 병원성 박테리아는 박테로이데스(Bacteroides), 클로스트리디움(Clostridium), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스테필로코쿠스(Staphylococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 하에모필루스(Haemophilus), 레지오넬라(Legionella), 미코박테리움(Mycobacterium), 에스체리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella) 또는 리스테리아(Listeria)의 박테리아 종을 포함하는 방법.
  31. 제 18 항에 있어서,
    상기 병태생리학적 상태는 결핵인 방법.
  32. 병원성 박테리아를 이미지화시키는 방법으로서,
    병원성 박테리아를 베타-락타마제 효소에 대한 플루오로제닉 기질과 접촉시키는 단계;
    기질 상의 베타-락타마제 활성의 생성물에 대한 여기 파장을 병원성 박테리아에 전달하는 단계;
    생성물로부터 방출된 형광성, 발광성 또는 비색성 신호들을 획득하는 단계; 및
    획득된 신호들의 3D 재구성을 생성시키며, 이에 의해 병원성 박테리아를 이미지화시키는 단계를 포함하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    상기 병원성 박테리아는 박테로이데스(Bacteroides), 클로스트리디움(Clostridium), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스테필로코쿠스(Staphylococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 하에모필루스(Haemophilus), 레지오넬라(Legionella), 미코박테리움(Mycobacterium), 에스체리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella) 또는 리스테리아(Listeria)의 박테리아 종을 포함하는 방법.
  34. 제 32 항에 있어서,
    상기 여기 파장은 약 540 내지 약 730 nm인 방법.
  35. 제 32 항에 있어서,
    상기 방출된 신호의 파장은 약 650 내지 약 800 nm인 방법.
  36. 제 32 항에 있어서,
    상기 병원성 박테리아를 생체 내에서 플루오로제닉 기질인 CNIR2, CNIR3, CNIR4, CNIR5, CNIR5-QSY22, CNIR7, CNIR9, CNIR10, CNIR-TAT, 케이징된 루시페린, 비색성 시약 또는 이들의 유도체와 접촉시키는 방법.
  37. 제 32 항에 있어서,
    상기 병원성 박테리아를 시험관 내에서 플루오로제닉 기질인 CC1, CC2, CHPQ, CR2, CNIR1, CNIR6 또는 이들의 유도체와 접촉시키는 방법.
  38. CNIR-7, CNIR7-TAT 또는 이들의 유도체인 박테리아 베타-락타마제에 대한 플루오로제닉 기질.
  39. 대상물 내의 병원성 박테리아를 실시간 검출하는 방법으로서,
    감마 방출과 연관된 동위원소로 방사선-표지화된 기질을 대상물 내에 도입시키되, 상기 기질은 병원성 박테리아에 특이적인 다른 효소 또는 단백질, 또는 베타-락타마제를 위한 것인 단계;
    방사선-표지화된 기질로부터 감마 방출에 대해 그의 활성 동안 대상물을 이미지화시키는 단계;
    방출된 감마선에 의해 생성된 신호들을 획득하는 단계; 및
    감마선 생성된 신호들의 세기에 기초하여 방사선-표지의 대상물 내의 농도의 3D 재구성을 생성시키며, 이에 의해 대상물 내의 병원성 박테리아를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서,
    병원성 박테리아와 연관된 병태생리학적 상태를 그의 검출에 기초하여 실시간으로 진단하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서,
    효과적인 하나 이상의 치료 화합물을 투여하여 병태생리학적 상태를 치료하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서,
    방사선-표지화된 기질을 대상물에 다시 투여하는 단계; 및
    대상물을 다시 이미지화시켜 치료 화합물의 효능을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하되,
    진단시 감마 방출과 비교해서 감마 방출에서의 감소는 병태생리학적 상태에 대한 치료 효과를 지시하는 방법.
  43. 제 40 항에 있어서,
    상기 병태생리학적 상태는 결핵인 방법.
  44. 제 39 항에 있어서,
    상기 방사선-표지는 양전자-방출 동위원소이고,
    상기 이미지화는 양전자 방출 단층촬영법(positron emission tomography)(PET)에 의한 것인 방법.
  45. 제 39 항에 있어서,
    상기 방사선-표지는 감마선을 직접 방출시키는 동위원소이고,
    상기 이미지화는 단일 광자 방출 계산 단층촬영법(single photon emission computed tomography)(SPECT)에 의한 것인 방법.
  46. 제 39 항에 있어서,
    상기 다른 효소 또는 단백질은 베타-락타마제-유사 효소 또는 페니실린-결합 단백질.
  47. 제 39 항에 있어서,
    상기 병원성 박테리아는 박테로이데스(Bacteroides), 클로스트리디움(Clostridium), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스테필로코쿠스(Staphylococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 하에모필루스(Haemophilus), 레지오넬라(Legionella), 미코박테리움(Mycobacterium), 에스체리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella) 또는 리스테리아(Listeria)의 박테리아 종을 포함하는 방법.
  48. PET 또는 SPECT 이미지화에 적합한 박테리아 베타-락타마제에 대한 방사선-표지화된 기질.
  49. 제 48 항에 있어서,
    상기 방사선-표지는 불소-18, 질소-13, 산소-18, 탄소-11, 테크네튬(technetium)-99m, 요소-123 또는 인듐-111인 방사선-표지화된 기질.
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