KR20110009046A

KR20110009046A - 조영제 중의 내독소 제거

Info

Publication number: KR20110009046A
Application number: KR1020100069977A
Authority: KR
Inventors: 구나르 하겔린; 라스 고란 비스트란
Original assignee: 지이 헬스케어 에이에스
Priority date: 2009-07-21
Filing date: 2010-07-20
Publication date: 2011-01-27
Also published as: EP2286887B1; US20110017673A1; ES2378455T3; CN101961498A; PL2286887T3; ATE542582T1; EP2286887A1

Abstract

본 발명은 조영제의 제조, 및 보다 구체적으로 이러한 조영제 중 내독소의 제거에 관한 것이다.

Description

조영제 중의 내독소 제거 {Endotoxin Removal in Contrast Media}

<관련 출원에 대한 교차 참조>

본원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2009년 7월 21일에 출원된 미국 가출원 제61/227,107호를 우선권주장하며, 상기 가출원은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.

<기술분야>

다양한 조영제의 제조에 있어서 일반적인 문제점은 다량의 수용액을 다루는 동안 박테리아 증식에 의해 생성되는 내독소의 존재와 관련된다. 박테리아 자체는 다양한 멸균화 절차에서 용이하게 제거되거나 파괴되나, 내독소는 때로는 무손상 상태로 남는다.

내독소는 다년간 특히 동물에서의 병태생리학적 반응에 대해 공지되고 연구되어 왔다. 다년간 내독소 물질은 그램-음성 간균 세포 내에 함유되고, 세포벽의 붕해시에만 방출되는 것으로 여겨졌다. 따라서, 상기 물질은 내독소라고 지칭된다. 그러나, 최근 연구는 내독소가 그램-음성 간균의 세포 표면에 편재되어 있고, 생존가능한 및 사멸 세포와 함께 뿐만 아니라 액체 배지 내에서 유리 형태로 존재할 수 있는 것으로 제안한다.

내독소는 여러 다양한 병태생리학적 반응을 유발하는 것으로 공지되어 있고, 많은 입원 환자의 직접적이고 기여적인 사망 원인이라고 확인되었다. 내독소는 동물에서 극심한 고열, 혈관확장, 설사의 증상 등, 및 극한 경우 치명적 쇼크와 함께 발열성 반응을 유발하는 것으로 공지되어 있다. 또한, 내독소는 백혈구증가증, 탄수화물 및 단백질 대사의 유해한 변화, 및 섬유소 형성에 의한 광범위한 혈관내 응고를 유발하는 것으로 공지되어 있다.

조영제는 종종 병원 환자에게 다량으로 주사되기 때문에, 조영제는 먼저 내독소 오염에 대해 정제되어야 한다.

용액으로부터의 내독소의 일반적인 제거 방법은 한외여과, 크로마토그래프 수지 및 이온 교환 수지로서 흡착 매트릭스이다. 이들 방법에서는 필터 막힘, 물질의 상당한 손실, 및 어렵고 고가이고 시간 소모적인 후처리와 같은 여러 문제점이 확인되었다.

제US 5972225호에는 출발 수용액에 조영제를 용해시키고, 활성탄을 함유하는 여과 대역을 통해 용액을 통과시키는 것을 포함하는, 벌크 비이온성 요오드화 조영제로부터 내독소를 제거하는 방법이 기재되어 있다.

조영제 중 내독소를 제거하기 위한, 신속하고 비용 효과적인 방법에 대한 필요성이 존재한다. 보다 구체적으로, 조영제의 농도, 상이한 양이온의 함량, 제형의 pH 및 이온 세기에 대한 최소 효과와 함께 약 1 EU/ml 미만의 내독소 값을 제공하는 이러한 방법의 개발에 대한 필요성이 존재한다.

<발명의 요약>

본 발명은 음이온 교환 막에 의한 여과의 사용에 의해 내독소를 제거함으로써 조영제를 정제하는 방법을 제공한다.

그러므로, 한 측면을 고려하여, 본 발명은 음이온 교환 막을 통해 조영제를 통과시키는 것을 포함하는, 조영제로부터 내독소를 제거하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 방법은 수행하기 간단하고, 매우 효율적이고, 제형의 pH 및 다른 파라미터에 대해 거의 영향을 미치지 않는다.

<발명의 상세한 설명>

일반적으로, 조영제의 제조는 화학적 약물 물질의 제조 (일차 제조라고 지칭됨), 이어서 약물 생성물로의 제제화 (이차 제조라고 지칭됨)를 포함한다.

이러한 조영제로부터 내독소를 제거하는 방법이 제공된다. 이와 관련하여, 본원에서 사용되는 용어 "조영제"는 음으로 하전된 이온성 조영제를 제외하고 의료 영상에서 체내의 구조물 또는 액체의 대조를 향상시키기 위해 사용되는 임의의 물질을 의미하는 것으로 의도된다. 조영제는 출발 수용액에 용해된 일차 제조로부터의 약물 물질일 수 있으나, 바람직하게는 조영제는 이차 제조에서의 제제화 후 생성물이다.

선행 기술에 따른 몇몇 내독소 제거 방법에 있어서 중요한 문제점은 정제 방법이 고점도를 갖는 제제화된 조영제를 다룰 수 없다는 것이다. 훨씬 더 중요하게는, 내독소는 또한 조영제의 조성을 변화시키지 않고 제거될 수 없다.

상기 문제점을 해결하고 또한 상기 언급된 기준을 충족시키기 위해, 본 발명은 음이온 교환 막을 통해 조영제를 통과시키는 것을 포함하는, 조영제로부터 내독소를 제거하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따라 사용되는 조영제는 자기 공명 영상화 (MRI)를 위한 조영제, 예를 들어 Gd-기재 조영제 또는 X-선 영상화를 위한 조영제일 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 바람직한 X-선 조영제는 비이온성 요오드화 조영제이다. 보다 바람직하게는, 상기 조영제는 고점도이고, 바람직하게는 약 20 내지 35 mPas의 점도를 갖는다.

보다 바람직하게는, 비이온성 조영제는 1,3-비스(포르밀아미노)-N,N'-비스[3,5-비스(2,3-디히드록시프로필아미노카르보닐)-2,4,6-트리요오도페닐]-2-히드록시-프로판을 포함한다. 가장 바람직하게는, 비이온성 조영제는 비시파크(Visipaque)™이고, 이는 진단 X-선 절차에서 가장 많이 사용되는 조영제 중 하나이다. 요오딕사놀은 비시파크™의 화학적 약물 물질의 일반명이다.

본 발명에 따라 처리되는 용액은 이롭게는 용액 밀리리터 당 유기 결합 요오드 약 50 밀리그램 내지 500 밀리그램 (mg I/ml), 보다 바람직하게는 약 100 내지 400 mg/I ml를 제공하기에 충분한 농도로 존재하는 요오드화 약물 물질을 가질 것이다.

또한, 본 발명에 따라, 정제 전의 용액은 통상적으로 내독소를 I 50 mg 당 0.2 EU (0.2 EU/50 mg I)를 초과하는 수준으로, 종종 약 5 EU/50 mg I를 초과하는 수준으로 함유할 것이다.

음이온 교환 막은 가까이에 조영제로부터의 내독소의 효과적이고 신속한 제거를 제공한다. 분리는 조영제 중의 이온과 막 중의 반대 이온의 선택적 교환의 결과로서 일어난다. 조영제는 막에 대한 친화성을 본질적으로 나타내지 않으므로, 내독소는 조영제 용액으로부터 효과적으로 분리된다. 음으로 하전된 내독소는 이온 교환제 상의 양으로 하전된 기에 흡착하여, 용액으로부터 제거될 것이다. 교환제가 제제화를 위해 사용되는 완충제의 동일한 이온 세기와 평형을 이루는 경우, 흡착되는 각 내독소 분자에 대해 하나의 음의 완충제 반대 이온이 교환될 것이다.

공업 규모에서, 용액은 바람직하게는 주어진 시간 내에 막을 통해 통과하는 용액으로부터 제거되는 내독소의 양 뿐만 아니라 막을 통해 통과되는 용액의 부피를 최적화하는 속도로 음이온 교환 막을 통해 통과할 것이다. 1 내지 10 l/분, 보다 바람직하게는 2 내지 5 l/분의 유속이 본 발명의 방법에서 전형적일 것이다.

시스템은 바람직하게는 1 psig 내지 100 psig, 보다 바람직하게는 5 psig 내지 15 psig, 가장 바람직하게는 약 10 psig의 압력에서 작동될 것이다. 또한, 시스템은 원하는 분리를 허용하고 포함된 약물 물질의 분해 온도 미만인 용액 온도를 유지시킬 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 약 실온 내지 약 4℃의 용액 온도에서 작동될 것이다.

정제 시스템은 바람직하게는 허용되는 수준으로의 내독소의 원하는 감소를 달성하기에 충분한 지속시간 동안 상기 파라미터 내에서 실행되도록 허용될 것이다. 전형적으로, 이러한 실행은 약 0.5 내지 약 10.0시간, 보다 바람직하게는 약 1.5 내지 약 2.5시간 동안 지속될 것이다. 샘플은 내독소 수준을 모니터링하기 위해 주기적으로 취해지고 시험될 수 있으며, 상기 방법은 허용되는 수준이 달성되면 정지될 수 있다.

최종 생성물은 출발 용액의 총 조영제를 본질적으로 모두 함유하는 조영제의 용액을 포함할 것이다. 생성물 용액은 내독소를 출발 용액과 비교하여 실질적으로 감소된 수준으로 함유할 것이며, 보다 바람직하게는 내독소를 본질적으로 함유하지 않을 것이다 (즉, 내독소를 약 1 EU/ml 미만의 수준으로 함유함).

본 발명은 본원에 기재된 특정 절차 또는 생성물의 범위로 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다.

실시예 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법은 상대적으로 짧고 상업적으로 실시가능한 기간 내에 1 EU/ml 미만으로의 내독소 수준의 감소를 달성하였다. 동시에, 비시파크™ 및 프로한스(Prohance)™의 효력은 변하지 않은 채로 유지되었다. 그러므로, 본 발명의 방법은 조영제 중의 내독소 오염을 감소시키기 위한 매우 비용 효과적인 수단을 제공한다.

실시예 2는 1,3-비스(포르밀아미노)-N,N'-비스[3,5-비스(2,3-디히드록시프로필아미노카르보닐)-2,4,6-트리요오도페닐]-2-히드록시-프로판을 포함하는 용액으로부터의 내독소의 제거를 나타낸다. 내독소의 수준이 0.5 EU/ml 미만의 수준으로 극적으로 감소한 것을 볼 수 있고, 중요하게는 또한 용액 중 나트륨 이온 및 칼슘 이온의 농도가 본질적으로 변하지 않은 것을 볼 수 있다.

<실시예>

실시예 1

샘플.

a) 요오드화 방향족 X-선 화합물 비시파크™ (10 mM 트리스(TRIS) 완충제 (pH 7.4) 중 요오딕사놀 320 mg 요오드/ml, 멸균 내독소 비함유 NaCl에 의해 290 mmol/kg으로 조절된 몰랄삼투압농도, 점도 = 24 mPa).

b) MR 프로한스™에 대한 Gd-킬레이트 기재 조영제 (Gd-DOTA, 10 mM 트리스 완충제 (pH 7.4) 중 0.8 M, 멸균 내독소 비함유 NaCl에 의해 290 mmol/kg으로 조절된 몰랄삼투압농도).

이. 콜라이(E. Coli)로부터의 내독소의 스톡 용액의 제조.

한 바이알 (10 mg, 10 e 7 EU, 시그마 코포레이션(Sigma Corp.), USA)에 주사용수 (WFI) 9 ml 및 아세토니트릴 1 ml를 첨가하여, 9.1 e6 EU/ml = 9.1 e3 EU/㎕의 농도를 얻었다.

이. 콜라이로부터의 LPS의 작업 용액의 제조: 스톡 용액 0.1 ml를 WFI 10 ml로 희석하여 (희석 인자 = 100), 91 EU/㎕를 얻었다.

내독소에 의한 제형의 스파이킹.

비시파크™ 및 프로한스™의 분액 10 ml에 이. 콜라이로부터의 LPS의 작업 용액 3 및 6 ㎕를 270 및 550 EU 내독소의 최종 이론 농도로 각각 첨가하였다.

발열원제거 절차.

a) 필터 장치: 양으로 하전된 사급 암모늄기로 개질된 셀룰로스로 제조된, 3 내지 5 ㎛의 세공 크기를 갖는 바로 사용가능한 단위로 통합된 사토바인드(Sartobind) Q15™ 막.

b) 사토바인드™ Q15의 평형화 및 멸균화.

각 필터를 10 mM 트리스 (pH 7.4) 50 ml, 이어서 70% 에탄올 5 ml (3분 동안 필터에 머물게 함), 및 최종적으로 10 mM 트리스 (pH 7.4) (멸균) 50 ml로 용리시켰다.

c) 내독소 제거.

초당 약 1 내지 2적의 유동에 의해 필터 단위를 통해 제형을 통과시켰다.

내독소 분석을 위한 샘플링.

고점도로 인해, 내독소 분석을 위한 샘플링 전에 사토바인드™ Q15 음이온 교환제를 통해 용리시킨 후, 제형을 완전히 혼합하였다.

내독소 함량의 분석

내독소 함량의 결정을 위해 사용된 방법은 0.005 EU/ml의 민감도를 갖는 미국 약전 및 유럽 약전에 기재된 발색 방법이었다. 제형 50 ㎕를 WFI (주사용수) 9.95 ml에서 희석하여 1:200 희석물을 제조하고, 샘플을 양성 대조군과 함께 역학 QCL 기구에서 분석하였다. 양성 대조군이 양성인 경우, 시험을 유효한 것으로 고려하였고, 소프트웨어에 의해 결과를 자동적으로 계산하였다. 존재하는 내독소가 없는 경우 NMT 1 EU/ml의 결과를 얻었다.

내독소, pH 및 요오드 및 가돌리늄의 농도의 결과 값은 표 1에 나타낸다. 내독소의 값은 측정값이고, 실험 부분에 제공된 이론값과 상이하다는 것을 주목해야 한다. * 기준값은 80.4 mg Gd/ml이고; ** 기준값은 320 mg I/ml이다.

실시예 2

순수한 1,3-비스(포르밀아미노)-N,N'-비스[3,5-비스(2,3-디히드록시프로필아미노카르보닐)-2,4,6-트리요오도페닐]-2-히드록시-프로판 화합물을 10 mM 트리스 완충제 및 0.1 mg/ml CaNa₂EDTA를 함유하는 멸균수에 약 320 mg I/ml의 농도로 용해함으로써, 1,3-비스(포르밀아미노)-N,N'-비스[3,5-비스(2,3-디히드록시프로필아미노카르보닐)-2,4,6-트리요오도페닐]-2-히드록시-프로판을 포함하는 용액의 샘플을 제조하였다. 염화칼슘을 하기 주어진 농도로 첨가하고, 염화나트륨의 첨가에 의해 용액의 몰랄삼투압농도를 등장도 (290 mOsm/kg)로 조절하였다. 최종적으로, 용액을 120℃에서 30분 동안 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 그 후, 내독소를 함유하는 샘플을 제조하고, 사토바인드 Q100™을 사용한 것을 제외하고 실시예 1에서와 같이 정제하였다. 정제전 및 정제후의 내독소 수준 및 Ca² ⁺ 및 Na⁺ 수준은 표 2에 나타낸다.

상기 논의되고/거나 인용된 모든 특허, 학술지 논문, 공보 및 기타 문헌은 본원에 참고로 도입된다.

Claims

음이온 교환 막을 통해 조영제를 통과시키는 것을 포함하는, 조영제로부터 내독소를 제거하는 방법.
제1항에 있어서, 조영제가 비이온성 요오드화 조영제인 방법.
제1항에 있어서, 조영제가 약 20 내지 35 mPas의 점도를 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 조영제가 1,3-비스(포르밀아미노)-N,N'-비스[3,5-비스(2,3-디히드록시프로필아미노카르보닐)-2,4,6-트리요오도페닐]-2-히드록시-프로판을 포함하는 것인 방법.