KR20110002876A - 치료약 - Google Patents

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KR20110002876A
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rifampicin
phagocytosis
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KR1020107026830A
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히로시 데라다
기미꼬 마끼노
겐이치로 소마
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히로시 데라다
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Abstract

본 발명은 기능 이상의 대식세포에 의해 유발되거나 대식세포를 매체로 하여 유발되는 질병에 대한 치료약을 제공하기 위한 것이며, 대식세포의 탐식 기능을 활성화하여 이를 이용하여, 대식세포에 적극적으로 탐식됨으로써 대식세포로 효율적으로 혼입되며, 이에 따라 기능 이상이 된 대식세포를 정상화하는, 병원체 감염 대식세포를 살멸하거나, 또는 병원체 감염 대식세포 내의 병원체를 살멸하는 치료약을 제공한다.

Description

치료약 {REMEDY}
본 발명은 대식세포의 탐식능(phagocytic capacity)을 이용하여 기능 이상 대식세포의 정상화를 도모하거나, 또는 여러가지의 감염성 병원체에 유효한 치료약에 관한 것이다. 본 발명에 따른 치료약(약물 또는 제제)은 치료상 및(또는) 진단상의 목적으로 주어지는 모든 물질 및 이들의 집합체를 대상으로 하며, 그 제제는 약물(경우에 따라서는 약물 담체를 포함함)과 약물 담체의 합제이다.
I. 대식세포
본 발명에 따른 치료약의 작용에 있어서, 중요한 기능을 담당하는 대식세포에 대해 개설한다.
대식세포의 형태·기능에 대해서는, 예를 들면 문헌[기요시 다까하시 등 저 "생명을 지지하는 대식세포", 분꼬도, 2001년]에 상술되어 있지만, 본 발명과 관련되는 배경을 설명하면 이하와 같다. 대식세포란, 단핵 식세포계(MPS: Mononuclear Phagocyte System)를 구성하는 세포이다. 혈중의 단구는 골수 세포 중의 조혈 줄기 세포로부터 유래하여, 골수 중에서 분열 분화하여 혈중에 유출되고, 여러가지 조직에 정착하여 여러가지 명칭으로 불리는 단구 세포로 분화한다. 이 세포는 결합 조직 중에서는 조직구, 간장에서는 쿠퍼 세포, 폐에서는 폐포 대식세포, 림프절/비장에서는 대식세포, 체강에서는 흉강/복강 대식세포, 뼈에서는 파골 세포, 피부에서는 랑겔한스 세포, 신경 조직에서는 소교 세포, 뇌에서는 소교세포, 골막에서는 A형 세포라고 불리고, 조직 특이적인 성질을 갖는다.
1. 일반적 성상
(1). 직경 약 15 내지 20 마이크론의 단핵 세포이고, 세포질이 풍부하며, 유리나 플라스틱 표면에 점착하기 쉽다. 위족을 내어 운동하며, 강한 이물 탐식 작용을 갖는다.
(2). 생체 방어 담당 세포.
(3). 이물 배제 기능과 면역능을 가짐.
(4). 항원 정보를 T 림프구에 제시하여 면역을 성립시킴.
(5). 인터페론에 의해서 활성화되어, 세포성 면역의 작동세포가 됨.
(6). 림프구에 비해 X 선 저항성임.
2. 대식세포의 생리적 의의
(1). 탐식 기능
대식세포의 기능으로서 가장 잘 알려져 있는 것은 탐식 작용이다. 이 기능은 생명이 탄생하여, 이것이 진화함에 있어서 단세포의 시대로부터 갖춰지고 있었던 가장 기본적인 기능 중 하나라고 생각할 수 있다. 따라서, 대식세포의 특징 중 하나는, 그 존재가 종(種)횡단적으로 보편성을 갖는 것이다. 이 특징은, 대식세포 기능을 대상으로 하는 연구의 큰 이점 중 하나를 제공하고 있다고 생각된다. 즉, 만일 포유 동물의 질병을 대상으로 한 치료약의 개발 연구를 행하는 경우에도, 포유 동물 이외의 대식세포가 기능적으로도 연구 소재로서도 유용할 수 있다. 이 점은 대식세포가 계통 발생적으로 보존된 세포인 점에 의한다.
(2). 생체 방어 기능
대식세포의 기능으로서 다음으로 중요한 것은 생체 방어 작용이다. 이 작용은 비특이적 생체 방어 작용이라고 불리는 것이지만, 최근의 연구로부터 대식세포의 생체 방어 작용에도 특이성이 있다는 것이 명확해지고 있다. 본래 비특이적이라는 말은 T 세포에 특징지어지는 항원 특이성이나 면역 기억에 대응한 말이며, 현재 시점에서 엄밀한 의미에서의 항원 특이성이나 면역 기억이 대식세포에 존재하는 것은 증명되어 있지 않기 때문에, 대식세포의 생체 방어 작용이 비특이적이라는 것은 틀린 것이 아니다. 그러나, 예를 들면 병원체의 종류에 따라 대식세포의 응답은 질적으로 다른 것, 또한 이 질적으로 다른 응답의 일부는 대식세포 세포 표면의 병원체를 인식하는 수용체의 차이와 대응하는 것을 나타낸 바와 같이, 이물(또는 환경)의 자극에 대한 세포 응답측에서 보면, 대식세포의 작용은 특이적이다고 할 수 있다.
현재로서는, 상기 사실을 근거로 하여, 대식세포를 중심으로 하는 생체 방어 작용을 자연 면역 기구(The innate immune system), T 세포를 중심으로 하는 주체 방어 작용을 획득 면역 기구(The acquired immune system)로 파악하는 것이 일반적이 되고 있다. 또한, 대식세포의 계통 발생적 보편성을 생각하면 당연하지만, 자연 면역 기구도 또한 계통 발생적으로 높게 보존된 생체 방어 기구이다.
(3). 자연 면역 기구
대식세포를 중심으로 하는 자연 면역 기구는 획득 면역 기구를 갖지 않은 생물종에서는 물론, 획득 면역 기구를 구비한 생물종에서도 이물 식별, 배제 기구라는 생체 방어 기구의 중핵을 담당하고 있다. 획득 면역 기구를 구비한 생물조차도 병원체 등의 이물의 식별·배제는 대부분의 경우 자연 면역 기구의 기능으로 제공되고 있지만, 이것이 불충분한 경우에는 획득 면역 기구가 동원된다. 이 경우에서도 특이적 이물 식별에는 대식세포 등에 의한 항원 제시가 필수가 되고, 외래 이물의 배제에 있어서, 배제 기구의 중심을 담당하는 것도 또한 대식세포 등의 자연 면역 기구를 구성하는 세포이다.
(4). 이물 배제
한편, 내인성의 이물(예를 들면, 바이러스 감염 세포의 제거) 등은 획득 면역에 특징적인 세포 상해성 T 세포에 의해 배제되지만, 이 세포 상해성 T 세포의 증식과 성숙 둘다에, 대식세포 등에 의한 항원 제시된 별도의 T 세포가 필수적이다. 즉, 획득 면역이 충분한 기능을 다하기 위해서는, 자연 면역 기구가 완전하고 합목적적으로 기능하는 것이 전제가 된다.
(5). 기능 부전
따라서, 대식세포의 탐식이나 항원 제시 등의 기능 부전은 주로 면역 부전의 잠재적인 원인이 될 수 있다. 구체적으로 말하면, 앞서 I. 1 (대식세포의 일반적 성상)에서 설명한 여러점에 관련되는 기능 부전과 질환으로서 이하에 기재한 것이 알려져 있다. 즉,
1). 이물 탐식 작용의 이상으로서의 탐식 기능 이상병으로서는 백혈구 접착 결손증, 체디악·히가시 증후군 등이 알려져 있다. 두 경우 모두에서 탐식 기능에 이상이 인정되고 있고, 후자에서는 라이소솜 효소가 탐식 공강으로 수송되는 데에 이상이 있기 때문에, 살균능이 저하되어 탐식능은 현저히 항진된다.
2). 생체 방어 담당 기능의 이상으로서의 질환으로서는, 만성 점막 피부 칸디다증을 들 수 있다. 이 질환을 앓는 환자의 대식세포는 이주 능력이 저하되어 칸디다의 살균능도 저하된다.
3). 이물 배제 기능과 면역능의 이상으로서의 질환으로서는, 위스콧·알드리치 증후군을 들 수 있다. 환자 대식세포는 이주 이상, 항체 의존성 세포 상해 작용의 결함 등 복잡한 면역 이상을 나타낸다.
4). 항원 정보의 제시 기능 이상으로서는, T 세포, B 세포가 정상임에도 불구하고 중증의 면역 부전을 야기하는 주요 조직 적합(MHC) 클래스 II 항원 결손증이 알려져 있다.
5). 인터페론에 의해서 활성화되어, 세포성 면역의 작동세포가 되는 점에 대해서의 기능 이상으로서는, 인터페론 수용체가 결손된 유아가 결핵균 감염을 방어할 수 없어 결핵균 감염이 치사적이 되는 인터페론 수용체 결손증이 알려져 있다.
또한, 획득 면역 세포가 결손된 포유 동물은 존재하고, 생존할 수 있지만, 대식세포 결손 동물은 존재할 수 없다. 또한, 이물 식별·배제를 중심으로 하는 생체 방어 기구에는, 세포 사이에서의 정보 전달을 행하는 사이토카인으로 총칭되는 생리 활성 물질이 중요한 기능을 맡는다는 것도 명확해지고 있다. 대식세포가 생성 분비하는 사이토카인의 종류는 매우 다양하다. 이와 같이, 대식세포의 기능은 이물의 식별·배제에 대해 보더라도 개체의 항상성 유지에 필수이다.
(6). 해부학적 특징
대식세포의 해부학적 특징은, 여러가지 조직에 정착한 고유의 성격을 갖는 조직 특이적 대식세포에 따라 다르다. 이것은 개체와 환경과의 접점인 점막 조직에서 보더라도 분명하며, 호흡기, 소화기, 비뇨생식기의 점막 하층에는 각각 특이적인 대식세포가 상재하고 있다. 이들 조직 특이적 대식세포는, 조직 특이적인 내외의 환경과의 생체 응답을 행하고 있다. 이는 대식세포가 이물의 식별·배제 뿐만 아니라, 생체 항상성의 유지에 중요한 기능을 해내고 있다는 것을 시사한다. 조직 특이적 대식세포의 생리적 의의는 미지의 점이 많다. 반대로, 새로운 시점으로부터, 조직 특이적 대식세포의 존재 의의를 보면 여러가지 병의 용태와의 관계야말로 주목받을 수 있다.
(7). 병의 용태와의 관계
왜냐하면, 대식세포가 면역 기구에서 중요한 역할을 한다는 생리적 의의를 근거로 하면, 조직 특이적 대식세포의 기능 이상은 조직 특이적인 병의 용태의 유도와 연관된다는 것이 강하게 시사되기 때문이다. 사실, 염증성 장질병 중 하나인 크론병에 있어서, 나아가서는 류마티즘 등의 자기 면역 질환, 골다공증 등의 노령 질환 등 난치성 질환 중 다수의 질환들이 대식세포의 기능 이상을 어떠한 형태로 따르고 있다. 결핵균인 어떤 항산균의 만성 감염도 또한, 항산균 자체의 문제와는 별도로 폐포 대식세포의 기능 이상이 병의 용태의 배경에 있다고 생각할 수도 있다. 이와 같이 생각하면, 표적 세포로서의 대식세포의 탐식능을 증대시키고, 그 결과 대식세포 내의 치료약의 농도를 증대시키는 것과 같은 치료약의 개발은 현재 유효한 치료법이 없는 결핵 등 감염증을 포함하는 난치성 질환의 신규 치료법을 제공하는 데에 있어서, 매우 중요하고 합리성이 있는 대상이라고 할 수 있다.
II. 대식세포의 기능 이상과 질환
(1). 감염성 병원체 매체로서의 대식세포
WHO에 의하면 결핵, 에이즈, 말라리아 등은 세계적인 규모로 가장 중시해야 하는 만성 난치성 감염증이다. 예를 들면, 매년 800만명인 이상의 결핵 환자가 발생하여, 300만명이 사망하고 있다고 한다. 이들 질병에 유효한 치료약(약물/제제)를 개발하는 것은 긴급 과제이고, 그 사회적 의의는 매우 크다.
그런데, 병원체의 감염의 방어·제거에 대해, 생체 내에서 가장 중요한 기능을 담당하는 세포 중 하나가 대식세포이다. 실제, 대식세포는 생체 내 장기, 기관의 모든 장소에 분포하고 있다. 이들 대식세포는 존재하는 장기, 기관에 따라 형태도 기능도 다르지만, 병원체의 감염의 방어·제거를 완수한다는 점에서는 공통된다.
한편, 감염성 병원체는 진화의 과정에서 대식세포의 공격을 회피하는 여러가지 수단을 획득하고 있다. 또한, 감염체 병원체 중에는 대식세포에 잠복하고, 대식세포를 숙주로 하는 것이 많다. 이렇게 하여 대식세포에 기생하는 데 성공한 병원체는, 만성적이고 또한 반복적으로 감염증을 야기하는 원인이 되는 것은 물론이고, 치명적인 결과를 초래하는 경우도 드물지 않다. 즉, 이 경우에는 원래 병원체의 감염의 방어·제거를 달성해야 하는 대식세포가 반대로 감염체 병원체 매체로서 기능하는 것이 된다.
(2). 대식세포 내의 병원체
그 전형예를 결핵으로 볼 수 있다. 즉, 병원체(마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 또는 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis))는 초기 감염 경로인 폐포의 대식세포에 의해 탐식되지만, 그 때 형성되는 식포(파고좀) 내에서 안정적으로 존재하고 있다. 즉, 병원체는 원래 이들을 소화하여야 할 대식세포를 "셸터"로 하여 생존할 수 있다. 이 외에도 나병의 원인균인 마이코박테리움 레푸라(Mycobacterium leprae), 비정형 항산균증의 원인균인 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 클라미디아증의 원인균인 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 또는 클라미디아 싯타시(Chlamydia psittaci) 등과 같이 근치 요법이 아직도 확립되어 있지 않고, 만연이 염려되는 난치성 감염 질환의 많은 원인균도 또한 대식세포가 감염 병원체 매체가 된다는 것에 공통점이 발견된다.
결핵균, 에이즈 바이러스 등은 현재 예방에 많은 노력이 기울여지고 있다. 그러나, 일단 감염이 성립되어 버리면, 유효한 치료법은 존재하지 않는다. 만일,감염 병원체에 대해 직접적으로 살균 작용을 갖는 화합물이 존재했다고 하더라도, 일반적으로 해당하는 치료약을 단순히 투여함으로써, 특정한 병원체를 살멸(본 발명에서의 살멸은 병원체의 전부 또는 일부를 죽여 소멸시키는 것을 의미함)하는 것에 충분한 농도를 병원체 보유 대식세포 내에서 달성하는 것은 쉽지 않다.
따라서, 유효한 치료약을 투여함으로써 세포 외의 병원체는 살멸할 수 있더라도, 병원체 매체로서의 대식세포는 여전히 병원체 공급원으로서 생존하여, 병원체를 계속해서 공급하게 된다. 현재, 대식세포 내에 기생하는 병원체에 대해서의 근치 요법이 전무인 이유는, 위와 같은 점에서 찾을 수 있다. 본 발명은 이 점을 과제로 하는 것이며, 반대로 병원체 매체로서의 병원체 감염 대식세포를 살멸하거나, 또는 병원체 감염 대식세포 내의 병원체를 살멸할 수 있으면, 상술한 많은 만성 난치성 감염증을 근본적으로 치료할 수 있게 된다. 따라서, 대식세포의 기능 이상에 기초하여, 또는 대식세포를 매체로 발병되는 질병에 대한 치료약을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명자들은 예의 연구를 진행시킨 결과, 병원체 매체로서의 병원체 감염 대식세포를 살멸하는 것, 병원체 감염 대식세포 내의 병원체를 살멸하는 것, 또는 질병으로 인해 기능에 이상이 생긴 대식세포에 작용하는 것을 목적으로 하는, 매우 새로운 착상을 얻는 것에 이르고 본 발명을 완성한 것이다.
본 발명의 치료약은 대식세포의 탐식 활성을 항진시켜, 대식세포 내의 병원체를 살멸하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 치료약은 대식세포의 탐식 활성을 항진시켜, 병원체를 보유하는 대식세포를 세포사시키는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 치료약은 대식세포의 탐식 활성을 항진시켜, 기능 이상의 상태에 있는 대식세포에 작용하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 치료약은 항산균증, 에이즈, 클라미디아증 또는 톡소플라즈마증 중 어느 하나에 대한 것이 바람직하다. 이에 따라, 대식세포가 병원체를 보유하는 것에 의한 질환을 유효하게 치료할 수 있다.
또한, 본 발명의 치료약은 크론병, 류마티즘, 암 또는 면역 부전 증후군에 대한 것이 바람직하다. 이에 따라, 대식세포가 기능 이상의 상태에 있는 것에 의한 질환을 유효하게 치료할 수 있다. 에이즈는 면역 부전 증후군에 포함된다.
또한, 상기 대식세포는 점막 조직에 상재하는 것인 것이 바람직하다. 이에 따라, 호흡기, 소화기 또는 생식기 등, 병원체가 처음 감염을 일으키는 부위에서 질환을 유효하게 치료할 수 있다.
또한, 상기 대식세포는 복강, 대망(greater omentum), 유반, 폐포, 폐간질, 간장, 간문맥 영역, 비장, 골수, 흉선, 소화관, 구강편도, 부신, 뇌하수체, 갑상선 간질, 랑겔한스섬, 부갑상선, 송과체, 정소, 난소, 난관, 자궁, 태반, 피부, 수막, 뇌질, 맥락막총 중 어느 하나에 상재하는 것이거나, 또는 상기 대식세포는 소교세포, 소교세포의 전구 세포, 아교세포, 아교세포의 전구 세포, 상기 상재 대식세포의 전구 세포, 상재 대식세포 유사 세포, 또는 상기 상재 대식세포 유사 세포의 전구 세포인 것이 바람직하다. 이에 따라, 체내의 여러가지의 장기 또는 조직에 발생하는 질환을 유효하게 치료할 수 있다.
또한, 본 발명의 치료약은 PLGA(폴리(락트산/글리콜산) 공중합체)를 포함하며, 결핵에 대한 것임을 특징으로 한다.
또한, 추가로 리팜피신을 포함하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 결핵균을 살멸하는 치료약을 제공할 수 있다.
또한, 분자량 1,500 내지 150,000의 PLGA를 포함하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 대식세포에 탐식되어 생분해성의 미립자 제제를 제공할 수 있다.
또한, 분자량 1,500 내지 75,000의 PLGA를 포함하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 대식세포에 탐식되어 대식세포 내에서 약물을 방출하기 쉬운 미립자 제제를 제공할 수 있다.
또한, 추가로 PVA(폴리비닐알코올), PEG(폴리에틸렌글리콜), PEO(폴리에틸렌옥시드), 당, 단백질, 펩티드, 인지질 또는 콜레스테롤 중 1 개 이상을 포함하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 대식세포의 종류에 따라 활발히 탐식되는 미립자 제제를 제공할 수 있다.
또한, 추가로 PVA, PEG, PEO, 당, 단백질, 펩티드, 인지질 또는 콜레스테롤 중 1 개 이상을 포함하고, 주된 입자 직경이 1 내지 6 마이크론인 미립자 제제인 것이 바람직하다. 이에 따라, 대식세포의 탐식 기능을 유효하게 이용하여 대식세포 내에 유효하게 혼입시킬 수 있다.
또한, 탐식됨으로써 대식세포의 탐식 활성을 항진시키는 것이 바람직하다.
또한, 분자량 5,000 내지 20,000의 PLGA를 포함하고, 결핵에 대한 것이 특히 바람직하다.
또한, 막 유화법에 의해 제조된 것이 특히 바람직하다.
또한, 팬토에아·아글로메란스(Pantoea agglomerans)의 리포 다당을 포함하고, 에이즈에 대한 것이 특히 바람직하다.
또한, 팬토에아·아글로메란스(Pantoea agglomerans)의 리포 다당을 포함하고, 폐암 세포에 대해 세포 상해 작용을 갖는 것이 특히 바람직하다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 제2002-247871호의 명세서 및(또는) 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
본 발명에 따라, 대식세포의 기능 이상에 의해 유발되거나 대식세포를 매체로 하여 유발되는 질병을 효과적으로 치료할 수 있는 치료약을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명과 종래의 치료약의 대식세포 내 약제 농도를 대비하여 설명하는 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시의 형태의 미립자 제제의 입경 분포를 나타낸 도면이다.
도 3은 리팜피신의 본 발명에 의한 투여와, 종래 사용되고 있는 용액에 의한 투여에 의해서 NR8383 세포에 혼입되는 양이 어느 정도 다른 지를 대비하여 설명하는 도면이다.
도 4는 RFP-PLGA 미립자의 리팜피신 유지 능력이 PLGA 미립자의 조성에 따라 방출하는 리팜피신의 양이 다르다는 것을 설명하는 도면(그의 1)이다. 실험치는 오차 5 ％를 포함한다.
도 5는 RFP-PLGA 미립자의 리팜피신 유지 능력이 PLGA 미립자의 조성에 따라 방출하는 리팜피신의 양이 다르다는 것을 설명하는 도면(그의 2)이다. 실험치는 오차 5 ％를 포함한다.
도 6은 결핵균을 탐식한 대식세포가 RFP-PLGA 미립자를 탐식함으로써 대식세포 내의 결핵균을 살멸할 수 있다는 것을 설명하는 도면이다. 생존율은 1: 5 ％ 이하, 2: 5 내지 25 ％, 3: 25 내지 50 ％, 4: 50 내지 75 ％, 5: 75 ％ 이상으로 평가하였다. 또한, 투여한 리팜피신은 단독 투여(도면 중 RFP로 표시)로서는 100 ㎍/mL, RFP-PLGA에 의한 투여(도면 중 RFP-PLGA로 표시)로서는 5 ㎍/mL(추정치)이다.
도 7은 리포 다당을 이용하여 폐포 대식세포 NR8383의 탐식능을 활성화함으로써, 사토(Sato) 폐암 세포와의 공배양에 의해 기능 이상의 상태에 있는 NR8383의 사토 폐암 세포에 미치는 세포 독성 효과가 증강하는 것을 설명하는 도면이다. (□)은 리포 다당 미처리의 NR8383의 사토 폐암에 대한 세포 상해 효과를, (●)은 리포 다당(1 ㎍/mL) 처리한 NR8383의 사토 폐암 세포에 대한 세포 상해성 효과를 각각 나타내고 있다(공배양 4 시간). 또한, 세포 상해 효과(％)는 배양액 중에 방출된 락트산 데히드로게나아제의 양으로부터 산출하여 평가하였다.
이하, 첨부 도면을 참조하면서 본 발명의 바람직한 실시의 형태에 대해 상세하게 설명한다. 단, 본 발명이 이들 실시의 형태에 의해 그 설명적 범위가 한정되는 것은 아니다.
대식세포 전반에 갖춰져 있고, 게다가 대식세포에 특이적인 기능 중 하나로 탐식 작용을 들 수 있다. 탐식 작용은 크기가 약 1 마이크론 정도 이상의 고형물을 적극적으로 대식세포 세포내에 혼입시키는 기능이다.
그런데, 인공적으로 제조한 고형물을 적극적으로 탐식시키면, 대식세포 내에 통상적으로는 달성할 수 없는 농도로 고형물을 축적시킬 수 있다. 이러한 고형물은 일반적으로 입자로서 제공될 수 있지만, 적극적으로 탐식시키기 위해서는 탐식에 유리한 입경, 입자의 표면 특성(전하를 갖는 것, 일정한 유연 구조를 갖는 것 등) 등을 최적화할 필요가 있다. 예를 들면, 폴리락테이트와 폴리에틸렌글리콜을 혼합한 재료를 기재로 하여 대식세포에 탐식되기 쉬운 입자를 제조할 수 있다.
그래서, 감염 병원체 또는 병원체 감염 대식세포에 작용하는 약물을 혼화하여 입자를 제조하면, 입자의 탐식에 따라 약물도 또한 대식세포 내에 적극적으로 혼입되게 된다.
본 발명의 근간은 대식세포가 갖는 탐식 기능을 적극적으로 활용하고, 대식세포의 기능 이상에 관계된 질병(I. 2. (5), (7), II. (1), 항산균증, 에이즈, 클라미디아증, 톡소플라즈마증 또는 암 등)을 치료하는 점에 있다. 그래서, 이들에 유효한 약물을 대식세포가 탐식할 수 있는 미립자(약물 담체) 중에 함유시킨 제제를 제조함으로써, 상기 목적을 달성하고자 하는 것이다.
통상, 약물 담체와 약물과의 합제인 제제는, 오히려 대식세포에 의한 탐식을 회피하기 위한 설계가 필요하다. 그러나, 본 발명은 종래와는 전혀 역전된 발상에 기초하여, 대식세포의 탐식 활성을 적극적으로 이용하는 점에 신규성이 있다.
상술한 바와 같이 대식세포의 생체 방어 기능 중 하나로 탐식 작용이 있다. 탐식 작용은 대식세포에 특징적으로 인정되는 고유한 기능이고, 대식세포 이외의 세포로서는 혼입할 수 없는 크기의 입자를 혼입할 수 있다. 세균 등의 병원 미생물은 대식세포에 탐식되어 대식세포 내에서 분해된다. 따라서, 대식세포의 탐식 기능의 생물학적 의의 중 하나는 병원 미생물에 대해 상해를 부여하는 것이다. 그러나, 대식세포는 탐식에 의해서 활성화되어, 병원 미생물에 대항할 수 있게 되는 경우가 있다. 이것은 탐식에 의한 대식세포 활성화로서 알려지는 현상이고, 이것에 의해서 대식세포는 암 세포라도 상해할 수 있게 된다. 따라서, 대식세포를 탐식에 의해 활성화하여 탐식 활성을 강화할 수 있으면, 병원 미생물을 보다 강하게 살멸할 수 있게 된다.
입자가 대식세포에 탐식되기 위해서는 이하의 성질을 구비하고 있을 필요가 있다고 생각된다(탐식가능성).
즉,
·입자 직경은 1 내지 6 마이크론이다. 이러한 입자를 미립자라고 한다.
·입자 표면은 대식세포 배양액(생체 내에서는 대식세포 주변의 체액)으로 누설되지만, 즉시는 용해되지 않고 일정 시간 입자로서 존재하고 있다.
·입자는 20 내지 45 ℃의 온도 범위에서 고체이다.
·입자의 비중은 대식세포 배양액(생체 내에서는 대식세포 주변의 체액)보다도 크다.
·또한, 입자는 표면에 물이나 이온이 침투 가능한 표면층을 갖는다.
한편, 입자를 생체 내에 투여하는 것을 고려하면, 입자 표면은 생체 적합성이 높은 고분자층을 갖고 있을 필요가 있고, 대식세포에 혼입될 때까지는 입자의 형태를 유지하는 한편, 대식세포에 혼입된 후에, 또는 혼입되지 않은 경우에도 생체 내에서 생체에서 무독한 성분으로 분해되어 대사될 필요가 있다(생체내 분해성).
이상의 두 조건을 충족시키고, 쉽게 입자에 성형 가능한 고분자로서, 폴리(락트산/글리콜산) 공중합체(이하 "PLGA"라고 함) 또는 폴리락트산(이하 "PL"이라고 함)을 들 수 있다. PL은 PLGA보다도 소수성이 높고, 분해까지 요하는 시간이 길다. 한편, PLGA는 단량체 비율에 의존하여 분해 속도가 변화한다. 분자량이 큰 쪽이 분해까지 요하는 시간은 길다. PLGA의 분자량이 1,000 이하인 경우에는 20 내지 45 ℃의 온도 범위에서 액체로서 존재할 가능성이 있다. 따라서, 20 내지 45 ℃의 온도 범위에서 고체로서 존재하는 PLGA의 분자량은 1,500 이상이 바람직하다.
또한, PLGA 입자 중에 함유하고 있는 약물의 입자 내에서의 방출은 분자량20,000정도의 PLGA의 경우에는 거의 0차로 약물이 방출된다. 즉, 방출량이 항상 일정하게 유지된다. 그러나, 분자량 44,000 및 75,000 정도의 PLGA 입자로부터는 0차 방출이 아니고, 일정 시간 후에 약물이 방출되는 펄스형이 된다는 것이 관측되어 있다. 게다가, 펄스형의 약물 방출이 관측되는 시간은 분자량이 큰 PLGA 제제에서 늦어지고 있다. 즉, PLGA 입자로부터의 약물 방출의 패턴은 PLGA의 분자량에 의존하고 있다. 또한, 약물의 방출에 관계하는 PLGA의 분해 속도는 PLGA의 분자량 증가에 따라 늦어지는 것 뿐만 아니라, 대식세포 내 등 생체 내 쪽이 시험관 내보다도 빠르다고 예측되기 때문에, 분자량은 150,000까지의 범위이면 생체 내에서 유효하게 사용 가능하다고 생각된다.
이상의 관점에서, 분자량 1,500 내지 150,000, 락트산·글리콜산의 단량체비50:50 내지 75:25의 PLGA를 포함하는, 입자 직경이 1 내지 6 마이크론인 미립자 제제(허용 범위), 분자량 5,000 내지 75,000, 락트산·글리콜산의 단량체비 50:50 내지 75:25의 PLGA를 포함하는, 입자 직경이 1 내지 6 마이크론인 미립자 제제(적합한 범위)가 대식세포에 탐식되기 쉽고, 게다가 대식세포 내에서 약물을 내포하는 미립자 제제로부터 약물이 일정한 지속성을 유지하면서 방출된다고 하는 목적에 대해 최적이라고 생각된다.
<감염증 병원체를 보유한 대식세포의 특이적 살멸을 가능하게 하는 신규 치료약의 제공>
결핵균을 비롯한 여러가지의 감염성 병원체를 보유한 대식세포가 특이적인 탐식 활성을 적극적으로 활용하여, 대식세포 내의 병원체 또는 병원체를 보유한 대식세포를 살멸하기 위해서는 하기의 치료약이 유효하다.
(1). 대식세포의 탐식 활성을 항진시키는 치료약
(2). 대식세포 내의 감염 병원체에 대해 직접적인 살멸 효과를 갖는 치료약
(3). 대식세포에 작용하는 치료약
(1)의 치료약은 감염 병원체 보유/비보유의 대식세포에 선택적으로 탐식될 수 있는 성질을 갖는 것이 바람직하다. 종래, 대식세포의 탐식능을 활성화하는 물질이 존재하는 것이 알려져 있었다(공지 사항) 그러나, 이 성질을 적극적으로 이용하여 대식세포 내의 병원체에 작용하는 치료약을 개발하는 시도는 전혀 이루어지고 있지 않다(신규 사항). (2), (3)의 유형은 병원체에 직접 작용하는 여러가지의 약물이 대상이 되는 것 뿐만 아니라, 병원체 보유/비보유 대식세포의 생리 기능을 변화시키는 작용을 갖는 DNA 또는 RNA 등의 유전자 자체도 약물으로서 사용할 수 있다. (1),(2),(3)을 조합한 감염성 병원체 제거에 유효한 치료약을 개발하려는 시도는 전혀 이루어지지 않았고, 본 발명의 치료약은 감염성 병원체에 대한 치료에 유효한 새로운 유형의 치료약이다(신규 사항).
예를 들면, 문헌[안티마이크로바이알 에이젠트 앤드 키모테라피(Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1998년 제42권 제10호 pp.2682-2689)]에는 PLGA에 리팜피신을 함유하는 입자의 항결핵 작용이 개시되어 있다. 그런데, 이 보고에서는 PLGA 입자에 의한 탐식 활성의 항진에 대해서는 전혀 설명되어 있지 않다. 또한, 리팜피신 함유 PLGA 입자는 단독의 리팜피신에 비해 항결핵약으로서의 약효는 향상되어 있지 않기 때문에, 본 발명의 입자와는 다른 성상을 갖고 있는 것이 분명하다. 또한, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이 리팜피신의 방출의 제어에는 PLGA의 분자량이 중요하다. 그런데, 상기 보고에는 PLGA의 제조시에 이용한 PLGA의 분자량의 기재가 이루어지고 있지 않다. 아마 본 발명의 입자와는 다른 분자량을 갖는 PLGA를 이용했기 때문에 항결핵약으로서의 기능을 갖는 것에 이르지 못한 것으로 추측된다. 항결핵약 활성을 갖는 PLGA 입자의 제조에 있어서는, PLGA의 분자량, 단량체비 및 제조된 입자의 직경에 대해 적절한 것을 이용하여, 대식세포의 탐식에 의한 입자의 혼입과, 대식세포 내에서의 항결핵 활성을 평가하지 않으면 안된다. 이상의 점을 종합하면, 상기 논문에 기재되어 있는 PLGA 입자는 PLGA의 단량체비, 입자의 직경이 본 발명에서의 "적합한 범위"에 있는 등, 소재에 대해 일정한 공통성이 인정되지만 입자에 관한 정확한 성상이 기재되어 있지 않고, 항결핵약 작용도 갖고 있지 않다. 따라서, 본 발명의 신규성·진보성을 부정하는 선행예로는 되기 어려운 것이다.
또한, 문헌[파머슈티탈 리서치(Pharmaceutical Research 2000년 제17권 제8호 pp.955-961)]에 분자량 82,500의 PLGA를 이용하여 제조한 리팜피신 함유 입자의 제조 방법이 개시되어 있지만, 이 입자의 제조법은 본 발명과는 다르다. 분자량82,500의 PLGA를 이용한 리팜피신 함유 PLGA 입자의 결핵균 살멸 효과는 문헌[파머슈티탈 리서치(Pharmaceutical Research 2001년 제18권 제9호 pp.1315-1319)]에 개시되어 있다. 상기 문헌을 살펴보면 리팜피신 함유 PLGA 입자의 항결핵 활성은 시험관 내에서는 리팜피신 단독에서의 효과에도 못 미치고, 동물 실험에서도 분명한 치료 효과가 있다고 할 수 없다. 리팜피신 함유 PLGA 입자가 항결핵 작용을 발현하기 위해서는 입자가 적합한 분해성과 높은 리팜피신 내포율을 갖고 있어야 한다. 그러나, 상술의 논문에서는 이와 같은 활성을 좌우하는 성상에 관한 검토를 행하지 않고, 항결핵 활성을 조사하고 있다. 분해성과 내포율이란 분자량의 큰 PLGA 입자에서는 저하되는 것이 알려져 있기 때문에, 82,500이라는 높은 분자량의 PLGA를 이용한 것이 항결핵 작용을 발현하지 않은 원인이라고 생각된다. 이상과 같이 지금까지 본 발명에서 제시하고 있는 것과 유사한 연구가 행해지고는 있지만, 본 발명과 같이 대식세포의 탐식 활성을 이용하는 것을 의도하고, 또한 이 활성화를 달성하는 것을 통해 세포내 기생 병원체의 살멸을 도모하는 시도는 지금까지 행해지고 있지 않다. 또한, 리팜피신 함유 PLGA는 제조되고는 있지만, 본 발명의 목적의 달성을 가능하게 하는 것을 목적으로 한 제조 방법이나 소재 특성에 관한 적절한 연구가 이루어지고 있지 않다. 겨우, 문헌[파머슈티탈 리서치(Pharmaceutical Research 2001년 제18권 제10호 pp.1405-1410)]에 리팜피신 함유 PLGA 입자가 대식세포에 혼입된다는 것이 상정된다는 기재가 있다. 그러나, 이 경우에도 상기 입자가 적극적으로 대식세포에 혼입되거나, 또는 활성화를 의도한 제제가 제조되는 것은 아니고, 실제로 리팜피신 함유 PLGA 입자의 탐식율 등은 검토되어 있지 않다. 덧붙여서 말하면, 이 보고에 기재되어 있는 리팜피신 함유 PLGA 입자를 이용한 시험관 내에서의 리팜피신의 대식세포 내 농도는 겨우 0.45 ㎍/106 세포에 멈춰 있다. 본 발명에서의 리팜피신 함유 PLGA 미립자를 사용한 경우는 탐식이 활성화될 뿐만 아니라, 리팜피신의 대식세포 내 농도는, 6 ㎍/106 세포에 달하는 것이고, 이는 13배 이상도 된다. 이로부터, 대식세포에 탐식을 유도하여 대식세포 내의 병원 미생물의 살멸을 의도한다면, 단순히 약제를 대식세포에 함유시키는 것만으로는 이의 달성이 곤란한 것이 분명하다. 게다가 지금까지의 어떠한 보고에서도 결핵균의 표적 세포인 폐포 대식세포를 이용하여 리팜피신 함유 PLGA 입자가 세포내 결핵균을 살멸하는 지를 검토한 보고는 없다. 상술의 "생명을 지지하는 대식세포"를 참조하면 명확한 바와 같이, 대식세포는 조직 특이성이 높고, 따라서 혈중에 존재하는 대식세포를 이용하여 얻어지는 결과를 즉시 조직 특이적 대식세포, 예를 들면 폐포 대식세포에 적용할 수 없는 것은 주지된 사실이다. 즉, 본 발명의 신규성은 개념의 신규성은 말할 필요도 없지만, 이 개념을 지지하는 실시예로서 폐포 대식세포를 이용하고, 게다가 상기 세포의 탐식 활성을 유도하며, 또한 실제로 폐포 대식세포 내에서 높은 약물 농도를 유지하고, 이 제제가 실제로 폐포 대식세포 내 결핵균의 살멸이 리팜피신 단독에 비해 분명히 우수한 리팜피신 함유 PLGA 입자를 제조하여 제공하는 점을 들 수 있다.
한편, 입자를 대식세포에 탐식시킴으로써, 대식세포로부터 비특이적인 항균 물질, 예를 들면 과산화수소, 산소 라디칼의 생성이 증강하는 것은 이미 널리 알려져 있다. 예를 들면, 문헌[유로피안 져널 오브 파머슈티탈 사이언스(European Journal of Pharmaceutical Sciences 2000년 제15권 pp.197-207)]에는, PLGA 입자를 탐식시킴으로써 혈중 단구의 성격과 유사한 성격의 배양 대식세포로부터의 과산화수소 생성이 증강하는 것이 개시되어 있다. 그러나, 대식세포가 PLGA를 탐식함으로써, 탐식 활성이 증강하는 것은 기재되어 있지 않다. 또한, 대식세포의 활성화는 매우 다양성이 풍부하기 때문에, 탐식에 의해 과산화수소의 생성이 증강하는 것이 즉시 탐식 증강과 직접적으로 결부되는 것은 아니다.
실제의 감염증 치료에 있어서는, (1)의 유형의 치료약에 (2) 또는 (3)의 유형의 약물을 함유시킨 제제가 유효하다. 즉, (2), (3)의 유형의 치료약이 대식세포 내에서 유효하게 작용하기 위해서, (1)의 치료약은 대식세포의 탐식 활성을 항진시켜 (2),(3)의 유형의 치료약을 대식세포 내에 운반하는 기능을 높인다. 즉, 본 발명의 대상이 되는 치료약은 도 1에 나타낸 바와 같이, 대식세포에 탐식되기 쉽고, 탐식됨으로써 대식세포의 탐식 활성을 항진시키기 때문에, 단순히 치료약만을 투여한 경우보다도 대식세포 내의 치료약의 농도가 현저히 높아진다. 즉, 우측의 종래의 물약 내에 있는 대식세포에 혼입되는 약제에 비해, 좌측의 본 발명에 의한 약제 밀봉 미립자는 적극적으로 대식세포에 혼입되어 대식세포 내의 약제 농도가 현저히 높아진다. 이와 같이, 청구의 범위에 기재한 "대식세포의 탐식 활성을 항진시켜,"란, 그 치료약이 대식세포의 탐식능을 높임으로써 단순히 치료약을 투여한 경우보다도 대식세포 내의 치료약의 농도가 현저히 높아지는 것을 의미한다.
구체적인 적용예: 결핵
본 발명에 제시하고 있는 치료약의 유효성에 대한 일례로서 결핵에 대해 설명한다. 결핵균은 비말에 의해 기도로부터 폐포에 침입하여, 폐포 대식세포에 탐식된다. 통상적으로는 탐식된 병원체는 세포내에서 단백질 분해 효소의 공격에 의해 분해되는 운명이다. 그러나, 결핵균은 단백질 분해 효소의 공격을 회피하여, 대식세포 내에서 생존한다. 이 대식세포 내의 결핵균은 대식세포 밖으로 이행하여, 지속적으로 숙주체 내에 결핵균을 공급한다. 현재, 항결핵균 약제로서는 이소니아지드, 리팜피신, 황산스트렙토마이신, 에탐부톨 등의 약물이 이용되고 있다. 상기 모든 약물은 대식세포 밖의 결핵균에 대해서는 유효하지만, 폐포 대식세포 내의 결핵균에 대해서는 효과를 나타내지 않는다. 이는 폐포 대식세포 내에서 결핵균을 살멸하기에 충분한 약물 농도가 얻어지지 않는 것에 주요한 원인이 있다.
그래서, 폐포 대식세포의 탐식 작용을 이용하여 폐포 대식세포 내에 결핵균을 살멸하기에 충분한 약물 농도가 얻어지면, 폐포 대식세포 내 결핵균도 살멸할 수 있다. 이 경우, 탐식 작용은 대식세포 내의 약물 농도를 선택적으로 상승시키기 위해 이용되는 것이 된다.
A. 대식세포의 탐식능을 증강시키는 치료약
PLGA를 예로서, 대식세포의 탐식능을 증강시키는 치료약의 제법 및 그 효과를 설명한다.
I. PLGA 미립자 제제에 의한 대식세포 탐식능의 증강(본항에서는 PLGA 미립자 그 자체가 약효 성분임)
1. PLGA 미립자 제제 제조법
(a). 재료
(1). PLGA(폴리(락트산/글리콜산) 공중합체) 단량체비: 75:25, 분자량 20,000(와꼬 쥰야꾸 가부시끼가이샤: PLGA-7520)
(2). PVA(폴리비닐알코올) 중합도 500
(b). PLGA 미립자 제제의 제조
(1). PLGA 500 mg을 염화메틸렌 1.5 mL에 용해한다.
(2). PVA를 0.3 ％(w/v)가 되도록 물에 용해한다.
(3). (2)의 PVA 수용액 8 mL를 (1)의 용액에 첨가하여 3 분간 교반하면, 수중 유적형(o/w형) 유탁액이 형성된다.
(4). (2)의 PVA 수용액 200 mL 중에 (3)를 첨가하여 520 회전/분으로 3 시간 동안 실온에서 교반한다.
(5). 원심 분리(3,000 회전/분, 15 분간)에 의해 미립자 제제를 침강시켜 분리하고, 추가로 증류수 10 mL를 첨가하여 2회, 원심 분리에 의해 세정한다.
(6). 하룻밤 데시케이터 내에서 감압 건조한다.
(7). 얻어진 미립자 제제의 입경 분포를 도 2에 나타낸다. 이 도면으로부터 명확한 바와 같이, 제조한 미립자 제제는 직경 약 2 마이크론에 피크를 갖고, 1 내지 10 마이크론의 사이에 분포를 갖는다. 이 입자는 상온에서 고체이다. 제조에 이용한 PLGA(500 mg)와 회수한 제제의 전체 중량으로부터 계산한 수율은 약 90 ％였다.
(8). 그 밖의 예
그 밖에 제조한 PLGA 미립자(분자량 및 조성)의 성상을 이하에 정리하였다.
1. PLGA-5005(PLGA 분자량 5,000, 락트산/글리콜산 50:50)
2. PLGA-5010(PLGA 분자량 10,000, 락트산/글리콜산 50:50)
3. PLGA-5020(PLGA 분자량 20,000, 락트산/글리콜산 50:50)
4. PLGA-7505(PLGA 분자량 5,000, 락트산/글리콜산 75:25)
5. PLGA-7510(PLGA 분자량 10,000, 락트산/글리콜산 75:25)
PLGA 미립자 제제 제조법은 PLGA의 종류를 제외하고 1.(b) (1) 내지 (6)과 마찬가지이다.
얻어진 미립자 제제의 평균 입경은 어떤 PLGA를 이용한 경우라도 약 2 마이크론이었다. 제조에 이용한 PLGA(500 mg)와 회수한 제제의 전체 중량으로부터 계산한 수율은 약 90 ％였다.
2. PLGA 미립자 제제를 탐식하는 것에 의한 폐포 대식세포의 탐식 증강 효과
(1). 폐포 대식세포 세포(NR8383 세포)를 1×106 개/mL로 배지(Ham F-12K, 15 ％ 우태 혈청)에서 제조하여 24웰 플레이트에 첨가하고, 여기에 PLGA-7520 미립자 제제를 0.04, 0.4, 4 마이크로그램(㎍) 첨가하여, 탄산 가스 배양기(37 ℃)에서 배양한다.
(2). 1 시간 배양 후, 배양액을 제거하고, 0.25 ％ 트립신/인산 완충액을 포함하는 생리 식염수(이하 PBS) 0.1 mL를 첨가하여 실온에서 5 분간 방치 후, 배양 상청액을 제거하고 세정한다.
(3). 이것에 0.1 mL의 배지를 첨가하여 80 ％ 퍼콜(파마시아사) 0.1 mL와 혼합하고, 40 ％ 퍼콜 용액을 제조하여 이것을 1.5 mL의 샘플 튜브에 넣은 70 ％ 퍼콜 0.1 mL에 중층하여 원심 분리(8,000 회전/분, 10 분간)한다.
(4). 원심 분리 후, 계면에 존재하는 세포를 회수하여 세포를 PBS에서 세정한 후, 배지를 1 mL 첨가하고, 입경 2.0 마이크론의 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 라벨한 폴리스티렌 라텍스 입자(FITC-PSLP)를 1×107 개 첨가하여 1 시간 배양한다. 형광성의 FITC로 라벨하는 것은 정량을 쉽게 하기 위해서이다.
(5). 배양 후, 원심 분리(700 회전/분, 5 분간)하고, 침강층의 대식세포에 PBS를 1 mL 첨가하여 원심 분리 조작을 2회 반복한다.
(6). PBS를 제거한 후에, 세포에 10 ％ 포르말린/PBS를 0.1 mL 첨가하여, 5 분간 고정 후 증류수를 1 mL 첨가하고, 상청액을 제거하고 다시 증류수를 1 mL 가하여 상청액을 제거한다. 상청액을 제거한 후, 0.1 mL의 증류수를 첨가하여 세포를 현탁시키고, 그 현탁액 0.02 mL를 취하여, 슬라이드 유리에 펼쳐 건조시킨다.
(7). 형광 현미경하에서 복수 시야 촬영을 행하여, 세포 100 개당 FITC-PSLP를 넣은 NR8383 세포의 수를 측정한다.
(8). PLGA 미립자 제제에 의한 대식세포의 FITC-PSLP 탐식량의 변화는 하기 표 1에 나타내는 바와 같다. PLGA 미립자 제제는 저량의 첨가로서는 대식세포의 탐식능에 대한 효과가 현저하지 않지만, 0.4(㎍/mL)의 첨가에 의해 탐식능이 현저히 활성화되는 것이 분명하다.
Figure pat00001
II. 리포 다당에 의한 대식세포 탐식능의 증강
1. 리포 다당 제조법
(a) 재료
(1). 그램 음성균 팬토에아(Pantoea)속 팬토에아·아글로메란스(Pantoea agglomerans)
(b) 리포 다당의 제조
(1). 7 리터(L)의 육즙 배지(트립톤 10 g/L, 효모 엑기스 5 g/L, NaCl 10 g/L, 글루코스 1 g/L, pH 7.5)에 팬토에아·아글로메란스(Pantoea agglomerans)를 첨가하고, 35 ℃에서 하룻밤 진탕 배양하여 약 70 g의 습균체를 집균한다.
(2). 균체 약 70 g을 500 mL의 증류수에 현탁하고, 500 mL의 90 ％ 가열 페놀을 첨가하여 65 내지 70 ℃에서 20 분간 교반하고, 냉각하고, 수층을 회수하였다. 회수한 수층을 하룻밤 투석하여 페놀을 제거하고, 투석 내액을 분자량 20만 컷트-오프막에 의해 2기압의 질소 가스하에서 초여과 농축한다.
(3). 얻어진 조 리포 다당 동결 건조물을 증류수에 용해하고, 음이온 교환 크로마토그래피(파마시아사 제조, Q-세파로스·패스트·플로우)에 걸고, 10 mM 트리스-HCl(pH 7.5) 및 10 mM의 NaCl을 포함하는 완충액으로 시료 용액을 칼럼에 통과시키고, 200 내지 400 mM NaCl/10 mM 트리스-HCl(pH 7.5)로 리뮬러스(Limulus) 활성 분획을 용출시킨다. 이 용출액을 상기와 동일한 조건으로 초여과하여 탈염 및 농축하고, 동결 건조하여 약 70 g의 습균체로부터 약 300 mg의 정제 리포 다당을 얻을 수 있다.
2. 리포 다당에 의한 폐포 대식세포의 탐식 증강 효과
(1). 폐포 대식세포 세포(NR8383)를 1×106 개/mL로 배지(Ham F-12K, 15 ％ 우태혈청)에서 제조하여, 24웰 플레이트에 첨가하고, 이것에 리포 다당을 1 ㎍/mL가 되도록 첨가하여, 탄산 가스 배양기(37 ℃)에서 배양한다.
(2). 1 시간 배양 후, 1.5 mL의 샘플 튜브로 세포를 옮겨, 배양액을 원심 분리(2,000 회전/분, 5 분간)로 제거하고, 0.25 ％ 트립신/PBS 0.1 mL를 첨가하여 실온에서 5 분간 방치 후, 원심 분리(2,000 회전/분, 5 분간)하고, 배양 상청액을 제거하여 PBS로 세정한다.
(3). 이것에 0.1 mL의 배지를 첨가하고, 60 ％ 퍼콜 0.1 mL와 혼합하여 30 ％ 퍼콜 용액을 제조하고, 원심 분리(8,000 회전/분, 10 분간)한다.
(4). 원심 분리 후, 액 표면에 존재하는 세포를 회수하여 PBS에서 2회 세정 후, 배지를 1 mL 첨가하고, 입경 2.0 마이크론의 FITC-PSLP를 1×107 개 첨가하여 1 시간 배양한다.
(5). 배양 후, 상청액을 제거하고, 0.25 ％ 트립신/PBS 0.1 mL를 첨가하여 실온에서 5 분간 방치 후, 배지를 1 mL 첨가하여, 원심 분리(700 회전/분, 5 분간)한다.
(6). 침강층의 대식세포에 PBS를 1 mL 첨가하여 원심 분리(700 회전/분, 5 분간)하여 상청액을 제거하고, 다시 PBS를 1 mL 첨가 후, 원심 분리(700 회전/분, 5 분간)하여 상청액을 제거한다.
(7). 상청액을 제거한 후에 세포에 10 ％ 포르말린/PBS를 0.1 mL 첨가하여, 5 분간 고정 후, 증류수를 1 mL 첨가하여, 상청액을 제거하고, 다시 증류수를 1 mL 첨가하여 상청액을 제거한다.
(8). 상청액을 제거한 후, 0.1 mL의 증류수를 첨가하여 세포를 현탁시키고, 그 현탁액 0.02 mL를 취하여, 슬라이드 유리에 펼쳐 건조시킨다.
(9). 형광 현미경하에서 복수 시야 촬영을 행하고, 세포 500 개당 FITC-PSLP를 혼입한 NR8383 세포의 수를 측정한다.
(10). 리포 다당에 의한 대식세포의 FITC-PSLP 탐식량의 증가는 하기 표 2에 나타내는 바와 같다. 리포 다당에 의해 대식세포의 탐식능이 활성화된 것이 분명하다.
Figure pat00002
B. 대식세포 내의 병원체에 작용하는 치료약
RFP-PLGA 미립자 제제 탐식에 의한 리팜피신(항결핵균약)의 대식세포 내로의 효과적 이행
1. 리팜피신을 내포한 PLGA 미립자 제제의 제조
(a) 재료
(1). PLGA(폴리(락트산/글리콜산) 공중합체) 단량체비: 75:25 또는 50:50, 분자량 5,000, 10,000 또는 20,000, 와꼬 쥰야꾸 가부시끼가이샤: PLGA-5005, 5010, 5020, 7505, 7510, 7520
(2). 리팜피신
(3). PVA(폴리비닐알코올) 중합도 500
(b) RFP-PLGA 미립자 제제의 제조
(1). PLGA 500 mg과 리팜피신(0, 50, 100, 200 mg)을 염화메틸렌 1.5 mL에 용해한다.
(2). PVA를 0.3 ％(w/v)가 되도록 물에 용해한다.
(3). (2)의 PVA 수용액 8 mL를 (1)의 용액에 첨가하여 3 분간 교반하면 o/w형 유탁액이 형성된다.
(4). (2)의 PVA 수용액 200 mL 중에 (3)을 첨가하여, 520 회전/분으로 3 시간, 실온에서 교반한다.
(5). 원심 분리(3,000 회전/분, 15 분간)에 의해 미립자 제제를 침강시켜 분리하고, 추가로 증류수 10 mL를 첨가하여 2회, 원심 분리에 의해 세정한다.
(6). 하룻밤 데시케이터 내에서 감압 건조한다.
(7). 제조한 RFP-PLGA 입자(분자량 및 조성)를 이하에 정리하였다.
1. RFP-PLGA 5005(PLGA 분자량 5,000, 락트산/글리콜산 50:50)
2. RFP-PLGA 5010(PLGA 분자량 10,000, 락트산/글리콜산 50:50)
3. RFP-PLGA 5020(PLGA 분자량 20,000, 락트산/글리콜산 50:50)
4. RFP-PLGA 7505(PLGA 분자량 5,000, 락트산/글리콜산 75:25)
5. RFP-PLGA 7510(PLGA 분자량 10,000, 락트산/글리콜산 75:25)
6. RFP-PLGA 7520(PLGA 분자량 20,000, 락트산/글리콜산 75:25)
얻어진 미립자 제제의 입도 분포 및 성상은 모두 PLGA만의 미립자 제제(A. I. 1. (b)(7))와 같은 것이었다.
(8). 500 mg의 PLGA 중에 리팜피신을 0, 50, 100, 200 mg 함유시킨 미립자 제제 4 mg을 염화메틸렌 1 mL에 용해한 후, 475 nm에서 흡광도를 분광 광도계로 측정한다.
(9). RFP-PLGA 미립자 제제(PLGA 분자량 20,000, 락트산/글리콜산 75:25를 포함하는 미립자 PLGA-7520) 중의 회수 리팜피신의 양을 하기 표 3에 나타내었다. 이 결과로부터 명확한 바와 같이, 리팜피신은 효율적으로 제제화되어 있다는 것을 알 수 있다.
Figure pat00003
2. 그 밖의 RFP-PLGA 미립자 제제 제조법(막 유화법, 공지)
막 유화법을 이용하여 RFP-PLGA 7510 미립자 제제를 제조하였다.
막 유화법은 2종의 서로 섞이지 않은 액체 중 한쪽(분산상)을 가압하여, 다공질 유리막(SPG막)을 통해 다른쪽의 액체(연속상) 중에 분산시키는 유화 방법이고, 이 방법을 이용하면 균일한 입경을 갖는 유탁액을 얻을 수 있다.
(a). 재료
(1). PLGA(폴리(락트산/글리콜산) 공중합체) 단량체비: 75:25, 분자량 10,000, 와꼬 쥰야꾸 가부시끼가이샤: PLGA 7510
(2). 리팜피신
(3). PVA(폴리비닐알코올) 중합도 500
(b) RFP-PLGA 미립자 제제의 제조
(1). PLGA 500 mg과 리팜피신 100 mg을 염화메틸렌 10 mL에 용해한다.
(2). PVA를 0.3 ％(w/v)가 되도록 물에 용해한다.
(3). (2)의 PVA 수용액 100 mL 중에 SPG막(이세 가가꾸 고교, 세공 직경 0.49 ㎛)을 통해 (1)의 용액을 분산하면 수중 유적형(o/w형) 유탁액이 형성된다.
(4). (2)의 PVA 수용액 200 mL 중에 (3)을 첨가하여, 520 회전/분으로 3 시간, 실온에서 교반한다.
(5). 원심 분리(3,000 회전/분, 15 분간)에 의해 미립자 제제를 침강시켜 분리하고, 추가로 증류수 10 mL를 첨가하여 2회, 원심 분리에 의해 세정한다.
(6). 하룻밤 데시케이터 내에서 감압 건조한다.
(7). 얻어진 미립자 제제의 평균 입경은 1.98 마이크론이다. 제조에 이용한 PLGA(500 mg)와 회수한 제제의 전체 중량으로부터 계산한 PLGA의 수율은 약 90 ％였다. 또한, 리팜피신의 수율은 약 75 ％였다. 이 입자는 상온에서 고체이다.
3. 막 유화법에 의한 그 밖의 예
막 유화법을 이용하여 제조한 RFP-PLGA 7510 미립자 제제 이외의 RFP-PLGA 미립자(분자량 및 조성)를 이하에 정리하였다.
1. RFP-PLGA 5005(PLGA 분자량 5,000, 락트산/글리콜산 50:50)
2. RFP-PLGA 5010(PLGA 분자량 10,000, 락트산/글리콜산 50:50)
3. RFP-PLGA 5020(PLGA 분자량 20,000, 락트산/글리콜산 50:50)
4. RFP-PLGA 7505(PLGA 분자량 5,000, 락트산/글리콜산 75:25)
5. RFP-PLGA 7520(PLGA 분자량 20,000, 락트산/글리콜산 75:25)
이들 RFP-PLGA 미립자 제제 제조법은 PLGA의 종류를 제외하고 상기한 막 유화법과 마찬가지이다.
얻어진 미립자 제제의 평균 입경은, PLGA 5005에서는 2.20 마이크론, PLGA 5010에서는 2.66 마이크론, PLGA 5020에서는 2.29 마이크론, PLGA 7505에서는 2.00 마이크론, PLGA 7520에서는 1.85 마이크론이다. 제조에 이용한 PLGA(500 mg)와 회수한 제제의 전체 중량으로부터 계산한 PLGA의 수율은 모두 약 90 ％였다. 또한, 리팜피신의 수율은 PLGA 5005에서는 약 87 ％, PLGA 5010에서는 약 78 ％, PLGA 5020에서는 약 67 ％, PLGA 7505에서는 약 91 ％, PLGA 7520에서는 약 58 ％였다.
4. RFP-PLGA 미립자로부터의 리팜피신의 방출
(1). 막 유화법에 의해 제조한 각 RFP-PLGA 미립자 50 mg을 37 ℃(온도)로 유지한 pH 7.4 인산 완충액(이온 강도 0.154 M) 5 mL에 분산하였다.
(2). 경시적으로 원심 분리에 의해 상청액을 채취하고, 잔류 미립자에 pH 7.4 인산 완충액(이온 강도 0.154 M) 5 mL를 첨가하였다.
(3). 상청액에 용출된 리팜피신 농도를 측정하였다. 이는 분광 광도계를 이용하여 475 nm의 파장으로 측정하였다.
(4). 각 RFP-PLGA 미립자로부터 상청액에 방출된 리팜피신의 비율을 도 4 및 도 5에 나타내었다. 본 실험 데이터로부터 PLGA의 분자량이 5,000 및 10,000인 PLGA 5005, PLGA 5010와 PLGA 7505, PLGA 7510에서는 리팜피신 방출 속도가 빠르다는 것이 나타났다. 이러한 결과로부터 분자량 5,000 내지 10,000, 락트산과 글리콜산의 비가 50:50 또는 75:25인 PLGA의 조성물이 탐식을 통한 대식세포로의 약제의 이행이 우수하다는 것이 나타났다.
5. RFP-PLGA 미립자 제제(PLGA-7520)의 탐식에 의한 세포내 리팜피신 농도의 선택적 증가
(1). 제조한 RFP-PLGA 미립자 제제를 PBS에 재분산시켜, 원심 분리(400 회전/분, 5 분간)을 행하여 큰 입자를 제거하고, 현미경 관찰에 의해 약 1 내지 3 마이크론의 크기로 제조한 미립자 제제(중량으로 약 30 ％)를 이후의 실험에 이용한다.
(2). 5×105 개/0.9 mL로 배지에서 배양한 NR8383 세포를 24웰 플레이트에 넣고, 이것에 각 RFP-PLGA 미립자 제제 0.12 mg/0.1 mL를 첨가하여, 12 시간 배양한다.
(3). 배양 후, 배양액을 제거하고, 0.25 ％ 트립신/PBS 0.1 mL를 첨가하여 실온에서 5 분간 방치 후, 배양 상청액을 제거하여 세정한다.
(4). 여기에, 0.1 mL의 배지를 첨가하고 80 ％ 퍼콜 0.1 mL와 혼합하여 40 ％ 퍼콜 용액으로 하고, 이것을 1.5 mL의 샘플 튜브에 넣은 70 ％ 퍼콜 0.1 mL상에 중층하여, 원심 분리(8,000 회전/분, 10 분간)한다.
(5). 원심 분리 후, 계면에 존재하는 세포를 회수하여 PBS로 세정한 후, 세포 중에 혼입된 리팜피신을 염화메틸렌으로 추출한다.
(6). 리팜피신의 양은 475 nm의 흡광도로부터 결정한다.
(7). 대조로서 각 RFP-PLGA 미립자 제제 0.12 mg 중에 포함되는 동량의 리팜피신의 디메틸술폭시드(DMSO) 용액을 제조하고, 이것을 1 mL의 배지를 첨가한 24웰 플레이트에 첨가하여 그것에 NR8383 세포를 첨가한다.
(8). 세포를 12 시간 배양한 후, 세포(5×105 개)를 회수하여 세포 중의 리팜피신을 염화메틸렌으로 추출한다.
(9). 리팜피신의 대식세포에 의한 혼입량을 도 3에 나타낸다. 리팜피신의 첨가량이 40(㎍/5×105 개/웰/mL)에 있어서, 종래의 리팜피신을 포함하는 배지와 비교할 때, 본 실시예의 RFP-PLGA 미립자 제제의 경우에는 약 19 배쯤의 리팜피신이 혼입되어 있다는 것이 나타나 있다.
C. 대식세포의 탐식능을 증강하여 대식세포 내의 병원체에 작용하는 약물(A+B)
RFP-PLGA 미립자 제제 탐식에 의한 대식세포의 탐식 활성 증강 효과
1. RFP-PLGA 미립자 제제의 제조
(a) 재료
(1). PLGA(폴리(락트산/글리콜산) 공중합체) 단량체비: 75:25 또는 50:50, 분자량 5,000, 10,000 또는 20,000, 와꼬 쥰야꾸 가부시끼가이샤: PLGA-5005, 5010, 5020, 7505, 7510, 7520
(2). 리팜피신
(3). PVA(폴리비닐알코올) 중합도 500
(b) RFP-PLGA 미립자 제제의 제조
(1). PLGA 500 mg과 리팜피신 100 mg을 염화메틸렌 1.5 mL에 용해한다.
(2). PVA를 0.3 ％(w/v)가 되도록 물에 용해한다.
(3). (2)의 PVA 수용액 8 mL를 (1)의 용액에 첨가하여 3 분간 교반하면 o/w형 유탁액이 형성된다.
(4). (2)의 PVA 수용액 200 mL 중에 (3)를 첨가하여, 520 회전/분으로 3 시간, 실온에서 교반한다.
(5). 원심 분리(3,000 회전/분, 15 분간)에 의해 미립자 제제를 침강시켜 분리하고, 추가로 증류수 10 mL를 첨가하여 2회, 원심 분리에 의해서 세정한다.
(6). 하룻밤 데시케이터 내에서 감압 건조한다.
(7). 얻어진 미립자 제제의 입도 분포 및 성상은 PLGA만의 미립자 제제(A. I. 1. (a)(7))와 같은 것이었다.
(8). PBS에 미립자 제제를 재분산시켜, 원심 분리(400 회전/분, 5 분간)로 큰 미립자 제제를 제거하고, 현미경 관찰로 약 1 내지 3 마이크론의 크기로 조정한 미립자 제제를 이후의 실험에 이용한다.
2. RFP-PLGA 미립자(PLGA-7520) 제제의 탐식에 의한 대식세포 탐식 활성 증강
(1). 폐포 대식세포 세포(NR8383)를 1×106 개/mL로 배지(Ham F-12K, 15 ％ 우태혈청)에서 제조하여, 24웰 플레이트에 첨가하고, 여기에 PLGA 미립자 제제를 0.012, 0.12, 1.2 ㎍ 첨가하여 탄산 가스 배양기(37 ℃)에서 배양한다.
(2). 1 시간 배양 후, 1.5 mL의 샘플 튜브로 세포를 옮겨, 배양액을 제거하고, 0.25 ％ 트립신/PBS 0.1 mL를 첨가하여 실온에서 5 분간 방치 후, 배양 상청액을 제거하여 세정한다.
(3). 여기에 0.1 mL의 배지와 90 ％ 퍼콜 0.1 mL를 첨가하여 퍼콜 농도를 45 ％로 한 후에, 원심 분리(8,000 회전/분, 10 분간)한다.
(4). 원심 분리 후, 액 표면의 세포를 회수하여, 이 세포를 PBS에서 2회 세정 후, (1)에서 사용한 것과 동일한 배지를 1 mL 첨가하고, 입경 2.0 마이크론의 FITC-PSLP를 1×107 개 첨가하여 1 시간 배양한다.
(5). 배양 후, 상청액을 제거하고, 0.25 ％ 트립신/PBS 0.1 mL를 첨가하여 실온에서 5 분간 방치 후, 배지를 1 mL 첨가하여, 원심 분리(700 회전/분, 5 분간)한다.
(6). 침강층의 대식세포에 PBS를 1 mL 첨가하여 원심 분리(700 회전/분, 5 분간)하여 상청액을 제거하고, 다시 PBS를 1 mL 첨가 후, 원심 분리(700 회전/분, 5 분간)하여 상청액을 제거한다.
(7). 상청액을 제거한 후에, 세포에 10 ％ 포르말린/PBS를 0.1 mL 첨가하여, 5 분간 고정 후, 증류수를 1 mL 첨가하고, 원심 분리(700 회전/분, 5 분간)하여 상청액을 제거한다. 여기에 0.1 mL의 증류수를 첨가하여 세포를 현탁시키고, 그 현탁액 0.02 mL를 취하여, 슬라이드 유리에 펼쳐 건조시킨다.
(8). 형광 현미경하에서 복수 시야 촬영을 행하여, 세포 500 개당 FITC-PSLP를 혼입한 대식세포(NR8383 세포)의 수를 측정한다.
(9). RFP-PLGA 미립자 제제 탐식에 의한 대식세포의 FITC-PSLP 탐식량의 증가는 하기 표 4에 나타내는 바와 같다. RFP-PLGA 미립자 제제에 의해 대식세포의 탐식능이 활성화된 것이 분명하다.
Figure pat00004
이상의 결과로부터, (1) PLGA 미립자 제제 및 리포 다당은 대식세포의 탐식능을 활성화한다는 것이 명확해졌다. 또한, (2) 리팜피신의 대식세포 내로의 이행은 PLGA 미립자 제제 중에 포함됨으로써 각별히 증대된다는 것, 및 (3) PLGA 미립자 제제 내에 리팜피신이 함유되어 있더라도, 대식세포 탐식능은 활성화된다는 것이 명확해졌다. 따라서, 리팜피신 함유 PLGA 미립자 제제는 대식세포의 탐식능을 활성화하고, 그 결과 리팜피신의 대식세포 내 농도는 증대되어, 대식세포 내에 보유된 병원체에 대해 효율적으로 작용시킨다는 본 발명의 목적을 달성할 수 있게 된다. 상기한 결과는, 본 발명의 기본 개념인 "대식세포의 탐식 활성을 항진"시킴으로써, 대식세포 내의 병원체에 작용하는 치료약을 대식세포 내에 유효하게 혼입시키는 신규 치료약의 일례를 나타내는 것이다.
3. RFP-PLGA 미립자 제제의 탐식에 의한 대식세포 내 결핵균 살멸 효과
(a) 대식세포 내 결핵균(BCG)의 생존율 측정법
(1). 건조 BCG 백신을 생리 식염수로 용해하여(12 mg/mL) 교반한 후, KRD 배지(3 내지 4 mL)를 T-25 배양 플라스크로 옮겨 BCG 현탁액을 40 μL 넣고, 건식 인큐베이터 37 ℃에서 배양하였다.
(2). 실험에서는 균액과 글래스 비드를 1:4의 비율로 샘플 튜브에 넣고, 볼텍스 믹서로 1 분간 교반 후, 추가로 초음파 세정기에서의 5 분간의 초음파 처리에 의해 균체의 분산을 행하였다.
(3). NR8383을 1×106 개/mL의 농도로 6웰 플레이트에 넣었다(총부피 5 mL). 결핵균(BCG)을 세포당 10 개(multiplicity of infection(M0I)=10)로 세포 배양액에 첨가하였다.
(4). 37 ℃, 탄산 가스 배양기로 4 시간 감염시킨 후, 2,000 회전/분, 5 분간(SCT15B) 원심 분리 후, 상청액을 제거하였다. 무혈청 배지를 이용하여 상기와 마찬가지로 원심 분리를 2회 반복하여 세포 밖에 있는 균을 제거하였다.
(5). NR8383을 1×106 개/mL의 농도로 24웰 플레이트에 시딩하였다.
(6). NR8383에 각 RFP-PLGA 미립자를 세포 1 개당 10 개의 비율로 배양액에 첨가하였다.
(7). 37 ℃, 탄산 가스 배양기로 4 시간 탐식시킨 후, 세포 밖에 있는 입자를 0.25 ％ 트립신을 이용하여 제거하였다.
(8). 80 ％ 퍼콜을 첨가하여 40 ％ 퍼콜-세포액을 만들고, 추가로 70 ％ 퍼콜을 첨가하여 밀도 구배를 만들었다. 10,000 회전/분, 5 분간(SORVALL Biofuge fresco) 원심 분리한 후, 40 ％, 70 ％ 퍼콜사이의 계면의 세포를 회수하여 세포와 RFP-PLGA를 분리하였다.
(9). PBS를 이용하여 마찬가지로 원심 분리를 2회 반복하여 퍼콜을 제거하였다.
(10). 플루오레세인 디아세테이트(FDA, Fluorescein diacetate)/에티듐 브로마이드(Ethidium bromide, EB) 염색법을 이용하여 생균과 사균의 비율을 측정하였다. FDA는 5 mg/mL의 농도로 아세톤에 용해하고, 사용시에 상기 용해물 20 μL를 1 mL의 PBS로 희석하였다. EB는 20 ㎍/mL의 농도로 PBS에 용해하여, 사용시에 상기 용해물 50 μL를 1 mL PBS로 희석하여 이용하였다. 염색은 희석한 FDA와 EB를 등량 혼합하여 사용하였다. 이 혼합액 1 μL를 슬라이드 유리 상에 놓고, 그 위에 1 μL 균액을 놓아 2 분간 실온에 두어 형광 현미경으로 관찰하였다. 생균은 균으로부터 유래된 에스테라제 활성에 의해 FDA가 분해되어 녹색의 형광을 발한다. 한편, 사균은 에스테라제 활성이 없기 때문에, FDA에 의한 염색은 보이지 않고, EB에 염색되어 오렌지색의 형광을 발한다.
(b) 탐식에 의해 대식세포 내에 혼입된 RFP-PLGA 미립자 제제의 결핵균 살멸 효과
(1). RFP-PLGA 미립자에 의한 대식세포 내의 결핵균 살멸 효과를 조사하기 위해, 미리 결핵균을 탐식한 대식세포(결핵균 감염 대식세포)에 RFP-PLGA 미립자를 투여하여 이 미립자를 대식세포에 탐식시켰다.
(2). 탐식에 의해 대식세포 내로 이행한 RFP-PLGA가 대식세포 내 결핵균에 대해 어떠한 살멸 효과를 나타내는 지를 조사한 결과를 도 6에 나타내었다. 단독의 리팜피신(100 ㎍/mL)보다도 약 20 분의 1의 리팜피신을 함유하는 RFP-PLGA 미립자 투여량이어도(MOI=10, 추정 리팜피신의 양이 5 ㎍/mL이기 때문에, 미립자 제제 중의 리팜피신은 리팜피신을 단독으로 투여한 경우의 20 분의 1의 양에 상당함), 리팜피신의 세포내 농도가 유의적으로 높아지는 것이 분명하다. 결핵균감염 폐포 대식세포로의 RFP-PLGA 미립자의 투여는, 단독 투여의 리팜피신에 비해 세포내의 결핵균을 20배 이상의 효율로 살멸하였다. 즉, 입자의 탐식을 통한 약제 투여에 의해 약제 그 자체의 항결핵 작용에 관계 없이 20배 이상의 치료 계수의 향상이 얻어졌다.
<대식세포의 탐식 활성을 항진시켜 기능 이상의 상태에 있는 대식세포에 작용하는 치료약의 제공>
암 조직에는, 통상 다수의 대식세포가 침윤하고 있다는 것이 알려져 있다. 이는 암 세포가 생체에서 이물이기 때문에, 암 세포를 배제할 목적으로 대식세포가 집적하는 데 기초한다. 대식세포 기능이 정상이면, 암 세포는 상해되어 소감되지만, 대식세포의 기능에 이상이 있으면, 암 세포를 상해하지 못하고 암 세포가 성장하여, 종양 덩어리를 형성하기에 이른다. 그런데 이미 진술한 바와 같이, 대식세포의 활성화에 의해 대식세포는 암 세포에 대해서도 상해를 제공할 수 있게 된다. 따라서, 대식세포의 탐식 활성을 항진시킴으로써, 기능 이상이 된 대식세포에 암 세포 상해 작용을 획득시켜, 암을 유효하게 치료할 수 있다.
한편, 표 2에 나타낸 바와 같이 폐포 대식세포의 탐식 작용은 리포 다당(1 ㎍/mL)의 처리에 의해 166 ％나 증강하여, 리포 다당에 의해 폐포 대식세포가 활성화되었다. 그래서, 리포 다당에 의해 탐식능이 활성화된 폐포 대식세포는 폐암 세포에 대해 세포 상해 작용을 발현한다고 생각된다. 따라서, 여기서는 리포 다당에 의한 활성화 폐포 대식세포의 폐암 세포 상해 작용의 예를 나타내는 것이다.
구체적인 적용예: 폐암
폐포 대식세포를 활성화함에 의한 폐암 세포 상해 효과를 적용예로서 나타낸다.
1. 리포 다당에 의한 폐포 대식세포의 활성화 및 폐포 대식세포와 사토 폐암 세포의 공배양
(1). NR8383을 1×106 개/mL의 농도로 24웰 플레이트에 넣었다(총부피 1.5 mL). 대조로서 5 ％ 우태혈청, F-12K 배지 150 μL, 10 ㎍/mL 리포 다당 150 μL를 첨가하였다.
(2). 37 ℃, 탄산 가스 배양기에서 24 시간 방치하였다.
(3). 사토 폐암 세포를 1×105 개/mL의 농도로 제조하여, 96웰 플레이트에 1 웰당 50 μL를 첨가하였다.
(4). (1)의 항에서 처리한 NR8383을 5×105, 1×105, 5×104, 1×104 개/mL의 농도로 제조하여, 96웰 플레이트에 1 웰당 50 μL를 넣었다(총부피 100 μL).
(5). 37 ℃, 탄산 가스 배양기에서 4 시간 방치하였다.
2. 사토 폐암 세포와 공배양한 대식세포의 폐암 세포에 대한 상해 작용
(1). 1에 기재한 리포 다당에 의해 활성화되고 사토 폐암 세포와 공배양된 대식세포의 암 세포에 대한 상해 효과를, 세포내로부터 배양액 중에 방출된 락트산 데히드로게나아제의 양으로부터 평가하기 위해, 1,000 회전/분으로 5 분간 원심 분리 후, 상청액 50 μL를 별도의 96웰 플레이트에 분취하였다.
(2). 이어서, 락트산 데히드로게나아제의 양을 측정하는 키트(CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega, cat. G1780)에 부착된 기질용액 50 μL를 첨가하였다. 또한, 포지티브 대조로서, 키트에 부착된 락트산 데히드로게나아제 효소 희석액(5000배 희석액 50 μL)을 이용하였다.
(3). 알루미늄 호일로 차광하여 실온에서 30 분간 방치하였다.
(4). 정지액 50 μL를 첨가하여 반응을 정지시켰다.
(5). 마이크로 플레이트 리더(Model 55O, 바이오-래드사 제조)를 이용하여 495 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
(6). 각 흡광도로부터 세포 독성(％)을 산출하였다.
(7). 사토 폐암 세포에 미치는 NR8383의 세포 독성 효과를 도 7에 나타낸다. 리포 다당 미처리의 NR8383에 비해, 리포 다당 처리한 NR8383는 탐식이 항진되어, 그 결과 사토 폐암에의 세포 상해 효과는 세포비에 의존하여 증강된다는 것이 나타났다.
<대식세포의 탐식 활성을 항진시켜 병원체를 보유하는 대식세포를 세포사시키는 치료약의 제공>
본 실시 형태의 치료약은 대식세포의 탐식 활성을 항진시킴으로써, 병원체를 보유하는 대식세포를 세포사시키는 것을 특징으로 한다.
표 2에서 나타낸 바와 같이, 대식세포 활성화제로서 잘 알려져 있는 리포 다당은 대식세포의 탐식 활성을 항진시킨다. 또한, 대식세포 활성화인자의 대표적인 사이토카인인 인터페론 γ도 탐식 활성을 항진시킨다. 즉, 대식세포의 탐식 활성의 항진은 대식세포 활성화의 지표 중 하나이다. 본건에서 나타낸 탐식에 의한 탐식 활성의 항진은, 탐식이라는 자극이 탐식 항진이라는 대식세포의 활성화를 유도하였다고 할 수 있다. 또한, 리포 다당이나 인터페론 γ에 의한 대식세포의 활성화에 따라, 대식세포의 막 구조의 변화가 유도되어, 대식세포 내에 막 결합형 종양 괴사 인자(TNF)가 유도된다는 것이 알려져 있다. 따라서, 탐식이라는 자극에 의한 대식세포의 활성화에 따라 막 결합형 TNF가 유도되는 것이다.
에이즈는 에이즈 바이러스 감염에 의해, T 세포가 파괴되어 면역 응답이 부전됨으로써 발병한다. 그런데, 에이즈 바이러스 감염은 T 세포에 감염되는 것 뿐만 아니라, 대식세포에 감염된다. 이 감염은 에이즈 바이러스가 T 세포, 대식세포 세포막 상에 공통되어 발현하는 CD4 단백질에 흡착함으로써 시작되기 때문이다. 에이즈 바이러스가 감염된 대식세포는, 세포사되지 않고 지속적으로 에이즈 바이러스를 생성하여, II. (2)에서 상술한 바와 같이 감염 병원체 매체가 된다.
따라서, 에이즈 바이러스로 감염된 대식세포를 세포사시킬 수 있으면, 감염 병원체 매체의 살멸이 달성된다. 이 가능성을 실현시킬 수 있는 일례로서, 막 결합형 TNF가 에이즈 바이러스(HIV)에 감염된 대식세포 세포에 작용하여 상기 세포를 특이적으로 세포사시킬 수 있다는 것이 나타나 있다.
구체적인 적용예: 막 결합형 TNF 발현 세포에 의한 HIV 감염 세포사의 유도
TNF가 병원체에 감염된 세포에 대해 세포사시키는 실시예로서 HIV 감염 몰트 4(M0LT-4) 세포에 대한 TNF의 작용을 나타낸다.
1. 막 결합형 TNF 발현 세포의 제조
(1). 막 결합형 TNF를 안정적으로 발현시키기 위해, 문헌[기보(져널 오브 바이올로지(Journal of Virology), 1889년, 제63권, pp.2504-2509)]에 따라 마우스 및 인간막 결합형 TNF 발현 플라스미드(pMT2βG/Hu-proTNF)를 제조하였다.
(2). 이어서, 이 발현 플라스미드를 네오마이신 내성 유전자를 10:1의 비율로 조합한 형질 전환주 선택용 플라스미드와 혼합하여, 마우스 태아에서 유래된 섬유 아세포(NIH3T3 세포)에 도입하였다.
(3). 상기, 형질 전환 조작을 행한 NIH3T3 세포를 선택 마커인 네오마이신800 ㎍/mL의 존재하에 37 ℃, 탄산 가스 배양기 내에서 약 2 주간 배양하였다.
(4). 배양 후, 세포에 조립된 TNF의 클론을 취득하였다.
(5). 취득한 클론은 막 결합형 TNF를 발현하고 있다는 것을 효소 면역 측정법으로 확인하였다.
2. HIV 감염 몰트 4 세포의 제조
(1). HIV 감염 세포의 경우, 37 ℃, 탄산 가스 배양기 내에서, 배지(RPMI1640, 10 ％ 우태혈청 및 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(100 ㎍/mL)을 첨가) 중에서, HIV 감염 세포(HTLV-IIIB 균주)를 이용하고, 문헌[기보(져널 오브 바이올로지, 1889년, 제63권, pp.2504-2509)]에 따라 몰트 4를 감염시켰다. 몰트 4 세포에 에이즈 바이러스 감염이 성립하면, 몰트 4 세포는 지속적으로 에이즈 바이러스를 생성하는 특징을 나타낸다. 따라서, 에이즈 바이러스 생성에 대해서 보면, 몰트 4 세포는 에이즈 바이러스 감염 대식세포의 모델이다.
(2). 이 감염 조건으로 HIV 감염 몰트 4 세포의 90 ％ 이상이 HIV 항체에 양성이 된다.
(3). 따라서, HIV 감염 세포에 의해 HIV는 몰트 4 세포의 거의 모두에 도입되어, HIV 감염 몰트 4 세포가 제조된다.
3. 막 결합형 TNF 발현 세포에 의한 HIV 감염 세포의 세포사 유도
(1). TNF의 플라스미드를 도입한 NIH3T3 세포를 24웰 배양 플레이트에 거의 플레이트 일면이 되도록 배양하였다.
(2). 이어서, 일정량의 HIV 감염 몰트 4 세포를 첨가하여 3 일간, 37 ℃, 탄산 가스 배양기 내에서 혼합 배양하였다.
(3). 발현한 막 결합형 TNF의 HIV 감염 세포에 대한 작용을 조사하기 위해, HlV 감염 세포의 생존율을 트리판 블루 색소 배제법으로 측정하였다.
(4). 그 결과, HIV에 감염된 몰트 4 세포의 40 ％가 막 결합형 TNF 발현 세포와의 혼합 배양으로 세포사한다는 것이 인정되었다.
이상의 예로부터 명확한 바와 같이, 막 결합형 TNF는 에이즈 바이러스(HIV)에 감염된 세포에 대해, 특이적으로 세포사를 유도하는 것이 분명하다. 이 때문에, 병원체를 보유함으로써 기능 이상이 된 대식세포가, 병원체를 탐식함으로써 활성화되어, 그 결과 유도된 막 결합형 TNF가 병원체 감염 대식세포를 세포사시킨다고 볼 수 있다.
대식세포가 병원체를 보유하여 발생하는 질환에는 항산균증, 에이즈, 클라미디아증, 또는 톡소플라즈마증 등이 있고, 항산균증에는 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 또는 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)를 원인균으로 하는 결핵, 마이코박테리움 레푸라(Mycobacterium leprae)를 원인균으로 하는 나병, 또는 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium) 등을 원인균으로 하는 비정형 항산균증 등이 있으며, 클라미디아증의 원인균으로서는 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 또는 클라미디아 싯타시(Chlamydia psittaci) 등이 있고, 모두 본 발명을 유효하게 적용할 수 있다. 그런데, 본 실시 형태에서 나타낸 RFP-PLGA 미립자의 대식세포 내 결핵균 살멸 효과는, 탐식에 의해 식포 내에 혼입된 RFP-PLGA 미립자로부터 리팜피신이 유리하여, 식포막을 투과하고, 추가로 결핵균 함유 식포의 식포막을 투과하는, 2회 이상의 세포내 소포막 구조의 통과가 없으면 달성되지 않는다. 상기에 나타낸 원인균의 대식세포 내에서의 생사 전략은 다양하다. 항산균증 전체, 레지오넬라, 톡소플라즈마는 식포 내에 원인균이 생존함으로써, 대식세포 내에서 생존한다. 리스테리아, 클라미디아는 원인균이 식포로부터 탈출하는 특징을 갖는다. 이들 원인균의 세포내 생존 형태는, 식포 내에 원인균이 존재하는 경우에 비해, 약제의 도달면에서 보면 약제가 한번 식포막을 투과하면 약효를 기대할 수 있기 때문에, 보다 용이하다고 추정된다. 또한, 에이즈는 세포내에 존재하는 원인균에 약제가 도달하면 약효를 기대할 수 있는 점에서, 리스테리아 등과 마찬가지이다. 이상의 점으로부터 본 발명은 상기 기재의 원인균에 대해서도 유망한 치료법이다.
또한, 본 발명을 유효하게 적용할 수 있는 각 질환에 대한 약물을 이하에 예를 든다.
1) 항산균증: 리팜피신, 이소니아지드, 에탐부톨, 피라진아마이드, 아지쓰로마이신, 카나마이신, 황산스트렙토마이신, 엔비오마이신, 에티오니아미드, 사이클로세린, 레보플록사신, 디아페닐술폰.
2) 에이즈: 아지도티미딘, 디데옥시이노신.
3) 클라미디아증: 염산미노사이클린, 염산독시사이클린, 클라리쓰로마이신, 스파플록사신, 록시쓰로마이신, 레보플록사신.
4) 톡소플라즈마증: 피리메타민, 술파모노메톡신, 아세틸스피라마이신.
5) 말라리아증: 인산클로로퀸, 황산퀴닌, 술파독신, 메플로퀸.
6) 암: 5-플루오로우라실, 아드리아마이신, 시스플라틴, 에토포시드, 마이토마이신, 빈크리스틴, 탁솔, 캄프토테신, 빈블라스틴, 사이클로포스파마이드, 블레오마이신
7) 크론병: 살라조술파피리딘, 글루코코르티코이드.
8) 류마티즘: 금 티오말산나트륨, 페니실라민, 부실라민, 글루코코르티코이드.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그대로 참고로서 본 명세서에 참작한 것으로 한다.
본 발명에 따라, 대식세포의 기능 이상에 의해 유발되거나 대식세포를 매체로 하여 유발되는 질병을 효과적으로 치료할 수 있는 치료약을 제공할 수 있다.

Claims (2)

  1. 팬토에아·아글로메란스(Pantoea agglomerans)의 리포 다당을 포함하고, 에이즈에 대한 것으로서, 대식세포의 탐식 활성을 항진시켜, 병원체를 보유하는 대식세포를 세포사로 유도하는 것을 특징으로 하는 에이즈에 대한 치료약.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대식세포가 점막 조직에 상재하는 것임을 특징으로 하는 치료약.
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