KR20110024835A - 미오―이노시톨 메틸트랜스퍼라아제 및 오노니톨 에피머라아제 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 이용한 ｄ―피니톨의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제 인코딩 핵산분자 및 상기 핵산분자에 작동적으로 결합된 프로모터를 포함하는 벡터; 및 (b) 오노니톨 에피머라아제 인코딩 핵산분자 및 상기 핵산분자에 작동적으로 결합된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체 및 이 형질전환체를 사용하여 D-피니톨을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 D-피니톨 생합성에 관련된 효소를 발현하는 형질전환체를 이용하면 D-피니톨을 저비용 및 대량으로 생산할 수 있는 효과가 있다.

D-피니톨, 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제, 오노니톨 에피머라아제, 형질전환체, 생산방법

Description

미오―이노시톨 메틸트랜스퍼라아제 및 오노니톨 에피머라아제 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 이용한 Ｄ―피니톨의 생산방법{Method for Producing D-pinitol Using Transformant Transformed with Vector Comprising Nucleotide Sequence Encoding myo-Inositol Methyltransferase and Ononitol Epimerase}

본 발명은 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제 및 오노니톨 에피머라아제 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 이용한 D-피니톨의 생산방법에 관한 것이다.

D-피니톨은 카이로이노시톨과 함께 대두, 솔잎, 캐롭 등의 식물체에 많이 포함되어 있는 당 성분이다. 카이로이노시톨은 1990년대 초부터 여러 연구결과에 의해 당뇨병 환자에 투여 시 혈당강하 효과가 있는 것으로 알려져 있고(Ortmeyer et al., Endocrinol. 132:646-651, 1993; Huang et al.,Endocrinol. 132:652-657, 1993; Farese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11040-11044, 1994; Fonteles et al.,Diabetologia 39:731-734, 1996), 종래의 혈당강하제들이 가지는 위장 장애, 간손상, 과사용시의 저혈당 초래와 같은 부작용이 없다. 카이로이노시톨(chiro-inositol)에 메틸기가 붙은 메틸에테르형 화합물인 D-피니톨도 카이로이노시톨과 동등한 정도의 혈당강하 효과가 있는 것으로 보고되었다(미국특허 제5,827,896호; Narayanan et al., Current Science, 56(3):139-141, 1987).

D-피니톨은 카이로이노시톨의 분리 방법과 유사하게 이를 많이 포함하고 있는 식물성 재료로부터 추출 및 정제하여 얻고 있다. 한국등록특허 제10-0620080호에는 대두 가공 부산물에 세균, 효모 또는 곰팡이 등의 미생물을 처리하여 피니톨 유도체를 피니톨로 전환시키고, 이로부터 원심분리, 여과의 전처리 공정과 이온교환수지 또는 활성탄을 이용한 정제 공정을 통해 피니톨을 회수하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 한국등록특허 제10-0753982호에는 피니톨의 함량이 높은 캐롭 시럽을 미생물 처리하여 피니톨 유도체를 피니톨로 전환시켜 피니톨의 농도를 더욱 증가시키고 다른 당 성분과 균체를 제거함으로써 40-50%의 저순도의 피니톨을 생산하고, 이 저순도 피니톨에 대해 추가적으로 활성탄 처리 공정을 행함으로써 고순도 피니톨을 생산하는 방법에 대해 개시하고 있다.

한편, 식물이 받는 스트레스는 크게 생물학적(biotic) 스트레스와 비생물학적(abiotic) 스트레스로 구분된다. 생물학적 스트레스는 다른 생물체에 의해서 일어나는 스트레스이고 비생물학적 스트레스는 가뭄, 염분, 저온, 중금속 등과 같은 물리적 또는 화학적 요인에 의한 스트레스이다. 식물이 이와 같은 스트레스를 받게 되면 세포 내 유전자 발현의 변화를 포함한 대사 작용을 유동적으로 변화시켜 스트레스에 대처하게 된다. 특히, 가뭄, 염분과 같은 삼투 스트레스(osmotic stress)는 식물의 생장과 발육에 심각한 해를 입혀 작물의 경우에는 생산성에 큰 영향을 미친다. 고등식물은 이러한 스트레스 상황에 대해 다양한 작용기작을 통해 적응한다. 가뭄, 염과 같은 스트레스를 받으면 대부분의 식물들은 세포내 수분의 균형이 무너지게 되고, 이를 회피하기 위해 삼투적으로 활성을 나타내는 글리신-베타인(glycine-betain), 프롤린(proline), 만니톨(mannitol) 같은 저분자 물질과 당(sugar), 알코올(alcohols) 등이 체내 곳곳에 축적하고 이렇게 축적되는 화합물들은 삼투보호 물질로써 비생물학적 스트레스 시 식물체내 물 함량의 균형을 유지시키는 역할을 한다(Nelson et al., 1998). 염 스트레스에 내성을 갖는 염생 식물에서는 메틸화된 이노시톨(methylated inositol)이 식물체내에 축적되면 스트레스에 대한 내성이 증가되는데, 미오-이노시톨(myo-inositol)은 글루코오스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate)가 INPS(myo-inositol-1-phosphate synthase)에 의해서 미오-이노시톨-1-포스페이트(myo-inositol-1-phosphate)로 전환되고 이는 다시 IMP (myo-inositol-phosphate phospatase)에 의해 탈인산화 되어 미오-이노시톨이 생성된다(Loewus and Murthy, 2000; Yoshida et al., 2002; Nelson et al., 1998; Isitani et al., 1996). 식물이 스트레스 상태가 되면 INPS가 스트레스에 의해 유도되고 미오-이노시톨이 다량 생산되어 메틸트랜스퍼라아제(methyl transferase)에 기질로 제공되면서 메틸 이노시톨인 오노니톨(ononitol)과 피니톨(pinitol)이 삼투보호물질로 생성되고 체내에 축적된다. 이로서, 식물은 삼투 스트레스에 대해 저항할 수 있는 많은 능력을 갖게된다(Isitani et al., 1996).

미오-이노시톨을 사용하여 생성되는 메틸화된-이노시톨의 생합성은 두 가지의 효소 작용에 의해 이루어질 것으로 추정된다. 첫 번째 단계는 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제에 의해서 미오-이노시톨을 기질로 사용하고 조효소인 SAM (S-adenosyl-L-methionine)을 메틸 도너(methyl donor)로 사용하여 미오-이노시톨의 C₃-OH기에 메틸기를 전이시켜 D-오노니톨을 생성한다. 두 번째 단계는 메틸트랜스퍼라아제에 의해 생성된 오노니톨을 기질로 사용하고 NAD⁺를 조효소로 이용하여 에피머라이제이션(epimerization)시키는 과정이며, 이 과정은 오노니톨 에피머라아제(ononitol epimerase)에 의해 촉진된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 형질전환 생물체를 이용하여 미오-이노시톨(myo-inositol)을 출발물질로 하여 D-피니톨(D-pinitol)을 생산하는 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과 미오-이노시톨로부터 D-피니톨을 제조하는 데 필요한 효소인 미 오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제 및 오노니톨 에피머라아제를 클로닝하였고, 이 효소를 발현 가능한 형태로 포함하는 재조합 벡터를 제조하여 적합한 숙주세포에 형질전환시켜 만든 형질전환체가 미오-이노시톨로부터 D-피니톨을 효율적으로 생성함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제 및 오노니톨 에피머라아제를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것에 있다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 미오-이노시톨로부터 D-피니톨을 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제(myo-inositol methyltransferase) 인코딩 핵산분자 및 상기 핵산분자에 작동적으로 결합된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터; 및 (b) 오노니톨 에피머라아제(ononitol epimerase) 인코딩 핵산분자 및 상기 핵산분자에 작동적으로 결합된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 D-피니톨 생산용 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 D-피니톨의 제조 방법을 제공한다: (a) (i) 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 결합된(operatively linked) 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제(myo-inositol methyltransferase) 인코딩 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터; 및 (ⅱ) 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 결합된(operatively linked) 오노니톨 에피머라아제(ononitol epimerase) 인코딩 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계; (b) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 형질전환체를 회수하여 D-피니톨을 얻는 단계.

이하에서, 본 발명의 D-피니톨 제조 방법의 각 단계에 따라 본 발명을 상세하게 설명한다.

단계 (a)의 1: 프로모터 및 상기 프로모터와 작동적으로 결합된 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제를 인코딩하는 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계.

본 발명에서 용어 "미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제(myo-inositol methyltransferase)"는 미오-이노시톨의 3번 탄소의 히드록시기(hydroxyl group)에 메틸기(methyl group)를 전이시켜 D-오노니톨(D-ononitol)을 생성하는 활성을 갖는 효소를 의미한다. 본 발명의 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제는 메틸 도너(methyl donor)로서 SAM (S-adenosyl-L-methionine)을 필요로하는 SAM 의존성 메 틸트랜스퍼라아제(SAM dependent methyltransferase)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명에서 상기 용어 "동일성"은 아미노산 잔기로 이루어지는 두 개의 아미노산 서열 사이에서의 상호 동일성 정도를 의미한다. 이 동일성은 두 서열을 눈으로 비교하여 결정할 수도 있으나, 비교대상이 되는 서열을 나란히 배열하여 동일성 정도를 분석하여 주는 생물 정보 알고리즘(bioinformatic algorithm)을 사용하여 결정할 수 있다. 상기 두 개의 아미노산 서열 사이의 동일성은 백분율로 표시할 수 있다. 유용한 자동화된 알고리즘은 Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, W, USA)의 GAP, BESTFIT, FASTA와 TFASTA 컴퓨터 소프트웨어 모듈에서 이용가능하다. 상기 모듈들에서 자동화된 배열 알고리즘은 Needleman & Wunsch와 Pearson & Lipman과 Smith & Waterman 서열 배열 알고리즘을 포함한다. 다른 유용한 배열에 대한 알고리즘과 상동성 결정은 FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST와 CLUSTAL W를 포함하는 소프트웨어 에서 자동화되어 있다. N.P.Brown et al., Bioinformatics: Applications Note, 1998, 14:380-81, U.S. National Center for Biotechnology information의 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Tools/index.html와 미국특허 제6,790,639호에서 본 발명의 상동성 결정에 유용한 소프트웨어 계수에 설정을 제공한다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제는 서열목록 제 1 서열의 보존적 치환 변이체를 포함한다.

본 명세서에서 상기 용어 "보존적 아미노산 치환(conservative amino acid)"은 주어진 아미노산 잔기 중 어떤 아미노산이 치환된 것을 나타내는 것으로 상기에서 치환 잔기가 원래 주어진 잔기와 생화학적 특성이 상당히 유사하여 폴리펩티드의 기능, 예를 들면 효소 활성을 실질적으로 감소시키지 않는 치환을 의미한다. 보존적 아미노산 치환은 본 기술 분야에서 보편적으로 알려져 있으며 예를 들면 미국 특허 제6,790,639호, 제6,774,107호, 제6,194,167호 또는 제5,350,576호에서 설명되어 있다.

본 발명의 바람직할 실시예에 따르면, 보존적 아미노산 치환은 다음의 여섯 개의 그룹 중 어느 하나에서 발생할 수 있다. 즉, ⅰ) 실질적으로 비극성인 작은 지방족 측쇄를 갖는 잔기: 알라닌(alanine), 글리신(glycine), 프롤린(proline), 세린(serine)과 쓰레오닌(threonine); ⅱ) 비극성이며 큰 지방족 측쇄를 갖는 잔기: 이소루신(isoleucine), 루신(leucine)과 발린(valine) 또는 메티오닌(methionine); ⅲ) 음전하의 극성인 측쇄를 갖는 잔기: 아스파르트산(aspartic acid)과 글루탐산(glutamic acid); ⅳ) 아미드기의 측쇄를 갖는 잔기: 아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine); v) 양전하의 극성인 측쇄를 갖는 잔기: 아르기닌(arginine), 라이신(lysin, Lys), 히스티딘(Histidine); ⅵ) 방향족 측쇄를 갖는 잔기: 트립토판(tryptophan), 타이로신(tyrosine), 페닐알라 닌(phenylalanine).

보존적 아미노산 치환은 다음의 어느 하나에서 발생할 수 있는데, 알라닌(alanine)을 세린, 아르기닌을 라이신, 아스파라긴을 글루타민 또는 히스티딘, 아스파르트산를 글루타민, 글루타민을 아스파르트산, 글리신을 프롤린, 히스티딘을 아스파라긴 또는 글루타민, 이소루신을 루신 또는 발린, 루신을 이소루신 또는 발린, 라이신을 아르기닌, 글루타민 또는 글루탐산, 메티오닌을 루신 또는 이소루신, 페닐알라닌을 메티오닌, 루신 또는 타이로신, 세린을 쓰레오닌, 쓰레오닌을 세린, 트립토판을 타이로신, 타이로신을 트립토판 또는 페닐알라닌 및 발린을 이소루신 또는 루신으로 치환할 수 있다.

본 발명에서 서열목록 제 1 서열로 이루어지는 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제의 보존적 치환 변이체는 아미노산 치환 변이가 발생하였음에도 불구하고 상기 효소의 활성을 유지하거나 보다 향상된 활성을 가진다.

본 발명에서 용어 "핵산분자"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드(DNA) 또는 리보뉴클레오타이드(RNA)이며, genomic DNA, cDNA 및 이로부터 전사되는 RNA를 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명에서 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제를 인코딩하는 핵산분자는 프 로모터에 작동적으로 결합되어 있다. 본 명세서에서 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 명세서에서 용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 프로모터 부위는 당업자라면 용이하게 인식할 수 있다. 즉, ATG 모티프를 포함하는 추정의 개시코돈이 확인되어 있고, 이 개시코돈으로부터 업스트림이 추정 프로모터 부위이다. 프로모터는 인접 및 원거리의 업스트림 엘리먼트(element)들로 구성되어 있다. 인접 엘리먼트로서는 통상적으로 RNA 중합효소 II가 적합한 전사 개시 위치에서 RNA의 합성을 개시할 수 있게 하는 TATA 박스를 포함한다. 원 거리 엘리먼트은 인헨서(enhancer)라고도 불리우는 조절 서열을 포함하는데, 이는 TATA 박스의 업스트림 부위에 조직 특이적 또는 시간 특이적 발현에 관여하는 추가 조절 엘리먼트이다. 인헨서는 프로모터의 활성을 촉진할 수 있는 DNA 서열이고, 프로모터의 고유의 엘리먼트이거나, 프로모터의 조직-특이성이나 발현 수준을 향상시키기 위해서 삽입되는 이종기원(heterologous)의 엘리먼트일 수 있다. 프로모터는 본래의 유전자로부터 그 전체가 유래한 것일 수 있고, 또는 자연계에서 발견된 상이한 프로모터들로부터 유래한 상이한 엘리먼트들로 구성될 수도 있고, 심지어 합성 DNA를 포함할 수도 있다. 당업자라면 각각 상이한 프로모터는 각각 상이한 조직 또는 세포 타입에서, 또는 발달단계의 상이한 단계에서, 또는 상이한 환경조건에 대응하여서 유전자의 발현을 지시할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 발명의 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주세포로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli (예, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다. 숙주세포로서 바실러스 균이 이용되는 경우, 바실러스 츄린겐시스의 독소단백질 유전자의 프로모터(Appl. Environ. Microbiol. 64:3932-3938(1998); Mol. Gen. Genet. 250:734-741(1996)) 또는 바실러스균에서 발현 가능한 어떠한 프로모터라도 조절부위로 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열(예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열)을 일반적으로 갖는다.

본 발명에 이용될 수 있는 진핵 세포용 발현 벡터는 당업계에 공지된 다양한 벡터로부터 선택할 수 있다. 예를 들어, SV40 벡터, 파필로마 바이러스 벡터, YIp5, YCpl9, 엡스테인-바 바이러스 벡터, pMSG, pAV009/A⁺, pMAMneo-5, 배큘로바이러스 pDSVE, pSecTag2B 또는 yT&A 벡터의 구조를 기본적인 백본으로 가질 수 있다.

한편, 본 발명의 재조합 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실 린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

단계 (a)의 2: 프로모터 및 상기 프로모터와 작동적으로 결합된 오노니톨 에피머라아제를 인코딩하는 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계.

본 발명에서 "오노니톨 에피머라아제 (ononitol epimerase)"는 D-오노니톨을 기질로 사용하고 NAD⁺를 조효소로 사용하여 D-오노니톨을 D-피니톨로 전환시키는 활성을 갖는 효소를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 오노니톨 에피머라아제는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 오노니톨 에피머라아제는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제는 서열목록 제 2 서열의 보존적 치환 변이체를 포함한다.

용어 "동일성" "보존적 치환 변이체" "핵산분자" "작동적 결합" "프로모터" 및 "재조합 벡터"에 관한 내용은 상기 미오-이오시톨 메틸트랜스퍼라아제에서 설명된 것과 동일하므로, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복하여 설명하지 않는다.

단계 (a)의 3: 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계.

상술한 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 형질전환체를 제조한다.

본 발명의 특정 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 숙주세포는 박테리아(bacteria), 이스트(yeast), 진균, 동물세포 또는 식물세포이다.

본 발명의 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21 (DE3), E. coli DH5α, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 식물세포의 형질전환은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 이는 전기천공(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 입자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)) 및 아그로박테리움-중재 형질전환(미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호)을 포함한다. 이 중에서, 아그로박테리움-중재 형질전환이 가장 바람직하다.

쌍떡잎 식물을 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용하여 형질전환시키고 형질전환된 식물체를 얻는 방법은 공지되어 있고, 이 외에 다른 다양한 식물에 대해서 형질전환 식물체를 얻는 방법이 공지되어 있는 데, 목화(cotton)에 대해서는 미합중국 특허 제 5,004,863 및 5,159135호; 콩에 대해서는 미합중국 특허 제 5,569,834 및 5,416011호; 브라시카(Brassica) 에 대해서는 미합중국 특허 제 5,463,174호; 땅콩(peanut)에 대해서는 Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep. 15:653-657, McKently et al. (1995) Plant Cell Rep. 14:699-703)에; 파파야(papaya)에 대해서는 Ling, K. et al. (1991) Bio/technology 9:752-758); and pea (Grant et al. (1995) Plant Cell Rep. 15:254-258에 개시되어 있다. 형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제(예컨데, 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물 세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

식물 원형질 또는 다양한 익스플랜트로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다(US. Pat. 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011호).

본 발명에 있어서, 바람직한 형질전환 방법은 아그로박테리움 시스템을 이용하여 실시되며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens) 바이너리 벡터 시스템을 이용하여 실시된다.

식물 세포의 형질전환은 Ti 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜머페이션스를 가지고 실시된다(Depicker, A. etal., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983)). 보다 바람직하게는, pBin19, pRD400, pRD320, pGA1611 및 pGA1991과 같은 바이너리 벡터 시스템이 이용된다(An, G. et al., Binary vectors" In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986); An et al., 1988; 및 Lee et al., 1999).

본 발명에 적합한 바이너리 벡터는 (i) 식물에서 작동하는 프로모터; (ⅱ) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 구조 유전자; 및 (ⅲ) 폴리아데닐화 시그널 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예:루시퍼라아제 및 글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 바이너리 벡터에 이용되는 프로모터의 예는 CaMV 35S 프로모터, 1 프로모터, 2 프로모터 및 노팔린 씬타아제(nos) 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 익스플랜트의 감염은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 감염 과정은 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양물에 익스플랜트를 함침시켜 공동배양하는 과정을 포함한다. 이에 의해 아그로박테리움 튜머페이션스는 식물내로 감염된다.

아그로박테리움 튜머페이션스에 의해 형질전환된 익스플랜트는 재분화 배지에서 재분화되며, 이는 최종적으로 형질전환 식물체를 형성한다.

본 발명에 따라 형질전환된 식물은 당업계에 공지된 방법에 의해 형질전환 여부가 확인된다. 예를 들어, 형질전환된 식물의 조직으로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여, PCR을 실시하면 형질전환 식물의 지놈에 삽입된 외래 유전자가 규명될 수 있다. 택일적으로, 노던 또는 서던 블롯팅을 실시하여 형질전환 여부를 확인할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)).

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 숙주 세포는 미오-이노시톨을 과량 생성하는 변이체 세포이다. 본 발명의 방법에서 출발물질인 미오-이노시톨을 과량 생성하는 변이체 세포를 숙주세포로 사용함으로써 최종 생성물질인 D-피니톨의 생성 수율을 증가시킬 수 있다.

단계 (b): 상기 형질전환체를 배양하는 단계.

본 발명에서 상기 제조한 형질전환체를 배양하는 방법은 숙주 세포를 배양하는 통상의 방법에 따라 행한다. 예를 들어, 숙주세포가 원핵세포인 경우 E.coli, 진핵세포인 경우 이스트(yeast)를 사용하여 얻은 형질전환체인 경우, 형질전환체 배양을 위한 배지는 숙주 세포가 효율적으로 이용할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염 등을 포함한다면 천연 배지 또는 합성 배지를 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스와 같은 탄수화물; 녹말, 녹말의 가수분해물; 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기산; 에탄올, 프로판과 같은 알코올 등을 포함한다. 질소원은 암모니아; 염화암모늄, 암모늄설페이트, 암모늄아세테이트 및 암모늄포스페이트와 같은 무기산 또는 유기산의 암모늄염; 펩톤, 육추출물(meat extract), 이스트추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두추출물, 대두가수분해물; 다양한 발효된 세포 및 이들의 분해물 등을 포함한다. 무기염은 포타슘디하이드로젠 포스페이트, 다이포타슘하이드로젠 포스페이트, 마그네슘 포스 페이트, 마그네슘 설페이트, 소디엄 클로라이드, 망간 설페이트, 구리 설페이느, 칼슘 카보네이트 등을 포함한다.

배양은 통상적으로 진탕배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 15 내지 40℃에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5 시간 내지 7 일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 암피실린 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다. 유도가능한 프로모터를 갖는 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 경우 필요하다면 배지에 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)을 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다.

숙주 세포로서 동물 세포를 사용하여 형질전환체를 얻은 경우 배지는 RPMI 1640 배지[The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM 배지 [Science, 122, 501 (1952)], DMEM 배지 [Virology, 8, 396 (1959)], 및 199 배지 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] 또는 이들 배지에 동물 유래 혈청을 첨가한 배지를 사용할 수 있다. 배양은 일반적으로, pH 6 내지 8, 온도 25 내지 40℃, 5% CO₂ 존재하에서 1 내지 7 일간 행한다. 또한, 필요하다면, 카나마이신, 페니실린 및 스트렙토마이신과 같은 항생제를 첨가할 수 있다.

식물 세포를 숙주세포로 하여 형질전환체를 얻은 경우 형질전환체 배양을 위한 배지는 MS (Murashige and Skoog) 배지, White 배지, 또는 이들 배지에 옥신(auxin) 또는 사이토키닌(cytokinine)과 같은 식물 호르몬을 첨가하여 사용할 수 있다. 배양은 일반적으로 pH 5 내지 9, 온도 20 내지 40 ℃에서, 3 내지 60 일간 배양한다. 필요한 경우 카나마이신 및 히그로마이신(hygromycin)과 같은 항생제도 배양 동안 배지에 첨가할 수 있다.

단계 (c): 상기 배양된 형질전환체를 회수하여 D-피니톨을 얻는 단계

배양한 형질전환체로부터 D-피니톨을 얻는 것은 당(sugar)을 분리 및 정제하는 공지된 다양한 방법 및 이의 변형된 방법을 이용하여 행한다.

먼저, D-피니톨이 형질전환체 내부에 용해된 상태로 존재하는 경우, 배양된 형질전환체를 수집한다. 예를 들어 배양한 형질전환체가 E.coli 세포인 경우 원심분리에 의해 수집한다. 수집된 세포를 완충액에 현탁시키고, 균질기(Homogenizer), 프렌치프레스(French press), 디노밀(Dynomill) 또는 초음파파쇄장치(untrasonicator)와 같은 장치를 이용하여 세포를 파쇄시켜 세포 추출물(cell extract)을 얻고, 세포추출물을 원심분리하여 얻은 상등액을 얻는다. 세포 찌꺼지(cell debris)를 제거한 상등액으부터 D-피니톨을 얻는 방법은 종래의 공지된 당의 분리 정제 방법 및 이를 변형한 방법을 이용할 수 있다.

종래 공지된 당의 분리 정제방법으로는, 제올라이트 분자체를 이용한 선택적 흡착 방법에 의한 분리방법(미국특허 제 4,482,761호), 양이온교환수지를 이용한 컬럼크로마토그래피에 의한 분리방법(미국특허 제 5,096,594호), 음이온 교환수지를 사용하는 컬럼크로마토그래피에 의한 분리방법(미국특허 제 5,482,631호), 활성탄에 의한 흡착 및 유기용매에 의한 용출 방법(대한민국특허 제10-0753982호) 등이 있으며, 이러한 방법을 이용하거나 이 방법의 변형된 방법을 이용할 수 있다.

본 발명은 상기 설명된 D-피니톨 생산용도의 형질전환체로서 (a) 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제 인코딩 핵산분자 및 상기 핵산분자에 작동적으로 결합된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터; 및 (b) 오노니톨 에피머라아제 인코딩 핵산분자 및 상기 핵산분자에 작동적으로 결합된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 의하면, 상기 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제는 서열목록 제 1서열의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 다른 바람직한 일 구현예에 의하면, 상기 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 다른 바람직한 일 구현예에 의하면, 상기 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열의 보존적 치환 변이체를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아 제 인코딩 핵산 분자는 서열목록 제 3 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명의 다른 바람직한 일 구현예에 의하면, 상기 오노니톨 에피머라아제는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 다른 바람직한 일 구현예에 의하면, 상기 오노니톨 에피머라아제는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 다른 바람직한 일 구현예에 의하면, 상기 오노니톨 에피머라아제는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열의 보존적 치환 변이체를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 오노니톨 에피머라아제 인코딩 핵산 분자는 서열목록 제 4 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명의 다른 바람직한 일 구현예에 의하면, 상기 숙주세포는 미오-이노시톨을 과량 생성하는 변이체 세포인 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 다른 바람직한 일 구현예에 의하면, 상기 형질전환체는 박테리아, 이스트, 진균, 동물세포 또는 식물세포인 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 (a) 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제 인코딩 핵산분자 및 상기 핵산분자에 작동적으로 결합된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터; 및 (b) 오노니톨 에피머라아제 인코딩 핵산분자 및 상기 핵산분자에 작동적으로 결합된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체 및 이 형질전환체를 사용하여 D-피니톨을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 D-피니톨 생합성에 관련된 효소를 발현하는 형질전환체를 이용하면 D-피니톨을 저비용 및 대량으로 생산할 수 있는 효과가 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 대두(Soybean) EST 데이터 베이스를 통한 대두 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제(GmIMT) 및 대두 오노니톨 에피머라아제(GmOEP)의 블라스트 서치(Blast Search)

1-1: 블라스트 서치

대두의 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제(Glycine max myo-inositol methyltransferase, 이하 'GmIMT'와 혼용함)와 대두의 오노니톨 에피머라아제(Glycine max ononitol epimerase, 이하 'GmOEP'와 혼용함)의 발현이 가뭄이나 염분 스트레스에 의해 유도 된다는 사실(Ishitani et al., 1996)에 착안하여, 가뭄 또는 염분 스트레스 처리된 대두 조직으로부터 다량 발현되는 EST를 블라스트 서치하였다.

먼저, 대두(Williams 82) 종자를 Plant Growth Chamber (Dasol Ltd, Gyonggi, Korea)를 이용하여 빛 상태 28℃ (14 hr), 암 상태 20℃ (10 hr)로 3 주간 키웠다. 발아 후 2 주된 콩을 염 처리(100 mM NaCl) 또는 가뭄처리(10% PEG 6000)한 후 잎과 뿌리의 조직을 Grinding Mixer Mill MM301 (Retsch, Haan, Germany)을 사용하여 분쇄하여 총(total) RNA를 얻고, 이로부터 cDNA 라이브러리(library)를 제작하였다. 이 cDNA 라이브러리로부터 ESTs를 만들고, 이를 대두 EST 데이터베이스() 에서의 ESTs와 조사하였다. 그 결과 이들 ESTs에서 SAM 의존성 메틸트랜스퍼라아제(SAM dependent methyltransferase), NAD^＋ 의존성 에피머라아제(NAD^＋ dependent epimerase)와 유사한 EST가 다량으로 존재하는 것을 확인하였다. 이들 ESTs의 서열을 NCBI GenBank (http://www.ncbi.nln.gov)에서 제공하는 블라스트 서치 프로그램(blast search program)을 통해 상동성(homology)이 높은 EST들을 검색한 결과, SAM을 메틸도너(methyl donor)로 이용하는 다양한 메틸트랜스퍼라아제의 아미노산 서열과 약 40% 이상의 상동성을 나타냄을 확인하였다. 오노니톨에피머라아제는 UDP-갈락토오스 4-에피머라아제(Joersbo et al., 1999) 또는 UDP-글루코오스 4-에피머라아제(Lake et al., 1998)의 아미노산 서열과 높은 상동성을 나타냄을 확인하였다.

1-2: 전체 서열 서치(Full Sequence Search)

블라스트 서치를 통해 찾아낸 유사성이 있는 ESTs중에 5＇에서부터 읽은 ESTs의 염기서열과 3＇에서부터 읽은 ESTs의 염기서열을 2 블라스트 서치 프로그램(2 blast search program)을 통해 연속적으로 중첩시켜서 시작 코돈(start cordon, ATG)이 포함되어 있는 전장 서열(full length sequence)을 찾아 낼 수 있었다. 이를 실제적으로 클로닝(cloning)하여 확인하기 위해 찾은 ESTs 중에서 시작 코돈을 포함하고 있는 EST 클론 GmIMT (Genome Systems Clone ID : Gm-c1068-2207)과 EST 클론 GmOEP (Genome Systems Clone ID : Gm-c1068-7728)을 선택하여 해당 EST를 구입하였다.

실시예 2: GmIMT 및 GmOEP cDNA의 클로닝 및 E.coli 으로의 도입

2-1: PCR을 이용한 GmIMT 및 GmOEP cDNA의 증폭

블라스트 서치로 인 실리코(in silico)상에서 찾아낸 GmIMT 및 GmOEP의 전체 염기서열을 근간으로 GmIMT는 NdeⅠ 제한효소 자리(site)가 포함 되어있는 프라이머(primer)와 XhoⅠ 제한효소 자리가 포함되어 있는 프라이머를 각각 제작하고, GmOEP는 XhoⅠ어댑터(adaptor)를 포함하는 프라이머와 SacⅠ어댑터를 포함하는 프라이머를 제작하였다(표 1 참조). 그리고 확보한 EST 클론에서 Wizard^?? Plus SV Minipreps DNA Purification system (Promega Co., USA)을 사용하여 플라스미드(plasmid)를 추출하고, 이 플라스미드를 주형(template)으로 하여, 상기 제작한 프라이머로 PCR [총 반응액 부피 50 ㎕에 주형 2 ㎕와 제작한 프라이머(10 pmol), ExTaq 폴리머라아제(TaKaRa, 5 unit), dNTP(10 mM), 10X 반응완충액을 포함시킴]을 수행하였다.

[표 1]

GmIMT	프라이머 서열
NdeI 자리가 포함된 프라이머	5＇-CAT ATG GAG ACT GTT CTT TTC AAT-3＇
XhoI 자리가 포함된 프라이머	5＇-CTC GAG TCA GAT TGG AAA CGC CTC-3＇
GmOEP
XhoI 어댑터가 포함된 프라이머	5＇-CTC GAG ATG CGC GAC AAG ACT GTG-3＇
SacI 어댑터가 포함된 프라이머	5＇-GAG CTC CTA AAC GGT GGA ATC CTC-3＇

2-2: 증폭된 PCR 산물의 용출( elution ) 및 T-벡터에 클로닝

PCR을 통해 증폭된 GmIMT 및 GmOEP cDNA를 1.0% 아가로오스(agarose gel) 전기영동으로 크기를 확인하고 이를 Geneclean^?? Ⅱ kit (Bio101 Co., USA)을 사용하여 PCR 밴드를 용출(elution)하였다. 추출한 PCR 산물을 T-벡터에 삽입하기 위해, 우선 5＇-말단에 인산기가 없는 PCR 산물에 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(polynucleotide kinase, 10 unit/㎕)를 사용하여 인산기를 붙여 주었고 T-벡터는 제한효소 XcmⅠ을 처리하여 3＇-말단에 티미딘(thymidine)을 생성시켜 PCR 산물의 5＇-말단에 존재하는 아데노신(adenosin)과 반응할 수 있도록 하였다. 준비한 PCR 산물 7 ㎕와 T-벡터 1 ㎕에 총 반응액 부피가 10 ㎕가 되도록 10X 리가아제 완충액 1 ㎕, T4 DNA 리가아제(ligase, 400 unit/㎕) 1 ㎕를 첨가하여 잘 혼합한 후 16℃에서 약 16 시간 반응시켰다.

2-3: 컴피턴트(Competent) 세포 E.coli DH5α의 제조

LB broth 5 ㎖에 E. coli DH5α를 접종하여 37 ℃에서 약 16 시간 성장시킨 후 50 ㎖ LB broth에 1/50 비율로 혼합하여 O.D₆₀₀ 값이 0.2-0.4 정도 될 때까지 배양하였다. 이후 얼음에서 10 분간 흔들며 세포 성장을 정지시키고 미리 얼음에서 냉각시킨 25 ㎖ 원심분리 튜브에 나누어 담아 4℃, 3,300 rpm에서 15 분간 원심분리 하였다. 상등액을 버리고 침전된 E.coli DH5α에 TSS [(LB broth 42.5 ㎖, PEG 5 g, DMSO 2.5 ㎖, 1 M MgCl₂ 2.5 ㎖)(pH 6.2)]용액 2.5 ㎖를 넣고 잘 섞은 뒤 100 ㎕씩 1.5 ㎖ 튜브에 분주하였다. 이후 액체 질소에서 약 1 분간 급속 냉동시킨 후 -70℃에 보관 하였다.

2-4: 클로닝한 T-벡터를 E . coli DH5α안으로 도입

클로닝한 T-벡터를 E. coli 안으로 도입하기 위해 -70℃에 보관하고 있던 컴피턴트 세포 E.coli DH5α를 얼음에 넣고 20 분간 서서히 녹였다. 녹인 컴피턴트 세포에 상기 라이게이션 혼합액(ligation mixture) 5 ㎕를 넣고 다시 얼음에서 10 분간 기다린 후 42℃ 열 충격을 가해 주었다. 이것을 다시 얼음에 넣어 10 분간 방치 하였고 여기에 LB broth 400 ㎕를 넣어 37℃, 150 rpm에서 1 시간동안 천천히 성장시켰다. 배양액 안에 존재하는 형질전환체를 선별하기 위해서 40 ㎕의 X-gal (5-bromo-4-chlono-3-indolyl-β-D-galactoside, 20 ㎎/㎖)과 4 ㎕의 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, 1 M, 238 ㎎/㎖)를 미리 도말해 놓은 암 피실린(ampicillin, 50 ㎕/㎖)이 첨가된 LB 플레이트에 계대 배양하였다. 여기서 형성된 백색/청색(white/blue) 콜로니 중에 백색 콜로니(white colony) 만을 선별하여 다시 암피실린이 첨가된 LB broth에서 배양한 후 Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System으로 플라스미드 DNA를 추출하였다. 컴피턴트 세포가 제대로 형질전환되었는지 확인하기 위해서 T-벡터에 삽입된 각각 유전자 양 말단에 포함되어있는 제한효소 자리를 GmIMT는 NdeⅠ와 XhoⅠ으로, GmOEP는 XhoⅠ과 SacⅠ 제한효소로 처리하였고, 1.0% 아가로스 젤 전기영동을 통해서 원하는 크기의 유전자가 삽입되었는지 확인하였다. 그리고 인 실리코(in silico)상에서 찾아낸 GmIMT와 GmOEP cDNA의 염기서열과 실제로 클로닝한 GmIMT와 GmOEP cDNA의 염기서열이 동일한지 확인하기 위해 바이오닉스(Guro, Seoul, Korea)에 염기서열분석을 의뢰하였다.

2-5: 염기서열분석 결과

블라스트 2 서치(Blast 2 Search)로 인 실리코(in silico) 상에서 찾아낸 GmIMT 및 GmOEP cDNA의 전체서열을 근간으로 제한효소 XhoⅠ자리 또는 SacⅠ자리를 포함하는 프라이머를 제작하여 PCR을 행하고 T-벡터에 클로닝하여 얻은 GmIMT 및 GmOEP cDNA의 염기서열을 분석한 결과, GmIMT cDNA는 ORF (open reading frame)이 1110 bp 이고 369 아미노산으로 구성되고(도 2 참조), GmOEP cDNA는 ORF (open reading frame)이 1050 bp이고 350 아미노산으로 구성되어 있는 것을 확인하였다(도 3 참조). 인 실리코(in silico) 상에서 얻은 서열과 실험을 통해 얻은 서열에 서 동일한 결과가 나타났다.

실시예 3: GmIMT 및 GmOEP cDNA를 pET 발현 시스템에 도입

3-1: PCR을 이용한 GmIMT 및 GmOEP cDNA의 증폭

GmIMT를 벡터(vector)에 삽입하기 위해 pET-15b 벡터를 NdeⅠ과 XhoⅠ으로 처리하였고, GmOEP를 삽입하기 위해서는 pET-15b 벡터의 클로닝자리를 변형시켜 제한효소 XhoⅠ과 SacⅠ으로 처리한 후 Geneclean^?? Ⅱ kit (Bio101 Co., USA)을 사용하여 용출시켰다. 또한, T-벡터에 삽입되어있는 GmIMT 및 GmOEP은 제한효소 NdeⅠ과 XhoⅠ, XhoⅠ과 SacⅠ을 처리하여 벡터로부터 분리한 후 용출하였다. 제한효소로 잘려진 pET-15b 벡터에 GmIMT 및 GmOEP를 삽입하기 위해서 10X T4 리가아제 완충액 1 ㎕와 T4 DNA 리가아제 1 ㎕를 첨가하여 22 ℃에서 16 시간 반응시켰다. 상기 라이게이션 혼합액을 컴피턴트 세포 E. coli DH5α에 형질전환 시킨 후 암피실린이 첨가된 LB 플레이트에서 자란 콜로니에서 플라스미드 DNA를 추출하였다. GmIMT 및 GmOEP cDNA가 제대로 삽입되었는지 확인하였다.

3-2: SDS-PAGE를 이용한 GmIMT 및 GmOEP cDNA의 발현 확인

GmIMT 및 GmOEP cDNA를 갖는 재조합 벡터가 도입되어 있는 E.coli BL21를 암피실린(50 ㎍/㎖)이 첨가된 LB broth 5 ㎖에 접종하여 37℃ 에서 14 시간 배양한 후 다시 암피실린(50 ㎍/㎖)이 첨가된 LB broth 45 ㎖로 옮겼다. 그리고 UV 분광 계(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용해서 O.D₆₀₀ 값이 0.8-1.0 이 되도록 배양한 후 IPTG 1 mM을 첨가하여 GmIMT 및 GmOEP cDNA의 대량 발현을 유도하였다. 배양된 E.coli BL21을 1 시간 간격으로 1 ㎖씩 추출하여 원심분리한 후 침전된 세포만을 얻었고 여기에 5X 샘플완충액(sample buffer) 20 ㎕와 멸균수 80 ㎕를 첨가하여 침전된 세포와 혼합하였다. 이후, 100℃에서 5-10 분간 가열하여 세포벽을 완전히 파괴시키고 12,000 rpm으로 원심 분리하여 총 단백질을 추출하였다. 이렇게 얻은 시간대 별 샘플을 10% SDS-PAGE를 이용하여 단백질의 발현 양상을 확인하였다.

3-3: 결과

ExPASy (Expert Protein Analysis System) proteomics server (http://us.expasy.org)에서 제공하는 형태측정 프로그램(topology prediction program)을 이용하여 GmIMT와 GmOEP이 용해성 단백질(soluble protein)임을 확인하였고 발현 벡터인 pET-15b에 클로닝된 GmIMT 및 GmOEP cDNA를 IPTG로 유도시키는 방법으로 각각의 유전자들의 발현을 E. coli에서 유도하였다. IPTG가 투입된 시기부터 시간별로 각각의 발현 샘플을 채취하여 10% SDS-PAGE를 이용하여 발현됨을 확인하였다. 발현 양을 1 시간 간격으로 확인해 본 결과 GmIMT 및 GmOEP가 모두 발현되는 것을 확인하였고 발현을 유도한지 4 시간째부터 GmIMT 및 GmOEP 모두 발현양이 증가하는 것을 확인하였다. 4 시간 이후 발현된 양 또한 크게 달라지지 않았고 GmIMT 및 GmOEP 모두 발현양의 큰 차이가 없었다(도 4 및 도 5).

실시예 4: GmIMT 및 GmOEP cDNA의 분리 및 정제

4-1: 형질전환된 BL21에서 용해성 단백질(soluble protein) 수득

형질전환된 E. coli BL21을 암피실린이 첨가된 LB broth 30 ㎖에 접종하여 37℃ 에서 10 시간 배양한 후 다시 암피실린이 첨가된 LB broth 270 ㎖에 이동시켰다. 이것을 O.D₆₀₀ 값이 0.8-1.0 정도 될 때까지 배양한 후 IPTG 1 mM을 첨가하고 다시 4 시간 더 배양하여 GmIMT 및 GmOEP를 대량 발현시켰다. GmIMT 및 GmOEP가 발현 된 E. coli BL21을 10 분간 10,000g로 원심분리하여 상등액을 제거하고 -70℃에 보관하였다. 동결된 E. coli BL21에 8 ㎖의 결합 버퍼(binding buffer)[20 mM Tris-HCl(pH 7.0), 500 mM NaCl, 5 mM 이미다졸]와 60 ㎕ PMSF(100 ㎍/㎖), DNaseⅠ, RNase A를 처리하여 상온에서 잘 섞어준 후 얼음에서 5 분간 방치하였다. 이후 초음파 분쇄기를 사용하여 세포를 분쇄시킨 후 15 분간 12,000g로 원심분리하여 상등액을 추출하였고 세공 크기(pore size) 0.45 ㎛ 시린지 필터(syringe filter)를 이용하여 여과하였다.

4-2: Ni ²⁺ 친화성 크로마토그래피를 이용한 GmIMT 및 GmOEP의 분리

pET-15b 벡터의 클로닝 자리 앞부분에는 히스티딘(histidine) 6 개가 존재하기 때문에 pET-15b 벡터에 삽입된 유전자에서 발현된 단백질에는 6 개의 히스티딘 잔기가 붙는다. His-결합 레진을 이용한 Ni^2＋ 친화성 크로마토그래피 방법을 이용 하여 GmIMT와 GmOEP 단백질을 분리하였다. GmIMT 및 GmOEP을 순수하게 분리하기 위해서 His-tag purification kit (Novagen Co., USA)의 금속 고정화 친화성 컬럼(metal immobilized affinity column)에 His-결합 레진 1.5 ㎖을 팩킹시킨 후 레진의 3 배 부피의 멸균수, 5배 부피의 1X 하전 완충액(charge buffer) (50 mM NiSO₄), 3배 부피의 1X 결합 완충액(binding buffer)[20 mM Tris-HCl(pH 7.0), 500 mM NaCl, 5 mM imidazole]을 차례대로 투과시켜 컬럼을 평형화 시켰다. 여기에 추출한 용해성 총 단백질을 투과시킨 후 다시 10 배 부피의 1X 결합 완충액, 4 배 부피의 1X 세정 완충액(wash buffer) [20 mM Tris-HCl(pH 7.0), 500 mM NaCl, 80 mM 이미다졸]을 차례대로 투과시켜 레진에 결합하지 않거나 무작위적으로 결합한 단백질을 제거하였다. 최종적으로 3 배 부피의 1X 용출 완충액 [20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 500 mM NaCl, 400 mM 이미다졸]로 GmIMT 및 GmOEP를 분리하였고 이렇게 얻어진 단백질을 10% SDS-PAGE를 실시하였다.

4-3: 결과

GmIMT 및 GmOEP cDNA가 삽입된 BL21를 IPTG 유도 방법을 이용해서 4 시간 동안 대량 배양한 후 초음파 분쇄기를 이용하여 세포를 분해하고 용출 된 총 단백질을 추출하고, 발현된 GmIMT 및 GmOEP를 얻기 위해 His-bind purification system을 사용하여 GmIMT 및 GmOEP를 분리하고, 10% SDS-PAGE로 분리하여 분자량을 확인한 결과, GmIMT의 분자량은 약 41,000 임을 확인하였고 GmOEP의 분자량은 대략 40,000 임을 확인하였다(도 4 및 도 5). 더 정확한 분자량을 알기위해 ExPASy에서 제공하는 compute pi/Mw tool을 이용해서 실제 계산된 분자량은 GmIMT는 41,500이었고 GmOEP는 40,499이었다.

실시예 5: GmIMT 및 GmOEP의 가스크로마토그래피-불꽃이온화검출기 (Gas chromatography Flame Ionization Detector, GC-FID)를 이용한 기질 특이성 및 활성 확인

5-1: GmIMT 및 GmOEP 반응 샘플의 준비

GmIMT 및 GmOEP cDNA로 형질전환된 균주 E. coli BL21을 각각 1L 플라스크에서 500 ml 배양한 후 4 시간 동안 IPTG에 의해 유도하고, 10,000 g로 원심분리하여 침전된 세포를 얻었다. 여기에 추출 완충액(extract buffer)[100 mM Tris-HCl (pH7.9), 10 mM EDAT]를 첨가하고 초음파분쇄기를 사용하여 1 분 동안 40% 파장세기로 세포를 분쇄시킨 후 다시 12,000 g로 원심분리 하여 용해성 단백질을 추출하였다. 추출한 GmIMT 용해성 단백질에는 샘플 완충액(sample buffer)[100 mM Tris-HCl (pH7.9), 10 mM MgCl₂]과 기질인 미오-이노시톨(myo-inositol), 조효소인 SAM 1 mM을 혼합하고 GmOEP 용해성 단백질은 샘플 완충액 [100 mM Tris-HCl (pH7.9), 10 mM MgCl₂]과 기질인 오노니톨(ononitol)을 혼합하여 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 기질을 제외한 대조군과 각각의 샘플을 캡바이얼(cap vial)로 옮겨 N₂ GAS 증발기를 사용하여 수분을 모두 제거하였고 잔여 수분을 완전히 제거하기 위하여 P₂O₅(phosphorus pentoxide)가 담긴 데시케이터(desiccator)에서 나머지 수분을 증발시켰다. 이후 트리메틸실릴이미다졸(trimethylsilylimidazole) : 피리딘(pyridine) 혼합액(1:1, v/v) 200 ㎕를 처리하고 70 ℃ 가열블록(heating block)에서 30 분간 반응시켰다.

5-2: 가스 크로마토그래피(Gas chromatography)

준비된 반응 샘플을 가스 크로마토그래프피를 사용하여 분석하였다. 가스 크로마토그래피에 사용된 컬럼은 HP-1 캐필러리 컬럼(capillary column) (30 M length, 0.25 ㎜ ID, 0.25 ㎛ film thickness)를 사용하였으며 스플릿 모드 인젝터(split mode injector)(1:50)에 반응 샘플 1 ㎕를 주입하였다. 가스 크로마토그래피의 초기온도는 150 ℃에서 2 분 유지시킨 후 20℃/min의 속도로 300 ℃ 까지 15 분간 온도 상승시킨 후 30 ℃ 2 분간 유지시켰다(Chiera et al.,2006). 인젝터의 온도는 280 ℃, 디텍터(detector)의 온도는 300 ℃에서 수행하였다.

5-3: 결과

효소로써의 활성을 확인하기 위해 GmIMT를 E. coli에 도입하여 대량 발현시키고 효소 반응 후 GC-FID을 이용하여 생산된 물질이 오노니톨(ononitol)임을 확인하였다. GmIMT는 미오-이노시톨(myo-inositol)을 기질로 사용하여 오노니톨을 생산하는 특징을 나타내었다. GmIMT는 기질로 미오-이노시톨을 사용하기 때문에 기 질과 결과물에 대한 보유 시간(retention time)을 먼저 알기 위해 GC-FID를 수행하였다. 1 mM 미오-이노시톨과 1 mM 오노니톨을 집적한 결과 미오-이노시톨은 보유시간이 약 8.635로 측정되었고 오노니톨은 보유시간이 약 7.797로 측정 되었다(도 6). 이후 GmIMT의 기질 특이성과 효소로써의 활성을 확인하기 위해 기질과 조효소 그리고 빈 벡터를 혼합한 대조군과, 기질과 조효소 그리고 대두에서 분리한 GmIMT를 혼합한 실험군을 약 1 시간 동안 반응 시킨 후 GC-FID를 통해서 다시 확인하였다. 대조군에서는 기질인 미오-이노시톨만 측정 되었을 뿐 결과물인 오노니톨이 측정되지 않았지만 GmIMT가 삽입된 실험군에서는 결과물인 오노니톨이 측정되었다. 이로써 대두에서 분리된 GmIMT의 기질이 미오-이노시톨임을 확인하였고 조효소로써 SAM이 필요한 것도 확인 하였다(도 7).

GmOEP는 기질로 오노니톨을 사용하여 피니톨을 생성시키기 때문에 가스-크로마토그래피(gas-chromatography)를 이용하여 GmOEP의 활성을 확인하였다. 기질과 결과물에 대한 보유시간을 GC-FID로 측정하였다. 1 mM 오노니톨과 1 mM 피니톨을 집적한 결과 오노니톨은 보유시간이 7.797로 측정되었고, 피니톨은 보유시간이 6.508로 측정 되었다(도 8). 이후 GmOEP의 기질 특이성 및 효소로써의 활성을 확인하기 위해 기질과 빈 벡터를 혼합한 대조군과, 기질과 GmOEP를 혼합한 실험군을 약 1 시간 반응시킨 후 GC-FID를 통해서 다시 확인하였다. 대조군에서는 기질인 오노니톨은 측정되었지만 결과물인 피니톨은 측정되지 않았고, 실험군에서는 결과물인 기질과 더불어 결과물인 피니톨이 생성되었다. 기질인 오노니톨을 사용한 만큼 피니톨이 합성되는 것으로 미루어 GmOEP의 활성이 상당히 높은 것으로 판단되었 다(도 9). 실험결과 대두에서 분리된 GmOEP는 NAD⁺ 의존성 에피머라아제(NAD⁺ dependent epimerase)로써의 효소 기능을 수행하였다.

실시예 6: 애기장대( Arabidopsis thalinana ) 형질전환

6-1: GmIMT 및 GmOEP cDNA를 Ti-플라스미드(pPZP211-Ex)바이너리 벡터(binary vector)에 클로닝

Ti-플라스미드의 MCS에 존재하는 제한효소 부위에 GmIMT 및 GmOEP cDNA를 클로닝하기 위해서 GmIMT 및 GmOEP cDNA의 전체 서열을 기초로, KpnⅠ자리를 포함하는 프라이머와 XbaⅠ자리를 포함하는 프라이머를 제작하고 PCR을 사용하여 GmIMT 및 GmOEP의 cDNA를 증폭한 후 T-벡터에 클로닝하였다. 이후 KpnⅠ과 XbaⅠ으로 절단하여 유전자를 분리하고 KpnI 과 XbaⅠ으로 잘라 낸 Ti-플라스미드에 삽입하였다.

[표 2]

GmIMT	프라이머 서열
Kpn I 자리가 포함된 프라이머	5＇-GGT ACC ATG GAG ACT GTT CTT TTC-3＇
Xba I 자리가 포함된 프라이머	5＇-TCT AGA TCA GAT TGG AAA CGC CTC-3
GmOEP
KpnI 자리가 포함된 프라이머	5＇-GGT ACC ATG CGC GAC AAG ACT GTG- 3＇
XbaI 자리가 포함된 프라이머	5＇-TCT AGA CTA AAC GGT GGA ATC CTC- 3＇

6-2: 아그로박테리움( Agrobacterium) 컴피턴트 세포의 제조

YEP 배지 2 ㎖에 아그로박테리움(Agrobacterium)을 접종하고 28℃ 에서 20 시간 동안 키운 후 50 ㎖ YEP를 더 첨가하여 O.D₆₀₀ 값이 0.6-1.0이 될 때까지 28℃ 에서 250 rpm으로 흔들면서 배양하였다. 배양한 아그로박테리움을 4,000 rpm 으로 5 분간 원심분리하고 상등액을 제거한 후 150 mM NaCl을 처리하여 천천히 흔들어 주면서 녹였다. 이것을 10 분간 얼음에 두었다가 5,000 rpm으로 5 분간 원심분리 하였다. 침전된 아그로박테리움에 차가운 20 mM CaCl₂을 처리한 후 멸균된 에펜도르프-튜브(eppendorf-tupe)에 100 ㎕씩 분주하여 -70℃에 보관하였다.

6-3: 클로닝된 Ti 플라스미드를 아그로박테리움에 도입

GmIMT 및 GmOEP cDNA가 삽입된 Ti-플라스미드를 아그로박테리움에 도입하기 위해서 -70℃에서 보관하고 있던 컴피턴트 세포에 클로닝된 Ti-플라스미드 1 ㎕를 섞고 액체 질소에 넣어 2 분간 급속냉동 시킨 후 37℃ 에서 5 분간 녹였다. 이 과정을 1 번 더 시행한 후 얼음에 30 분간 넣어 두었다. 여기에 YEP 배지 1 ㎖을 넣고 28℃ 에서 3 시간 동안 배양한 후 3,000 rpm 에서 1 분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 침전된 균주에 YEP 배지 100 ㎕를 첨가해서 현탁시키고 스펙티노마이신(spectinomycin) (50 ㎍/㎖)이 첨가된 YEP 아가 플레이트(agar plate)에 도말하여 28℃에서 2 일간 키웠다.

6-4: 아그로박테리움 침윤 시스템을 이용한 애기장대( Arabidopsis )의 형질전환

형질 전환된 아그로박테리움(Agrobacterium)을 스펙티노마이신이 첨가된 YEP 배지 5 ㎖에 접종하여 28℃ 에서 2 일간 배양한 후, 1L YEP 배지에 1 ㎖을 옮겨 O.D₆₀₀ 값이 0.8이 될 때까지 배양하였다. 배양한 균주를 5,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후 침윤 배지(infiltration media)를 첨가하여 침전된 균주를 현탁시켰다. 여기에 정상조건에서 3주 정도 자란 야생형 애기장대를 10분 정도 담군 후에 꺼내어 하루 동안 비닐을 씌워두고 3-4 주 후에 충분히 익은 종자를 받았다. 이 종자를 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 Gamborg B5 배지에서 키워 형질전환체를 선별하였고 멸균된 토양으로 옮겨 심어 키운 후 종자를 받았다.

6-5: GmIMT 및 GmOEP cDNA가 삽입된 형질전환 애기장대( Arabidopsis )의 비-생물학적 스트레스(abiotic stress)상태에서 발아율(germination rate) 확인

GmIMT 및 GmOEP cDNA가 삽입된 형질 전환된 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 받은 T₃ 세대(T₃ generation) 종자와 야생형 애기장대(Arabidopsis thaliana) 종자를 암 상태 4℃에서 24 시간 흡입(imbibition)시켰다. 플레이트에 3M 필터를 첨가한 후 종자들이 충분히 발아될 수 있도록 물로 충분히 적시고 흡입된 야생형 종자와 형절전환된 종자를 플레이트상에 전개하였다. 각각을 저온 스트레스로서 4℃, 가뭄 스트레스로서 10% PEG 6000, 염 스트레스로서 100 mM NaCl을 처리하여 스트레스 상태에서의 발아 상태를 확인하였다.

6-6: GmIMT 및 GmOEP cDNA가 삽입된 형질전환된 애기장대( Arabidopsis )의 비-생물학적 스트레스에 대한 표현형 관찰

형질전환된 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 받은 T₃ 세대(T₃ generation) 종자와 야생형 애기장대 종자를 70% 에탄올로 소독한 후 카나마이신(kanamycin) (50 ㎍/㎖), MES 모노하이드레이트(0.5 g/L), 수크로오스(20 g/L)가 첨가된 Gambrog B5 배지에 치상하였다. 이를 식물 배양기에서 온도 22℃, 습도 80%의 조건으로 1 주일간 성장시켰다. 성장된 유식물을 스트레스 처리하기 위해 염스트레스가 처리된 100 mM NaCl₂ 첨가된 Gambrog B5 배지와 가뭄 스트레스가 처리된 10% PEG 6000가 첨가된 플레이트에서 옮긴 후 지속적으로 성장시켜 야생형과 GmIMT 및 GmOEP cDNA가 발현된 형질전환체의 표현형을 관찰하였다.

6-7: 삼투스트레스(Osmotic stress)에 따른 GmIMT 및 GmOEP cDNA가 삽입된 형질전환체와 야생형의 발아율(germination) 확인

정상적인 조건에서 야생형 애기장대 종자와 GmIMT 과발현 애기장대 종자가 발아되는 최종 비율은 같으나, GmIMT-OX 종자가 2 일 안에 발아되는 모습을 보이고 있으며 여러 스트레스 상태에서도 야생형 종자보다 약간 상회한 발아율을 보였다. 하지만 가뭄 스트레스가 처리된 상태에는 GmIMT-OX 종자가 야생형 종자보다 빨리 발아되는 모습과 동시에 높은 발아율을 보였다(도 10). GmOEP-OX 종자도 일반적인 조건일 때는 야생형 종자와 거의 같은 모습으로 발아되는 모습을 보였다. 여러 스트레스가 처리된 후에도 특징적으로 강하게 저항성이 나타나 발아율이 높지는 않았지만 저온 스트레스와 염 스트레스가 처리된 상태에서 야생형 종자보다 높은 발 아율을 보였다(도 11).

6-8: 삼투스트레스에 따른 GmIMT 및 GmOEP cDNA가 삽입된 애기장대 형질전환체의 표현형 관찰

오노니톨과 피니톨이 많이 함유된 식물체들은 비-생물학적 스트레스에 의해서 높은 저항성을 갖게 된다(McManus et al., 2000; Rathinasabapathi, 2000; Yoshida, 2002). 형질전환된 GmIMT-OX 애기장대와 GmOEP-OX 애기장대를 살펴보면 가뭄 스트레스와 염 스트레스 시에 삼투 보호물질 역할을 하는 오노니톨과 피니톨이 축적되어 저항성이 증가하는 모습을 보였다. 100 mM NaCl 처리된 염 스트레스에 대해 살펴 보면 야생형 애기장대는 2 일부터 탈색이 시작되어 죽어가고 있는 모습이 보이며 3 일이 지난 후에는 완전히 탈색 되었지만 GmIMT-OX 애기장대는 3 일이 되어서 조금씩 탈색이 시작되며 4 일이 지난 후에도 완전히 탈색되지 않는 모습을 보여 GmIMT-OX는 염 스트레스에 대한 저항성이 증가된 것을 알 수 있었고 GmOEP-OX 애기장대도 야생형 애기장대 보다 늦게 탈색되는 현상이 일어나 저항성이 증가된 모습을 볼 수 있으며 표현형으로 보면 오히려 GmIMT-OX 보다 탈색의 정도가 약한 것으로 보아서는 저항성이 높다고 볼 수 있었다.

가뭄 스트레스 상태는 성장배지가 아닌 수분에 10% PEG 첨가하여 측정하였다. GmIMT-OX 식물체와 GmOEP-OX 식물체는 10% PEG가 처리된 가뭄 스트레스에 저항하고자 GmIMT-OX 식물체는 오노니톨을 생성하고 축적하여 체내 존재하는 효소들과 막에 대한 손상을 최소한 적게 하고(Nelson et al., 1998), GmOEP-OX 식물체는 피니톨을 축적하여 수분의 이탈을 방지함으로써 식물체 스스로를 보호하지만 야생형 식물체는 대부분이 스트레스에 의한 피해에 저항성을 갖지 못하고 죽어가는 모습을 보여주었다. GmIMT-OX가 야생형 보다는 형태를 많이 유지하고 있는 것을 볼 수 있으며 GmOEP-OX도 충분히 가뭄 스트레스에 대한 저항성이 증가한 모습을 보여주었다.

실시예 7: 이스트 형질전환(Yeast Transformation)

7-1: GmIMT 및 GmOEP cDNA를 pRS423과 pRS426 벡터에 클로닝

GmIMT 및 GmOEP cDNA를 이스트 셔틀 벡터(yeast shuttle vector)인 pRS423 벡터(His^-)와 pRS426 벡터(Ura^-) 각각에 MCS(multiple cloning site) 부위에 클로닝하였다. 먼저, GmIMT 및 GmOEP 전체 염기서열에 기초하여, Spe I 제한효소 자리를 포함하는 프라이머와 XhoⅠ제한효소 자리를 포함하는 프라이머를 제작하고 PCR을 사용하여 GmIMT 및 GmOEP cDNA를 증폭한 후 T-벡터에 클로닝하였다. 이후, 각각 클로닝된 GmIMT 및 GmOEP cDNA를 Spe I과 XhoⅠ으로 절단하여 인서트(insert)를 용출시키고, GmIMT는 pRS423 벡터에 삽입하기 위해 pRS423 벡터를 Spe I과 XhoⅠ제한효소로 처리하고 GmOEP는 pRS426 벡터에 삽입하기 위해 pRS426 벡터를 Spe I과 XhoⅠ제한효소로 처리하였다. 이어서, GmIMT 및 GmOEP를 각각 pRS423 및 pRS426 벡터에 라이게이션하여 삽입하였다.

[표 3]

GmIMT	프라이머 서열
Spe I 자리가 포함된 프라이머	5＇-ACT AGT ATG ACT GTT CTT TTC AAT-3＇
Xho I 자리가 포함된 프라이머	5＇-CTC GAG TCA GAT TGG AAA CGC CTC-3＇
GmOEP
Spe I 자리가 포함된 프라이머	5＇-ACT AGT ATG CGC GAC AAG ACT GTG- 3＇
Xho I 자리가 포함된 프라이머	5＇-CTC GAG CTA AAC GGT GGA ATC CTC- 3＇

7-2: 이스트 컴피턴트 세포(Yeast competent cell) 제조

YPD 액체배지(20 ml)에 이스트(yeast) 균주 단일 콜로니(single colony)를 접종하여 30 ℃에서 16-18 시간 동안 성장시켰다. 이후 성장된 이스트 균주 10 ml을 200 ml YPD 액체배지에 옮긴 후 O.D₆₀₀ = 0.2 - 0.3 이 될 때까지 30℃에서 성장시켰다. 4℃, 3000 rpm에서 배양된 이스트를 원심분리하여 상등액을 버리고 멸균수에 전부 녹인 후 다시 한번 원심분리하여 배지를 씻어내는 과정을 2 번 반복하였다. 마지막으로 원심분리 하여 멸균수를 전부 제거한 후 1.5 ml 1X TE/LiAc를 첨가하여 녹였다.

7-3: GmIMT 및 GmOEP cDNA가 클로닝된 pRS423과 pRS426 벡터를 이스트에 형질전환

제조한 L3262 이스트 컴피턴트 세포와 미오-이노시톨(myo-inositol)이 다량 존재하는 돌연변이 YHL020C [(ATCC number : 4010943, 구입처 : ATCC (www.atcc.org )] 이스트 컴피턴트 세포를 준비하고 PEG/LiAc 용액 (50 % PEG, 10X TE, 10X LiAc)을 준비하고 클로닝한 GmIMT 삽입된 pRS423 벡터와 GmOEP 삽입된 pRS426 벡터의 샘플을 각각 10 ㎕씩 하나의 1.5 ml 에펜도르프 튜브(e-tube)에 넣 었다. 미리 준비된 이스트 컴피턴트 세포 100 ㎕ 첨가한 뒤 잘 혼합시켰다. 이후 600 ㎕의 PEG/LiAc 용액을 첨가하고 흔들어 혼합하였다. 3℃ 200 rpm에서 30 분간 성장시킨 후 100% DMSO 70 ㎕ 첨가한 뒤 조심스럽게 흔들어 42℃에서 15 분간 열 충격을 가하였다. 이어서 바로 얼음에서 15 분간 식힌 후 원심 분리하여 상등액을 제거하고 1X TE 완충액 0.5 ml 첨가하여 잘 녹인 후 SD (His^-, Ura^-) 배지에 250 ㎕를 도말하였다.

7-4: 결과

피니톨을 대량 생산하기 위해 이스트 형질전환체(yeast transformant)를 제조하였다. GmIMT 및 GmOEP를 동시에 이스트에 삽입하기 위해서, 우선 GmIMT 및 GmOEP cDNA의 제한 효소 부분을 변화시켜 T-벡터에 클로닝하였고, 이를 분리하여 이스트 셔틀벡터인 pRS423 벡터(His^-)에 GmIMT를 클로닝하였고, pRS426 벡터(Ura^-)에는 GmOEP를 클로닝하였다(도 12). 또한 두 가지 종류의 이스트 균주에 GmIMT 및 GmOEP를 도입하였는데 첫 번째는 미오-이노시톨이 다량 합성되지 않는 일반 이스트 변이체 Yc3262 균주에 도입 하였고, 두 번째는 미오-이노시톨이 다량으로 합성되는 이스트 변이체인 Yhl020C에 도입하여 형질전환체를 만들었다.

실시예 8: GC-FID를 이용한 형질전환된 이스트의 효소활성 확인

8-1: GmIMT 및 GmOEP cDNA를 발현 가능한 형태로 도입된 이스트 샘플 제조

L3262 (Yc3262) 이스트 균주와 미오-이노시톨이 다량 존재하는 변이체 Yhl020C 이스트 균주에 GmIMT 및 GmOEP cDNA가 발현 가능한 형태로 도입된 균주 콜로니(colony)를 선택하여 SD 배지(His^-, Ura^-) 1L 플라스크에서 500 ml 24 시간 동안 성장시켰다. 10,000g로 원심분리하여 침전된 세포를 얻었고 여기에 추출 완충액 [100 mM Tris-HCl (pH7.9), 10 mM EDAT]를 첨가하고 100℃ 30 분 간 중탕 가열하여 이스트를 최대한 약하게 한 후 투니크아제(tunicase) 1-2%를 첨가하여 180rpm 30℃에서 2 일간 반응시키면서 세포벽을 분해시켰다. 광학현미경을 통해서 세포벽의 분해가 충분히 이루어졌는지 확인하였고, 12,000 g로 원심분리하여 상등액을 추출하였다. 이후 필터를 통해 단백질을 제거하고 형질전환되지 않은 대조구와 실험군의 샘플을 캡 바이얼(cap vial)로 옮겨 N₂ GAS 증발기를 사용하여 수분을 모두 제거하였다. 이어서, 잔여 수분을 완전히 제거하기 위해 P₂O₅ (phosphorus pentoxide)가 담긴 데시케이터(desiccator)에서 나머지 수분을 증발시켰다. 이후 트리메틸실릴이미다졸(trimethylsilylimidazole) : 피리딘(pyridine) (1:1, v/v)의 혼합물 200 ㎕를 처리하고 70℃ 가열 블록에서 30 분간 반응시켰다.

8-2: 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography)

준비된 각각의 이스트 반응 샘플을 가스 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. 가스 크로마토그래피에 사용된 컬럼은 HP-1 모세관 컬럼(30 M length, 0.25 ㎜ ID, 0.25 ㎛ film thickness)를 사용하였으며 스플릿 모드 인젝터(split mode injector)(1 : 50)에 반응 샘플 1 ㎕를 주입하였다. 가스 크로마토그래피의 초기 온도는 150℃에서 2 분 유지시킨 후 20℃/min의 속도로 300℃까지 15 분간 온도 상승 후 300℃ 2 분간 유지시켰다. 인젝터(injector)의 온도는 280℃, 디텍터(detector)의 온도는 300℃에서 수행하였다.

8-3: Yc3262 이스트에 대한 가스 크로마토그래피 결과

GmIMT에 의해 생성된 오노니톨을 기질로 사용하여 GmOEP가 피니톨을 생성하는지 이스트 형질전환체를 만들어 확인하였다. GC-FID를 사용하여 효소의 활성을 확인하였고 이스트에 GmIMT와 GmOEP를 동시에 도입함으로써 상호간의 연계과정을 확인하였다. GmIMT와 GmOEP가 발현가능한 형태로 도입된 Yc3262 이스트를 24 시간 동안 대량 배양한 후 열처리 및 투니크아제(tunicase)를 이용하여 세포벽을 제거하고 용출된 단백질을 제거한 후에 GmIMT와 GmOEP에 의해 생성된 물질을 GC-FID를 이용하여 확인하였다. 빈 벡터를 삽입한 이스트에서는 아무 생성물도 측정되지 않았지만 GmIMT와 GmOEP가 삽입된 이스트에서는 오노니톨과 피니톨이 생성된 것을 볼 수 있었다(도 13). 이는 GmIMT에 의해서 생성된 오노니톨을 GmOEP가 기질로 이용하여 피니톨을 생성한 것으로 볼 수 있었다. 피니톨 생성량이 적은 이유는 이스트내에 미오-이노시톨이 소량으로 존재하기 때문인 것으로 사료되었다.

8-4: Yc3262 이스트에 대한 가스 크로마토그래피 결과

GmIMT의 기질인 미오-이노시톨이 다량 존재하는 Yhl020C 이스트에 GmIMT 및 GmOEP의 cDNA를 발현가능한 형태로 도입시켜 만든 형질 전환체를 24 시간 동안 대량 배양한 후 열 처리 및 투니크아제(tunicase)를 이용하여 이스트의 세포벽을 제거하고 용출된 단백질을 제거한 후에 GmIMT와 GmOEP에 의해서 생성된 물질을 GC-FID를 이용하여 측정하였다. GmIMT 및 GmOEP가 도입된 이스트에서 오노니톨과 다량의 피니톨이 생성되었다(도 14). 빈 벡터가 삽입된 이스트에서는 특이 물질이 측정되지 않았지만 GmIMT 및 GmOEP가 도입된 이스트에서는 다량의 피니톨이 생성된 것을 볼 수 있었다(도 14). 이은 다량의 미오-이노시톨이 GmIMT의 기질로 공급되면서 오노니톨이 다량 생성되고, 다시 이를 GmOEP가 기질로 사용함으로써 다량의 피니톨이 생성되었다고 볼 수 있었다. 또한, 이는 GmIMT와 GmOEP의 상호 연결된 활성에 의해 미오-이노시톨로부터 피니톨이 생성될 수 있음을 확인한 중요한 결과이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 미오-이노시톨(myo-inositol)로부터 D-카이로-이노시톨(D-chiro-inositol)을 거쳐 D-피니톨(D-pinitol)로 생전환시키는 과정을 보여주는 도면이다.

도 2는 GmIMT cDNA 뉴클레오타이드 서열 및 이로부터 추정된 아미노산 서열을 보여준다.

도 3은 GmOEP cDNA 뉴클레오타이드 서열 및 이로부터 추정된 아미노산 서열을 보여준다.

도 4는 E.coli에서 GmIMT의 cDNA 발현을 확인한 결과이다. 패널 1에서, M : 분자 사이즈 마커; lane 1, 3, 5, 7 : 벡터만, lane 2 : 2 hr incubation after IPTG 유도 후 2 시간 배양; lane 4 : IPTG 유도 후 4 시간 배양; lane 6 : IPTG 유도 후 6시간 배양; lane 8 : IPTG 유도 후 8시간 배양; lane 9 : IPTG 유도 후 밤샘 배양. 패널 2에서, M : 분자 사이즈 마커; lane 1 : IPTG 유도 전; lane 2 : IPTG 유도 후; lane 3 : 5 mM 이미다졸 컬럼 세정(run-through); lane 4 : 정제된 GmIMT (500 mM 이미다졸 용출 샘플)

도 5는 E.coli에서 GmOEP의 cDNA 발현을 확인한 결과이다. 패널 1에서 M : 단백질 마커; lane 2, 4, 6 : 벡터만 트랜스펙션 시킨 형질전환체; lane 1 : IPTG 유도 후 2 시간 배양; lane 3 : IPTG 유도 후 4 시간 배양; lane 5 : IPTG 유도 후 6 시간 배양. 패널 2에서 M : 단백질 마커; lane 1 : 정제된 GmOEP; lane 2 : 80 mM 이미다졸 컬럼 세정 (washing sample); lane 3 : 5 mM 이미다졸 컬럼 세정(run-through); lane 4 : 추정 GmOEP를 발현하는 E. coli로부터의 조추출물; lane 5 : pET15b만을 발현하는 E. coli로부터의 조추출물.

도 6은 GC-FID에 의한 미오-이노시톨 및 오노니톨의 분석 결과이다. 패널 1에서 미오-이노시톨의 보유시간(retention time)이 8.635이고, 오노니톨의 보유시간은 7.797이다.

도 7은 GmIMT에 의한 반응물의 분석결과를 보여준다. 패널 1은 대조군 (빈 벡터 + SAM + 이노시톨)이고, 패널 2는 샘플(GmIMT + SAM + 이노시톨, 생성물 오노니톨 피크는 7.567이다)

도 8은 GC-FID에 의한 오노니톨 및 피니톨의 분석결과를 보여준다. 패널 1은 오노니톨 보유시간이 7.797이고, 패널 2는 피니톨의 보유시간이 6.508인 것을 보여준다.

도 9는 GmOEP에 의한 반응생성물의 분석결과를 보여준다. 패널 1은 대조군(빈 벡터 + 오노니톨)을 보여주고, 패널 2는 샘플(GmOEP + 오노니톨, 생성물 피니톨 피크 6.433이다)

도 10은 GmIMT 과발현된 애기장대의 발아율을 보여주는 도면이다.

도 11은 GmOEP 과발현된 애기장대의 발아율을 보여주는 도면이다.

도 12는 GmIMT 및 GmOEP의 cDNA를 이스트 셔틀 벡터인 pRS423 및 pRS426안으로 클로닝하는 것을 보여주는 도면이다.

도 13은 GmIMT 및 GmOEP cDNA를 이스트안으로 형질전환한 후에 미오-이노시톨, 오노니톨, 피니톨의 양을 측정한 결과이다. 패널 1은 Yc3262 이스트 + 빈 텍 터이고, 패널 2는 Yc3262 이스트 + GmIMT 및 GmOEP이다.

도 14는 GmIMT 및 GmOEP의 cDNA를 이스트안으로 형질전환시킨 후에 미오-이노시톨, 오노니톨 및 피니톨의 양을 측정한 결과이다. 패널 1은 Yhl020c 이스트 + 빈 벡터이고, 패널 2는 Yhl020c + GmIMT 및 GmOEP이다.

<110> University-Industry Cooperation Foundation University Suwon Solgent co., Ltd. <120> Method for Producing D-pinitol Using Transformant Transformed with Vector Comprising Nucleotide Sequence Encoding myo-Inositol Methyltransferase and Ononitol Epimerase <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 370 <212> PRT <213> Glycine max <400> 1 Met Glu Thr Val Leu Phe Asn His Ser Pro Pro Leu Glu Phe Lys Gly 1 5 10 15 Leu Ser Lys Glu Glu Glu Asp Ser Leu Leu Gly Gln Val Glu Ile Trp 20 25 30 Arg Tyr Met Thr Cys Phe Thr Asp Ser Val Ala Leu Lys Ala Val Ile 35 40 45 Glu Leu Arg Ile Ala Asp Ile Leu Asp Arg Tyr Gly Lys Pro Leu Ser 50 55 60 Leu Ser Gln Ile Val Glu Asn Ile Glu Asp Ala Pro Ser Pro Asp Ala 65 70 75 80 Ser Leu Leu Gln Arg Val Leu Arg Val Met Val Arg Arg Lys Ile Phe 85 90 95 Ser Ala Gln Glu Ser Glu Thr Gly Glu Thr Leu Phe Gly Leu Thr Arg 100 105 110 Ala Ser Lys Trp Ile Leu Arg Asp Thr Lys Met Thr Leu Ala Pro Met 115 120 125 Leu Leu Leu Glu Asn His Pro Ile His Leu Asn Pro Ala His Tyr Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Ile Arg Glu Gly Thr Lys Asn Gly Thr Ala Phe Phe Lys 145 150 155 160 Cys His Gly His Glu Gln Phe Glu Met Thr Gly Leu Asp Pro Glu Tyr 165 170 175 Asn Arg Leu Phe Asn Glu Gly Met Val Cys Thr Ala Arg Val Val Ser 180 185 190 Lys Ala Val Ile Thr Gly Tyr Lys Asp Gly Phe Asn Gln Ile Lys Ser 195 200 205 Leu Val Asp Val Gly Gly Gly Ile Gly Gly Ser Leu Ser Glu Ile Val 210 215 220 Arg Ala Tyr Pro His Ile Asn Ala Ile Asn Phe Asp Leu Pro His Val 225 230 235 240 Val Ala Thr Ala Pro Lys Phe Asp Gly Ile Thr His Val Gly Gly Asp 245 250 255 Met Phe Val Ser Ile Pro Ser Ala Asp Ala Ile Tyr Met Lys Trp Ile 260 265 270 Leu His Asp Trp Ser Asp Glu His Cys Ile Lys Ile Leu Lys Asn Cys 275 280 285 Arg Lys Ala Ile Pro Glu Lys Thr Gly Lys Val Ile Ile Val Asp His 290 295 300 Val Leu Arg Pro Glu Gly Asn Glu Leu Phe Thr Asp Val Gly Ile Ala 305 310 315 320 Phe Asp Met Met Leu Leu Ala His Asn Ala Gly Gly Lys Glu Arg Thr 325 330 335 Glu Glu Asn Trp Lys Trp Leu Phe Lys Glu Thr Gly Phe Ala Arg Tyr 340 345 350 Asn Ile Ile Lys Ile Asn Ala Leu Pro Ser Ile Ile Glu Ala Phe Pro 355 360 365 Ile Glx 370 <210> 2 <211> 351 <212> PRT <213> Glycine max <400> 2 Met Arg Asp Lys Thr Val Leu Val Thr Gly Gly Ala Gly Tyr Ile Gly 1 5 10 15 Thr His Thr Val Leu Gln Leu Leu Leu Gly Gly Cys Arg Thr Val Val 20 25 30 Val Asp Asn Leu Asp Asn Ser Ser Glu Val Ser Ile His Arg Val Arg 35 40 45 Glu Leu Ala Gly Glu Phe Gly Asn Asn Leu Ser Phe His Lys Val Asp 50 55 60 Leu Arg Asp Arg Asp Ala Leu Glu Gln Ile Phe Val Ser Thr Gln Phe 65 70 75 80 Asp Ala Val Ile His Phe Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu Ser Val 85 90 95 Gln Lys Pro Leu Leu Tyr Tyr Asn Asn Asn Leu Thr Gly Thr Ile Thr 100 105 110 Leu Leu Glu Val Met Ala Ala His Gly Cys Lys Lys Leu Val Phe Ser 115 120 125 Ser Ser Ala Thr Val Tyr Gly Trp Pro Lys Glu Val Pro Cys Thr Glu 130 135 140 Glu Phe Pro Leu Ser Ala Met Asn Pro Tyr Gly Arg Thr Lys Leu Ile 145 150 155 160 Ile Glu Glu Ile Cys Arg Asp Val His Arg Ala Glu Pro Asp Trp Lys 165 170 175 Ile Ile Leu Leu Arg Tyr Phe Asn Pro Val Gly Ala His Pro Ser Gly 180 185 190 Cys Ile Gly Glu Asp Pro Arg Gly Ile Pro Asn Asn Leu Met Pro Phe 195 200 205 Val Gln Gln Val Ala Val Gly Arg Arg Pro Ala Leu Thr Val Phe Gly 210 215 220 Asn Asp Tyr Asn Thr Thr Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp Tyr Ile His 225 230 235 240 Val Val Asp Leu Ala Asp Gly His Ile Ala Ala Leu Leu Lys Leu Asp 245 250 255 Asp Pro Asn Ile Gly Cys Glu Val Tyr Asn Leu Gly Thr Gly Lys Gly 260 265 270 Thr Ser Val Leu Glu Met Val Arg Ala Phe Glu Met Ala Ser Gly Lys 275 280 285 Lys Ile Pro Leu Val Met Ala Gly Arg Arg Pro Gly Asp Ala Glu Ile 290 295 300 Val Tyr Ala Ser Thr Lys Lys Ala Glu Arg Glu Leu Lys Trp Lys Ala 305 310 315 320 Lys Tyr Gly Ile Asp Glu Met Cys Arg Asp Gln Trp Asn Trp Ala Ser 325 330 335 Lys Asn Pro Tyr Gly Tyr Gly Asp Gln Glu Asp Ser Thr Val Glx 340 345 350 <210> 3 <211> 1110 <212> DNA <213> Glycine max <400> 3 atggagactg ttcttttcaa tcactcccca cctttggaat tcaagggttt gagcaaggag 60 gaggaagact cattgctagg gcaagtggaa atatggaggt acatgacatg cttcacggac 120 tccgtggcct tgaaagctgt catagagctt cgtatagcgg acatactaga ccgttatggt 180 aaaccactat ccttgtcgca aattgtggag aacatagaag acgcaccctc cccagatgcc 240 tctcttctcc agagagtcct gagagtgatg gtgcgcagaa agatcttcag tgcacaagaa 300 tcagagacag gagaaaccct cttcggcttg acacgagcct cgaagtggat ccttcgcgac 360 acgaaaatga ccctagcacc catgttgctg ctggagaacc acccaattca cctgaaccct 420 gcgcactaca tcagtgagat tattagagaa ggcacaaaaa atggcactgc tttctttaag 480 tgccatggac atgagcaatt tgagatgacg ggtttggatc ctgagtataa taggttgttc 540 aatgagggca tggtgtgcac tgctagggtt gtgtccaagg ctgtgatcac tggctacaaa 600 gatgggttca accagattaa gtccttggtt gatgttggag gtggcattgg agggtctctt 660 tcggagattg ttagggctta tcctcatatc aatgccatca actttgactt gcctcatgtg 720 gttgccactg ctcctaagtt cgatgggatc acccatgttg gaggtgacat gttcgtgtcc 780 attcctagtg ctgatgctat ttacatgaag tggattctgc atgactggag cgacgagcac 840 tgcatcaaga tcttgaagaa ctgcaggaag gcaataccag agaagacagg aaaagtcata 900 atcgtggatc acgttcttcg acccgaaggc aacgaactct tcacagacgt tggcatcgca 960 ttcgacatga tgcttctcgc tcacaacgcc ggtggcaaag agaggaccga agagaactgg 1020 aagtggctgt tcaaggaaac cggtttcgcg cgttacaaca tcatcaagat caacgctctc 1080 ccttccatca ttgaggcgtt tccaatctga 1110 <210> 4 <211> 1053 <212> DNA <213> Glycine max <400> 4 atgcgcgaca agactgtgct ggtaaccggc ggagccggtt acatcggcac ccacaccgtt 60 cttcagctct tgctcggagg ttgcagaacc gtcgtcgtcg acaatctcga caattcctcc 120 gaggtttcta tccaccgagt cagggagctt gccggcgaat ttgggaacaa cctctccttt 180 cacaaggtgg acctacggga cagggatgca ctagagcaaa tttttgtttc cacacaattt 240 gatgctgtca tacactttgc tggactgaaa gcagtaggag aaagtgtgca aaaaccttta 300 ctatactata acaacaactt gactgggaca atcactctat tggaagtcat ggctgcccat 360 ggatgcaaga agctcgtgtt ctcttcttca gcaactgtat atggttggcc aaaggaagtt 420 ccatgcacag aagagttccc tctgtcagca atgaacccat atggacgaac taagcttatc 480 attgaagaaa tttgtcgtga tgtccaccgt gcagagccag attggaaaat aatattgtta 540 agatacttca acccagtcgg tgcacaccct agcggttgta ttggggagga tccccgcgga 600 attccaaaca atctcatgcc atttgttcag caagtagcag ttggccgacg gcctgcactg 660 acagtttttg gaaatgatta taatacaact gatggcactg gggttcggga ttacattcat 720 gttgttgatt tagcagatgg gcacattgct gcgttgctta aactagatga tcctaatata 780 ggttgtgagg tttataacct gggaacagga aagggaacat cagttttgga gatggttcga 840 gcttttgaga tggcatctgg aaagaaaatt ccacttgtga tggctggccg tagacctggt 900 gatgctgaaa ttgtttatgc atcaacaaag aaagcggaaa gagagcttaa atggaaggca 960 aaatatggca ttgatgagat gtgccgcgat caatggaatt gggctagcaa aaacccttat 1020 ggctatggag atcaggagga ttccaccgtt taa 1053 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Glycine max <400> 5 catatggaga ctgttctttt caat 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Glycine max <400> 6 ctcgagtcag attggaaacg cctc 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Glycine max <400> 7 ctcgagatgc gcgacaagac tgtg 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Glycine max <400> 8 gagctcctaa acggtggaat cctc 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Glycine max <400> 9 ggtaccatgg agactgttct tttc 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Glycine max <400> 10 tctagatcag attggaaacg cctc 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Glycine max <400> 11 ggtaccatgc gcgacaagac tgtg 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Glycine max <400> 12 tctagactaa acggtggaat cctc 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Glycine max <400> 13 actagtatga ctgttctttt caat 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Glycine max <400> 14 ctcgagtcag attggaaacg cctc 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Glycine max <400> 15 actagtatgc gcgacaagac tgtg 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Glycine max <400> 16 ctcgagctaa acggtggaat cctc 24

Claims (18)

1. (a) 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제 (myo-inositol methyltransferase) 인코딩 핵산분자 및 상기 핵산분자에 작동적으로 결합된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터; 및 (b) 오노니톨 에피머라아제 (ononitol epimerase) 인코딩 핵산분자 및 상기 핵산분자에 작동적으로 결합된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열의 보존적 치환 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 오노니톨 에피머라아제는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 오노니톨 에피머라아제는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 오노니톨 에피머라아제는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열의 보존적 치환 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 숙주세포는 미오-이노시톨을 과량 생성하는 변이체 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 형질전환체는 박테리아, 이스트, 진균, 동물세포 또는 식물세포인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
10. 다음의 단계를 포함하는 D-피니톨의 제조 방법:

    (a) (i) 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 결합된(operatively linked) 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제(myo-inositol methyltransferase) 인코딩 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터; 및 (ⅱ) 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 결합된(operatively linked) 오노니톨 에피머라아제(ononitol epimerase) 인코딩 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계;

    (b) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및

    (c) 상기 배양된 형질전환체를 회수하여 D-피니톨을 얻는 단계.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제는 서열목록 제 1서열의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 10 항에 있어서, 상기 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 미오-이노시톨 메틸트랜스퍼라아제는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열의 보존적 치환 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 10 항에 있어서, 상기 오노니톨 에피머라아제는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 10 항에 있어서, 상기 오노니톨 에피머라아제는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 오노니톨 에피머라아제는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열의 보존적 치환 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 10 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 숙주세포는 미오-이노시톨을 과량 생성하는 변이체 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 10 항에 있어서, 상기 숙주세포는 박테리아, 이스트, 진균, 동물세포 또는 식물세포인 것을 특징으로 하는 방법.

Images