KR20110049140A - 식중독 원인균의 다중 실시간 검출방법 - Google Patents

식중독 원인균의 다중 실시간 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식중독 원인균인 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)를 동시에 실시간으로 검출할 수 있는 PCR 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법의 방법에 따르면 세 가지 식중독 원인균 살모넬라 티피무리움, 스타필로코커스 아우레우스와 비브리오 파라해몰리티쿠스를 동시에 경제적인 비용으로 단기간 내에 검출할 수 있는 효과가 있다.
식중독균, 살모넬라 티피무리움, 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스, PCR

Description

식중독 원인균의 다중 실시간 검출방법{A multiflex real time PCR for detecting food poisoning phathogen bacterium}
본 발명은 식중독 원인균의 다중 실시간 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 식중독 원인균인 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)를 동시에 실시간으로 검출할 수 있는 PCR 방법에 관한 것이다.
식중독이란 음식물 섭취에 따른 건강 장해 중의 하나로 일반적으로 “식중독을 일으키는 미생물이 식품에 부착, 증식하거나, 독성물질의 혼입 혹은 잔류에 따른 건강상의 장해”를 식중독이라 한다. 국내 식중독 현황을 분석해보면 1990년 대비 2006년에 환자수 618명에서 10,833명으로 16년 사이 17배가 증가하였으며, 식중독 사고 1건 당 환자의 발생 비율도 41명으로 약 2.16배가 증가 하였다. 이는 최근 환경 변화로 인해 계절에 관계없이 연중 식중독이 발생할 뿐만 아니라 농축산물 원료 및 가공식품의 수출입 자유화에 따른 국제간의 교류 확대 및 식생활 패턴 변화에 의한 단체 급식, 가공식품, 냉장 및 냉동식품, 즉석식품 등의 소비 증가에 따라 다발적인 집단 식중독 발생 증가가 주요 요인이다. 따라서 식중독 발생 증가와 함께 먹거리에 대한 국민들의 불안감은 고조되었으며, 건강한 삶의 영위를 위해 식품으로부터 오는 위해를 사전에 예방하고 피해를 최소화함으로써 식품으로부터의 안전을 확보하고자 하는 중요성이 높아지고 있다.
국내에서 식품으로부터 발생되는 유해는 80-90%가 세균성 식중독이 차지하고 있으며, 살모넬라, 장염비브리오, 황색포도상구균의 순서로 발생하고 있다. 이에 정부는 위해요소중점관리기준(HACCP) 및 우수농산물(GAP) 인증 등의 제도를 통해 식품안전성을 향상시키고자 노력하고 있다. 그러나 현, 식중독 균 검사 방법은 장기적인 시간과 많은 노동력 등이 요구되어 늘어나는 검사 수요를 감당 할 수 없을 뿐만 아니라 신속성이 낮아 조기 발견으로의 역할은 미비하다. 따라서 최근에는 현행 식중독 균 검출법을 보완을 위해 식중독 균 검출법은 분자생물학적 방법을 응용한 검출법들이 다양하게 개발되어졌다.
분자생물학 중심으로 연구된 병원성 세균 검출법을 살펴보면, 항체를 이용하여 균주의 특이적 항원을 측정하는 면역학적 방법으로는 면역크로마토그래피(Gwag, H.S., Lee, D.H., Mun H.S., Park, J.S., U, G.J., Kim, C.M. (2003) Evaluation of the efficiency of E. coli O157: H7 rapid detection kit using immunochromatography, J. Fd Hyg. Safety, 18, 118-124), 면역리포좀(Kim, M.H., Kim, W.J, Sin, W.S., Son, D.H., Cha, S.G. (2003) Feasibility study on the Use of liposomes for detecting food-borne pathogenic bacteria, Korean J. Food Sci. Ani. Resour., 23, 278-283 ) 등이 개발 되었다.
이와 관련하여 대한민국 특허출원 제10-2007-0133750호 “면역자기분리 및 면역리포좀을 이용한 살모넬라균의 탐지방법”에 면역자기분리(Immunomagnetic Separation; IMS) 및 면역리포좀(Immunoliposomes; IL)을 사용한 식중독의 원인이 되는 살모넬라균의 탐지방법이 개시되어 있다.
유전학적 방법으로는 일반적으로 PCR을 이용하여 균주의 특정 DNA 서열을 증폭시켜 진단하는 것으로 대상 유전자들은 주로 병원균주의 독소유전자(Jung, H.J., Cho, J.I., Song, E.S., Kim, J.J., Kim, K.S. (2005) PCR detection of virulence genes encoding coagulase and other toxins among clinical methicillin-resistant 스타필로코커스 아우레우스 Isolates, Kor. J. Microbio. Biotechnol., 33, 207-214; Lim, J.S., Yoon, J.H., Min, B.K., Hong, K.W. (2008) Detection and identification of shiga-like toxin producing Escherichia coli O157:H7 by multiplex PCR, Food Engineering Progress., 12, 8-14; Jeong, S.H., Kim, M.Y., Kim, H.J., Kim, T.U., Yu, S.L., Kim, H.Y. (2003) Rapid detection of Salmonella Species in foods using PCR, J. Korean Soc. Agric. Chem, Biotechnol., 46, 225-228)나 병원균에서 발현하는 고유 단백질 유전자(Han, K.H., Lee, C.W., Lee, Y.S. Yang, O.S., Lim, Y.K, Yoon, B.S. (2001) Application of multiplex PCR Using Lis - mix primers in food test and specific detection of Listeria ivanovii, J. Fd Hyg. Safety, 16, 251-257), 원시핵 세포의 게놈 상에 간헐적으로 분산되어 있는 반복적인 DNA 서열(Seo, H.A., Park, S.H., Kim, G.S. Optimization of the concentrations of ERIC-PCR components to simultaneously differentiate five foodborne pathogenic bacterial genera, J. Fd Hyg. Safety, 18, 229-236), 16S rRNA 유전자 등을 사용한 연구도 있다.
이와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-090616호 “중합효소연쇄반응과 효소결합면역반응을 이용한 식중독 세균 Listeria monocytogenes의 검출법”에는 Listeria monocytogenes의 병원성 인자(virulence factor)인 리스테리오라이신(listeriolysin)을 코딩하는 hly 유전자를 선택적으로 검출할 수 있는 PCR 프라이머로 중합효소연쇄반응을 시키고, 위 PCR 반응의 산물에 특이적으로 결합할 수 있는 탐침자(capture probe)를 넣어 혼성화시킨 후, 위 혼성화된 PCR 반응의 산물에 효소결합면역반응(ELISA)을 적용시켜서 위 식중독 세균을 검출하는 방법 및 키트가 개시되어 있다.
또한 대한민국 등록특허 제10-0919262호 “식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법”에는 대장균 O157:H7, 스타필로코커스 아우레우스, 바실러스 세레우스, 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 리스테리아 모노사이토게네스, 열시니아 엔테리콜리티카, 클로스트리디움 퍼프리젠스, 살모넬라 속 균주, 쉬겔라 속 균주 및 캠필로박터 제주니 각각의 특이 유전자를 신속 정확하게 증폭시킬 수 있는 PCR 프라이머, 상기 프라이머를 이용한 식중독 검출방법 및 검출키트가 개시되어 있다.
또한 대한민국 특허출원 제10-2008-0026869호 “식중독 병원균의 동시 검출용 프라이머 및 이의 용도”에 식중독 병원균의 동시 검출용 프라이머쌍 및 이를 이용한 식중독 병원균의 검출 방법이 개시되어 있고, 대한민국 특허출원 제10-2008-0003945호에 노로바이러스 검출용 항체, 및 이를 이용한 노로바이러스검출방법이 개시되어 있다.
그 외에도 김 등(Kim, S.S., Lee, H.M., Lee, J.B. (2003) Molecular epidemiological characteristics of Vibrio parahemoliticus as recently wilde-spreaded in Korea, Korean J. Biotechnol. Bioeng. 18, 522-528)은 변패원인균인 Pseudomonas aeruginosa를 검출할 수 있는 비표지 면역센서 개발하여 병원균 검출에 있어 바이오센서의 적용도 시도하였다.
이와 관련하여 대한민국 특허출원 제10-2008-0011842호 “식중독균 검출용 임피던스 바이오 센서 및 이를 이용한검출방법”에는 교호로 배치되는 미세 전극과, 전극 상에 고정되는 식중독균 포획항체와, 전극에서 입출력하는 주파수를 비교하여 임피던스를 측정 및 분석하는 임피던스 모듈을 포함하며, 이 센서를 이용하여 반응억제제를 분석 대상 시료에 첨가하는 단계, 시료를 전극 상의 식중독균 포획항체에 투입하는 단계, 항체와 결합하지 않은 세균과 이물질을 제거하는 단계, 및 임피던스를 측정 및 분석하는 단계에 의한 식중독균을 검출하는 임피던스 바이오 센서가 개시되어 있다.
그러나 상기의 개발된 종래의 검출법은 검출 결과의 정확성 및 검출 비용 절감에 대한 논쟁이 지속적으로 이루어지고 있다. 그러므로 식품 안전성을 향상시키기 위한 세균성 식중독 균의 검출법은 효율적이고 간편하며 이와 더불어 소요 비용을 줄이고 신속하게 검출 할 수 있는 기술 개발이 필요한 실정이다.
따라서 본 발명에서는 식중독의 발생의 주요 원인균으로 보고되고 있는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)의 다중동시 검출법으로써 멀티플렉스 실시간 PCR법(Multiplex Real time PCR)을 개발하여 검사시간 단축과 비용 절감, 정량화를 할 수 있는 식중독 검출법을 개발하고 본 발명에 이르게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 식중독균의 검사기간 단축과 비용 절감, 정량화를 위해 살모넬라 티피무리움, 스타필로코커스 아우레우스와 비브리오 파라해몰리티쿠스를 다중동시 검출법할 수 있는 멀티플렉스 실시간 PCR법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적은 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 티피무리움으로부터 템플릿 DNA를 제작하고, 상기 DNA 검출을 위한 최적 구성의 프라이머 세트를 선정한 후, 이들을 섞어 다중 PCR을 수행하여 상기 세 균주를 한 번에 검출할 수 있음을 확인함으로써 달성되었다.
본 발명은 식품에서 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 비 브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)를 동시에 검출할 수 있는 다중 실시간 PCR(multiflex real time PCR; RTi-PCR) 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)로부터 각각 템플릿 DNA를 제작하는 단계;
하기 1) 내지 3)의 프라이머 세트를 선정하는 단계;
1) 서열번호 1(GAC ATT GTG TCT TCG AGT CGT)의 STA-YH5F 프라이머와 서열번호 2(TAT ACA TCA CCT TAC GGT TTA GC)의 STA-YH5R 프라이머로 구성된 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머 세트,
2) 서열번호 3(AGT GAG TGA TAA CTA TCT GC)의 Vib-YH4F 프라이머와 서열번호 4(ACG TAG TTG CGC TTC AGA)의 Vib-YH4R 프라이머로 구성된 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 검출용 프라이머 세트,
3) 서열번호 5(ACA ATG GAT CGC ACT ATC)의 Sal-YH1CF 프라이머와 서열번호 6(CAA CAT CCT TGA ACA TGT GAT)의 Sal-YH1CR 프라이머로 구성된 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 검출용 프라미어 세트
상기 템플릿 DNA와 프라이머세트를 이용하여 다중 PCR을 수행하는 단계; 및
상기 PCR 산물로부터 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 티피무리움을 동시에 검출하는 단계
로 이루어진다.
또한 본 발명은 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시에 검출하는 다중 PCR 방법에 사용되는 서열번호 1의 STA-YH5F 프라이머와 서열번호 2의 STA-YH5R 프라이머로 구성된 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시에 검출하는 다중 PCR 방법에 사용되는 서열번호 3의 Vib-YH4F 프라이머와 서열번호 4의 Vib-YH4R 프라이머로 구성된 비브리오 파라해몰리티쿠스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시에 검출하는 다중 PCR 방법에 사용되는 서열번호 5의 Sal-YH1CF 프라이머와 서열번호 6의 Sal-YH1CR 프라이머로 구성된 살모넬라 엔테리카 검출용 프라미어 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 1) 서열번호 1의 STA-YH5F 프라이머와 서열번호 2의 STA-YH5R 프라이머로 구성된 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 세트, 2) 서열번호 3의 Vib-YH4F 프라이머와 서열번호 4의 Vib-YH4R 프라이머로 구성된 비브리오 파라해몰리티쿠스 검출용 프라이머 세트 및 3) 서열번호 5의 Sal-YH1CF 프라이머와 서열번호 6의 Sal-YH1CR 프라이머로 구성된 살모넬라 엔테리카 검출용 프라미어 세트를 포함하는 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에서는 국내 주요 식중독 원인균인 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 티피무리움을 RTi-PCR에 의해 다중동시 검출하고자 하였다. 따라서 스타필로코커스 아우레우스 균주를 검출하기 위하여 STA-YH5F/STA-YH5R 프라이머 세트, 비브리오 파라해몰리티쿠스 균주를 검출하기 위하여 Vib-YH4F/Vib-YH4R 프라이머 세트, 살모넬라 티피무리움 균주를 검출하기 위하여 Sal-YH1CF/Sal-YH1CR 프라이머 세트를 구축하였으며 사용 최적조건을 확립하였다.
상기에서 구축된 프라이머 세트는 목적하는 식중독 원인균주 간에 교차반응을 나타내지 않았으며, 시험되어진 8종의 병원성 균주에 대해서 비특이적 유전자 증폭반응을 일으키지 않음을 확인하였다. 또한 특이적으로 증폭되어진 유전자의 융점(℃)은 각 균주를 동정할 수 있는 각기 다른 특정온도인 스타필로코커스 아우레우스 85.5±5℃, 비브리오 파라해몰리티쿠스 77.5±5℃, 살모넬라 티피무리움 79.5±5℃값으로 RTi-PCR법에 의해 >101CFU을 증균배양 없이 식품에서 세 식중독 원인균의 다중동시검출 및 동정이 가능하였다.
종래 PCR을 위하여 사용되는 템플릿 DNA를 얻기 위해 시료에 상업용 DNA 추출 키트를 사용한다. 하지만 본 발명에서 사용된 조 DNA 추출물 시료는 PCR 반응에 템플릿으로써 문제가 없었다. 따라서 경제적인 비용으로 PCR을 위한 템플릿을 얻을 수 있었다.
본 발명에서 확립되어진 시료 전처리 프로토콜, 프라이머 세트 및 PCR 조건으로 식품 내에 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 티피무리움의 오염여부를 알기 위해 모든 실험과정부터 결과분석까지 총 4-5시간 안에 해결할 수 있게 되었다.
본 발명의 식중독 원인균의 다중 실시간 검출방법에 따른 전처리 프로토콜, 프라이머 세트 및 PCR 조건을 사용함으로써 식품 내에 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 티피무리움의 오염여부를 경제적 비용으로 단기간 내에 확인할 수 있는 효과가 있다,
이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
본 발명에서는 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 티피무리움을 다중동시검출 할 수 있는 멀티플레스 실시간 PCR 시스템을 확립하고자 하였다.
본 발명에 이용된 균주인 스타필로코커스 아우레우스 외 9종의 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC), 한국미생물보존센터(KCCM)에서 구입하여 사용하였으며, 배양배지 및 배양조건은 하기 표 1과 같다.
<표 1>
병원성 세균 배양 조건
균주 배지 배양 온도
Staphylococcus aureus subsp. aureus
(KCTC 1621)		 Trypticase Soy Agar 37℃
Vibrio parahaemolyticus
(KCTC 2471)		 Marine Agar 30℃
Salmonella typhimurium
(KCTC 2514)		 Nutrient agar 37℃
Bacillus cereus
(KCTC 1012)		 Nutrient agar 30℃
Listeria monocytogenes
(KCTC 3569)		 Brain Heart in fusion agar 37℃
Escherichia coli
(KCTC 2593)		 Nutrient agar 37℃
Proteus vulgaris
(KCTC 2433)		 Nutrient agar 37℃
Streptococcus pyogenes
(KCTC 3096)		 Brain Heart in fusion agar 37℃
Candida albicans
(KCTC7965)		 YM agar 25℃
Shigella sonnei
(KCCM 41282 )		 Nutrient agar 37℃
PCR 분석 시 사용되는 템플릿 DNA를 준비하기 위해 각 병원균의 진탕배양액을 2mL씩 취하여 10,000 rpm으로 원심분리한 후 상등액을 제거하고 회수한 펠릿을 1 mL로 멸균 증류수로 현탁시켰다. 그리고 이를 자동핵산추출기(Magtration 6 GC, PSS. Japan)를 사용하여 총 DNA를 정제하였다.
본 발명에서 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 티피무리움의 검출 프라이머는 하기 표 2와 같다. 스타필로코커스 아우레우스는 272bp의 PCR산물인 23s rRNA를 증폭시킬 수 있는 STA-YS5F/STA-YS5R 프라이머 세트를 사용하였고, 비브리오 파라해몰리티쿠스는 독소유전자인 ToxR(91bp)(15)을 증폭시킬 수 있는 Vib-YS4F/Vib-YS4R 프라이머 세트를 사용하였다. 살모넬라 티피 무리움은 101bp의 PCR 산물인 복제 기원(Replication origin)을 증폭시킬 수 있는 Sal-YS1CF/Sal-YS1CR 프라이머 세트를 사용하였다. 이러한 프라이머는 바이오니아사(Bioneer, Korea)에 합성을 의뢰하여 본 발명에 이용하였다.
<표 2>
식중독 원인균 검출 프라이머
균주 증폭 유전자
(PCR 산물 크기) 		프라이머 DNA 서열 (5'-3') 서열번호
스타필로코커스 아우레우스 23S rRNA
(272bp)		 STA-YH5F
(정방향 프라이머)		 GAC ATT GTG TCT TCG AGT CGT 1
STA-YH5R
(역방향 프라이머)		 TAT ACA TCA CCT TAC GGT TTA GC 2
비브리오 파라해몰리티쿠스 ToxR gene
(91bp)		 Vib-YH4F
(정방향 프라이머)		 AGT GAG TGA TAA CTA TCT GC 3
Vib-YH4R
(역방향 프라이머)		 ACG TAG TTG CGC TTC AGA 4
살모넬라 티피무리움 Replication origin gene
(101bp)		 Sal-YH1CF
(정방향 프라이머)		 ACA ATG GAT CGC ACT ATC 5
Sal-YH1CR
(역방향 프라이머)		 CAA CAT CCT TGA ACA TGT GAT 6
실시예 1 : 구축된 프라이머 세트에 의한 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 티피무리움 의 특이적 유전자 증폭
상기 표 2와 같은 프라이머 세트를 이용하여 RTi-PCR법에 의하여 식중독의 원인균인 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 티피무리움을 특이적으로 증폭 및 검출 할 수 있는지 알아보고자 하였다.
선정되어진 프라이머 세트로 세 식중독 원인균의 다중동시 검출을 위한 바이오마커용 프라이머를 구축하기 위해 프라이머 사용 농도조건과 불림 온도(annealing temperature) 조건에 따른 비교반복 시험을 통해 최적 사용조건을 확 립 하고자 하였다.
스타필로코커스 아우레우스 유전자의 증폭 및 검출을 위한 PCR 혼합물로써 템플릿 DNA(1ng) 1uL, STA-YH5F(1.65pmole/uL) 1uL, STA-YH5R(1.65pmole/ul) 1uL, 2x iQ　SYBR Green supermix(Bio-rad, USA) 12.5uL와 최종 부피가 25uL 되도록 증류수를 첨가하여 PCR을 수행하였다.
비브리오 파라해몰리티쿠스 유전자의 증폭 및 검출을 위한 PCR 혼합물로써 템플릿 DNA(1ng) 1uL, Vib-YH4F(2pmole/uL) 1uL, Vib-YH4R(2pmole/uL) 1uL, 2x iQ　SYBR Green supermix(Bio-rad, USA) 12.5uL와 최종 부피가 25uL 되도록 증류수를 첨가하여 PCR을 수행하였다.
살모넬라 티피무리움 유전자의 증폭 및 검출을 위한 PCR 혼합물로써 템플릿 DNA(1ng) 1uL, Sal-YH1CF(4.2pmole/uL) 1uL, Sal-YH1CR(2pmole/uL) 1uL, 2x iQ　SYBR Green supermix(Bio-rad, USA) 12.5uL와 최종 부피가 25uL 되도록 증류수를 첨가하여 PCR을 수행하였다. 하기 표 3과 같은 조건으로 RTi-PCR을 수행하여 Ct 수치와 융점(Tm)을 분석하였다.
<표 3>
Figure 112009067843865-PAT00001
실시간 PCR에 의한 유전자 증폭 시 분석되어지는 융점(℃, Tm)은 증폭되어진 PCR 산물의 GC 함량(%)과 크기에 따라 온도가 특이적으로 나타나며, 이는 증폭되어진 유전자 산물의 동정을 가능하도록 하여 각각 융점이 다를 경우 다중검출이 가능하다.
본 발명에서는 상기와 같은 STA-YH5F/STA-YH5R 프라이머 세트에 의해 스타필로코커스 아우레우스는 85.5℃의 융점을 가지는 23s rRNA 유전자(272bp)가 증폭되었고, Vib-YH4F/Vib-YH4R에 의해 비브리오 파라해몰리티쿠스는 77.5℃의 융점을 가지는 ToxR 유전자(91bp)가 증폭되었고, Sal-YH1CF/YH1CR 프라이머 세트에 의해 살모넬라 티피무리움은 79.5℃의 융점을 가지는 복제 기원 유전자(101bp)이 증폭되었다. 이렇게 구축되어진 프라이머 세트는 RTi-PCR에 의해 세 식중독 원인균의 정제되어진 DNA를 각각 다른 융점을 가지는 특이적 PCR 산물로 증폭하였다.
실시예 2 : 프라이머 세트의 타병원성 균주에 대한 특이적 반응
구축되어진 프라이머 세트의 특이성을 확인하고자 Bacillus cereus(KCTC 1012), Listeria monocytogenes(KCTC 3569), Escherichia coli(KCTC 2593), Proteus vulgaris(KCTC 2433), Staphylococcus epidermidis(KCTC 1917), Streptococcus pyogenes(KCTC 3096), Candida albicans(KCTC7965), Shigella sonnei(KCCM ) 병원성 균들의 정제된 DNA를 템플릿으로 하여 상기에 나타낸 PCR 혼합물과 표 3의 조건으로 RTi-PCR을 수행하였다.
상기와 같이 구축되어진 프라이머 세트(표 2 참조)과 확립되어진 PCR 수행조건(표 3 참조) 하에서 비특이적인 유전자 증폭 반응은 일어나지 않았다. 따라서 구축되어진 프라이머 세트와 PCR 수행조건은 S.aureus, 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 티피무리움의 검출을 위한 바이오마커인 유전자들을 RTi-PCR 법에 의해 특이적으로 증폭 및 분석되어짐을 확인 하였다(표 4).
<표 4>
다양한 세균 균주에서 특이 유전자의 싱글플렉스 PCR 검출
균주 타깃 유전자 분석된 특이 융점(℃)
23S rRNA 1 tox R 2 oriC 3
Staphylococcus aureus subsp. aureus
(KCTC 1621)		 + - - 85.5±℃
Vibrio parahaemolyticus
(KCTC 2471)		 - + - 77.5±℃
Salmonella typhimurium
(KCTC 2514)		 - - + 79.5±℃
Bacillus cereus
(KCTC 1012)		 - - - -
Listeria monocytogenes
(KCTC 3569)		 - - - -
Escherichia coli
(KCTC 2593)		 - - - -
Proteus vulgaris
(KCTC 2433)		 - - - -
Streptococcus pyogenes
(KCTC 3096)		 - - - -
Candida albicans
(KCTC7965)		 - - - -
Shigella sonnei
(KCCM 41282)		 - - - -
1STA-YH5F(forward)/STA-YH5R(reverse) primer, 2Vib-YH4F/Vib-YH4R, 3Sal-YH1CF/Sal-YH1CR
실시예 3 : RTi-PCR법에 의한 식중독 원인균 검출한계
실시예 3-1 : 유전자 DNA 농도별 RTi-PCR
스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 티피무리움 균주의 정제된 총l DNA를 1ng에서 1fg까지 10 배로 연속 희석하여 PCR을 위한 템플릿으로써 사용하여 검출한계를 알아보고자 상기에 나타낸 각 균주의 PCR 혼합물과 표 3의 조건으로 RTi-PCR을 수행하였다.
그 결과, STA-YH5F/STA-YH5R 프라이머는 스타필로코커스 아우레우스 유전자 DNA를 85.5±5℃ 융점 범위에서 1pg까지, Vib-YH4F/Vib-YH4R 프라이머는 비브리오 파라해몰리티쿠스 유전자 DNA를 77.5±5℃ 융점 범위에서 100fg까지, Sal-YH1CF/Sal-YH1CR은 살모넬라 티피무리움 유전자 DNA를 79.5±5℃ 융점 범위에서 1pg까지의 정제된 DNA를 검출하였다.
실시예 3-2 : CFU 균수별 실시간 PCR
스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 티피무리움 균주의 균수(CFU: 콜로니 형성 유니트)에 따른 검출 한계를 조사하고자 하였다. 각 최적생육 고체배지에서 배양되어진 균주의 1 콜로니를 각 브로쓰 배지에 접종하여 18hr 배양하여 흡광도를 측정하였다. O.D. 600nm에서 0.666 값이 되도록 각 균주의 배양액(O.D600nm0.666≒108CFU/mL)을 준비하였다. 106CFU/mL로 균액을 멸균한 2.5% NaCl로 10 배 순차 희석하여 106-10-1CFU/mL 시험 균액을 준비하였다. 준비된 각 시험균액 200uL를 각 한천 배지에 도말하여 37℃에서 18hr 배양하여 균수를 계수하였으며, RTi-PCR 수행 시 템플릿으로써 사용 될 조 DNA 시료(cell lysates)로 만들었다. 조 DNA 시료를 만들기 위하여 각 균주의 희석된 시험균액 200uL에서 균체를 회수 한 후(cfg 12,000rpm, 20min, 4℃) 2.5% NaCl 200uL로 1회 세척하였다(12,000rpm, 20min, 4℃, cfg). 상등액을 깨끗이 제거 한 후 회수된 균체에 아크로모펩티다아제(Achromopeptidase)(250u/mL) 100uL를 첨가하여 55℃에서 30min 동안 반응하였다. 이후 프로테이나제 K 5uL와 10% Chelex 95uL를 첨가한 후 60℃ 에서 30min 동안 반응 하였다. 이후 95℃에서 10min 반응과 얼음에서 2min 반응을 3회 반복한 후 8,000rpm 2min, 4℃에서 원심분리한 후 상등액 만을 회수하여 PCR을 위한 템플릿으로써 사용하였다. 이렇게 준비된 조 DNA 시료를 템플릿으로써 사용하여 검출한계를 알아보고자 각 균의 PCR 혼합물로써 각 균의 조 DNA 시료 1uL, 각 사용최적농도의 정방향 프라이머 1uL, 역방향 프라이머 1uL, 2x iQ　SYBR Green supermix(Bio-rad, USA) 12.5uL와 최종 부피가 25uL 되도록 증류수를 첨가하여 표 3의 조건으로 RTi-PCR을 수행하였다.
상기와 같이 PCR에 의한 식중독 원인균 검출 과정 중에 식중독 원인균의 DNA를 정제하는 키트를 사용하지 않음으로써 경제적 부담을 줄이고자 균체에 대한 전처리를 통하여 PCR반응의 템플릿으로써 사용 할 조 DNA 시료를 얻었으며, 얻어진 시료는 RTi-PCR 반응에 문제가 없음을 확인하였다. 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 티피무리움은 각각 특이적 융점인 85.5±5℃, 77.5±5℃, 79.5±5℃를 나타내며 1.78x101CFU, 1.47x101CFU, 3.42x101CFU 까지 검출이 가능함을 확인하였다.
실시예 4 : RTi-PCR법에 의한 식중독 원인균 다중동시검출
실시예 4-1 : 유전자 DNA 농도별 RTi-PCR
스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 티피무리움 균주의 정제된 총 DNA를 1ng에서 1fg까지 10 배로 연속 희석하여 PCR을 위한 템 플릿으로써 사용하여 다중동시 검출 한계를 알아보고자하였다. 이를 위한 PCR 혼합물로써 스타필로코커스 아우레우스 DNA 1uL, 비브리오 파라해몰리티쿠스DNA 1uL, 살모넬라 티피무리움 DNA 1uL, STA-YS5F/STA-YS5F(1.65pmole/uL) 각 1uL, Vib-YS4F/Vib-YS4R(2pmole/uL) 각 1uL, Sal-YS1CF/Sal-YS1CR(4.2pmole/uL) 각 1uL, 2x iQ　SYBR Green supermix(Bio-rad, USA) 12.5uL와 최종 부피가 25uL 되도록 증류수를 첨가하여 표 3의 조건으로 RTi-PCR을 수행하였다.
세 균주의 특이적 융점가 함께 분석되어지는 다중동시 검출 확인 결과, 스타필로코커스 아우레우스의 증폭된 특이적 유전자는 85.5±5℃범위에서 1pg까지, 비브리오 파라해몰리티쿠스의 증폭된 특이적 유전자는 77.5±5℃ 범위에서 100fg까지, 살모넬라 티피무리움의 증폭된 특이적 유전자는 79.5±5℃ 범위에서 1pg까지 다중동시검출이 되어지는 것을 확인하였다.
실시예 4-2 : CFU 균수별 RTi-PCR
스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 티피무리움 균주의 균수(CFU: 콜로니 forming unit)에 따른 다중동시 검출 한계를 조사하고자 하였다. 각 최적생육 고체배지에서 배양되어진 균주의 콜로니를 각 브로쓰 배지에 접종하여 18hr 배양하여 흡광도를 측정하였다. O.D 600nm에서 0.666 값이 되도록 각 균주의 배양액(O.D600nm 0.666≒108CFU/mL)을 준비하였다. 106CFU/mL로 균액을 멸균한 2.5% NaCl로 10 배 희석하여 106-10-1CFU/mL 시험 균액을 준비하였다. 준비된 각 시험 균액 200uL를 각 한천 배지에 도말하여 37℃에서 18hr 배양하여 균수를 계수하였으며, RTi-PCR 수행 시 템플릿 로써 사용 될 조 DNA 시료(cell lysates)로 만들었다. 조 DNA 시료을 만들기 위하여 각 균주의 희석된 시험균액 200uL에서 균체를 회수 한 후(12,000rpm, 20min, 4℃ cfg) 2.5% NaCl 200uL로 1회 세척하였다(12,000rpm, 20min, 4℃, cfg). 상등액을 깨끗이 제거 한 후 회수된 균체에 세포벽분해효소 아크로모펩타이드(250u/mL) 100uL를 첨가하여 55℃에서 30min 동안 반응하였다. 이후 프로테이나제 K 5uL와 10% Chelex 95uL를 첨가한 후 60℃에서 30min 동안 반응 하였다. 이후 95℃에서 10min 반응과 얼음에서 2min 반응을 3회 반복한 후 8,000rpm 2min, 4℃에서 원심분리 한 후 상등액 만을 회수하여 PCR을 위한 템플릿으로써 사용하였다. 이렇게 준비된 조 DNA 시료를 템플릿으로써 사용하여 검출한계를 알아보고자 PCR 혼합물로써 스타필로코커스 아우레우스 DNA 2uL, 비브리오 파라해몰리티쿠스 DNA 2uL, 살모넬라 티피무리움 DNA 2uL, STA-YS5F/STA-YS5F(1.65pmole/uL) 각 1uL, Vib-YS4F/Vib-YS4R(2pmole/uL) 각 1uL, Sal-YS1CF/Sal-YS1CR(4.2pmole/uL) 각 1uL, 2x iQ　SYBR Green supermix(Bio-rad, USA) 12.5uL와 최종 부피가 25uL 되도록 증류수를 첨가하여 표 3의 조건으로 RTi-PCR을 수행하였다.
그 결과, 스타필로코커스 아우레우스의 증폭된 유전자가 85.5±5℃범위에서 1.78x101CFU까지, 비브리오 파라해몰리티쿠스의 증폭된 유전자가 77.5±5℃ 범위에서 1.47x101CFU까지, 살모넬라 티피무리움의 증폭된 유전자가 79.5±5℃ 범위에서 3.42x102CFU까지 다중동시 검출 되었다.
실시예 5 : 식품에서의 RTi-PCR법에 의한 식중독 원인균 검출
실시예 5-1 : 우유에서의 식중독 원인균 검출
1 싱글플렉스(Singleplex) RTi-PCR
본 실시예에서는 식품시료로써 우유를 대상으로 접종되어진 식중독 원인균들의 검출한계를 알아보고자 하였으며 시험되어진 우유는 대형마트에서 판매되는 우유를 준비하였다. 각 최적생육 고체배지에서 배양되어진 균주의 1 콜로니를 각 브로쓰 배지에 접종하여 18hr 배양하여 흡광도를 측정하였다. O.D 600nm에서 0.666 값이 되도록 각 균주의 배양액(O.D600nm0.666≒108CFU/ml)을 준비하였다. 106CFU/mL로 균액을 멸균한 2.5% NaCl로 10 배 연속 희석하여 9mL 우유 내에 각 균주들이 106-10-1CFU/mL가 되도록 1mL의 희석 균액을 접종하여 시료를 준비하였다. 준비된 각 시험 균액 200uL를 각 한천 배지에 도말하여 37℃에서 18hr 배양하여 균수를 계수하였으며, RTi-PCR 수행 시 템플릿으로써 사용 될 조 DNA 시료(Cell lysates)로 만들었다.
도 1의 방법으로 준비된 조 DNA 시료를 템플릿으로써 사용하여 검출한계를 알아보고자 각 균주의 PCR 혼합물로써 각 균의 조 DNA 시료 1uL, 각 사용최적농도의 정방향 프라이머 1uL, 역방향 프라이머 1uL, 2x iQ　SYBR Green supermix(Bio- rad, USA) 12.5uL와 최종 부피가 25uL 되도록 증류수를 첨가하여 표 3의 조건으로 RTi-PCR을 수행하였다.
그 결과, 스타필로코커스 아우레우스의 증폭된 유전자가 85.5±5℃범위에서 6x101CFU까지, 비브리오 파라해몰리티쿠스의 증폭된 유전자가 77.5±5℃ 범위에서 6.8x101CFU까지, 살모넬라 티피무리움의 증폭된 유전자가 79.5±5℃ 범위에서 1.5x102CFU까지 다중동시검출 되었다. 더욱 정확한 균종 판독을 위해 RFU(dRFU/dT)검출 값 30초과를 기준으로 설정하여 판별하였다.
2. 멀티플렉스(Multiplex) RTi-PCR
본 실시예에서는 식품시료로써 우유를 대상으로 접종되어진 식중독 원인균들의 다중동시 검출한계를 알아보고자 하였다. 상기의 방법으로 우유에 접종 되어진 균액 시료로부터 조 DNA 시료를 준비하여 이를 템플릿으로써 사용하여 검출한계를 알아보고자 PCR 혼합물로써 스타필로코커스 아우레우스 1uL, 비브리오 파라해몰리티쿠스 1uL, 살모넬라 티피무리움 1uL, STA-YS5F/STA-YS5F(1.65pmole/ul) 각 1uL, Vib-YS4F/Vib-YS4R(2pmole/ul) 각 1uL, Sal-YS1CF/Sal-YS1CR(4.2pmole/ul) 각 1uL, 2x iQ　SYBR Green supermix(Bio-rad, USA) 12.5uL와 최종 부피가 25uL 되도록 증류수를 첨가하여 표 3의 조건으로 RTi-PCR을 수행하였다.
그 결과, 스타필로코커스 아우레우스의 증폭된 유전자가 85.5±5℃범위에서 6x101CFU까지, 비브리오 파라해몰리티쿠스의 증폭된 유전자가 77.5±5℃ 범위에서 6.8x101CFU까지, 살모넬라 티피무리움의 증폭된 유전자가 79.5±5℃ 범위에서 1.5x102CFU까지 다중동시검출 되었다. 더욱 정확한 균종 판독을 위해 RFU(dRFU/dT)검출 값 30초과를 기준으로 설정하여 판별하였다.
실시예 5-2 : 김밥에서의 식중독 원인균 검출
1. 싱글플렉스 RTi-PCR
본 실시예에서는 식품시료로써 김밥을 대상으로 접종되어진 식중독 원인균들의 검출한계를 알아보고자 하였다. 시험되어진 김밥은 편의점에서 판매되는 것을 준비하였으며 쌀, 김, 단무지, 오이, 마요네즈, 계란, 게맛살, 당근, 참치, 양파, 식초, 깻잎, 참기름, 소금, 양배추, 스모크햄, 밥새우, 새우엑기스, 다진마늘, 고춧가루, 다시다로 구성되어져 있다. 각 최적생육 고체배지에서 배양되어진 균주의 1 콜로니를 각 broth 배지에 접종하여 18hr 배양하여 흡광도를 측정하였다. O.D 600nm에서 0.666 값이 되도록 각 균주의 배양액(O.D600nm 0.666≒108CFU/ml)을 준비하였다. 106CFU/mL로 균액을 멸균한 2.5% NaCl로 10 배 연속 희석하여 10g 김밥 내에 1mL 접종하고 99mL 2.5% NaCl을 첨가하여 스토마커에 의해 시료파쇄 및 균액을 균 질화시켜 각 균주들이 106-10-1CFU/mL 가 되도록 시료를 준비하였다. 준비된 각 시험 균액 200uL를 각 한천 배지에 도말하여 37℃에서 18hr 배양하여 균수를 계수하였으며, RTi-PCR 수행 시 템플릿 로써 사용 될 조 DNA 시료(cell lysates)로 만들었다. 도 1의 방법으로 준비된 조 DNA 시료를 템플릿으로써 사용하여 검출한계를 알아보고자 각 균주의 PCR 혼합물로써 균의 조 DNA 시료 1ul, 사용최적농도의 정방향 프라이머 1uL, 역방향 프라이머 1uL, 2x iQ　SYBR Green supermix(Bio-rad, USA) 12.5uL와 최종 부피가 25uL 되도록 증류수를 첨가하여 표 3의 조건으로 RTi-PCR을 수행하였다.
그 결과, 스타필로코커스 아우레우스의 증폭된 유전자가 85.5±5℃범위에서 6.15x101CFU까지, 비브리오 파라해몰리티쿠스의 증폭된 유전자가 77.5±5℃ 범위에서 5.25x101CFU까지, 살모넬라 티피무리움의 증폭된 유전자가 79.5±5℃ 범위에서 9.6x101CFU까지 다중동시검출 되었다. 정확한 균종 판독을 위해 RFU(dRFU/dT)검출 값 30초과를 기준으로 설정하여 증폭된 유전자를 동정하였다.
2. 멀티플렉스 RTi-PCR
본 실시예에서는 식품시료로써 김밥을 대상으로 접종되어진 식중독 원인균들의 다중동시 검출한계를 알아보고자 하였다. 상기의 방법으로 김밥에 접종되어진 균액 시료로부터 조 DNA 시료를 준비하여 이를 템플릿으로써 사용하여 검출한계를 알아보고자 PCR 혼합물로써 스타필로코커스 아우레우스 1uL, 비브리오 파라해몰리티쿠스 1uL, 살모넬라 티피무리움 1uL, STA-YS5F/STA-YS5F(1.65pmole/ul) 각 1uL, Vib-YS4F/Vib-YS4R(2pmole/ul) 각 1uL, Sal-YS1CF/Sal-YS1CR(4.2pmole/ul) 각 1uL, 2x iQ　SYBR Green supermix(Bio-rad, USA) 12.5uL와 최종 부피가 25uL 되도록 증류수를 첨가하여 표 3의 조건으로 RTi-PCR을 수행하였다.
그 결과, 스타필로코커스 아우레우스의 증폭된 유전자가 85.5±5℃범위에서 6.15x101CFU까지, 비브리오 파라해몰리티쿠스의 증폭된 유전자가 77.5±5℃ 범위에서 5.25x101CFU까지, 살모넬라 티피무리움의 증폭된 유전자가 79.5±5℃ 범위에서 9.6x101CFU까지 다중동시검출 되었다. 정확한 균종 판독을 위해 RFU(dRFU/dT)검출 값 30초과를 기준으로 설정하여 증폭된 유전자를 동정하였다.
도 1은 식중독 원인균의 정제된 DNA 검출 한계를 나타낸 도이다.
도 2는 식중독 원인균의 콜로니 형성 유니트(CFU) 검출 한계를 나타낸 도이다.
도 3은 식중독 원인균의 멀티플렉스 RTi-PCR 검출 한계를 나타낸 도이다.
도 4는 식중독 원인균의 멀티플렉스 RTi-PCR 검출 한계를 나타낸 도이다.
도 5는 우유에 접종된 식중독 원인균의 콜로니 형성 유니트(CFU) 검출 한계를 나타낸 도이다.
도 6은 우유에 접종된 식중독 원인균의 멀티플렉스 RTi-PCR 검출 한계를 나타낸 도이다.
도 7은 김밥에 접종된 식중독 원인균의 콜로니 형성 유니트(CFU) 검출 한계를 나타낸 도이다.
도 8은 김밥에 접종된 식중독 원인균의 멀티플렉스 RTi-PCR 검출 한계를 나타낸 도이다.
도 9는 템플릿으로서 조 DNA의 추출 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.

Claims (5)

  1. 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)로부터 각각 템플릿 DNA를 제작하는 단계;
    하기 1) 내지 3)의 프라이머 세트를 선정하는 단계;
    1) 서열번호 1의 STA-YH5F 프라이머와 서열번호 2의 STA-YH5R 프라이머로 구성된 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머 세트,
    2) 서열번호 3의 Vib-YH4F 프라이머와 서열번호 4의 Vib-YH4R 프라이머로 구성된 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 검출용 프라이머 세트,
    3) 서열번호 5의 Sal-YH1CF 프라이머와 서열번호 6의 Sal-YH1CR 프라이머로 구성된 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 검출용 프라미어 세트
    상기 템플릿 DNA와 프라이머세트를 이용하여 다중 PCR을 수행하는 단계; 및
    상기 PCR 산물로부터 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 티피무리움을 동시에 검출하는 단계
    로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 티피무리움을 동시에 검출하는 다중 PCR 방법.
  2. 제1항에 따른 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시에 검출하는 다중 PCR 방법에 사용되는 서열번호 1의 STA- YH5F 프라이머와 서열번호 2의 STA-YH5R 프라이머로 구성된 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 세트.
  3. 제1항에 따른 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시에 검출하는 다중 PCR 방법에 사용되는 서열번호 3의 Vib-YH4F 프라이머와 서열번호 4의 Vib-YH4R 프라이머로 구성된 비브리오 파라해몰리티쿠스 검출용 프라이머 세트.
  4. 제1항에 따른 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시에 검출하는 다중 PCR 방법에 사용되는 서열번호 5의 Sal-YH1CF 프라이머와 서열번호 6의 Sal-YH1CR 프라이머로 구성된 살모넬라 엔테리카 검출용 프라미어 세트.
  5. 1) 서열번호 1의 STA-YH5F 프라이머와 서열번호 2의 STA-YH5R 프라이머로 구성된 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 세트,
    2) 서열번호 3의 Vib-YH4F 프라이머와 서열번호 4의 Vib-YH4R 프라이머로 구성된 비브리오 파라해몰리티쿠스 검출용 프라이머 세트 및
    3) 서열번호 5의 Sal-YH1CF 프라이머와 서열번호 6의 Sal-YH1CR 프라이머로 구성된 살모넬라 엔테리카 검출용 프라미어 세트
    를 포함하는 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시 검출용 키트.
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KR1020090106006A KR20110049140A (ko) 2009-11-04 2009-11-04 식중독 원인균의 다중 실시간 검출방법

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102219249B1 (ko) * 2019-09-20 2021-02-25 주식회사 세니젠 녹농균 검출용 중합효소연쇄반응 키트

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