KR20100135797A

KR20100135797A - 중합체 분석물의 검출

Info

Publication number: KR20100135797A
Application number: KR1020107022805A
Authority: KR
Inventors: 제임스 랜더스; 데이비드 핀클러; 스코트 바커; 댄 레슬리
Original assignee: 유니버시티 오브 버지니아 페이턴트 파운데이션
Priority date: 2008-03-12
Filing date: 2009-03-12
Publication date: 2010-12-27
Also published as: EP2265942A2; AU2009223122B2; EP2265942B1; AU2009223122A1; US10656146B2; WO2009114709A3; WO2009114709A2; US20110070660A1; EP2265942A4

Abstract

본 발명은 중합체 분석물, 특히 생중합체의 검출 방법, 및 중합체 분석물의 검출을 위한 센서에 관한 것이다. 본 발명은 핵산, 지질, 다당류, 단백질 등과 같은 중합체 분석물의 존재를 가시적으로 검출하기 위해 회전 자기장에서 자기 비드를 사용한다. 중합체 분석물이 자기 비드에 결합하는 경우, 비드에 회전 자기장이 적용되어 고유한 핀휠(pinwheel)을 형성한다. 중합체 분석물이 존재하지 않는 경우, 회전 자기장에 의해 유도된 자기 비드의 이동은 핀휠 형성과 상당히 상이하다. 따라서, 핀휠은 중합체 분석물의 존재를 검출하는데 사용된다.

Description

중합체 분석물의 검출 {DETECTION OF POLYMERIC ANALYTES}

본 발명은 중합체 분석물, 특히 생중합체의 검출 방법, 및 중합체 분석물의 검출을 위한 센서에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 중합체 분석물이 자기 비드에 결합하여 회전 자기장에 노출시 고유한 핀휠(pinwheel)의 형성에 관한 것이다.

중합체 분석물은 크로마토그래프, 전기영동, 결합 분석, 분광광도법 등과 같은 현행 방법을 이용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 핵산을 사용하여 260 nm에서의 샘플의 흡광도를 측정함으로써 DNA 농도를 분광학적으로 검출하였다. 이 방법은 비교적 고 농도의 DNA에서는 신뢰할만한 검출 및 정량화를 제공하지만, 저 농도에서는 불량한 민감성이 문제가 된다.

DNA 검출을 위한 다른 방법은 DNA를 형광 염료에 결합시켜 형광광도계를 사용하여 형광을 검출하는 것을 포함한다. 이러한 염료의 예로는 인비트로겐(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)을 통해 시판되는 피코그린(PicoGreen)^®, 및 미국 특허 제6,664,047호, 동 제5,582,977호 및 동 제5,321,130호에 개시된 염료가 있다. 형광광도계 방법은 매우 민감하지만, 시약 제조 및 취급, 및 여기 및 형광-방출의 측정을 위한 특수 형광광도계가 요구되어 일반적으로 귀찮은 방법이다.

또한, 단백질은 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 분광 측광학적으로 검출될 수 있다. 단백질 검출을 위한 또다른 방법은 로우리(Lowry) 분석이다. 상기 방법은 750 nm에서 최대 흡광도를 나타내는 단백질에 의한 폴린-시오칼토(Folin-Ciocalteu) 페놀 시약에서의 환원 포스포몰리브드산-텅스텐산의 혼합 산 색소원에 기초한다. 단백질을 검출하는 다른 방법으로는 브래드포드(Bradford) 분석 및 뷰렛(Biuret) 분석을 들 수 있다. 이들 분석은 낮은 민감도 또는 집약적인 실험 준비 및 절차가 문제가 된다.

탄수화물의 존재는 또한 디니트로살리실산을 사용하여 그의 환원성 말단을 검출함으로써 분광 측광학적으로 검출될 수 있다. 이는 비등하는 물 중에서 디니트로살리실산의 존재하에 샘플을 가열하고, 540 nm에서 흡광도를 측정하는 것을 포함한다. 상기 방법도 또한 낮은 민감도 및 집약적인 실험 준비 및 절차가 문제가 된다.

일반적으로, 미세유체 장치에서의 분석물의 검출은, 1) 분석물 농도가 일반적으로 낮기 때문에 높은 민감도; 및 2) 최소 수의 시약 및 유체 취급을 요하는 방법의 단순화를 필요로 한다. 따라서, 특히 미세유체 분야에서는, 핵산을 검출하기 위한 간단하고, 빠르며, 민감한 방법 및 장치가 여전히 필요하다.

<본 발명의 개요>

효율적인 분자 분석은 대개 매우 작은 샘플 내 매우 낮은 농도의 분석물의 존재를 검출하는 것을 필요로 한다. 자기 비드 제어를 수행하기 위해 마이크로디바이스에서 외부 자기장을 이용하는 것은, 예를 들어 미국 특허 제7,452,726호; 동 제6,664,104호; 동 제6,632,655호; 및 동 제6,344,326호 (본원에 참조로 포함됨)에 의해 이미 개시되었다. 그러나, 본 발명은 회전 자기장에서 자기 비드를 사용하여 중합체 분석물, 예컨대 핵산, 지질, 다당류, 단백질 등의 존재의 가시적 검출을 제공한다. 상기 방법은 중합체 분석물이 자기 비드에 결합하는 경우, 회전 자기장이 상기 비드에 적용되어 고유한 핀휠을 형성하는 관찰로부터 비롯된다. 중합체 분석물이 존재하지 않는 경우, 회전 자기장에 의해 유도된 자기 비드의 이동은 핀휠 형성과 상당히 상이하다. 따라서, 핀휠 형성은 중합체 분석물과 자기 비드 사이의 결합의 존재에 대해 특이적이므로, 분석물의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 목적은 샘플을 자기 비드와 접촉시키고, 자기 비드를 회전 자기장에 노출시켜 샘플 내 중합체 분석물의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 핀휠 형성의 존재는 결합된 중합체 분석물의 존재를 나타낸다. 바람직하게는, 자기 비드는, 중합체 분석물에 특이적으로 결합하거나 또는 자기 비드에 대한 중합체 분석물의 결합을 증강시키기 위해 코팅 또는 유도체화된다. 또한, 자기 비드에 대한 중합체 분석물의 결합을 증강시키기 위해서 환경을 조작할 수 있다.

본 발명의 또다른 목적은 액체 샘플 내 중합체 분석물의 존재를 검출하기 위한 시스템에 관한 것이다. 상기 시스템은 회전가능한 자석, 바람직하게는 모터 상에 탑재된 자석을 함유하여, 모터가 작동할 때 자석을 회전시켜 회전 자기장을 형성한다. 내부에 자기 비드를 함유하는 검출 챔버를 대략 자석의 N극과 S극 사이의 중심에 위치시킨다. 사용시 샘플을 검출 챔버에 둔다. 이어서, 모터를 작동시켜 자석을 검출 챔버 주위로 회전시킨다. 챔버 내 핀휠 형성의 존재는 샘플 내 중합체 분석물의 존재를 나타낸다.

본 발명의 방법 및 장치를 기존의 분석 또는 장치, 특히 μ-TAS에 추가하여 중합체 분석물 검출기로서 작동시킬 수 있다. 예를 들어, 항체/항원 반응의 존재는 핵산의 커플링을 개시할 수 있고, 핀휠 형성의 존재/부재는 항체/항원 결합이 일어났는 지 여부를 결정한다. 이는 면역-PCR 방법과 유사하며, 여기서 핵산의 검출을 위해 PCR 및 형광 프로브를 사용하는 대신 핀휠 형성을 이용할 것이다.

도 1은 검출 챔버가 교반 플레이트의 중심에 위치된 본 발명의 실시양태를 나타낸다.
도 2는 교반 플레이트 내에서의 회전 자석의 실시양태를 나타낸다.
도 3은 검출 챔버를 나타낸다.
도 4는 도 1에서 나타낸 교반 플레이트의 표면 상에서 x-방향의 자기장의 성분을 나타낸다.
도 5는 도 1에서 나타낸 교반 플레이트의 표면 상에서 y-방향의 자기장의 성분을 나타낸다.
도 6은 도 1에서 나타낸 교반 플레이트의 표면 상에서 z-방향의 자기장의 성분을 나타낸다.
도 7a 내지 도 7h는 비디오 사진에서 핀휠 형성을 검출하기 위한 컴퓨터 프로그램의 스크린 디스플레이를 나타낸다.
도 8은 회전 자석에 대한 검출 챔버의 위치를 나타낸다.
도 9는 부착된 DNA의 유무 하의 자기 비드를 갖는 검출 챔버를 나타낸다.
도 10은 다양한 DNA 농도에서의 핀휠 형성을 나타낸다.
도 11은 DNA의 핀휠 형성에 대한 초음파처리의 효과를 나타낸다.
도 12는 초음파처리 후의 DNA의 존재를 나타낸다.
도 13은 부착된 다당류의 유무 하의 자기 비드를 갖는 검출 챔버를 나타낸다.

본 발명은 중합체 분석물이 자기 비드에 결합하며 회전 자기장의 존재하에 있는 경우 고유한 핀휠 형성을 초래한다는 신규한 관찰을 기초로 한다. 핀휠 효과는 정자기장에서는 나타나지 않으며, 회전 자기장에 특이적인 것으로 판단된다. 본원에서 사용되는 "핀휠 형성"은 원형 단면을 갖는 회전 덩어리(rotating mass)를 의미한다. 상기 덩어리는 자기 비드의 집단(clump) 또는 응집물(aggregate)로 이루어져 있다. 스틸 사진으로 관찰하는 경우 (도 8-10), 핀휠 형성은 자기 비드의 응집물로 이루어진 디스크형 물건으로 보인다. 그러나, 가시적으로 또는 이미지화에 의해 관찰하는 경우에, 디스크형 물건은 실제로 회전 핀휠의 경우와 유사하게 그의 중심축 주위를 회전한다. 검출 챔버 내에서, 핀휠 형성은 때때로 서로 충돌하여 보다 큰 핀휠을 형성하며, 때때로 챔버 벽과 충돌하여 보다 작은 핀휠로 분열한다.

본원에서 사용되는 "중합체 분석물"은 동일하거나 또는 동일하지 않을 수 있는 반복 구조 단위로 구성된 거대분자를 의미한다. 중합체 분석물에는 생중합체 또는 비-생중합체가 포함될 수 있다. 생중합체에는 핵산 (예컨대, DNA 또는 RNA), 단백질, 폴리펩티드, 다당류 (예컨대, 전분, 글리코겐, 셀룰로스 또는 키틴), 및 지질이 포함되나, 이로 제한되지는 않는다.

본 발명의 방법을 수행하기 위한 장치에는 바람직하게는 모터에 장착된 회전가능한 자석, 및 대략 자석의 N극과 S극 사이의 중심에 위치된 검출 챔버가 포함된다. 도 1은 교반 플레이트 (10) (그 안에 회전가능한 자석을 가짐) 및 교반 플레이트 (10)의 중심에 위치된 검출 챔버 (12)를 포함하는 본 발명의 장치의 실시양태를 나타낸다. 교반 플레이트 (10)는 탑 커버 (14)를 가지며, 이의 상부에 검출 챔버 (12)가 있다. 도 2에서 나타낸 것과 같이, 탑 커버 (14)의 하부에 N극 (22) 및 S극 (24)을 갖는 자석 (20)이 있다. 도 1 및 도 2에서 나타낸 x축, y축 및 z축은 동일하며, 두 도면에 대한 참조로서 기능한다. 바람직하게는, 자석은 도 2에서 나타낸 것과 같이 U자 모양의 각각의 단부에 극을 갖는 U-형 자석이다. 비록 상기 형태가 바람직한 형태이지만, 다른 자석 형태, 예를 들어 I-형 또는 반원형 자석 또한 본 발명에 적합하다. 바람직하게는, 자석은 그의 중심축 (z) 주위에서 자석 (20)을 회전시킬 수 있는 모터 (24)에 장착된다. 도 1 및 도 2가 검출 챔버 (12) 바로 아래에 위치된 자석 (20)을 나타내지만, 검출 챔버가 대략 자석의 두 극 사이에 위치되는 한, 이러한 형태가 본 발명을 실시하기 위해 필수적인 것은 아니다. 자기장은 검출 챔버에 평행하게, 직각으로, 또는 임의의 각도 중 하나로 위치시킬 수 있다. 비드는 정해진 형태로 이동하며, 여기서 이들은 핀휠 구조를 형성하고, 자기장의 방향성 회전에 상호관련하는 고유한 방향으로 회전한다. 회전가능한 자석이 본원에 개시되어 있지만, 회전 자기장을 생성할 수 있는 다른 디바이스로 대체할 수 있다. 이러한 디바이스는 회전 자석에 의해 생성되는 것과 유사한 회전 자기장을 생성할 수 있는 전자석, 또는 전자 회로일 수 있다.

검출 챔버 (12)는 대략 자석 (20)의 중심 (자석이 회전하는 경우 대략 자기장의 중심)에 위치될 수 있는 임의의 유체 용기일 수 있다. 바람직하게는, 검출 챔버 (12)는 당업계에 알려진 미세유체 디바이스 또는 마이크로-종합 분석 시스템(micro-total analysis system; μ-TAS)의 부품 또는 성분이다. 일반적으로, 미세유체 디바이스 또는 μ-TAS는 하나 이상의 마이크로-채널을 포함한다. μ-TAS의 제작을 위한 여러 형태, 물질 및 크기 규모가 존재한다. 통상적인 μ-TAS 디바이스는 미국 특허 제6,692,700호 (한디크(Handique) 등); 제6,919,046호 (오코너(O'Connor) 등); 제6,551,841호 (윌딩(Wilding) 등); 제6,630,353호 (파르세(Parce) 등); 제6,620,625호 (올크(Wolk) 등); 및 제6,517,234호 (코프-실(Kopf-Sill) 등)에 개시되어 있으며, 이들 문헌의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 통상적으로, μ-TAS 디바이스는 서로 결합된 2개 이상의 기판으로 이루어진다. 유체 처리를 위한 마이크로규모 성분을 기판 중 하나 이상의 표면에 배치한다. 이들 마이크로규모 성분에는 반응 챔버, 전기영동 모듈, 마이크로채널, 유체 저장부, 검출기, 벨브 또는 혼합기가 포함되나, 이로 제한되지는 않는다. 기판이 서로 결합된 경우, 마이크로규모 성분이 기판 사이에 둘러싸여지며 샌드위칭된다. 도 3은 마이크로채널 (30)이 포함된 검출 챔버 (12)의 단순한 실시양태를 나타낸다. 마이크로채널 (30)의 양쪽 단부에는 샘플을 마이크로채널 (30)에 첨가하고, 마이크로채널 (30)로부터 제거하기 위한 주입구 (32) 및 배출구 (34) 포트가 있다. 실무상, 검출 챔버는 분석을 위한 일체화된 시스템의 부분으로서 μ-TAS의 다른 마이크로규모 성분에 연결될 수 있다.

검출 챔버는 샘플의 첨가 전에 자기 비드를 포함할 수 있거나, 또는 자기 비드를 샘플과 함께 검출 챔버에 첨가할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 자기 비드는 중합체 분석물의 자기 비드에의 결합, 또는 결합 증강을 위한 물질로 코팅 또는 유도체화된 표면을 함유한다. 당업계에 알려진 몇몇 코팅 또는 유도체화에는 아민-기재 전하 스위치, 보론산, 실란화(silanization), 역상, 올리고뉴클레오티드, 렉틴, 항체-항원 및 아비딘-비오틴이 포함되나, 이로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 핵산의 검출에 대하여, 자기 비드는 고 이온 농도, 무질서유발 완충제 (chaotropic buffer)에 노출된 경우 핵산을 특이적으로 결합시키도록 코팅된 실리카일 수 있다. 또한, 비드는 핵산과의 결합을 위한 양전하 아민 또는 올리고머로 코팅될 수 있다. 올리고머의 경우, 약 50개 미만의 염기, 보다 바람직하게는 5개 내지 50개의 염기, 가장 바람직하게는 5개 내지 30개의 염기를 가져, 보다 긴 핵산과 결합하지 않고는 핀휠 형성이 형성되지 않는 것이 바람직하다.

탄수화물을 결합시키기 위해, 자기 비드는 보론산-개질된 표면을 함유할 수 있다. 보론산은 글루코스를 비롯한 특정 탄수화물에서 공통의 잔기인 -시스 디알콜에 공유적으로 및 특이적으로 결합한다.

지질을 결합시키기 위해, 자기 비드는 소수성 기, 예컨대 벤질기, 다양한 길이 (6-20)의 알칸, 또는 비닐기로 개질될 수 있다. 지질은 소수성 결합력에 의해 비드에 결합된다.

단백질을 결합시키기 위해, 자기 비드는 단백질 개질된 표면을 함유할 수 있다. 예를 들어, 비드의 표면은 관심 단백질에 대한 특이적인 항체로 코팅될 수 있다. 일반적인 단백질 검출에 대해, 비드 표면은 아비딘 또는 비오틴으로 코팅될 수 있고, 관심 단백질은 비오틴 또는 아비딘으로 유도체화될 수 있다. 따라서, 아비딘-비오틴 결합으로 인해 단백질이 비드에 결합할 수 있다.

자기 비드의 유도체화 또는 코팅 이외에, 중합체 분석물이 자기 비드와 접촉하는 물리적 환경이 또한 조작되어 비드가 중합체 분석물에 특이적으로 결합되거나 또는 상기에의 자기 비드의 결합이 증강될 수 있다. 예를 들어, 실리카 코팅된 비드는 사용되는 조건에 따라 핵산, 탄수화물 또는 단백질을 특이적으로 결합시키도록 조작될 수 있으며; DNA의 결합은 무질서유발 염 용액에서 일어나고, 양전하 탄수화물의 결합은 저 이온 농도 용액에서 일어나고, 단백질의 결합은 변성 조건 하에서 (우레아, 열 등의 존재하에) 일어난다.

검출되는 중합체 분석물의 농도에 따라, 채널에서의 비드의 수는 바람직하게는 약 100 내지 약 10⁸ 개, 보다 바람직하게는 약 10⁴ 내지 10⁷ 개이다. 샘플에서 분석물의 농도가 높을수록, 사용되어야 하는 자기 비드의 양은 더 많아진다. 자기 비드는 바람직하게는 약 0.25 내지 50 μm, 바람직하게는 5 내지 8 μm의 유효 직경을 갖는다. 바람직하게는, 비드의 크기는 검출될 핵산의 예상된 크기에 부합한다. 보다 작은 비드는 보다 짧은 중합체 분석물과 함께 핀휠을 형성한다. 비드 크기는 식별용으로 요구되는 크기로 특정 컷오프로 변경될 수 있다.

도 4 내지 6은 각각 x, y 및 z 축에서 자석의 자기장 세기의 성분을 나타낸다 (x, y 및 z 축은 도 2에 나타낸 바와 같고, y 축은 자석의 2개의 극을 연결하고, x 축은 z 축에 수직이며 자석의 회전면에 존재하고, z 축은 자석의 수평면에 수직임). x-축 및 z-축에서의 자기장의 성분은 본질적으로 자기장의 중심에서는 무시할 수 있으며, 따라서 핀휠 형성에 결정적인 것은 아닐 것이다. 바람직하게는, y-축에서의 자기장은 약 1 내지 5,000 가우스(gauss), 보다 바람직하게는 약 10 내지 1000 가우스의 세기를 갖는다. 또한, 자석의 형상과 관계없이, 바람직하게는, y-축에서의 자기장 성분의 형상은 도 5에 도시된 것과 유사해야 한다. 바람직하게는, 이러한 자기장 성분은 회전의 중심에서 그의 최대 세기를 획득하고, 자석의 두 개의 극에서 최소 세기로 존재한다. 바람직하게는, 이러한 자기장 성분은 자석의 길이에 따라 최대화되고, 극에서 갑작스럽게 그의 최소값으로 떨어진다. 바람직하게는, 이러한 자기장 성분은 자석의 어느 한 측면을 유의하게 감소시키지는 않는다. 또한 바람직하게는, 검출 챔버에서의 자기장 라인은 검출 챔버가 놓여진 xy-면에 평행이다.

샘플에서 중합체 분석물을 검출하기 위해, 샘플을 검출 챔버에 첨가한다. 검출 챔버는 내부에 이미 자기 비드를 함유할 수 있거나, 또는 자기 비드가 샘플과 함께 챔버에 첨가될 수 있다. 자기 비드가 첨가되는 방법 또는 챔버의 치수에 관계없이, 샘플 및 자기 비드를 챔버 안에서 접촉시키는 것이 중요하다. 챔버를 대략 자석의 중심에 (자석의 두 극 사이에) 위치시키면서, 자석을 회전시켜 챔버가 회전 자기장을 경험하게 하였다 (회전 자기장은 또한 자석보다는 오히려 전자 회로를 사용하여 수행될 수 있음). 자석은 바람직하게는, 약 10 내지 10,000 rpm, 보다 바람직하게는 약 1000 내지 3000 rpm으로 회전한다. 채널에서의 핀휠 형성의 관찰은 샘플에서 중합체 분석물의 존재를 나타낸다. 바람직하게는, 핀휠의 평균 크기 (직경)는 샘플에서 핵산의 농도에 비례한다. 교정 곡선을 획득하여 핀휠의 평균 크기를 중합체 분석물 농도와 관련시킬 수 있다. 이러한 교정 곡선은 예를 들어, 공지된 농도의 중합체 분석물을 회전 자기장에 적용시키고, 각 농도에 대한 핀휠 형성의 평균 크기를 측정함으로써 생성될 수 있다.

핀휠 형성의 존재는 가시적으로 또는 광학 또는 영상 장비를 사용하여 검출될 수 있다. 핀휠 형성을 검출하기 위한 하나의 방식은 검출 챔버의 비디오를 촬영 또는 기록하는 것이다. 이어서, 컴퓨터 프로그램을 사용하여 사진 또는 비디오에서 핀휠 형성을 검출할 수 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램의 예는 표 1 및 도 7에 도시되어 있다. 프로그램을 먼저 업로드하고, 검출 챔버만이 나타나도록 영상 (사진 또는 비디오 프레임)을 자른다. 이어서, 잘려진 영상을 그레이 스케일로 전환시킨다. 이어서, 약 40 내지 70의 한계로 확장된 최소 변환을 수행하여 배경 픽셀로부터 자기 미세입자를 단리한다. 각 대상체 내의 홀이 채워지면, 각 대상체를, 바람직하게는 개별적 RGB 색으로 라벨링한다. 이어서, 경계가 각각의 별개의 대상체 주위에 생성된다. 각 경계에 대해, 측정치 m = 4πa/p²를 계산한다 (여기서 a는 대상체의 면적이고, p는 대상체의 둘레임). 측정치 m은 대상체의 원형정도의 척도이고, 완전한 원의 경우 m은 1이다. 각 대상체에 대해, m이 약 0.8 초과, 바람직하게는 약 0.95 초과인 경우, 대상체는 핀휠로서 정의된다. 이어서, 약 0.8 초과의 m을 갖는 각 대상체 (핀휠)에 대해 도심(centroid)을 플롯팅한다. 이어서, 사진이 사용되는 경우, 핀휠의 수를 계수한다. 비디오가 사용되는 경우, 단계를 비디오의 각 프레임에 대해 반복하고, 프레임 당 핀휠의 평균 개수를 계산한다. 핀휠의 개수 또는 프레임 당 핀휠의 평균 개수가 0.5 내지 10의 설정값 (중합체 분석물 및 비드 농도에 따라 달라짐) 초과인 경우, 중합체 분석물이 샘플에 존재한다라는 결과로 프로그램을 되돌린다. 표 1 및 도 7은 프로그램의 단계, 각 단계를 달성하기 위한 MATLAB® 프로그램의 리스팅, 및 프로그램의 일부 단계에 대한 컴퓨터 디스플레이를 나타낸다. MATLAB® 프로그램의 전체 리스팅을 부록으로 제공한다.

프로그램 단계	MATLAB® 프로그램 목록	스크린 디스플레이
1. (카메라로부터) 비디오 파일을 열고 Matlab®에 넣는 단계		도 7a
2. 변수를 초기화하고 비디오에서 프레임의 개수를 얻는 단계
3. 미세유체 채널만 함유하도록 영상을 자르는 단계		도 7b
4. 영상을 그레이스케일로 변환시키는 단계		도 7c
5. 한계 40 내지 70에 의해 연장된 최소 변형을 실시하여 자기 미세입자를 배경 픽셀로부터 단리시키는 단계		도 7d
6. 각 대상체 내의 임의의 홀을 채우는 단계		도 7e
7. 각 대상체를 개별적 RGB 색으로 라벨링하는 단계		도 7f
8. 각 별개의 대상체 주변에 경계를 형성하는 단계		도 7g
9. 면적 및 둘레를 계산하고 각 대상체에 대해 측정치 4πa/p2를 계산하는 단계
10. 한계를 0.94로 설정하고 측정치가 0.94 초과인 대상체를 핀휠로 정의하는 단계
11. 상기 기준을 만족시키는 각 대상체에 대해 도심을 플롯팅하여 그를 핀휠로 표시하는 단계		도 7h
12. 프레임 당 핀휠의 평균 개수를 계산하는 단계
13. 상기 값이 0.5 내지 10의 설정값(DNA 및 비드 농도에 따라 다름)을 초과하는 경우, DNA가 샘플에 존재함을 유저에게 리턴하는 단계

자동화 검출 기반 소프트웨어에 있어서, 한가지 가능한 시스템은 하나 이상의 카메라, 및 컴퓨터 프로그램 작동을 위한 컴퓨터를 함유한다. 상기 시스템에서, 카메라는 검출 챔버의 사진 또는 비디오를 찍고, 카메라로부터의 영상은 컴퓨터에 의해 분석된다. 상기 컴퓨터는 바람직하게는 상기 언급한 바와 같이 카메라로부터의 영상을 자동적으로 다운로딩(downloading)하고 처리하기 위해 카메라에 전자적으로 연결된다. 자동화 검출은 검출 챔버가 μ-TAS의 부품인 경우에 특히 효율적이고, 여기서 컴퓨터는 또한 μ-TAS의 다른 면, 예컨대 온도, 유체 흐름, 통문(gating), 반응 모니터링 등을 제어하고 감지하는 데에 사용될 수 있다.

추가의 기재 없이, 당업자는 상기 기재 및 하기 실시예를 사용하여 본 발명의 장치를 제조하고 이용할 수 있으며 그 방법을 실시할 수 있다고 여겨진다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 주어진다. 본 발명은 하기 실시예에 기재된 특정 조건 또는 세부사항에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.

실시예 1

도 8은 자석 (20)에 대한 검출 챔버의 위치의 중요성을 나타낸다 (N 및 S는 각각 자석의 북극 및 남극을 나타냄). 여기서, DNA 및 실리카-코팅된 자기 비드를 마이크로챔버 (검출 챔버)에 첨가하였다. 상기 검출 챔버를 화살표에 의해 나타낸 방향으로 회전하는 자석 (20)에 대해 다양한 위치 (70, 72, 74, 76, 및 78)에 배치시켰다. 도 7로부터, 핀휠 형성이 대략 자석 (20)의 극 사이의 중심인 위치 76에서 최적이라는 것이 명백하였다. 다른 위치는 핀휠 형성을 초래하지 않았다.

실시예 2

도 9는 DNA를 함유하지 않는 샘플 및 인간 DNA 30 ng를 함유하는 샘플에 대해 본 발명의 방법을 사용한 결과를 나타낸다. DNA를 함유하는 샘플은 핀휠의 형성을 명백하게 나타내었으나, DNA를 함유하지 않는 샘플은 핀휠 형성을 나타내지 않았다.

도 10은 상이한 DNA 농도 및 비드 크기를 사용하는 동일한 실험을 나타낸다. 핀휠 형성은 30 pg 만큼 적은 DNA에서 검출될 수 있는 것으로 나타났다.

실시예 3

도 11은 본 발명의 방법을 사용하여 인간 게놈 DNA 검출에 대한 초음파처리의 효과를 나타낸다. 초음파처리된 DNA는 DNA가 존재하지 않는 것처럼 거동하는 것으로 나타났다. DNA가 샘플에 여전히 존재하더라도 (도 12) 초음파처리된 DNA의 존재는 핀휠을 형성하지 않았고, 이는 상기 초음파처리가 핀휠을 형성하고 가시적으로 검출되는 능력을 근절시키는 방식으로 DNA의 물리적 특성, 예컨대 길이 및 2차 구조를 변형시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 4

분자량이 약 7 kDa인 양이온성 다당류 키토산을 마이크로챔버 (검출 챔버)에서 저 이온 농도 용액 (10 mM MES 완충제, pH 5.0) 중의 마그네실(Magnesil) (실리카 코팅된 자기 비드)에 첨가하였다. 이어서 마이크로챔버를 회전 자기장에 적용시켰다. 도 13은, 키토산의 존재하에 핀휠이 형성되었지만 키토산의 부재하에(저 염 완충제만 있음) 핀휠이 검출되지 않았다는 것을 나타낸다.

본 발명의 현재의 바람직한 특정 실시양태를 본원에 구체적으로 기재하였지만, 본원에 나타내고 기재한 다양한 실시양태의 변형 및 개질이 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 일어날 수 있다는 것은 본 발명에 관한 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명을 첨부된 특허청구범위 및 법의 적용가능한 규칙에 의해 요구되는 정도로만 제한하고자 한다.

부록

Claims

(a) 검출 챔버에서 샘플을 자기 비드와 접촉시키는 단계;
(b) 검출 챔버를 회전 자기장의 중심에 인접하게 위치시키는 단계; 및
(c) 중합체 분석물의 존재를 나타내는 핀휠(pinwheel) 형성의 존재를 검출하는 단계
를 포함하는, 샘플에서 중합체 분석물의 존재를 검출하는 방법.
제1항에 있어서, 중합체 분석물이 핵산, 지질, 다당류, 단백질, 또는 펩티드인 방법.
제2항에 있어서, 핵산이 DNA 또는 RNA인 방법.
제2항에 있어서, 지질이 지방산인 방법.
제1항에 있어서, 자기장이 U-형 자석에 의해 생성되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 자기 비드가, 중합체 분석물에 결합하거나 그에 대한 결합을 증강시키기 위해 코팅 또는 유도체화되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 자기 비드가 실리카, 아민-기재 전하 스위치, 보론산, 실란, 올리고뉴클레오티드, 렉틴, 역상, 항체, 항원, 아비딘, 또는 비오틴으로 코팅되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 검출 챔버가 미세유체 디바이스의 부품인 방법.
제1항에 있어서, 중합체 분석물이 핵산이고, 자기 비드가 실리카 코팅되고, 단계 (a)가 무질서유발제(chaotropic agent)의 존재하에 일어나는 것인 방법.
제1항에 있어서, 중합체 분석물이 양전하 다당류이고, 자기 비드가 실리카 코팅되고, 단계 (a)가 저 이온 농도의 존재하에 일어나는 것인 방법.
제1항에 있어서, 중합체 분석물이 단백질이고, 자기 비드가 실리카 코팅되고, 단계 (a)가 단백질에 대한 변성 조건 하에 일어나는 것인 방법.
(a) 회전 자기장을 생성하기 위한 디바이스;
(b) 내부에 자기 비드를 함유하며, 회전 자기장의 중심에 위치하는 검출 챔버
를 포함하는, 중합체 분석물의 존재를 검출하기 위한 장치.
제12항에 있어서, 중합체 분석물이 핵산, 지질, 다당류, 단백질, 또는 펩티드인 장치.
제13항에 있어서, 핵산이 DNA 또는 RNA인 장치.
제13항에 있어서, 지질이 지방산인 장치.
제12항에 있어서, 자기 비드가, 핵산에 결합하거나 그에 대한 결합을 증강시키기 위해 코팅 또는 유도체화되는 것인 장치.
제12항에 있어서, 자기 비드가, 실리카, 아민-기재 전하 스위치, 보론산, 실란, 역상, 항체, 항원, 아비딘, 또는 비오틴으로 코팅되는 것인 장치.
제12항에 있어서, 검출 챔버가 미세유체 디바이스의 부품인 장치.
제12항에 있어서, 디바이스가 자석을 회전시키기 위해 자석에 연결된 모터를 포함하는 것인 장치.
제12항에 있어서, 핀휠 형성의 검출을 위한 시스템을 추가로 포함하는 장치.
제20항에 있어서, 핀휠 형성의 검출을 위한 시스템이 카메라를 함유하고, 카메라로부터의 영상을 분석하기 위해 카메라에 전자적으로 연결된 컴퓨터를 함유하는 것인 장치.
제21항에 있어서, 카메라가 비디오 카메라인 장치.
제12항에 있어서, 자기장을 생성하기 위한 디바이스가 그의 중심축 주위에서 회전가능한 자석 또는 전자 회로인 장지.
제23항에 있어서, 자석이 U-형인 장치.