JPWO2004019982A1 - 治療薬 - Google Patents

Abstract

機能異常のマクロファージ、又は、マクロファージを媒体して罹患する疾病に対する治療薬を提供するためのものであり、マクロファージの貪食機能を活性化しこれを利用して、マクロファージに積極的に貪食されることでマクロファージに効率的に取り込ませ、これにより、機能異常となったマクロファージを正常化する、病原体感染マクロファージを殺滅する、又は、病原体感染マクロファージ内の病原体を殺滅する治療薬。

Description

本発明は、マクロファージの貪食能を利用し、機能異常マクロファージの正常化を図る、又は種々の感染性病原体に有効な治療薬に関するものである。本発明にかかる治療薬（薬物又は製剤）は、治療上及び／又は診断上の目的で与えられるあらゆる物質及びこれらの集合体を対象とし、その製剤は、薬物（場合によっては、薬物担体を含む）と薬物担体の合剤である。

Ｉ．マクロファージ
まず、本発明にかかる治療薬の作用において中核的機能を担うマクロファージについて概説する。
マクロファージの形態・機能については、例えば高橋 潔 等著「生命を支えるマクロファージ」、文光堂、２００１年に詳述されているが、本発明に関連する背景を述べれば以下の通りである。マクロファージとは単核食細胞系（ＭＰＳ：Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｐｈａｇｏｃｙｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を構成する細胞である。血中の単球は骨髄細胞中の造血幹細胞に由来し、骨髄中で分裂分化して血中に流出し、種々の組織に定着して種々の名称で呼ばれる単球細胞へと分化する。この細胞は結合組織中では組織球、肝臓ではクッパー細胞、肺では肺胞マクロファージ、リンパ節／脾臓ではマクロファージ、体腔では胸腔／腹腔マクロファージ、骨では破骨細胞、皮膚ではランゲルハンス細胞、神経組織では小膠細胞、脳ではマイクログリア、滑膜ではＡ型細胞と呼ばれ、組織特異的な性質を有する。
１．一般的性状
（１）．直径約１５〜２０ミクロンの単核細胞で、細胞質に富み、ガラスやプラスティック表面に粘着し易い。偽足を出して運動し、強い異物貪食作用を持つ。
（２）．生体防御担当細胞。
（３）．異物排除機能と免疫能を持つ。
（４）．抗原情報をＴリンパ球に提示して免疫を成立させる。
（５）．インターフェロンによって活性化され、細胞性免疫のエフェクターとなる。
（６）．リンパ球に比較してＸ線抵抗性である。
２．マクロファージの生理的意義
（１）．貪食機能
マクロファージの機能として最もよく知られているものは、貪食作用である。この機能は生命が誕生し、これが進化するにあたって単細胞の時代から備わっていた最も基本的な機能のひとつと考えてよい。従って、マクロファージの特徴のひとつは、その存在が種横断的に普遍性を持つことである。この特徴は、マクロファージ機能を対象とする研究の大きな利点のひとつを提供していると思われる。つまり、仮に哺乳動物の疾病を対象とした治療薬の開発研究を行う場合であっても、哺乳動物以外のマクロファージが機能的にも研究素材としても有用であり得ることである。この点は、マクロファージが、系統発生的に保存された細胞である点による。
（２）．生体防御機能
マクロファージの機能として次に重要なのは、生体防御作用である。この作用は非特異的生体防御作用と呼ばれるものであるが、近年の研究からマクロファージの生体防御作用にも特異性があることが明らかになりつつある。もともと非特異的という言葉は、Ｔ細胞に特徴づけられる抗原特異性や免疫記憶に対応した言葉であり、現在のところ厳密な意味での抗原特異性や免疫記憶がマクロファージに存在することは証明されていないから、マクロファージの生体防御作用が非特異的であるということは間違いではない。しかし、例えば病原体の種類に応じて、マクロファージの応答は質的に異なること、そして、この質的に異なる応答の一部は、マクロファージ細胞表面の病原体を認識する受容体の違いと対応することが示す様に、異物（又は環境）の刺激に対する細胞応答の側からみれば、マクロファージの作用は特異的であるといえる。
現在では、上記の点も踏まえ、マクロファージを中心とする生体防御作用を自然免疫機構（Ｔｈｅ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）、Ｔ細胞を中心とする生体防御作用を獲得免疫機構（Ｔｈｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）と捉えるのが一般的になりつつある。さらに、マクロファージの系統発生的普遍性を考えれば、当然であるが、自然免疫機構もまた、系統発生的に高く保存された生体防御機構である。
（３）．自然免疫機構
マクロファージを中心とする自然免疫機構は、獲得免疫機構を持たない生物種にあっては勿論のこと、獲得免疫機構を備えた生物種にあっても、異物識別、排除機構という生体防御機構の中核を担っている。獲得免疫機構を備えた生物でさえも病原体などの異物の識別・排除は殆どの場合自然免疫機構の機能でまかなわれているが、これが不十分な場合には、獲得免疫機構が動員される。この場合でも、特異的異物識別にはマクロファージ等による抗原提示が必須になるし、外来異物の排除に際して、排除機構の中心を担うのもまたマクロファージ等、自然免疫機構を構成する細胞である。
（４）．異物排除
一方、内因性の異物（例えば、ウイルス感染細胞の除去）などは、獲得免疫に特徴的な細胞傷害性Ｔ細胞によって排除されるが、この細胞傷害性Ｔ細胞の増殖と成熟との両方に、マクロファージ等による抗原提示を受けた別のＴ細胞が必須である。すなわち、獲得免疫が、十分な機能を果たすためには、自然免疫機構が完全かつ合目的的に機能することが前提となる。
（５）．機能不全
従って、マクロファージの貪食や抗原提示等の機能不全は、一義的に、免疫不全の潜在的な原因となりうることになる。具体的に言えば、先にＩ．１（マクロファージの一般的性状）で述べた諸点に関連する機能不全と疾患として以下に記すものが知られている。すなわち、
１）．異物貪食作用の異常としての貪食機能異常症としては白血球接着欠損症、チェディアック・ヒガシ症候群などが知られている。いずれの場合にも、貪食機能に異常が認められており後者では、ライソソーム酵素の貪食空腔への輸送に異常があるために、殺菌能が低下し、貪食能は顕著に亢進している。
２）．生体防御担当機能の異常としての疾患としては、慢性粘膜皮膚カンジダ症があげられる。この疾患に罹患した患者のマクロファージは、遊走能が低下しカンジダの殺菌能も低下している。
３）．異物排除機能と免疫能の異常としての疾患としては、ウィスコット・アルドリッチ症候群をあげることができる。患者マクロファージは、遊走異常、抗体依存性細胞傷害作用の欠陥など複雑な免疫異常を呈する。
４）．抗原情報の提示機能異常としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞は健常にも拘わらず重症の免疫不全を引き起こす主要組織適合（ＭＨＣ）クラスＩＩ抗原欠損症が知られる。
５）．インターフェロンによって活性化され、細胞性免疫のエフェクターとなる点についての機能異常としては、インターフェロン受容体が欠損した幼児は、結核菌感染を防御できず結核菌感染が致死的となるインターフェロン受容体欠損症が知られる。
さらに、獲得免疫細胞を欠損した哺乳動物は存在しかつ生存し得るが、マクロファージ欠損動物は存在し得ない。そして、異物識別・排除を中心とする生体防御機構には、細胞間での情報伝達を行うサイトカインと総称される生理活性物質が重要な機能を果たすことも明らかになりつつある。マクロファージが産生分泌するサイトカインの種類は極めて多様性に富む。この様に、マクロファージの機能は、異物の識別・排除についてみても個体の恒常性維持に必須である。
（６）．解剖学的特徴
マクロファージの解剖学的特徴は、種々の組織に定着した固有の性格をもつ組織特異的マクロファージによって異なっている。このことは、個体と環境との接点である粘膜組織でみても明らかである、呼吸器、消化器、泌尿生殖器の粘膜下層には、それぞれ特異的なマクロファージが常在している。これら組織特異的マクロファージは、組織特異的な内外の環境との生体応答を行っている。このことは、マクロファージが異物の識別・排除を超えて生体恒常性の維持に重要な機能を果たしていることを示唆する。組織特異的マクロファージの生理的意義は、未知の点が多い。翻って、新たな視点から、組織特異的マクロファージの存在意義を見ると、まさに種々の病態との関係でこそ、注目されてよい。
（７）．病態との関係
何故ならば、マクロファージが免疫機構の中核に位置するとの生理的意義を踏まえれば、組織特異的マクロファージの機能異常は組織特異的な病態の誘導に関わることが強く示唆されるからである。事実、炎症性腸疾病のひとつであるクローン病において、さらにはリューマチなどの自己免疫疾患、骨粗鬆症などの加齢性疾患など難治性疾患の多くは、マクロファージの機能異常を何らかの形で伴っている。結核菌などの抗酸菌の慢性感染も又、抗酸菌自体の問題とは別に、肺胞マクロファージの機能異常が、病態の背景にあると考えてもよかろう。この様に考えれば、標的細胞としてのマクロファージの貪食能を増大させ、その結果マクロファージ内の治療薬の濃度を増大させるような治療薬の開発は、現在、有効な治療法がない結核等感染症を含む難治性疾患の新規治療法を提供する上で、極めて重要かつ合理性のある対象であると言える。
ＩＩ．マクロファージの機能異常と疾患
（１）．感染性病原体媒体としてのマクロファージ
ＷＨＯによると結核、エイズ、マラリアなどは世界的な規模で最も重視しないといけない慢性難治性感染症である。例えば、毎年８００万人以上の結核患者が発生し、３００万人が死亡しているという。これらの疾病に有効な治療薬（薬物／製剤）を開発することは緊急課題であり、その社会的意義は極めて大きい。
ところで、病原体の感染の防御・除去に関し、生体内で最も重要な機能を担う細胞のひとつが、マクロファージである。実際、マクロファージは、生体内臓器、器官のあらゆる場所に分布している。これらマクロファージは存在する臓器、器官によって、形態も機能も異なっているが、病原体の感染の防御・除去を果たすという点では、共通である。
一方、感染性病原体は、進化の過程で、マクロファージの攻撃を回避する様々な手段を獲得している。さらに、感染性病原体の中には、マクロファージに潜伏し、マクロファージを宿主するものが多い。この様にしてマクロファージに寄生することに成功した病原体は、慢性的かつ反復的に感染症を引き起こす原因となることは言うまでもなく、致命的な結果を招くことも稀ではない。すなわち、この場合には、本来病原体の感染の防御・除去を達成するべきマクロファージが、一転して感染性病原体媒体として機能することになる。
（２）．マクロファージ内の病原体
その典型例を結核に見ることができる。すなわち、病原体（マイコバクテリウム ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、又はマイコバクテリウム ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ））は初期感染経路である肺胞のマクロファージによって貪食されるが、その際形成される食胞（ファゴゾーム）内において安定に存在している。つまり、病原体は本来ならばこれらを消化すべきマクロファージを「シェルター」として生存し得る。この他にもライの原因菌であるマイコバクテリウムレプラ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、非定型抗酸菌症の原因菌であるマイコバクテリウム アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）や、クラミジア症の原因菌であるクラミジア ニューモニア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、又はクラミジア シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）など、根治療法が未だに確立されておらず、漫延が危惧される難治性感染疾患の多くの原因菌もまた、マクロファージが感染病原体媒体となることに共通性が見出される。
結核菌、エイズウイルス等は、現在、予防に多大な精力が傾けられている。しかし、いったん感染が成立してしまえば、有効な治療法は存在しない。仮に、感染病原体に対して直接的に殺菌作用をもつ化合物が存在したとしても、一般に、該当する治療薬を単に投与することで、特定の病原体を殺滅（本発明における殺滅は病原体の全てもしくは一部を殺して消滅させることを意味する。）するに十分な濃度を病原体保持マクロファージ内で達成することは容易ではない。

従って、有効な治療薬を投与することで、細胞外の病原体は殺滅できても、病原体媒体としてのマクロファージは依然として病原体供給源として生存し、病原体を供給し続けることになる。現在マクロファージ内に寄生する病原体に対しての根治療法が皆無である理由は、如上の点に求めることができる。本発明はこの点を課題とするものであり、逆に、病原体媒体としての病原体感染マクロファージを殺滅する、又は病原体感染マクロファージ内の病原体を殺滅することができれば、上述した多くの慢性難治性感染症を根本的に治療することができることになる。このため、マクロファージの機能異常に基づき、又は、マクロファージを媒体して罹患する疾病に対する治療薬を提供することが本発明の目的である。
本発明者らは、鋭意研究を進めた結果、病原体媒体としての病原体感染マクロファージを殺滅すること、病原体感染マクロファージ内の病原体を殺滅すること、又は、疾病のために機能が異常となったマクロファージに作用することを目的とした、全く新しい着想を得るに到り本発明を完成したものである。
本発明の治療薬は、マクロファージの貪食活性を誘起し、マクロファージ内の病原体を殺滅することを特徴とする。
また、本発明の治療薬は、マクロファージの貪食活性を誘起し、病原体を保持するマクロファージを細胞死に誘導することを特徴とする。
また、本発明の治療薬は、マクロファージの貪食活性を誘起し、機能異常の状態にあるマクロファージに作用することを特徴とする。
また、本発明の治療薬は、抗酸菌症、エイズ、クラミジア症又はトキソプラズマ症のいずれかに対するものであることが望ましい。これにより、マクロファージが病原体を保持することによる疾患を有効に治療することができる。
また、本発明の治療薬は、クローン病、リューマチ、がん又は免疫不全症候群に対するものであることが望ましい。これにより、マクロファージが機能異常の状態にあることによる疾患を有効に治療することができる。エイズは免疫不全症候群に含まれる。
また、前記マクロファージは、粘膜組織に常在するものであることが望ましい。これにより、呼吸器、消化器あるいは生殖器など、病原体が初感染を起こす部位で疾患を有効に治療することができる。
また、前記マクロファージは、腹腔、大網、乳斑、肺胞、肺間質、肝臓、門脈域、脾臓、骨髄、胸腺、消化管、口腔偏頭、副腎、脳下垂体、甲状腺間質、ランゲルハンス島、副甲状腺、松果体、精巣、卵巣、卵管、子宮、胎盤、皮膚、髄膜、脳質、脈絡叢のいずれかに常在するもの、又は、前記マクロファージは、マイクログリア、マイクログリアの前駆細胞、グリア細胞、グリア細胞の前駆細胞、前記常在マクロファージの前駆細胞、常在マクロファージ類縁細胞、若しくは常在マクロファージ類縁細胞の前駆細胞であることが望ましい。これにより、体内の種々の臓器あるいは組織に起こる疾患を有効に治療することができる。
また、本発明の治療薬は、ＰＬＧＡ（ポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体）を含み、結核に対するものであることを特徴とする。
また、さらに、リファンピシンを含むことが望ましい。これにより、結核菌を殺滅する治療薬を提供できる。
また、分子量１，５００から１５０，０００のＰＬＧＡを含むことが望ましい。これにより、マクロファージに貪食されかつ生分解性の微粒子製剤を提供できる。
また、分子量１，５００から７５，０００のＰＬＧＡを含むことが望ましい。これにより、マクロファージに貪食されかつマクロファージ内で薬物を放出しやすい微粒子製剤を提供できる。
また、さらにＰＶＡ（ポリビニルアルコール）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＥＯ（ポリエチレンオキシド）、糖、タンパク質、ペプチド、リン脂質又はコレステロールの少なくとも１つを含むことが望ましい。これにより、マクロファージの種類に応じて活発に貪食される微粒子製剤を提供できる。
また、さらに、ＰＶＡ、ＰＥＧ、ＰＥＯ、糖、タンパク質、ペプチド、リン脂質又はコレステロールの少なくとも１つを含み、主たる粒子直径が１〜６ミクロンである微粒子製剤であることが望ましい。これにより、マクロファージの貪食機能を有効に利用してマクロファージ内に有効に取り込ませることができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である特願２００２−２４７８７１の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。

図１は、本発明と従来の治療薬のマクロファージ内薬剤濃度を対比して説明する図である。
図２は、本発明の実施の形態の微粒子製剤の粒子径分布を示す図である。
図３は、リファンピシンの本発明による投与と従来用いられている溶液による投与によってＮＲ８３８３細胞に取り込まれる量がどの程度異なるかを対比して説明する図である。
図４は、ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子のリファンピシン保持能力がＰＬＧＡ微粒子の組成によって放出するリファンピシン量が異なることを説明する図（その１）である。実験値は誤差５％を含む。
図５は、ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子のリファンピシン保持能力がＰＬＧＡ微粒子の組成によって放出するリファンピシン量が異なることを説明する図（その２）である。実験値は誤差５％を含む。
図６は、結核菌を貪食したマクロファージがＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子を貪食することでマクロファージ内の結核菌を殺滅することが可能なことを説明する図である。生存率は、１：５％以下、２：５〜２５％、３：２５〜５０％、４：５０〜７５％、５：７５％以上で評価した。なお、投与したリファンピシンは単独投与（図中ＲＦＰで表示）では１００μｇ／ｍＬ、ＲＦＰ−ＰＬＧＡによる投与（図中ＲＦＰ−ＰＬＧＡで表示）では５μｇ／ｍＬ（推定値）である。
図７は、リポ多糖を用いて肺胞マクロファージＮＲ８３８３の貪食能を活性化することにより、佐藤肺癌細胞との共培養により機能異常の状態にあるＮＲ８３８３の佐藤肺癌細胞に及ぼす細胞毒性効果が増強することを説明する図である。（□）はリポ多糖未処理のＮＲ８３８３の佐藤肺癌に対する細胞傷害効果を、（■）はリポ多糖（１μｇ／ｍＬ）処理したＮＲ８３８３の佐藤肺癌細胞に対する細胞傷害性効果をそれぞれ示している（共培養４時間）。なお、細胞傷害効果（％）は、培養液中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ量から算出し、評価した。

以下、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施の形態について詳細に説明する。ただし、本発明はこれら実施の形態によりその技術的範囲が限定されるものではない。
マクロファージ全般に備わっており、しかもマクロファージに特異的な機能のひとつに貪食作用があげられている。貪食作用は、大きさが約１ミクロン程度以上の固形物を積極的にマクロファージ細胞内に取り込む機能である。
ところで、人工的に作製した固形物を積極的に貪食させるならばマクロファージ内に通常は達成できない濃度で固形物を蓄積させることが可能である。このような固形物は一般に粒子として提供し得るが積極的に貪食させるためには、貪食に有利な粒子径、粒子の表面特性（電荷を有すること、一定の柔軟構造を有することなど）などを最適化する必要がある。例えば、ポリラクテートとポリエチレングリコールを混合した材料を基材としてマクロファージに貪食されやすい粒子を調製することが可能である。
そこで、感染病原体又は病原体感染マクロファージに作用する薬物を混和して、粒子を調製するならば、粒子の貪食に伴い薬物もまたマクロファージ内に積極的に取り込まれることになる。
本発明の根幹は、マクロファージがもつ貪食機能を積極的に活用して、マクロファージの機能異常にかかる疾病（Ｉ．２．（５）、（７）、ＩＩ．（１）、抗酸菌症、エイズ、クラミジア症、トキソプラズマ症又はがんなど）を治療する点にある。そこで、これらに有効な薬物をマクロファージが貪食しうる微粒子（薬物担体）中に含有させた製剤を調製することで上記目的を達成しようとするものである。
通常、薬物担体と薬物との合剤である製剤は、むしろマクロファージによる貪食を回避するための設計が必要である。しかし本発明は、従来とは全く逆転した発想に基づいて、マクロファージの貪食活性を積極的に利用する点に新規性がある。
前述の通りマクロファージの生体防御機能の一つに貪食作用が有る。貪食作用はマクロファージに特徴的に認められる固有の機能であり、マクロファージ以外の細胞では取り込むことのできない大きさの粒子を取り込むことができる。細菌などの病原微生物はマクロファージに貪食されマクロファージ内で分解される。従ってマクロファージの貪食機能の生物学的意義の一つは病原微生物に対して傷害を与えることである。ところでマクロファージは貪食によって活性化され、病原微生物に対抗することが可能となる場合がある。これは貪食によるマクロファージ活性化として知られる現象であり、これによってマクロファージはがん細胞でさえ傷害することが可能になる。従って、マクロファージを貪食により活性化し、貪食活性を強めることができれば、病原微生物をより強く殺滅することが可能となる。
粒子がマクロファージに貪食されるためには、以下の性質を備えている必要があると考えられている（可貪食性）。
すなわち、
・粒子直径は１〜６ミクロンである。このような粒子を微粒子と呼ぶ。
・粒子表面はマクロファージ培養液（生体内ではマクロファージ周辺の体液）で濡れるが、直ちには溶解せずに一定時間粒子として存在している。
・粒子は２０〜４５℃の温度範囲で固体である。
・粒子の比重はマクロファージ培養液（生体内ではマクロファージ周辺の体液）よりも大きい。
・また、粒子は表面に水やイオンが浸透可能な表面層を持つ。
一方、粒子を生体内に投与することを考慮すると、粒子表面は生体適合性の高い高分子層を持っている必要があるし、マクロファージに取り込まれるまでは粒子の形態を保持する一方で、マクロファージに取り込まれた後に、あるいは取り込まれなかった場合にも生体内で生体にとって無毒な成分にまで分解されて代謝される必要がある（生体内分解性）。
以上の２つの条件を満たし、容易に粒子に成型可能な高分子として、ポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体（以下「ＰＬＧＡ」という）又はポリ乳酸（以下「ＰＬ」という）が候補となる。ＰＬはＰＬＧＡよりも疎水性が高く、分解までに要する時間が長い。一方ＰＬＧＡは、モノマー比率に依存して分解速度が変化する。分子量が大きい方が分解までに要する時間は長い。ＰＬＧＡの分子量が１，０００以下の場合には２０〜４５℃の温度範囲で液体として存在する可能性がある。従って、２０〜４５℃の温度範囲で固体として存在するＰＬＧＡの分子量は１，５００以上が望ましい。
さらに、ＰＬＧＡ粒子中に含有している薬物の粒子内からの放出は分子量２０，０００程度のＰＬＧＡの場合にはほぼ０次で薬物が放出される。すなわち、放出量が常に一定に保たれる。しかし、分子量４４，０００及び７５，０００程度のＰＬＧＡ粒子からは０次放出ではなく、一定時間後に薬物が放出されるパルス型になることが観測されている。しかも、パルス型の薬物放出が観測される時間は分子量の大きいＰＬＧＡ製剤で遅くなっている。すなわち、ＰＬＧＡ粒子からの薬物放出のパターンはＰＬＧＡの分子量に依存している。さらに、薬物の放出に関係するＰＬＧＡの分解速度は、ＰＬＧＡの分子量増加に伴い遅くなるばかりでなく、マクロファージ内など生体内の方が試験管内よりも早いと予測されるため、分子量は１５０，０００までの範囲であれば生体内で有効に使用可能であると考えられる。
以上の観点から、分子量１，５００から１５０，０００、乳酸・グリコール酸のモノマー比５０：５０から７５：２５のＰＬＧＡから成る，粒子直径が１〜６ミクロンの微粒子製剤（許容範囲）、分子量５，０００から７５，０００、乳酸・グリコール酸のモノマー比５０：５０から７５：２５のＰＬＧＡから成る，粒子直径が１〜６ミクロンの微粒子製剤（適する範囲）がマクロファージに貪食されやすく、しかも、マクロファージ内で薬物を内包する微粒子製剤から薬物が一定の持続性を保ちながら放出されるという目的に対し最適であると考えられる。
感染症病原体を保持したマクロファージの特異的殺滅を可能とする新規治療薬の提供
結核菌を始めとした種々の感染性病原体を保持したマクロファージの特異的な貪食活性を積極的に活用して、マクロファージ内の病原体又は病原体を保持したマクロファージそのものを殺滅するためには、下記の治療薬が有効である。
（１）．マクロファージの貪食活性を誘起する治療薬
（２）．マクロファージ内の感染病原体に対し直接の殺滅効果をもつ治療薬
（３）．マクロファージに作用する治療薬
（１）の治療薬は、前述した２つの条件（可貪食性及び生体内分解性）を満たす性質を持つもので足りるが、好ましくは感染病原体保持／非保持のマクロファージに選択的に貪食され得る性質を有することが望ましい。従来、マクロファージの貪食能を活性化する物質が存在することが知られていた（公知事項）。しかし、この性質を積極的に利用してマクロファージ内の病原体に作用する治療薬を開発する試みは全く為されていない（新規事項）。（２）、（３）のタイプは、病原体に直接作用する種々の薬物が対象になるばかりでなく、病原体保持／非保持マクロファージの生理機能を改変する作用を持つＤＮＡ又はＲＮＡなど遺伝子自体も薬物として使用可能である。（１）、（２）、（３）を組み合わせた感染性病原体除去に有効な治療薬を開発する試みは全く為されておらず、本発明の治療薬は、感染性病原体に対する治療に有効な新しいタイプの治療薬である（新規事項）。
例えば、アンチマイクロバイアルエジェント アンド ケモテラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ １９９８年 第４２巻 第１０号 ｐｐ．２６８２−２６８９）には、ＰＬＧＡにリファンピシンを含有する粒子の抗結核作用が開示されている。ところが、この報告ではＰＬＧＡ粒子による貪食活性の誘起に関しては全く述べられていない。さらに、リファンピシン含有ＰＬＧＡ粒子は、単独のリファンピシンに比べ抗結核薬としての薬効は向上していないことから、本発明の粒子とは異なった性状を有していることが明らかである。さらに、図４及び図５に示すようにリファンピシンの放出の制御にはＰＬＧＡの分子量が重要である。ところが、上記報告には、ＰＬＧＡの調製の際に用いたＰＬＧＡの分子量の記載が為されていない。おそらく本発明の粒子とは異なる分子量を持つＰＬＧＡを用いたために抗結核薬としての機能を有するに至らなかったものと推測される。抗結核薬活性を有するＰＬＧＡ粒子の調製に際しては、ＰＬＧＡの分子量、モノマー比及び調製された粒子の直径に関し適正なもの用い、マクロファージの貪食による粒子の取り込みとマクロファージ内での抗結核活性とを評価しないといけない。以上の点を総合するならば、上記論文に記載されているＰＬＧＡ粒子は、ＰＬＧＡのモノマー比、粒子の直径が本発明における“適する範囲”にあるなど、素材に関し一定の共通性が認められるものの粒子に関する正確な性状が記載されておらず、抗結核薬作用をも有していない。従って、本発明の新規性・進歩性を否定する先行例とはなり難いものである。
更に、ファーマシューティカル リサーチ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０００年 第１７巻 第８号 ｐｐ．９５５−９６１）に分子量８２，５００のＰＬＧＡを用いて作製したリファンピシン含有粒子の調製方法が開示されているが、この粒子の調製法は本発明とは異なっている。分子量８２，５００のＰＬＧＡを用いたリファンピシン含有ＰＬＧＡ粒子の結核菌殺滅効果は、ファーマシューティカル リサーチ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００１年 第１８巻 第９号 ｐｐ．１３１５−１３１９）に開示されている。これを見ればリファンピシン含有ＰＬＧＡ粒子の抗結核活性は試験管内ではリファンピシン単独での効果にも及ばないし、動物実験においても明らかな治療効果があるとは言えない。リファンピシン含有ＰＬＧＡ粒子が抗結核作用を発現するためには、粒子が適度の分解性と高いリファンピシン内包率を有していなければならない。しかし、上述の論文ではこの様な活性を左右する性状に関する検討を行わずに、抗結核活性が調べられている。分解性と内包率とは分子量の大きなＰＬＧＡ粒子では低下することが知られているので、８２，５００という高い分子量のＰＬＧＡを用いたことが抗結核作用を発現しなかった原因であると思われる。以上の様にこれまで本発明で提示しているものと類似の研究が行われてはいるが、本発明のごとく、マクロファージの貪食活性を利用することを意図し、かつこの活性化を達成することを通じて、細胞内寄生病原体の殺滅を図る試みはこれまでに行われていない。また、リファンピシン含有ＰＬＧＡは調製されてはいるが、本発明の目的を達成することを可能とすることを目的とした調製方法や素材特性に関する適正な研究がなされていない。わずかにファーマシューティカル リサーチ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００１年 第１８巻 第１０号 ｐｐ．１４０５−１４１０）にリファンピシン含有ＰＬＧＡ粒子がマクロファージに取り込まれることが想定されるとの記載がある。しかし、この場合も積極的にマクロファージに取り込ませること、あるいは活性化を意図した製剤が作製されているわけではなく、実際にリファンピシン含有ＰＬＧＡ粒子の貪食率などは検討されていない。ちなみに、この報告に記載されているリファンピシン含有ＰＬＧＡ粒子を用いた試験管内でのリファンピシンのマクロファージ内濃度はわずかに０．４５μｇ／１０^６細胞に留まっている。本発明でのリファンピシン含有ＰＬＧＡ微粒子を用いた場合は貪食が活性化されるばかりか、リファンピシンのマクロファージ内濃度は、６μｇ／１０^６細胞に達するのであって、１３倍以上にもなる。以上のことは、マクロファージに貪食を誘導しマクロファージ内の病原微生物の殺滅を意図すれば、単に薬剤をミクロスフェアに含有させるだけではこの達成が困難であることが明らかである。しかもこれまでのいかなる報告においても結核菌の標的細胞である肺胞マクロファージを用いてリファンピシン含有ＰＬＧＡ粒子が細胞内結核菌を殺滅するかを検討した報告は無い。前述の「生命を支えるマクロファージ」を参照すれば明らかなようにマクロファージは組織特異性が高く血中に存在するマクロファージを用いて得られる結果を直ちに組織特異的マクロファージ、例えば肺胞マクロファージ、に対しても適用可能とすることができないことは周知の事実である。すなわち本発明の新規性は、概念の新規性は言うまでもないが、この概念を支える実施例として、肺胞マクロファージを用いて、しかも該細胞の貪食活性を誘導しかつ、実際に肺胞マクロファージ内で高い薬物濃度を保持し、かつこの製剤が実際に肺胞マクロファージ内結核菌の殺滅がリファピシン単独に比べ明らかに優れたリファンピシン含有ＰＬＧＡ粒子を製造し提供する点が挙げられる。
一方、粒子をマクロファージに貪食させることによって、マクロファージから非特異的な抗菌物質、例えば過酸化水素、酸素ラジカルの産生が増強することは既に広く知られている。例えばヨーロピアン ジャーナル オブ ファーマシュウティカル サイエンシズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０００年 第１５巻 ｐｐ．１９７−２０７）には、ＰＬＧＡ粒子を貪食させることで、血中単球に性格の類似した培養マクロファージから過酸化水素の産生が増強することが開示されている。然しながら、マクロファージがＰＬＧＡを貪食することにより、貪食活性が増強することは記載されていない。更にマクロファージの活性化はきわめて多様性に富んでいることから、貪食により過酸化水素の産生が増強することが、直ちに貪食増強と直接に結びつくものではない。
実際の感染症治療に際しては、（１）のタイプの治療薬に（２）又は（３）（前出では．をつけていない）のタイプの薬物を含有させた製剤が有効である。つまり、（２）、（３）のタイプの治療薬がマクロファージ内で有効に作用するために、（１）の治療薬は、マクロファージの貪食機能を利用して（２）、（３）のタイプの治療薬をマクロファージ内に運搬する機能を担う。すなわち、本発明の対象となる治療薬は図１に示すように、マクロファージに貪食されやすく、単に治療薬のみを投与した場合よりもマクロファージ内の治療薬の濃度が高くなる。すなわち、右側の従来の薬液内にあるマクロファージに取り込まれる薬剤と比較して、左側の本発明による薬剤封入微粒子は積極的にマクロファージに取り込まれてマクロファージ内の薬剤濃度が高くなる。このように、請求の範囲に記載した「マクロファージの貪食活性を誘起し、」とは、単に治療薬を投与した場合よりもマクロファージ内の治療薬の濃度が高くなることを意味する。
具体的な適用例：結核
本発明に提示している治療薬の有効性に関する一例として結核について述べる。結核菌は飛沫により気道から肺胞に侵入し、肺胞マクロファージに貪食される。通常であれば貪食された病原体は、細胞内でタンパク分解酵素の攻撃により分解される運命にある。しかし結核菌はタンパク分解酵素の攻撃を回避して、マクロファージ内で生存する。このマクロファージ内の結核菌はマクロファージ外に移行し、持続的に宿主体内に結核菌を供給する。現在抗結核菌薬剤としては、イソニアジド、リファンピシン、硫酸ストレプトマイシン、エタンブタール等の薬物が用いられている。いずれの薬物もマクロファージ外の結核菌に対しては有効であるが、肺胞マクロファージ内の結核菌に対しては効果を示さない。このことは肺胞マクロファージ内に結核菌を殺滅するに十分な薬物濃度が得られないことに主要な原因が求められる。
そこで、肺胞マクロファージの貪食作用を利用して肺胞マクロファージ内に結核菌を殺滅するに十分な薬物濃度が得られれば、肺胞マクロファージ内結核菌をも殺滅することが出来る。この場合貪食作用はマクロファージ内の薬物濃度を選択的に上昇せしめるために利用されることになる。
Ａ．マクロファージの貪食能を増強させる治療薬
ＰＬＧＡを例として、マクロファージの貪食能を増強させる治療薬の製法及びその効果を説明する。
Ｉ．ＰＬＧＡ微粒子製剤によるマクロファージ貪食能の増強（本項ではＰＬＧＡ微粒子そのものが薬効成分である。）
１．ＰＬＧＡ微粒子製剤調製法
（ａ）材料
（１）．ＰＬＧＡ（ポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体）モノマー比：
７５：２５、分子量２０，０００（和光純薬株式会社：ＰＬＧＡ−７５２０）
（２）．ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）重合度５００
（ｂ）．ＰＬＧＡ微粒子製剤の調製
（１）．ＰＬＧＡ５００ｍｇを塩化メチレン１．５ｍＬに溶解する。
（２）．ＰＶＡを０．３％（ｗ／ｖ）になるように水に溶解する。
（３）．（２）のＰＶＡ水溶液８ｍＬを（１）の溶液に加えて３分間攪拌すると水中油滴型（ｏ／ｗ型）エマルションが形成される。
（４）．（２）のＰＶＡ水溶液２００ｍＬの中に、（３）を加え、５２０回転／分で３時間、室温で攪拌する。
（５）．遠心分離（３，０００回転／分、１５分間）によって、微粒子製剤を沈降させて分離し、さらに蒸留水１０ｍＬを加えて２回、遠心分離によって洗浄する。
（６）．１昼夜デシケータ内で減圧乾燥。
（７）．得られた微粒子製剤の粒子径分布を図２に示す。この図から明らかなように調製した微粒子製剤は直径約２ミクロンにピークを持ち、１〜１０ミクロンの間に分布を持つ。この粒子は常温で固体である。調製に用いたＰＬＧＡ（５００ｍｇ）と回収した製剤の全重量から計算した収率は約９０％であった。
（８）．他の例
他に作成したＰＬＧＡ微粒子（分子量及び組成）の性状を以下にまとめた。
１．ＰＬＧＡ−５００５（ＰＬＧＡ分子量５，０００、乳酸／グリコール酸 ５０：５０）
２．ＰＬＧＡ−５０１０（ＰＬＧＡ分子量１０，０００、乳酸／グリコール酸 ５０：５０）
３．ＰＬＧＡ−５０２０（ＰＬＧＡ分子量２０，０００、乳酸／グリコール酸 ５０：５０）
４．ＰＬＧＡ−７５０５（ＰＬＧＡ分子量５，０００、乳酸／グリコール酸 ７５：２５）
５．ＰＬＧＡ−７５１０（ＰＬＧＡ分子量１０，０００、乳酸／グリコール酸 ７５：２５）
ＰＬＧＡ微粒子製剤調製法は、ＰＬＧＡの種類を除き１．（ｂ）（１）〜（６）と同様である。
得られた微粒子製剤の平均粒子径はどのＰＬＧＡを用いた場合でも約２ミクロンであった。調製に用いたＰＬＧＡ（５００ｍｇ）と回収した製剤の全重量から計算した収率は約９０％であった。
２．ＰＬＧＡ微粒子製剤を貪食することによる肺胞マクロファージの貪食増強効果
（１）．肺胞マクロファージ細胞（ＮＲ８３８３細胞）を１×１０^６個／ｍＬに培地（Ｈａｍ Ｆ−１２Ｋ，１５％ウシ胎児血清）で調製し、２４穴プレートに加え、ここに、ＰＬＧＡ−７５２０微粒子製剤を０．０４、０．４、４マイクログラム（μｇ）添加し、炭酸ガス培養器（３７℃）で培養する。
（２）．１時間培養後、培養液を除去し、０．２５％トリプシン／リン酸緩衝液を含む生理食塩水（以下ＰＢＳ）０．１ｍＬを添加し室温で５分間放置後、培養上清を除き、洗浄を行う。
（３）．これに、０．１ｍＬの培地を加え８０％パーコール（ファルマシア社）０．１ｍＬと混ぜ合わせて４０％パーコール溶液を調製し、これを１．５ｍＬのサンプルチューブに入れた７０％パーコール０．１ｍＬに重層し、遠心分離（８，０００回転／分、１０分間）する。
（４）．遠心分離後、界面に存在する細胞を回収し、細胞をＰＢＳで洗浄後、培地を１ｍＬ添加し、粒子径２．０ミクロンのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）でラベルしたポリスチレンラテックス粒子（ＦＩＴＣ−ＰＳＬＰ）を１×１０^７個添加し、１時間培養する。蛍光性のＦＩＴＣでラベルするのは定量を容易に行うためである。
（５）．培養後、遠心分離（７００回転／分、５分間）し、沈降層のマクロファージにＰＢＳを１ｍＬ加え、遠心分離操作を、２回繰り返す。
（６）．ＰＢＳを除いた後に、細胞に１０％ホルマリン／ＰＢＳを０．１ｍＬ添加し、５分間固定後、蒸留水を１ｍＬ加え、上清を除き、再度蒸留水を１ｍＬ加え、上清を除く。上清を除いた後、０．１ｍＬの蒸留水を加え細胞を懸濁させ、その懸濁液０．０２ｍＬを取り、スライドグラスに広げ、乾燥させる。
（７）．蛍光顕微鏡下で複数視野撮影行い、細胞１００個当たりのＦＩＴＣ−ＰＳＬＰを取り込んだＮＲ８３８３細胞の数を測定する。
（８）．ＰＬＧＡ微粒子製剤によるマクロファージのＦＩＴＣ−ＰＳＬＰ貪食量の変化は表１に示すとおりである。ＰＬＧＡ微粒子製剤は低量の添加ではマクロファージの貪食能に対する効果は顕著ではないが、０．４（μｇ／ｍＬ）の添加により著しく貪食能を活性化することが明らかである。

ＩＩ．リポ多糖によるマクロファージ貪食能の増強
１．リポ多糖調製法
（ａ）材料
（１）．グラム陰性菌パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）
（ｂ）リポ多糖の調製
（１）．７リットル（Ｌ）の肉汁培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ、グルコース１ｇ／Ｌ、ｐＨ７．５）にパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）を加え、３５℃で１夜振とう培養し、約７０ｇの湿菌体を集菌する。
（２）．菌体約７０ｇを５００ｍＬの蒸留水に懸濁し、５００ｍＬの９０％熱フェノールを添加して６５〜７０℃で２０分間撹拌し、冷却し、水層を回収した。回収した水層を１夜透析してフェノールを除去し、透析内液を分子量２０万カット−オフ膜により２気圧の窒素ガス下で限外瀘過濃縮する。
（３）．得られた粗リポ多糖凍結乾燥物を蒸留水に溶解し、陰イオン交換クロマトグラフィー（ファルマシア社製。Ｑ−セファロース・ファースト・フロー）にかけ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で試料溶液をカラムに通液し、２００〜４００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でリムラス活性画分を溶出させる。この溶出液を前記と同一条件で限外瀘過して脱塩及び濃縮し、凍結乾燥し、約７０ｇの湿菌体から約３００ｍｇの精製リポ多糖を得ることができる。
２．リポ多糖による肺胞マクロファージの貪食増強効果
（１）．肺胞マクロファージ細胞（ＮＲ８３８３）を１×１０^６個／ｍＬに培地（ＨａｍＦ−１２Ｋ，１５％ウシ胎児血清）で調製し、２４穴プレートに加え、これに、リポ多糖を１μｇ／ｍＬになるように添加し、炭酸ガス培養器（３７℃）で培養する。
（２）．１時間培養後、１．５ｍＬのサンプルチューブに細胞を移し、培養液を遠心分離（２，０００回転／分、５分間）で除去し、０．２５％トリプシン／ＰＢＳ０．１ｍＬを添加し室温で５分間放置後、遠心分離（２，０００回転／分、５分間）して培養上清を除き、ＰＢＳで洗浄を行う。
（３）．これに、０．１ｍＬの培地を加え６０％パーコール０．１ｍＬと混ぜ合わせ３０％パーコール溶液を調製し、遠心分離（８，０００回転／分、１０分間）する。
（４）．遠心分離後、液表面に存在する細胞を回収し、細胞をＰＢＳで２回洗浄後、培地を１ｍＬ添加し、粒子径２．０ミクロンのＦＩＴＣ−ＰＳＬＰを１×１０^７個添加し、１時間培養する。
（５）．培養後、上清を除き、０．２５％トリプシン／ＰＢＳ０．１ｍＬを添加し室温で５分間放置後、培地を１ｍＬ添加し、遠心分離（７００回転／分、５分間）する。
（６）．沈降層のマクロファージにＰＢＳを１ｍＬ加え遠心分離（７００回転／分、５分間）し、上清を除き、再度ＰＢＳを１ｍＬ添加後、遠心分離（７００回転／分、５分間）し上清を除く。
（７）．上清を除いた後に、細胞に１０％ホルマリン／ＰＢＳを０．１ｍＬ添加し、５分間固定後、蒸留水を１ｍＬ加え、上清を除き、再度蒸留水を１ｍＬ加え、上清を除く。
（８）．上清を除いた後、０．１ｍＬの蒸留水を加え細胞を懸濁させ、その懸濁液０．０２ｍＬを取り、スライドグラスに広げ、乾燥させる。
（９）．蛍光顕微鏡下で複数視野撮影行い、細胞５００個当たりのＦＩＴＣ−ＰＳＬＰを取り込んだＮＲ８３８３細胞の数を測定する。
（１０）．リポ多糖によるマクロファージのＦＩＴＣ−ＰＳＬＰ貪食量の増加は表２に示すとおりである。リポ多糖によりマクロファージの貪食能が活性化されたことが明らかである。

Ｂ．マクロファージ内の病原体に作用する治療薬
ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤貪食によるリファンピシン（抗結核菌薬）のマクロファージ内への効果的移行
１．リファンピシンを内包したＰＬＧＡ微粒子製剤の調製
（ａ）材料
（１）．ＰＬＧＡ（ポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体）モノマー比：７５：２５又は５０：５０、分子量５，０００、１０，０００又は２０，０００、和光純薬株式会社：ＰＬＧＡ−５００５，５０１０，５０２０，７５０５，７５１０，７５２０
（２）．リファンピシン
（３）．ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）重合度５００
（ｂ）ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤の調製
（１）．ＰＬＧＡ５００ｍｇとリファンピシン（０，５０，１００，２００ｍｇ）を塩化メチレン１．５ｍＬに溶解する。
（２）．ＰＶＡを０．３％（ｗ／ｖ）になるように水に溶解する。
（３）．（２）のＰＶＡ水溶液８ｍＬを（１）の溶液に加えて３分間攪拌するとｏ／ｗ型エマルションが形成される。
（４）．（２）のＰＶＡ水溶液２００ｍＬの中に、（３）を加え、５２０回転／分で３時間、室温で攪拌する。
（５）．遠心分離（３，０００回転／分、１５分間）によって、微粒子製剤を沈降させて分離し、さらに蒸留水１０ｍＬを加えて２回、遠心分離によって洗浄する。
（６）．１昼夜デシケータ内で減圧乾燥。
（７）．作成したＲＦＰ−ＰＬＧＡ粒子（分子量及び組成）を以下にまとめた。
１．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ５００５（ＰＬＧＡ分子量５，０００、乳酸／グリコール酸５０：５０）
２．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ５０１０（ＰＬＧＡ分子量１０，０００、乳酸／グリコール酸 ５０：５０）
３．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ５０２０（ＰＬＧＡ分子量２０，０００、乳酸／グリコール酸 ５０：５０）
４．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ７５０５（ＰＬＧＡ分子量５，０００、乳酸／グリコール酸 ７５：２５）
５．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ７５１０（ＰＬＧＡ分子量１０，０００、乳酸／グリコール酸 ７５：２５）
６．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ７５２０（ＰＬＧＡ分子量２０，０００、乳酸／グリコール酸 ７５：２５）
得られた微粒子製剤の粒度分布並びに性状は全てＰＬＧＡのみの微粒子製剤（Ａ．Ｉ．１．（ｂ）（７））と同じものであった。
（８）．５００ｍｇのＰＬＧＡ中にリファンピシンを０，５０，１００，２００ｍｇ含有させた微粒子製剤４ｍｇを塩化メチレン１ｍＬに溶解後、４７５ｎｍの吸光度を分光光度計で測定する。
（９）．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤（ＰＬＧＡ分子量２０，０００，乳酸／グリコール酸７５：２５よりなる微粒子ＰＬＧＡ−７５２０）中の回収リファンピシン量を表３に示した。この結果から明らかなように、リファンピシンは効率よく製剤化されていることがわかる。

２．他のＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤調製法（膜乳化法、公知）
膜乳化法を用いてＲＦＰ−ＰＬＧＡ７５１０微粒子製剤を調製した。
膜乳化法は、２種類の混じりあわない液体の一方（分散相）を加圧して、多孔質ガラス膜（ＳＰＧ膜）を介して他方の液体（連続相）中に分散させる乳化方法であり、この方法を用いると、均一な粒子径をもつエマルションを得ることができる。
（ａ）．材料
（１）．ＰＬＧＡ（ポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体）モノマー比：７５：２５、分子量１０，０００、和光純薬株式会社：ＰＬＧＡ７５１０
（２）．リファンピシン
（３）．ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）重合度５００
（ｂ）ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤の調製
（１）．ＰＬＧＡ５００ｍｇとリファンピシン１００ｍｇを塩化メチレン１０ｍＬに溶解する。
（２）．ＰＶＡを０．３％（ｗ／ｖ）になるように水に溶解する。
（３）．（２）のＰＶＡ水溶液１００ｍＬ中にＳＰＧ膜（伊勢化学工業 細孔径０．４９μｍ）を介して（１）の溶液を分散すると水中油滴型（ｏ／ｗ型）エマルションが形成する。
（４）．（２）のＰＶＡ水溶液２００ｍＬの中に、（３）を加え、５２０回転／分で３時間、室温で攪拌する。
（５）．遠心分離（３，０００回転／分、１５分間）によって、微粒子製剤を沈降させて分離し、さらに蒸留水１０ｍＬを加えて２回、遠心分離によって洗浄する。
（６）．１昼夜デシケータ内で減圧乾燥。
（７）．得られた微粒子製剤の平均粒子径は１．９８ミクロンである。調製に用いたＰＬＧＡ（５００ｍｇ）と回収した製剤の全重量から計算したＰＬＧＡの収率は約９０％であった。また、リファンピシンの収率は約７５％であった。この粒子は常温で固体である。
３．膜乳化法による他の例
膜乳化法を用いて調製したＲＦＰ−ＰＬＧＡ７５１０微粒子製剤以外のＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子（分子量及び組成）を以下にまとめた。
１．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ５００５（ＰＬＧＡ分子量５，０００、乳酸／グリコール酸 ５０：５０）
２．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ５０１０（ＰＬＧＡ分子量１０，０００、乳酸／グリコール酸 ５０：５０）
３．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ５０２０（ＰＬＧＡ分子量２０，０００、乳酸／グリコール酸 ５０：５０）
４．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ７５０５（ＰＬＧＡ分子量５，０００、乳酸／グリコール酸 ７５：２５）
５．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ７５２０（ＰＬＧＡ分子量２０，０００、乳酸／グリコール酸 ７５：２５）
これらのＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤調製法は、ＰＬＧＡの種類を除き上記の膜乳化法と同様である。
得られた微粒子製剤の平均粒子径はＰＬＧＡ５００５では、２．２０ミクロン、ＰＬＧＡ５０１０では、２．６６ミクロン、ＰＬＧＡ５０２０では、２．２９ミクロン、ＰＬＧＡ７５０５では、２．００ミクロン、ＰＬＧＡ７５２０では、１．８５ミクロンである。調製に用いたＰＬＧＡ（５００ｍｇ）と回収した製剤の全重量から計算したＰＬＧＡの収率は全て約９０％であった。また、リファンピシンの収率はＰＬＧＡ５００５では、約８７％、ＰＬＧＡ５０１０では、約７８％、ＰＬＧＡ５０２０では、約６７％、ＰＬＧＡ７５０５では、約９１％、ＰＬＧＡ７５２０では、約５８％であった。
４．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子からのリファンピシンの放出
（１）．膜乳化法により調製した各ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子５０ｍｇを３７℃（温度）に保持したｐＨ７．４リン酸緩衝液（イオン強度０．１５４Ｍ）５ｍＬに分散した。
（２）．経時的に遠心分離により上清を採取し、残存した微粒子にｐＨ７．４リン酸緩衝液（イオン強度０．１５４Ｍ）５ｍＬを加えた。
（３）．上清に溶出したリファンピシン濃度を測定した。測定には、分光光度計を用いて４７５ｎｍの波長で測定した。
（４）．各ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子から上清に放出されたリファンピシンの割合を図４及び図５に示した。本実験データからはＰＬＧＡの分子量が５，０００及び１０，０００であるＰＬＧＡ５００５、ＰＬＧＡ５０１０とＰＬＧＡ７５０５、ＰＬＧＡ７５１０からはリファンピシン放出速度が速いことが示された。これらの結果からＰＬＧＡの組成は分子量５，０００〜１０，０００、乳酸とグリコール酸の比が５０：５０又は７５：２５がマクロファージへの貪食を介した薬剤の移行に優れていることが示された。
５．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤（ＰＬＧＡ−７５２０）の貪食による細胞内リファンピシン濃度の選択的増加
（１）．調製したＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤をＰＢＳに微粒子製剤を再分散させ、遠心分離（４００回転／分、５分間）を行って大きな粒子を除き、顕微鏡観察により約１〜３ミクロンのサイズに調製した微粒子製剤（重量で約３０％）を以後の実験に用いる。
（２）．５×１０^５個／０．９ｍＬに培地で培養したＮＲ８３８３細胞を、２４穴プレートに入れ、これに各ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤０．１２ｍｇ／０．１ｍＬを添加し、１２時間培養する。
（３）．培養後、培養液を除去し、０．２５％トリプシン／ＰＢＳ０．１ｍＬを添加し室温で５分間放置後、培養上清を除き、洗浄を行う。
（４）．これに、０．１ｍＬの培地を加え８０％パーコール０．１ｍＬと混ぜ合わせ４０％パーコール溶液とし、これを１．５ｍＬのサンプルチューブに入れた７０％パーコール０．１ｍＬに重層し、遠心分離（８，０００回転／分、１０分間）する。
（５）．遠心分離後、界面に存在する細胞を回収し、細胞をＰＢＳで洗浄後、細胞中に取り込まれたリファンピシンを塩化メチレンで抽出する。
（６）．リファンピシンの量は４７５ｎｍの吸光度から決定する。
（７）．対照として各ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤０．１２ｍｇ中に含まれる同量のリファンピシンのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を調製し、これを１ｍＬの培地を加えた２４穴プレートに加え、それにＮＲ８３８３細胞を添加する。
（８）．細胞を１２時間培養後、細胞（５×１０^５個）を回収し、細胞中のリファンピシンを塩化メチレンで抽出する。
（９）．リファンピシンのマクロファージによる取り込み量を図３に示す。リファンピシンの添加量が４０（μｇ／５×１０^５個／穴／ｍＬ）において、従来のリファンピシンを含む培地と比較して、本実施例のＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤の場合は約１９倍ものリファンピシンを取り込んでいることが示されている。
Ｃ．マクロファージの貪食能を増強しマクロファージ内の病原体に作用する薬物（Ａ＋Ｂ）
ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤貪食によるマクロファージの貪食活性増強効果
１．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤の調製
（ａ）材料
（１）．（１）ＰＬＧＡ（ポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体）モノマー比：７５：２５又は５０：５０、分子量５，０００、１０，０００又は２０，０００、和光純薬株式会社：ＰＬＧＡ−５００５，５０１０，５０２０，７５０５，７５１０，７５２０
（２）．リファンピシン
（３）．ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）重合度５００
（ｂ）ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤の調製
（１）．ＰＬＧＡ５００ｍｇとリファンピシン１００ｍｇを塩化メチレン１．５ｍＬに溶解する。
（２）．ＰＶＡを０．３％（ｗ／ｖ）になるように水に溶解する。
（３）．（２）のＰＶＡ水溶液８ｍＬを（１）の溶液に加えて３分間攪拌するとｏ／ｗ型エマルションが形成される。
（４）．（２）のＰＶＡ水溶液２００ｍＬの中に、（３）を加え、５２０回転／分で３時間、室温で攪拌する。
（５）．遠心分離（３，０００回転／分、１５分間）によって、微粒子製剤を沈降させて分離し、さらに蒸留水１０ｍＬを加えて２回、遠心分離によって洗浄する。
（６）．１昼夜デシケータ内で減圧乾燥。
（７）．得られた微粒子製剤の粒度分布並びに性状はＰＬＧＡのみの微粒子製剤（Ａ．Ｉ．１．（ａ）（７））と同じものであった。
（８）．ＰＢＳに微粒子製剤を再分散させ、遠心分離（４００回転／分、５分間）にて大きな微粒子製剤を除き、顕微鏡観察で約１〜３ミクロンのサイズに調整した微粒子製剤を以後の実験に用いる。
２．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子（ＰＬＧＡ−７５２０）製剤の貪食によるマクロファージ貪食活性増強
（１）．肺胞マクロファージ細胞（ＮＲ８３８３）を１×１０^６個／ｍＬに培地（ＨａｍＦ−１２Ｋ，１５％ウシ胎児血清）で調製し、２４穴プレートに加え、ここに、ＰＬＧＡ微粒子製剤を０．０１２、０．１２、１．２μｇ添加し、炭酸ガス培養器（３７℃）で培養する。
（２）．１時間培養後、１．５ｍＬのサンプルチューブに細胞を移し、培養液を除去し、０．２５％トリプシン／ＰＢＳ０．１ｍＬを添加し室温で５分間放置後、培養上清を除き、洗浄を行う。
（３）．これに、０．１ｍＬの培地と９０％パーコール０．１ｍＬを加えパーコール濃度を４５％とした後に、遠心分離（８，０００回転／分、１０分間）する。
（４）．遠心分離後、液表面の細胞を回収し、この細胞をＰＢＳで２回洗浄後、（１）で用いたのと同じ培地を１ｍＬ添加し、粒子径２．０ミクロンのＦＩＴＣ−ＰＳＬＰを１×１０^７個添加し、１時間培養する。
（５）．培養後、上清を除き、０．２５％トリプシン／ＰＢＳ０．１ｍＬを添加し室温で５分間放置後、培地を１ｍＬ添加し、遠心分離（７００回転／分、５分間）する。
（６）．沈降層のマクロファージにＰＢＳを１ｍＬ加え遠心分離（７００回転／分、５分間）し、上清を除き、再度ＰＢＳを１ｍＬ添加後、遠心分離（７００回転／分、５分間）し上清を除く。
（７）．上清を除いた後に、細胞に１０％ホルマリン／ＰＢＳを０．１ｍＬ添加し、５分間固定後、蒸留水を１ｍＬ加え、遠心分離（７００回転／分、５分間）し、上清を除く。これに、０．１ｍＬの蒸留水を加え細胞を懸濁させ、その懸濁液０．０２ｍＬを取り、スライドグラスに広げ、乾燥させる。
（８）．蛍光顕微鏡下で複数視野撮影行い、細胞５００個当たりのＦＩＴＣ−ＰＳＬＰを取り込んだマクロファージ（ＮＲ８３８３細胞）の数を測定する。
（９）．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤貪食によるマクロファージのＦＩＴＣ−ＰＳＬＰ貪食量の増加は表４に示すとおりである。ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤によりマクロファージの貪食能が活性化されたことが明らかである。

以上の結果から、（１）ＰＬＧＡ微粒子製剤及びリポ多糖はマクロファージの貪食能を活性化することが明らかになった。また、（２）リファンピシンのマクロファージ内への移行はＰＬＧＡ微粒子製剤中に包含されることによって格段に増大すること、及び（３）ＰＬＧＡ微粒子製剤内にリファンピシンが含有されていても、マクロファージ貪食能は活性化されることが明らかになった。従って、リファンピシン含有ＰＬＧＡ微粒子製剤は、マクロファージの貪食能を活性化し、その結果リファンピシンのマクロファージ内濃度は増大し、マクロファージ内に保持されている病原体に対して効率的に作用させるという本発明の目的を達成することが可能となる。上記の結果は、本発明の基本概念である“マクロファージの貪食活性を誘起”することにより、マクロファージ内の病原体に作用する治療薬をマクロファージ内に有効に取り込ませる新規治療薬の一例を示すものである。
３．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤の貪食によるマクロファージ内結核菌殺滅効果
（ａ）マクロファージ内結核菌（ＢＣＧ）の生存率測定法
（１）．乾燥ＢＣＧワクチンを生理食塩水で溶解し（１２ｍｇ／ｍＬ）攪拌した後、ＫＲＤ培地（３〜４ｍＬ）をＴ−２５培養フラスコに移しＢＣＧ懸濁液を４０μＬ入れ、乾式インキュベーター３７℃で培養した。
（２）．実験には菌液とガラスビーズを１：４の割合でサンプルチューブに入れ、ボルテックスミキサーで１分間攪拌後、さらに、超音波洗浄機での５分間の超音波処理によって菌体の分散を行った。
（３）．ＮＲ８３８３を１×１０^６個／ｍＬの濃度で６穴プレートに入れた（全体積５ｍＬ）。結核菌（ＢＣＧ）を細胞当たり１０個（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）＝１０）で細胞培養液に添加した。
（４）．３７℃、炭酸ガス培養器で４時間感染させたのち、２，０００回転／分，５分間（ＳＣＴ１５Ｂ）遠心後、上清を除いた。無血清培地を用いて同様に遠心を２回繰り返し細胞の外にいる菌を除いた。
（５）．ＮＲ８３８３を１×１０^６個／ｍＬの濃度で２４穴プレートに蒔いた。
（６）．ＮＲ８３８３に各ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子を細胞１個あたり１０個の割合で培養液に添加した。
（７）．３７℃、炭酸ガス培養器で４時間貪食させたのち、細胞外にある粒子を０．２５％トリプシンを用いて除外した。
（８）．８０％パーコールを加えて４０％パーコール−細胞液を作り、更に７０％パーコールを加え密度勾配を作った。１０，０００回転／分，５分間（ＳＯＲＶＡＬＬ Ｂｉｏｆｕｇｅ ｆｒｅｓｃｏ）遠心後、４０％，７０％パーコール間の界面の細胞を回収し、細胞とＲＦＰ−ＰＬＧＡを分離した。
（９）．ＰＢＳを用いて同様に遠心を２回繰り返しパーコールを除いた。
（１０）．フルオレッセインジアセテート（ＦＤＡ／、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ）／エチジウムブロマイド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＥＢ）染色法を用いて生菌と死菌の比率を測定した。ＦＤＡは５ｍｇ／ｍＬの濃度でアセトンに溶解し、使用時に２０μＬを１ｍＬのＰＢＳで希釈した。ＥＢは２０μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解し、使用時に５０μＬを１ｍＬ ＰＢＳで希釈して用いた。染色は希釈したＦＤＡとＥＢを等量混ぜて使用した。この混合液を１μＬスライドガラス上にのせ、その上に１μＬ菌液をのせ２分間室温におき蛍光顕微鏡で観察した。生菌は菌由来のエステラーゼ活性によりＦＤＡが分解され、緑色の蛍光を発する。一方、死菌はエステラーゼ活性がないため、ＦＤＡによる染色は見られず、ＥＢに染色されオレンジ色の蛍光を発する。
（ｂ）貪食によりマクロファージ内に取り込まれたＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子製剤の結核菌殺滅効果
（１）．ＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子によるマクロファージ内の結核菌殺滅効果を調べるために、予め結核菌を貪食したマクロファージ（結核菌感染マクロファージ）にＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子を投与し、この微粒子をマクロファージに貪食させた。
（２）．貪食によりマクロファージ内に移行したＲＦＰ−ＰＬＧＡがマクロファージ内結核菌に対しどの様な殺滅効果を示すかを調べた結果を図６に示した。単独のリファンピシン（１００μｇ／ｍＬ）よりも約２０分の１のリファンピシン含有のＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子投与量でも（ＭＯＩ＝１０、推定リファンピシン量５μｇ／ｍＬであるので、微粒子製剤中のリファンピシンはリファンピシンを単独に投与した場合の２０分の１量に相当する。）、リファンピシンの細胞内濃度が有意に高くなることが明らかである。結核菌感染肺胞マクロファージへのＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子の投与は、単独投与のリファンピシンに比べて細胞内の結核菌を２０倍以上の効率で殺滅した。すなわち粒子の貪食を介する薬剤投与によることで、薬剤そのものの抗結核作用にかかわらず２０倍以上の治療係数の向上が得られた。
マクロファージの貪食活性を誘起し機能異常の状態にあるマクロファージに作用する治療薬の提供
がん組織には、通常多数のマクロファージが浸潤していることが知られている。これはがん細胞が生体にとって異物であるために、がん細胞を排除する目的でマクロファージが集積することに基づく。マクロファージ機能が正常であれば、がん細胞は傷害され消滅するが、マクロファージの機能に異常があれば、がん細胞を傷害できずがん細胞は成長し、腫瘍塊を形成するに至る。ところで既に述べたように、マクロファージの活性化によってマクロファージはがん細胞に対しても傷害を与えることが可能になる。従って、マクロファージの貪食活性を誘起することで機能異常となったマクロファージにがん細胞傷害作用を獲得させ、がんを有効に治療することができ得る。
一方、表２に示したように肺胞マクロファージの貪食作用はリポ多糖（１μｇ／ｍＬ）の処理により１６６％も増強し、リポ多糖により肺胞マクロファージが活性化された。そこで、貪食能をリポ多糖により活性化された肺胞マクロファージは肺がん細胞に対して細胞傷害作用を発現すると考えられる。従って、ここでは、リポ多糖による活性化肺胞マクロファージの肺がん細胞傷害作用の例を示すものである。
具体的な適用例：肺がん
肺胞マクロファージを活性化することによる肺がん細胞傷害効果を適用例として示す。
１．リポ多糖による肺胞マクロファージの活性化及び肺胞マクロファージと佐藤肺癌細胞の共培養
（１）．ＮＲ８３８３を１×１０^６個／ｍＬの濃度で２４穴プレートに入れた（全体積１．５ｍＬ）。コントロールとして５％ウシ胎児血清，Ｆ−１２Ｋ培地１５０μＬ、１０μｇ／ｍＬリポ多糖を１５０μＬ加えた。
（２）．３７℃、炭酸ガス培養器で２４時間放置した。
（３）．佐藤肺癌細胞を１×１０^５個／ｍＬの濃度に調製し、９６穴プレートに１穴あたり５０μＬ加えた。
（４）．（１）の項で処理したＮＲ８３８３を、５×１０^５、１×１０^５、５×１０^４、１×１０^４個／ｍＬの濃度に調製し、９６穴プレートに５０μＬ入れた（全体積１００μＬ）。
（５）．３７℃、炭酸ガス培養器で４時間放置した。
２．佐藤肺癌細胞と共培養したマクロファージの肺癌細胞に対する傷害作用
（１）．１に記した、リポ多糖による活性化され、佐藤肺癌細胞と共培養したマクロファージのがん細胞に対する傷害効果を細胞内から培養液中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ量から評価するため、１，０００回転／分で５分間遠心後、上清５０μＬを別の９６穴プレートに分取した。
（２）．引き続き、乳酸デヒドロゲナーゼ量を測定するキット（ＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ，ｃａｔ．Ｇ１７８０）に付属している基質溶液５０μＬを加えた。なお、ポジティブコントロールとして、キットに付属している乳酸デヒドロゲナーゼ酵素希釈液（５０００倍希釈液５０μＬ）を用いた。
（３）．アルミホイルで遮光し、室温、３０分間放置した。
（４）．停止液５０μＬを加え、反応を停止させた。
（５）．マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ ５５０，ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて、４９５ｎｍにおける吸光度を測定した。
（６）．各吸光度から、細胞毒性（％）を算出した。
（７）．ＮＲ８３８３の佐藤肺癌細胞に及ぼす細胞毒性効果を図７に示す。リポ多糖未処理のＮＲ８３８３に比べ、リポ多糖処理したＮＲ８３８３は貪食が亢進しその結果佐藤肺癌への細胞傷害効果は、細胞比に依存して増強していることが示された。
マクロファージの貪食活性を誘起し、病原体を保持するマクロファージを細胞死に誘導する治療薬の提供
本実施の形態の治療薬は、マクロファージの貪食活性を誘起することにより、病原体を保持するマクロファージを細胞死に誘導することを特徴とする。
表２で示したように、マクロファージ活性化剤としてよく知られているリポ多糖はマクロファージの貪食活性を誘起する。また、マクロファージ活性化因子の代表的なサイトカインであるインターフェロンγも貪食活性を誘起する。すなわち、マクロファージの貪食活性の誘起はマクロファージ活性化の指標の一つである。本件で示した貪食による貪食活性の誘起は、貪食という刺激が貪食誘起というマクロファージの活性化を誘導したといえる。また、リポ多糖やインターフェロンγによるマクロファージの活性化に伴い、マクロファージの膜構造の変化が誘起され、マクロファージ内に膜結合型腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が誘導されることが知られている。従って、貪食という刺激によるマクロファージの活性化に伴い膜結合型ＴＮＦが誘導されることになる。
エイズはエイズウイルス感染によって、Ｔ細胞が破壊され、免疫応答が不全となることで発症する。ところで、エイズウイルス感染はＴ細胞に感染するだけでなく、マクロファージに感染する。この感染はエイズウイルスがＴ細胞、マクロファージ細胞膜上に共通して発現するＣＤ４タンバク質に吸着することで始まることによる。エイズウイルスが感染したマクロファージは、細胞死に陥ることなく持続的にエイズウイルスを産生しＩＩ．（２）で詳述したごとく感染病原体媒体となる。
従って、エイズウイルスが感染したマクロファージを細胞死に誘導することができれば、感染病原体媒体の殺滅が達成されることになる。
この可能性を実現させ得る一例として、膜結合型ＴＮＦがエイズウイルス（ＨＩＶ）に感染したマクロファージ細胞に作用して該細胞を特異的に細胞死に誘導し得ることを示す。
具体的な適用例：膜結合型ＴＮＦ発現細胞によるＨＩＶ感染細胞死の誘導
ＴＮＦが病原体に感染した細胞に対して細胞死を誘導する実施例としてＨＩＶ感染モルト４（ＭＯＬＴ−４）細胞に対するＴＮＦの作用を示す。
１．膜結合型ＴＮＦ発現細胞の作製
（１）．膜結合型ＴＮＦを安定に発現させるために既報（ジャーナルオブビィロロジー Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８８９年、第６３巻、ｐｐ．２５０４−２５０９）に従いマウス及びヒト膜結合型ＴＮＦ発現プラスミド（ｐＭＴ２βＧ／Ｈｕ−ｐｒｏＴＮＦ）を作製した。
（２）．ついで、この発現プラスミドを形質転換株選択用にネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだプラスミドと１０：１の比率で混合し、マウス胎児由来繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞）に導入した。
（３）．上記、形質転換操作を行ったＮＩＨ３Ｔ３細胞を、選択マーカーであるネオマイシン８００μｇ／ｍＬの存在下、３７℃、炭酸ガス培養器内にて、約２週間培養した。
（４）．培養後、細胞に組み込まれたＴＮＦのクローンを取得した。
（５）．取得したクローンは、膜結合型ＴＮＦを発現していることを酵素免疫測定法にて確認した。
２．ＨＩＶ感染モルト４細胞の調製
（１）．ＨＩＶ感染細胞は、３７℃、炭酸ガス培養器内にて、培地（ＲＰＭＩ１６４０，１０％ウシ胎児血清及びペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加）中で、モルト４に、ＨＩＶ感染細胞（ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ株）を用いて、既報（ジャーナルオブビィロロジー １８８９年、第６３巻、ｐｐ．２５０４−２５０９）に従って感染させた。モルト４細胞にエイズウイルス感染が成立すると、モルト４細胞は持続的にエイズウイルスを産生し続ける特徴を示す。従って、エイズウイルス産生に関してみれば、モルト４細胞はエイズウイルス感染マクロファージのモデルである。
（２）．この感染条件にて、ＨＩＶ感染モルト４細胞の９０％以上がＨＩＶ抗体に陽性となった。
（３）．従って、ＨＩＶ感染細胞によって、ＨＩＶはモルト４細胞の殆ど全てに導入され、ＨＩＶ感染モルト４細胞が調製されたことになる。
３．膜結合型ＴＮＦ発現細胞によるＨＩＶ感染細胞の細胞死誘導
（１）．ＴＮＦのプラスミドを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞を２４穴培養プレートにほぼプレート一面になるように培養した。
（２）．次いで、一定量のＨＩＶ感染モルト４細胞を加えて３日間、３７℃、炭酸ガス培養器内にて混合培養した。
（３）．発現した膜結合型ＴＮＦのＨＩＶ感染細胞に対する作用を調べるために、ＨＩＶ感染細胞の生存率をトリパンブルー色素排除法にて測定した。
（４）．その結果、ＨＩＶに感染したモルト４細胞の４０％が膜結合型ＴＮＦ発現細胞との混合培養で細胞死することが認められた。
以上の例から明らかなように、膜結合型ＴＮＦはエイズウイルス（ＨＩＶ）に感染した細胞に対して、特異的に細胞死を誘導することが明らかである。このことから、病原体を保持することにより機能異常となったマクロファージが、病原体を貪食することにより活性化され、その結果誘導された膜結合型ＴＮＦが、病原体感染マクロファージを細胞死に誘導すると見ることができる。
マクロファージが病原体を保持することによる疾患には、抗酸菌症、エイズ、クラミジア症、又は、トキソプラズマ症などがあり、抗酸菌症には、マイコバクテリウム ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、若しくはマイコバクテリウム ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）を原因菌とする結核、マイコバクテリウム レプラ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｌｅｐｒａｅ）を原因菌とするライ、又はマイコバクテリウム アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）他を原因菌とする非定型抗酸菌症などがあり、クラミジア症の原因菌としてはクラミジア ニューモニア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、又はクラミジア シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）などがあり、いずれも本発明を有効に適用できる。ところで、本実施の形態で示したＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子のマクロファージ内結核菌殺滅効果は、貪食誘起によって食胞内に取り込まれたＲＦＰ−ＰＬＧＡ微粒子からリファンピシンが遊離し、食胞膜を透過し、さらに結核菌含有食胞の食胞膜を透過するという、少なくとも２回の細胞内小胞膜構造の通過がなければ、達成されない。上記に示した原因菌のマクロファージ内での生残戦略は様々である。抗酸菌症全般、レジオネラ、トキソプラズマは食胞内に原因菌が生残することで、マクロファージ内で生存する。リステリア、クラミジアは原因菌が、食胞から脱出する特徴を有する。これら原因菌の細胞内生存態様は、食胞内に原因菌が存在する場合と比べ、薬剤の到達の観点からみれば、薬剤が一度食胞膜を透過すれば薬効が期待できるので、より容易であると推定される。また、エイズでは細胞内に存在する原因菌に薬剤が到達すれば薬効が期待できる点で、リステリアなどと同様である。以上のことから本発明は上記記載の原因菌に対しても有望な治療である。
また、本発明を有効に適用できる各疾患に対する薬品を以下に挙げる。
１）抗酸菌症：リファンピシン、イソニアジド、エタンブトール、ピラジナミド、アジスロマイシン、カナマイシン、硫酸ストレプトマイシン、エンビオマイシン、エチオナミド、サイクロセリン、レボフロキサシン、ジアフェニルスルフォン。
２）エイズ：アジドチミジン、ジデオキシイノシン。
３）クラミジア症：塩酸ミノサイクリン、塩酸ドキシサイクリン、クラリスロマイシン、スパルフロキサシン、ロキスロマイシン、レボフロキサシン。
４）トキソプラズマ症：ピリメサミン、スルファモノメトキシン、アセチルスルピラマイシン。
５）マラリア症：燐酸クロロキン、硫酸キニーネ、スルファドキシン、メフロキン。
６）がん：５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、シスプラチン、エトポシド、マイトマイシン、ビンクリスチン、タキソール、カンプトテシン、ビンブラスチン、サイクロフォスファマイド、ブレオマイシン。
７）クローン病：サラゾスルファピリジン、グルココルチコイド。
８）リュウマチ：金チオリンゴ酸ナトリウム、ペニシラミン、ブシラミン、グルココルチコイド。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

産業上の利用の可能性

本発明により、マクロファージの機能異常のため、又は、マクロファージを媒体して罹患する疾病を効果的に治療することができる治療薬を提供することができる。

Claims (13)

1. マクロファージの貪食活性を誘起し、マクロファージ内に存在する病原体の全てもしくは一部を殺して消滅させることを特徴とする治療薬。
2. マクロファージの貪食活性を誘起し、病原体を保持するマクロファージを細胞死に誘導することを特徴とする治療薬。
3. マクロファージの貪食活性を誘起し、機能異常の状態にあるマクロファージに作用することを特徴とする治療薬。
4. 抗酸菌症、エイズ、クラミジア症又はトキソプラズマ症に対するものであることを特徴とする請求項１又は２記載の治療薬。
5. クローン病、リューマチ、がん又は免疫不全症候群に対するものであることを特徴とする請求項２又は３記載の治療薬。
6. 前記マクロファージは、粘膜組織に常在するものであることを特徴とする請求項１乃至４いずれかに記載の治療薬
7. 前記マクロファージは、腹腔、大網、乳斑、肺胞、肺間質、肝臓、門脈域、脾臓、骨髄、胸腺、消化管、口腔偏頭、副腎、脳下垂体、甲状腺間質、ランゲルハンス島、副甲状腺、松果体、精巣、卵巣、卵管、子宮、胎盤、皮膚、髄膜、脳質、脈絡叢のいずれかに常在するもの、又は、前記マクロファージは、マイクログリア、マイクログリアの前駆細胞、グリア細胞、グリア細胞の前駆細胞、前記常在マクロファージの前駆細胞、常在マクロファージ類縁細胞、若しくは常在マクロファージ類縁細胞の前駆細胞であることを特徴とする請求項１乃至４いずれかに記載の治療薬。
8. ＰＬＧＡ（ポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体）を含み、結核に対するものであることを特徴とする請求項１、２、３又は６記載の治療薬。
9. さらに、リファンピシンを含むことを特徴とする請求項８記載の治療薬。
10. 分子量１，５００から１５０，０００のＰＬＧＡを含むことを特徴とする請求項１乃至９いずれかに記載の治療薬。
11. 分子量１，５００から７５，０００のＰＬＧＡを含むことを特徴とする請求項１乃至９いずれかに記載の治療薬。
12. さらにＰＶＡ（ポリビニルアルコール）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＥＯ（ポリエチレンオキシド）、糖、タンパク質、ペプチド、リン脂質又はコレステロールの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１乃至１１いずれかに記載の治療薬。
13. さらに、ＰＶＡ、ＰＥＧ、ＰＥＯ、糖、タンパク質、ペプチド、リン脂質又はコレステロールの少なくとも１つを含み、主たる粒子直径が１〜６ミクロンである微粒子製剤であることを特徴とする請求項８又は９記載の治療薬。

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