KR20110046961A

KR20110046961A - 세포투과성 펩타이드 표면 결합 나노 리포좀 및 이를 포함하는 항-아토피 조성물

Info

Publication number: KR20110046961A
Application number: KR1020090103692A
Authority: KR
Inventors: 최영욱; 이민원; 오칠환; 강경호; 김성규; 강명주; 김보견; 엄재윤
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단; 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2009-10-29
Filing date: 2009-10-29
Publication date: 2011-05-06
Also published as: KR101130550B1

Abstract

본 발명은 항-아토피 활성물질 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드(taxifolin 3-O-β-D-glucopyranoside)가 봉입되어 있고 세포투과성 펩타이드가 표면에 결합된 나노 리포좀, 이를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 항-아토피 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 나노리포좀은 세포투과성 펩타이드가 결합되어 있어 리포좀의 피부투과촉진 효과와 세포투과성 펩타이드의 피부세포내로의 약물이입 촉진효과가 상승적으로 발휘되고, 항-아토피 활성물질에 의한 아토피 피부염의 치료 효능을 극대화시킨다. 본 발명의 나노리포좀을 포함하는 약제학적 조성물 및 화장품학적 조성물은 아토피성 피부질환의 치료 및 예방에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드, 지질나노담체, 나노리포좀, 세포투과성 펩타이드, 피부외용기제

Description

세포투과성 펩타이드 표면 결합 나노 리포좀 및 이를 포함하는 항-아토피 조성물{Cell Penetrating Peptide Modified Nanoliposome and Anti-Atopic Composition Comprising the Same}

본 발명은 세포투과성 펩타이드가 표면 결합된 나노 리포좀에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 항-아토피 활성물질 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드(taxifolin 3-O-β-D-glucopyranoside)가 봉입되어 있고 세포투과성 펩타이드가 표면에 결합된 나노 리포좀, 이를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 항-아토피 조성물에 관한 것이다.

아토피성 피부염은 대부분 유아기나 소아 때 발생하여 호전과 악화를 반복하며 외부 자극 물질에 의해 발진과 심한 가려움을 수반하는 만성 염증성 피부질환이다. 최근 산업화, 도시화와 환경오염은 아토피성 피부염의 발생을 급격히 증가시켜 이는 사회문제로까지 심화되고 있다. 아토피 피부염의 병인론은 아직 확실히 밝혀 있지 않지만, IgE 항체의 증가에 따른 과감작 반응에 의하거나, 세포매개성 면역기능의 저하로 나타나는 T 림프구의 불균열 분화에 의한 기능적 결여와 같은 병리적 요인이 밝혀지면서 현재 면역학적인 이상이 관여하는 질환으로 생각되고 있다. 그 치료 및 관리를 위해, 피부 표면의 수분을 유지시켜주는 보습제와 염증반응을 호전시키기 위한 스테로이드 호르몬 즉, 국소 부신피질호르몬 제제를 처방하는 하는 것이 일반적이다. 하지만, 국소 부신피질호르몬의 경우 피부 위축, 혈관 확장, 색소 탈실 및 팽창 선조의 발생 등 다양한 피부 부작용을 야기하는 문제를 가지고 있어 장기간 사용하기에 무리가 있다. 따라서 항아토피 효능을 가진 동시에 부작용이 매우 낮은 천연 신약 후보물질을 이용한 아토피 치료제 또는 보조 물질로의 개발이 제약, 화장품 영역에서 진행되고 있다.

본 발명자들은 진달래 뿌리 추출물로부터 분리한 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드를 아토피 피부염 유발 마우스에 주사 또는 피부에 적용할 경우 대표적인 면역학적 지표인 호산성백혈구(eosinophile), 인터루킨 (IL-4, 5, 13)의 수준을 감소시킬 뿐 만 아니라, COX-2 및 iNOS의 발현 또한 강하게 억제하여 아토피성 피부염의 면역조절 치료제로 개발될 수 있음을 밝혔다. 하지만 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드를 사용한 아토피의 치료 및 예방용도의 의약품과 화장품의 개발을 위해서는 활성성분에 대한 피부 전달 기술 개발이 선행되어야 함은 자명한 사실이다. 특히 피부는 구조상 세포 간극과 최외각층인 각질층이 대부분 지질로 이루어져 있으며 피부 표면은 세포가 분비한 피지로 덮여 있기 때문에 친수성의 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드가 피부를 침투하는 것은 매우 어려운 일이다.

인지질의 지질 이중막으로 이루어진 나노 리포좀 약물 전달 시스템은 피부로의 약물 전달에 있어서, ⅰ) 각질 피부세포간극을 통하여 또는 직접 세포를 관통하여 진피층까지 지용성 물질과 수용성 물질 모두 전달할 수 있으며, ⅱ) 생체친화적인 성분으로 구성되어 화학 흡수 촉진제에 비해 독성이 낮고, ⅲ) 레시틴 등의 천연물질로 이루어진 피부생체막과 친화적인 구조라는 점, ⅳ) 약물의 물리적 안정도를 증가시키는 장점을 가지고 있고, ⅴ) 특히 나노 리포좀 약물 전달 시스템은 높은 피부 친화성 및 보습력을 가져 아토피성 피부로의 약물 전달에 매우 유용한 것으로 보고되고 있다. 현재 나노 리포좀은 지질의 차별화 기술, 표면을 수식하는 기술 등을 통해 주사 영역에 있어 약물 전달용 나노 입자로서의 응용 범위를 넓혀가고 있으나 피부 전달 측면에 있어서 리포좀 시스템의 고기능화에 관한 연구는 활발히 진행되어 있지 않다.

최근에는 친수성 거대분자를 세포안으로 통과시킬 수 있는 운반체 역할을 하는 몇 가지의 세포투과성 펩타이드(cell-penetrating peptide)가 개발됨으로써 세포내로 약물을 전달할 수 있는 약물전달시스템(drug delivery system)에 응용되고 있다. 한편, 대한민국 공개특허 제10-2008-0003177호에는 세포투과 펩타이드 AP-GRR 펩티드[Gly-(Arg)_n-Gly-Tyr-Lys-Cys]; n = 1 내지 20를 포함하는 약물전달담체를 개시하고 있고, 대한민국 공개특허 제10-2009-0034240호에는 다양한 형태의 세포투과성 펩타이드를 개시하고 있다.

이러한 세포투과성 펩타이드는 피부로의 약물 전달에 있어서도 단순 혼합물 이나 약물에 직접 화학 결합시켜 적용된 바 있으며, 이와 관련하여, 대한민국 공개특허 제10-2009-0033868호에는 운반체 펩티드(transporter peptide)를 포함하는 융합펩티드와 약학적 담체를 포함하는 약학조성물이 개시되어 있다. 하지만 세포투과성 펩타이드와 약물을 혼합한 경우에는 세포투과성 펩타이드와 약물의 피부 투과 시간 격차가 발생할 수 있으며 난용성의 약물의 경우 적용에 한계가 존재하고 투여 조건에 따라 큰 편차를 야기할 수 있다. 또한 화학 결합 역시 활성 물질과 펩타이드와의 결합의 용이성과 활성 물질의 활성 유지 여부에 문제점이 발생되어 그 활용이 매우 제한적이다. 지질 나노 담체와 세포 투과성 펩타이드를 결합시킬 경우 이러한 세포투과성 펩타이드의 피부 적용 문제점을 해결하며 리포좀의 피부 투과 기능(vesicular skin penetration), 투과 촉진 기능(penetration enhancing effect), 땀샘을 포함한 부속기관을 통한 침투(penetration of liposomes through the transappendageal route) 기능과, 세포투과성 펩타이드의 피부 세포 내 약물 이입 촉진 및 이에 의한 농도구배 형성 작용에 의한 피부 침투 증가 기전이 함께 적용됨으로써, 약물의 피부 침투성을 상승적으로 향상시킬 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 아토피 치료 활성을 갖는 친수성의 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드의 피부 침투성을 개선할 수 있는 약물전달시스템을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 나노리포좀에 활성성분을 봉입하고 세포투과성 펩타이드를 나노리포좀의 표면상에 결합시켜 구성하면 활성성분인 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드의 피부 침투성이 놀랍게 향상되어 아토피 치료 효능이 크게 증대됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 항-아토피 활성물질이 봉입되어 있고, 세포투과성 펩타이드가 표면에 결합된 나노리포좀을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 나노리포좀의 제조방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노리포좀을 포함하는 항-아토피 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, (i) 항-아토피 활성물질이 봉입되어 있고, (ⅱ) 세포투과성 펩타이드가 표면에 결합된 것을 특징으로 하는 나노리포 좀(nanoliposome)을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 나노리포좀의 제조방법을 제공한다: (a) 항-아토피 활성물질이 봉입된 나노리포좀을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 생성된 나노리포좀의 표면에 세포투과성 펩타이드를 결합시키는 단계.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 단계 (a) 이후에, 단계 (a)에서 형성된 나노 리포좀의 표면을 기능기(functional group)로 개질시키는 단계 (a)'을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 단계 (b) 이후에, 단계 (b)에서 형성된 나노 리포좀을 분리하여 정제하는 단계 (b)'를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.

이하에서 본 발명의 나노리포좀을 제조방법에 따라 상세히 설명한다.

단계 (a): 항-아토피 활성물질이 봉입된 나노리포좀를 제조하는 단계

본 발명에서 사용되는 용어 "나노리포좀(nanoliposome)은 지질(lipid)로 구성되어 구형(sphere) 형태를 갖는 나노 크기의 담체(carrier)를 의미하며, 본 명세서, 도면 및 도면의 간단한 설명에서 "지질 나노담체"와 동일한 의미로 혼용하여 기재한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 항-아토피 활성물질은 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드(taxifolin 3-O-β-D-glucopyranoside)이다. 상기 활성성분 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드는 하기의 화학식 1로 표현되는 화합 물로서, 호산성백혈구(eosinophile) 및 인터루킨 (IL-4, 5, 13)의 수준을 감소시키며, COX-2 및 iNOS의 발현을 강하게 억제함으로써, 항-아토피 활성을 갖는다.

[화학식 1]

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드의 함유량은 나노리포좀 총 중량에 대해 0.001-40.0 중량％이며, 보다 바람직하게는 0.1-25.0 중량％이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 나노리포좀을 구성하는 지질은 인지질(phospholipid)이다. 보다 바람직하게는 상기 인지질은 디아실 그룹의 탄소수가 3 - 24인 포스포콜린(phosphocholine)이다.

본 발명의 나노리포좀의 구성에 사용되는 인지질은 구체적으로, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), L-a-포스파티딜콜린(HSPC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PGPC), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디마이리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 및 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.

상기 나노리포좀 중에서 상기 인지질의 농도는 0.1- 10 mM 인 것이 바람직하 다. 인지질이 이러한 농도 범위를 벗어나게 되면 활성성분의 봉입율이 현저히 저하되고, 나노리포좀 입자간에 응집과 융합이 발생되어 안정성이 낮아지는 등의 문제점이 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 나노 리포좀은 탄력성 조절 성분으로서 폴리소르베이트(polysorbate)80, 스판 80(Span 80, Sorbitan monooleate), 소듐 콜레이트, 디포타슘 글리시리지네이트, 라이소포스파티딜콜린, 또는 에탄올을 포함한다. 상기 탄력성 조절 성분이 인지질과 혼합됨으로써 고탄력성의 나노리포좀을 형성할 수 있다.

상기 탄력성 조절성분은 바람직하게는 인지질 100 중량부 대해 0.1 - 50.0 중량부, 보다 바람직하게는 0.5 - 30.0 중량부의 범위 내에서 포함된다.

본 발명의 지질 나노담체의 제조시에 사용되는 수상(water phase)은 바람직하게는 탈이온화된 이차 증류수를 사용하며, 지질 나노담체의 총 중량에 대해 3.0 - 20.0 중량％로 포함된다.

본 발명의 나노리포좀은 인지질과 탄력성 조절성분을 적합한 용매에 혼합한 후, 여기에 활성성분을 추가하여 제조한다. 상기 인지질 이중막(phospholipid bilayer)으로 형성되는 나노리포좀은 당업자에게 공지된 리포좀 제조방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 뱅험씨 등의 방법(Bangham et al. J. Mol. Biol., 13, 238, 1965), 이를 변형한 방법(일본국 특개소 제52-114O13호 공보, 특개소 제59-173133호 공보, 특개평 제2-139029호 공보, 특개평 제7-241487호 공보 등), 초음파처리법(Biochem. Biophys. Res. Commun., 94, 1367, 1980), 에탄올 주입법(J. Cell. Biol., 66, 621, 1975), 프렌치 프레스법(FEBS Lett., 99, 210, 1979), 에테르 주입법(N. Y. Acad. Sci., 308, 250, 1978), 콜산(계면활성제)법(Biochim. Biophys. Acta, 455, 322, 1976), 칼슘 융합법(Biochim. Biophys. Acta, 394, 483, 1978), 동결 융해법(Arch. Biochem. Biophys., 212, 186, 1981), 역상 증발법(Pro. N. A. S. USA, 75, 4194, 1978), 유리 필터 에 의한 방법(Third US-Japan Symposium on Drug Delivery System, 1995) 및 코트솜 등의 시판하는 키트를 이용한 방법 등을 들 수 있다.

발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 나노리포좀의 평균 입자 크기는 10.0 - 500.0 nm 이고, 보다 바람직하게는 10.0 - 300.0 nm이다. 나노리포좀의 입자 크기가 상기 범위를 벗어나는 경우 피부 적용시, 원하는 피부 침투효과를 얻을 수 없다.

단계 (a)': 나노리포좀의 표면을 기능기(functional group)로 개질시키는 단계

본 발명의 제조방법에서 상기 단계 (a) 이후에, 단계 (a)에서 형성된 나노 리포좀의 표면을 기능기(functional group)로 개질시키는 단계 (a)'을 추가로 포함할 수 있다. 상기 단계 (a)에서 제조된 나노리포좀의 표면을 기능기(functional group)로 개질시켜 세포투과성 펩타이드의 결합을 용이하게 한다.

본 발명에서 나노리포좀의 표면의 개질화에 사용할 수 있는 기능기는 예를 들어, 1,4-비스-말레이미도부탄(1,4-bis-maleimidobutane, BMB), 1,11-비스-말레이미도테트라에틸렌글리콜 (1,11-bis-maleimidotetraethylene-glycol), 1-에틸-3- (3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드하이드로클로라이드[1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, EDC], 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카복시-[6-아미도카프로에이트]) (succinimidyl-4-[N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy-[6-amidocaproate]], SMCC) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMCC), 숙시이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-로피오나미도] 헥사노에이트](succimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)-ropionamido] hexanoate, SPDP) 및 그의 설폰화염(sulfo-SPDP), m-말레이미도벤조일-N-하이드로시숙시이미드 에스터(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, MBS) 및 그의 설폰화염(sulfo-MBS), 숙시이미딜[4-(p-말레이미도페닐) 부틸레이트](succimidyl[4-(p-mal eimidophenyl) butyrate], SMPB) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMPB)으로 구성된 군에서 선택할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 인지질을 사용하여 나노리포좀을 형성하는 상기 단계 (a)에서, 이미 기능기가 부착된 인지질을 사용하여도 좋다. 기능기가 부착된 인지질은 예를 들어, 숙시닐(succinyl), 글루타릴(glutaryl), 도데카노일(dodecanoyl), 카프로일아민(caproylamine),[4-(p-말레이미도메틸)시클로헥산-카르복사미드] [4-(p-maleimidomethyl)cyclohexane-carboxamide], [4-(p-말레이미도페닐)부티르아미드][4-(p-maleimidophenyl)butyramide], [3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트] [3-(2-pyridyldithio)propionate], 비오티닐(biotinyl) 등으로 개질된 인지질을 들 수 있다. 이 경우 단계 (b)가 생략되어 제조공정이 간편화되고, 제조된 나노리포좀이 더욱 안정화될 수 있는 이점이 있다.

본 발명에서 기능기의 함유 비율은 바람직하게는 인지질 대비 0.01 - 10.0％(w/v) 범위，보다 바람직하게는 0.1 - 5.0％(w/v) 범위이다. 기능기의 함유 비율이 0.01％(w/v) 미만인 경우, 나노리포좀에 결합되는 세포 투과성 펩타이드의 비율이 낮아 원하는 피부 투과 효과를 얻을 수 없으며, 10.0％(w/v)를 초과하여 높은 경우 세포투과성 펩타이드가 과도하게 결합되어 나노리포좀의 안정성이 저하되어 역시 원하는 정도의 피부침투효과를 얻기 어렵다.

단계 (b): 상기 단계 (a) 또는 (a)'에서 생성된 나노리포좀의 표면에 세포투과성 펩타이드를 겹합시키는 단계

본 단계에서는 상기 단계 (b)에서 생성된 지질 나노담체의 표면에 세포투과성 펩타이드를 결합시킨다. 나노리포좀에 결합된 세포투과성 펩타이드는 나노리포좀의 피부세포내로의 투과성을 향상시킨다.

본 발명에서 사용할 수 있는 세포투과성 펩타이드는 바람직하게는 펩-1 펩타이드(pep-1 peptide, KETWWETWWTEWSQPKKKRKV), 저분자형 프로타민(LMWP, VSRRRRRRGGRRRR), 탯 펩타이드(Tat peptide, YGRKKRRQRRR), 페너트라틴(Penetratin, RQIKIWFQNRRMKWKK), 안테나페디아(Antennapedia, ANTP), D-아르기닌 올리고 펩타이드(D-arginine oligopeptide, R8 이상) 또는 L-아르기닌 올리고 펩타이드(L-arginine oligopeptide, R8 이상)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

나노리포좀당 세포투과성 펩타이드의 개수는 피부투과율 증가 효과가 극대화될 수 있도록 조절된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 세포투과성 펩타이드는 나노리포좀당 1 - 10000 개 포함되며, 보다 바람직하게는 90 - 550개, 보다 더 바람직하게는 200 - 500개, 가장 바람직하게는 300 - 400개 포함된다.

본 발명에서 나노리포좀에 세포투과성 펩타이드를 가해주는 양은 바람직하게는 기능기에 대한 몰분율 대비로 0.01 - 5.0의 비율, 보다 바람직하게는 0.05 - 3.0의 비율이다. 0.01의 몰비율 보다 낮은 비율로 첨가하면 결합의 효율이 떨어지고, 5.0의 몰비율 보다 높은 비율로 첨가하면 잉여의 세포투과성 펩타이드가 지나치게 증가하는 문제점이 있다.

단계 (b)': 상기 단계 (b)에서 형성된 나노리포좀을 분리하여 정제하는 단계

상기 단계 (b)에서 형성된 나노리포좀을, 봉입되지 않은 활성성분 및 결합되지 않은 세포투과성 펩타이드들의 잔여물로부터 분리 정제해낸다. 이 분리 및 정제 과정에서는 휘저음 초여과 셀(stirred ultrafiltration cell), 초원심분리(ultracentrifugation)의 방법이 사용될 수 있다. 본 단계 (b)'은 나노리포좀이 순도가 높아 따로 분리 정제 공정이 필요하지 않은 경우에서는 생략될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 상기 설명된 본 발명의 나노리포좀을 포함하는 항-아토피용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 나노리포좀은 상기 조성물 총 중량에 대해 0.1 - 20 중량％로 함유된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 조성물은 약제학적 조성물의 형태로 형성된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체 를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물이 아토피성 피부염의 치료를 위해 적용되는 점을 감안하면, 투여는 피부에 국소적으로 도포되어 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부외용 제형 형태를 갖는다. 상기 피부외용 제형은 특별히 한정되지 않으나, 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형이 바람직하다.

본 발명에서 피부외용제형의 겔 기재로는 카보폴(Carbopol), 카르보머(Carbomer), 폴리에틸렌글리콜(Polyethyleneglycol), 폴리프로필렌글리콜(Polypropylene glycol), 폴리아크릴산(Polyacrylic acid), 카르복시메틸셀룰로오스(Carboxymethyl cellulose), 히드록시메틸셀룰로오스(Hydroxymethylcellulose), 폴리비닐피롤리돈 (Polyvinylpyrrolidone), 젤라틴(Gelatine), 알지네이트염(Alginate Salt), 키틴(Chitin) 또는 키토산(Chitosan) 유도체, 하이알우론산(hyaluronic acid), 콜라겐(collagen) 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 조성물은 화장품학적 조성물의 형태로 형성된다.

본 발명의 화장품학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등 이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품학적 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

이상에서 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명은 항-아토피 활성물질 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드(taxifolin 3-O-β-D-glucopyranoside)가 봉입되어 있고 세포투과성 펩타이드가 표면에 결합된 나노 리포좀, 이를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 항-아토피 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 나노리포좀은 세포투과성 펩타이드가 결합되어 있어 리포좀의 피부투과촉진 효과와 세포투과성 펩타이드의 피부세포내로의 약물이입 촉진효과가 상승적으로 발휘되고, 항-아토피 활성물질에 의한 아토피 피부염의 치료 효능을 극대화시킨다. 본 발명의 나노리포좀을 포 함하는 약제학적 조성물 및 화장품학적 조성물은 아토피성 피부질환의 치료 및 예방에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 세포투과성 펩타이드가 표면에 결합된 나노리포좀의 제조

탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드가 봉입되어 있으며 세포투과성 펩타이드가 표면에 결합된 나노리포좀(지질 나노담체)은 다음 방법을 통해 제조하였다. 나노리포좀의 제조시에 나노리포좀에 결합된 펩-1 펩타이드(pep-1 peptide)의 개수를 달리하여 3 가지 종류의 리포좀을 제조하였다. 3가지 종류의 리포좀에서 기본 성분으로는 모두 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 폴리소르베이트 80 (polysorbate 80)과 기능기를 포함한 인지질인 N-[4-(파라아미도페닐)부티릭]-포스파티틸에탄올아민(N-[4-(p-maleimido phenyl)butyryl]-phosphatidylethanolamine, MPB-PE)을 사용하였다.

포스파티딜콜린, 폴리소르베이트 80, MPB-PE를 각각 89.9 : 10.0 : 0.1 (지질 나노담체 1의 제조), 89.5 : 10.0 : 0.5 (지질 나노담체 2의 제조), 89.5 : 10.0 : 1.0 (지질 나노담체 3의 제조)의 몰비율로 클로로포름과 디에틸에테르 혼합액 20 ㎖(1:3)에 녹였다. 여기에, 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드 수용액 1 ㎖ (15 mg/㎖의 약물 농도)를 가한 후, 역상 증발법(reverse phase evaporation technique)을 사용하여 나노리포좀을 제조하였다. 200 nm 크기의 세공(pore)을 가진 폴리카본필터(polycarbon filter)를 사용한 압출(extrusion)과정을 통해 나노리포좀의 입자 크기를 150 nm 이하로 조절하였다.

이어서, 세포투과성 펩타이드인 펩-1 펩타이드 (Pep-1 peptide; KETWWETWWTEWSQPKKKRKVC)를 MPB-PE 대비 2배의 몰비율로 가하고, pH 7.4의 조건에서 12 시간 동안 교반시켜 세포투과성 펩타이드의 시스테인(cysteine) 잔기가 MPB-PE의 말레이미도(maleimide)에 결합하도록 하여 최종적으로 세포투과성 펩타이드가 표면에 결합된 지질 나노담체(나노리포좀) 1, 2, 3을 제조하였다.

이후, 휘저음 초여과 셀(stirred ultrafiltration cell)을 이용하여 제조된 나노리포좀을, 리포좀에 결합되지 않은 펩-1 펩타이드 및 탑재되지 않은 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드의 잉여물로부터 분리하여 정제하였다. 분리 정제한 나노리포좀은 용액 중에 인지질 50 mg/㎖의 농도로 분산시켰다.

실시예 2. 세포투과성 펩타이드 표면 결합 나노리포좀의 물리화학적 특성 분석

2-1. 나노리포좀 표면에 결합된 세포투과성 펩타이드의 정량 분석

지질 나노담체(나노리포좀) 1, 2, 3에서 각각의 표면에 결합된 세포투과성 펩타이드의 양은 HPLC 분석을 통해 반응에 참여하지 않은 펩-1 펩타이드를 정량함으로서 간접적으로 정량하였다. HPLC 분석에 있어 C₁₈컬럼(시세이드, 일본)을 사용하였으며 이동상은 0.05％ 트리플루오아세트산(trifluoroacetic acid)(이동상 1)을 함유한 증류수와 0.05％ 트리플루오아세트산(trifluoroacetic acid)을 함유한 아세토니트릴(acetonitrile)(이동상 2)을 사용하였다. 50분 동안 이동상 2의 조성을 10％ 에서 60％로 증가시키는 방법을 사용하였으며, 이후 5 분간 이동상 2의 비율을 10％로 떨어뜨렸다. 검출파장은 220 nm, 주입용량은 20 ㎕, 유속은 1 ㎖/min으로 하였다. 이 조건에서 펩-1 펩타이드의 보유시간(retention time)은 32 분이었다. 정량된 펩-1 펩타이드를 초기에 가해준 양에서 제함으로써 결합된 펩-1 펩타이드의 양을 간접적으로 계산하였다. 또한 120 nm 크기를 가진 리포좀 입자는 대개 144,000개의 인지질 분자로 이루어져있다는 기존의 연구 결과를 바탕으로 지질 나노담체에 개별적으로 결합된 세포투과성 펩타이드의 개수를 도출하였다.

2-2. 나노리포좀의 입도 분포 및 표전 전하 분석

본 발명에서 제조된 나노리포좀의 입도 분포 및 표면 전하는 제타사이저(Zetasizer Nano-ZS, Malvern Instrument, Worcestershire, UK)를 이용한 동적광산란법으로 측정하였다.

2-3. 나노리포좀에 봉입된 활성성분의 정량 분석

본 발명에서 제조된 나노리포좀 내부에 탑재된 활성성분 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드의 양은 정제된 담체를 메탄올을 사용하여 완전히 용해시킨 후 HPLC를 사용하여 측정하였으며 아래 식을 이용하여 약물의 봉입량과 봉입효율을 각각 계산하였다.

봉입량 = 리포좀에 봉입된 약물의 양/초기 첨가한 인지질의 양

봉입효율(％) = 리포좀에 봉입된 약물의 양/초기에 가해준 약물의 양 X 100

2-4. 나노리포좀의 탄력성 평가

나노리포좀의 탄력성(Deformability index)은 변형된 압출 방법을 통해 평가되었다. 리포좀액을 50 nm 필터를 포함한 압출기(extruder)에 가하고 2.5바(bar)의 세기로 5 분간 압력을 가하였다. 5분 동안 통과한 리포좀액의 양을 이용하여 아래 식에 의해 나노리포좀의 탄력성을 평가하였다.

변형지수(Deformability index) = 통과한 리포좀액의 양 X (리포좀의 크기/필터 세공의 크기)²

탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드가 봉입되어 있고, 세포투과성 펩타이드가 표면에 결합된 지질 나노담체(나노리포좀) 1, 2, 및 3의 분석된 물리화학적 특성은 아래 표 1과 같다.

[표 1]

	나노담체 1	나노담체 2	나노담체 3
펩-1 펩타이드의 개수 /지질 나노담체	70 ± 10	350 ± 50	700 ± 100
입자크기(nm)	130.6 ± 3.1	133.7 ± 1.4	131.2 ± 0.9
제타전위(mV)	-.1.8 ± 0.6	19.8 ± 2.9	40.3 ± 2.4
균일성(PDI)	0.105 ± 0.04	0.109 ± 0.01	0.121 ± 0.04
봉입효율(％)	31.42 ± 2.11	32.36 ± 3.08	29.54 ± 1.80
봉입량(wt. %)	13.17 ± 1.74	13.51 ± 0.58	12.48 ± 0.71
변형지수	67.4 ± 4.4	58.4 ± 4.1	64.8 ± 3.6

실시예 3. 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드가 봉입된 세포투과성 펩타이드 표면 결합 나노리포좀을 함유한 카르보머 겔 제조

50 mg/㎖의 인지질 농도로 증류수에 분산된 나노리포좀 액 30 ㎖에 기제로서 2.2 g의 카르보머(Carbomer)940을 소량씩 첨가하여 서서히 교반하면서 완전히 용해시켰다. 상기 용액에 겔화제로서 트리에탄올아민(TEA)을 1.35 g을 가한 후 상온에서 균질혼합기(homomixer)로 균질한 상태가 될 때까지 1,000 rpm으로 교반하여 겔을 제조하였다. 총 제제 중 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드의 중량 비율이 0.1％ 또는 1.0％가 되도록 하였다.

실시예 4. 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드를 탑재한 세포투과성 펩타이드 표면 결합 나노리포좀을 함유한 폴록사머 겔 제조

폴록사머 겔은 냉각 방법(cold method)를 이용하여 제조하였다. 총량에 대해 30％에 해당하는 폴록사머를 4℃ 냉장고에 보관하여 용해하였다. 이에 20 mg의 인지질 농도로 분산된 나노리포좀과 혼합하여 폴록사머의 농도가 15-20％가 되도록 겔을 제조하였다. 총 제제 중 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드의 중량 비율이 0.1％ 또는 1.0％가 되도록 제조하였다.

실시예 5. 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드를 탑재한 세포투과성 펩타이드 표면 결합 나노리포좀을 함유한 크림 제조

폴리글리세릴-3-메틸글루코오스디스테아레이트(3％), 스테아린산(5％), 세탄올(2％) 및 유동 파라핀(7％)을 조성에 따라 첨가하고, 65℃에서 가온하여 유상을 제조한 후, 글리세린(10％), 정제수(73％)를 혼합하여 수상을 제조하였다. 유상을 수상에 가하고 균질기(homogenizer)를 사용하여 수 분간 유화시킨 후 냉각하여 O/W 크림을 제조하였다. 이에 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드를 탑재한 세포투과성 펩타이드 표면 결합 나노리포좀을 혼합하고 교반하여 균일한 크림 제형을 제조하였다. 총 제제 중 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드의 중량 비율이 0.1％ 또는 1.0％가 되도록 제조하였다.

실시예 6. 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드를 탑재한 세포투과성 펩타이드 표면 결합 나노리포좀의 카르복실 메틸 세룰로즈의 겔 제조

탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드를 0.1 또는 1.0％(w/w) 함유한 나노리포좀 용액에 총 제제 중량 대비 2.5％의 소듐 카르복실메틸세룰로즈(sodium carboxyl methyl cellulose)를 가하여 겔 제형을 제조하였다.

실시예 7. 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드의 HPLC 분석

탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드를 증류수에 용해시켜 스탁용액(stock solution)(100 ㎍/㎖)을 조제하고, 이를 희석하여 1, 5, 10, 25, 50 ㎍/㎖의 농도의 표준용액을 조제하였다. 이동상은 아세토니트릴과 0.3％ 초산액의 혼합액 (20 : 80 v/v)을 사용하였으며, 검출파장은 291 nm, 주입용량은 20 ㎕, 유속은 1 ㎖/min 으로 하였다. 이 조건에서 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드의 보유시간은 3.67 분이었다.

실시예 8. 세포투과성 펩타이드 표면 결합 나노리포좀의 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드에 대한 피부 투과 증진성 평가

4 주령의 알비노 마우스(hairy albino mice)의 등 부위의 피부를 이용하여 Franz 확산 셀 모델에서 피부 투과 실험을 진행하였다. 전기면도기를 이용하여 등에 있는 털을 제거한 후 경피를 복강부터 절개하여 복막과 지방 조직이 붙지 않게 잘 떼어낸 후, 가로, 세로 각각 1.5 cm 정도의 크기로 자른 다음 인산버퍼용액(PBS, pH 7.4)으로 세척한 후, 각 확산 셀에 올린 후 잘 펴서 고정시켜 사용하였다. Water jacket으로 각 셀의 내부온도를 32℃로 유지하면서 12 시간 투과실험을 진행하였다. 매질(receptor medium)은 10 mM 농도의 인산버퍼용액을 사용하였다. 투여 제형은 지질 나노담체(나노 리포좀) 1, 2, 3, 대조군으로 인지질과 폴리소르베이트 80만으로 구성되고 세포투과성 펩타이드는 포함되지 않은 130 nm의 일반 리 포좀, 나노담체 3에 준하는 농도의 펩-1 펩타이드과 활성성분 약물만으로 이루어진 펩-1 펩타이드 약물 용액, 증류수를 매질로 한 약물 용액이었으며, 각 제형은 모두 동일 볼륨에 5 mg의 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드를 포함하도록 제조하였다.

실험 결과 도 1에서와 같이 세포투과성 펩타이드 표면 결합 지질 나노담체(나노리포좀)은 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드의 피부 침투 효율을 월등히 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 12시간 동안 투과된 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드의 양을 비교하면, 나노 담체 1, 2, 3은 약물 용액에 비해 1.5 배 이상의 피부 투과량을 나타내었다. 특히, 나노 담체 2의 경우 약물 용액 대비 4.8 배 이상의 월등히 높은 결과를 보였다. 또한 나노 담체 2는 기존의 약물 전달에 활용되는 세포투과성 펩타이드와 리포좀 제형에 비해서도 2배 이상의 높은 투과도를 나타냄을 확인하였다. 지질 나노담체와 세포 투과성 펩타이드를 결합시킬 경우 리포좀의 피부 투과 기능(vesicular skin penetration), 투과 촉진 기능(penetration enhancing effect), 땀샘을 포함한 부속기관을 통한 침투(penetration of liposomes through the transappendageal route) 기능과 세포투과성 펩타이드의 피부 세포 내 약물 이입 촉진 및 이에 의한 농도구배 형성 작용에 의한 피부 침투 증가 기전이 함께 작용함으로써 약물의 피부투과 침투 효과가 상승적으로 나타난 것으로 보인다. 다만, 세포투과성 펩타이드의 함유율이 낮은 나노담체 1의 경우 세포투과성 펩타이드의 피부 전달 촉진작용이 미미하였을 것으로 생각되며, 또한 흥미롭게도 세포투과성 펩타이드의 비율이 높은 나노 담체 3의 경우 에서도 나노담체 2에 비해 낮은 피부 투과도를 나타내었다. 이는 세포투과성 펩타이드의 비율이 일정이상이 될 경우 표면 전하가 40 mV이상으로 증가하며 리포좀 표면의 친수성을 기하급수적으로 증가하여 지질 성분으로 이루어진 각질층과 세포 간극 침투에 불리하게 작용한 것으로 생각된다.

마우스 피부에서의 투과실험을 통해 각 제형의 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드에 대한 피부 전달 증진성을 평가하였으며, 그 결과 펩-1 펩타이드를 표면 결합시킨 지질 나노담체, 특히 나노담체 2가 우수한 피부 전달 증진성을 가짐을 확인하였다. 지질 나노담체에 의한 향상된 전달 증진성은 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드의 용량 의존성 항아토피 효능 증진 패턴을 감안할 때 약물의 항아토피 효과를 극대화시킬 수 있을 것으로 기대된다.

실시예 9. 세포투과성 펩타이드 표면 결합 나노리포좀의 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드에 대한 효능 개선성 평가-육안평가

아토피성 피부염 동물 모델인 NC/Nga 마우스에서의 효능 평가를 통해, 세포투과성 펩타이드 표면 결합 나노리포좀을 통한 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드의 치료 효율성 증진 정도를 평가하였다. 2주 동안 0.1％ TNCB(100 μl, 2,4,6-Trimitrochiorokenzen) 처치를 통해 마우스에서 아토피성 피부염을 유발시켰다(도 2a 참조). 이후 아토피 피부염이 유발된 마우스에 대해 ⅰ) 약물이 함유되지 않은 겔 기재(실시예 6에 기재된 겔 조성), ⅱ) 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드를 함유한 1％ 겔 조성, ⅲ) 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드가 봉 입된 나노담체 2를 포함한 1％ 겔 제형(실시예 6의 겔 제형)을 각각 4주 동안 도포한 후에, 아토피성 피부염 발생 부위 외관을 육안 관찰에 의해 호전여부를 평가하였다. 평가 결과, 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드 적용을 통해 아토피 피부염의 증상이 1주 후부터 개선됨이 증명되었으며, 나노리포좀의 형태로 적용한 경우 보다 빠르고 완전한 개선 효과를 나타냄이 증명되었다. 용량 의존성 항아토피 효능 증진 약물에 있어 약물의 피부 전달 개선은 치료 속도 및 개선 정도에 있어 유익한 결과를 나타냄을 입증하였다.

실시예 10. 세포투과성 펩타이드 표면 결합 나노리포좀의 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드에 대한 효능 개선성 평가-면역학적 지표 평가

실시예 9에 상기된 육안평가 뿐 만 아니라 면역학적 지표 개선도 평가를 통해 세포투과성 펩타이드 표면 결합 나노리포좀를 통한 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드의 치료 효율성 증진 정도를 평가하였다. 면역학적 지표로서 IgE, IFN-γ, IL-4의 혈중 농도를 평가하였다. 실시예 9에 기재된 방법에 따라 4주 동안 각 제형을 처치한 후 각 마우스의 혈액을 채취하고, 12,000 rpm에서 원심분리하여 혈장 시료를 얻었다. ELISA 키트를 이용하여 각각의 농도를 측정하였다. 실시예 9에서 확인한 육안평가와 유사한 양상의 면역학적 지표의 변화가 관찰되었다. 음성군에 비해 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드를 처치한 경우 IgE, IL-4의 수준이 감소하였으며 IFN-γ의 수준이 증가하였다. IL-4는 활성화된 B 세포 및 T 세포 의 증식을 촉진하며 초기(naive) T 세포(CD4⁺ T 세포)의 Th2 세포로의 분화를 촉진하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 아토피성 피부염 마우스에 있어서는 IL-4 수준이 증가하는데, 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드를 처치한 경우 IL-4 수준을 감소시킴으로써 알러지(allergy) 반응을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 특히 나노리포좀의 형태로 투여한 경우 모든 면역학적 지표에 있어서 단순한 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드 겔 조성물에 비해 유의성 있는 강력한 면역 조절 효과가 달성됨이 관찰되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드 결합 지질 나노담체(나노 리포좀)의 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드에 대한 피부 전달량을 Franz 확산 셀 모델에서 시간의 흐름에 따라 측정한 결과이다.

도 2a 및 도 2b는 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드 표면 결합 지질 나노담체의 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드에 대한 효능 개선성을 아토피성 피부염 동물 모델인 NC/Nga 마우스에서 평가하고 병변 부위 사진을 제시하였다.

도 3은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드 표면 결합 지질 나노담체의 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드에 대한 효능 개선성을 아토피성 피부염 동물 모델인 NC/Nga 마우스에서 면역학적 지표를 통해 평가하였다. 세포투과성 펩타이드 표면 결합 지질 나노담체는 탁시폴린 3-Ｏ-β-D-글루코피라노사이드의 일반겔에 비해 IgE, IL-4, IFN-r의 수준을 확연히 개선하였다.

Claims

(i) 항-아토피 활성물질이 봉입되어 있고, (ⅱ) 세포투과성 펩타이드가 표면에 결합된 것을 특징으로 하는 나노리포좀(nanoliposome).
제 1 항에 있어서, 상기 항-아토피 활성물질은 탁시폴린 3-O-β-D-글루코피라노사이드(taxifolin 3-O-β-D-glucopyranoside)인 것을 특징으로 하는 나노리포좀.
제 1 항에 있어서, 상기 항-아토피 활성물질의 함유량은 나노리포좀 총 중량에 대해 0.001 - 40.0 중량％인 것을 특징으로 하는 나노리포좀.
제 1 항에 있어서, 상기 나노리포좀을 구성하는 지질은 인지질(phospholipid)인 것을 특징으로 하는 나노리포좀.
제 4 항에 있어서, 상기 인지질은 디아실 그룹의 탄소수가 3 - 24인 포스포 콜린(phosphocholine)인 것을 특징으로 하는 나노리포좀.
제 5 항에 있어서, 상기 인지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), L-a-포스파티딜콜린(HSPC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PGPC), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디마이리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC) 및 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 나노리포좀.
제 1 항에 있어서, 상기 나노리포좀은 탄력성 조절 성분으로서 폴리소르베이트(polysorbate)80, 스판 80(Span 80, Sorbitan monooleate), 소듐 콜레이트, 디포타슘 글리시리지네이트, 라이소포스파티딜콜린, 또는 에탄올을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노리포좀.
제 7 항에 있어서, 상기 탄력성 조절 성분은 인지질 100 중량부에 대해 0.1 - 50.0 중량부의 범위내에서 포함되는 것을 특징으로 하는 나노리포좀.
제 7 항에 있어서, 상기 나노리포좀은 기능기(functional group)를 포함한 인지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노리포좀.
제 1 항에 있어서, 상기 나노리포좀의 평균 입자 크기는 10.0 - 500.0 nm인 것을 특징으로 하는 나노리포좀.
제 1 항에 있어서, 상기 세포투과성 펩타이드는 펩-1 펩타이드(pep-1 peptide, KETWWETWWTEWSQPKKKRKV), 저분자형 프로타민(LMWP, VSRRRRRRGGRRRR), 탯 펩타이드(Tat peptide, YGRKKRRQRRR), 페너트라틴(Penetratin, RQIKIWFQNRRMKWKK), 안테나페디아(Antennapedia, ANTP), D-아르기닌 올리고 펩타이드(D-arginine oligopeptide, R8 이상) 및 L-아르기닌 올리고 펩타이드(L-arginine oligopeptide, R8 이상)로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 나노 리포좀.
제 11 항에 있어서, 상기 세포투과성 펩타이드는 나노리포좀당 1-10000개 포함되는 것을 특징으로 하는 나노 리포좀.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 나노리포좀을 포함하는 항-아토피용 조성물.
제 13 항에 있어서, 상기 나노 리포좀은 조성물 총 중량에 대해 0.1 - 20 중량％로 함유되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 13 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 15 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 피부 외용 제형 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 피부 외용 제형은 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 13 항에 있어서, 상기 조성물은 화장품학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 18 항에 있어서, 상기 화장품학적 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱 및 스프레이로 구성된 군에서 선택되는 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
다음의 단계를 포함하는 나노리포좀의 제조방법:

(a) 항-아토피 활성물질이 봉입된 나노리포좀을 제조하는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)에서 생성된 나노리포좀의 표면에 세포투과성 펩타이드를 결합시키는 단계.
제 20 항에 있어서, 상기 단계 (a) 이후에, 단계 (a)에서 형성된 나노 리포좀의 표면을 기능기(functional group)로 개질시키는 단계 (a)'을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 단계 (b) 이후에, 단계 (b)에서 형성된 나노 리포좀을 분리하여 정제하는 단계 (b)'를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.