KR20100130479A - 레이저 소산장을 이용하는 광바이오센서를 이용한 표적물질의 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

레이저 소산장을 이용하는 광바이오센서를 이용한 표적물질의 검출 방법이 제공된다. 미세유로관과 레이저도파관이 교차 배치되고 교차점에서 접촉되어 소산장(evanescent field)을 생성할 수 있는 광바이오센서를 이용하여 표적물질을 검출하는 방법은 간단한 단계를 통해 농식품의 잔류농약, 식중독균 등의 다성분 유해물질을 수 분내에 동시에 높은 감도로 검출하는 것이 가능하다.
광바이오센서, 소산장, 잔류농약, 식중독균

Description

레이저 소산장을 이용하는 광바이오센서를 이용한 표적물질의 검출 방법{METHOD FOR DETECTING A TARGET SUBSTANCE BY OPTICAL BIOSENSOR USING LASER-EVANESCENT FIELD}
본 발명은 레이저 소산장을 이용한 광바이오센서를 이용하여 표적물질을 검출하는 방법에 관한 것으로서, 표적물질, 특히 농식품의 잔류농약, 식중독균 등 유해물질을 신속하기 검출하기 위한 방법에 관한 것이다.
농식품은 재배, 수확, 가공, 보관, 유통 그리고 소비자에 의해 소비될 때까지 수 많은 종류의 농약, 위해 미생물, 곰팡이독소, 이물질에 의해 오염되거나 위협을 받는다. 일반적으로, 잔류농약 검사는 GC, HPLC, GC/MS와 같은 정밀화학방법을 이용하며 O-157, 살모넬라와 같은 식중독균은 균주동정에 의한 방법으로 측정한다. 이러한 측정방법은 잔류농약 검출의 경우 전처리 시간을 포함하면 6시간, 식중독균 검사의 경우 무려 24시간 정도로 장시간이 필요하고 숙련된 전문요원에 의해 측정이 가능하며, 실험실에서만 측정할 수 있다. 따라서, 현장에서 누구나 쉽고 편리하게 측정 할 수 있는 휴대형 다채널 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법의 개 발에 대한 요구가 점차 증가되고 있는 실정이다.
특히, 종래의 바이오센서에 의한 농식품 유해물질 측정 방법으로 전기화학법, UV-스펙트로포토미터를 이용한 흡광도(absorbance) 측정법, 표식자를 이용한 스마트라벨(smart label)법, 흡광도를 이용하여 이성분 동시 측정용 광바이오 센서 연구, 분광광도계를 이용한 바이오센서 등 다양한 방법이 개발이 되었지만, 복잡한 측정절차 및 프로토콜, 고가의 광학렌즈를 이용한 제품의 원가 부담, 그리고 측정 정밀도가 떨어지는 문제점을 가지고 있다. 안전한 농식품 생산을 위해서는 유통중 농식품에서 유해물질을 신속하고 정확하게 MRL(maximum residual limit)수준까지 충분히 검사할 필요가 있기 때문에 기존의 방법들은 현실적 요구를 만족하는데 한계를 가지고 있다.
즉, 국민의 안전한 먹거리 확보를 위해서는 유통 중 농식품의 다양한 유해물질을 언제 어디서나 빠르게 측정할 수 있는 바이오센싱 기술이 필요하다.
본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들에 의하여 안출된 것으로서, 레이저 소산장을 이용한 광바이오센서를 이용하여 표적물질을 간단하고 신속하게 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 미세유로관과 레이저도파관이 교차 배치되고 교차점에서 접촉되어 소산장(evanescent field)을 생성할 수 있는 광바이오센서를 이용한 표적물질 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 표적물질 검출 방법은, 상기 미세유로관과 레이저도파관이 교차 배치되고 교차점에서 접촉되어 소산장(evanescent field)을 생성할 수 있는 광바이오센서를 준비하는 단계; 상기 미세유로관 내부로 검사시료를 통과시켜주는 단계; 상기 검사시료의 통과에 따른 상기 소산장의 굴절률의 변화 또는 스펙트럼 변이를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 소산장의 굴절률의 변화 또는 스펙트럼 변이를 통하여 검사시료 중의 표적물질의 존부 또는 양을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 광바이오센서를 준비하는 단계는, 상기 미세유로관과 상기 레이저 도파관의 교차점 부분의 미세유로관 내벽에 표적물질과 결합할 수 있는 리셉터를 부착하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 표적물질과 상기 리셉터의 결합은 항원항체반응으로 결합하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 리셉터는 잔류농약 성분의 검출을 위한 아세틸콜린에스테라제(AChE) 또는 홀셀(whole cell)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 리셉터는 식중독균인 이콜라이(E. coli) O157의 검출을 위한 안티 이콜라이 O157 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 리셉터를 부착하는 단계는, 상기 미세 유로관의 내벽을 활성화시키는 단계; pH 3.5 내지 7.0의 버퍼 용액으로 상기 리셉터를 희석하여 리셉터 희석액을 상기 미세유로관의 활성화된 내벽에 흘려주어 상기 내벽의 표면에 리셉터를 고정화하는 단계; 상기 미세유로관 내에 비특이적 반응을 억제하기 위한 블락킹 버퍼를 흘려주는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 미세유로관의 내벽을 활성화시키는 단계는, 3-APS(3-aminopropyltrimethoxysilane)을 상기 미세유로관 내벽에 도포하는 단계; 및 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 크로스링커를 상기 3-APS가 도포된 미세유로관 내벽에 도포하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 블락킹 버퍼는 카세인(casein)을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 리셉터를 부착하는 단계는, 광활성물질과 포토마스크를 이용한 포토마스킹 방법을 통하여 상기 교차점 부분의 미세유로관 내벽에만 상기 리셉터를 부착하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 검출 방법은 준비된 광바이오센서를 이용하여 1분 이내의 시간에 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 미세유로관은 폴리마이크론(polymicro glass), 콰츠글라스(quartz glass) 및 알루미노실리케이트(aluminosilicate glass)로 이루어지는 군에서 선택되는 유리 재질인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 미세유로관은 직경이 10~1000 μm이고, 벽 두께가 1~30 μm일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 미세유로관은 유리 재질의 모세관을 레이저로 가열한 후 인장력을 가하여 직경이 10~1000 μm이 되도록 늘리고, 산(acid)을 상기 모세관 내부로 흘려주어 벽 두께가 1~30 μm가 되도록 에칭하여 제조하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 레이저도파관은 직경이 1~2 μm일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 레이저도파관은, 싱글모드파이버 광케이블의 피복(outer jacket) 및 크레딩(cladding)을 제거하고, 파이버 부분을 가열하여 직경이 1~2 μm가 되도록 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 레이저도파관은 900~1550 nm 파장대역의 레이저광원을 이용하여 레이저를 도파하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 광바이오센서는 복수의 상기 미세유로관과, 복수의 상기 레이저도파관이 배치되어, 각각의 교차 접촉되는 교차점이 하나의 분석 채널을 구성하여 다채널 분석이 가능한 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, 레이저도파관과 미세유로관의 결합으로 손쉽게 제작할 수 있는 광바이오센서를 이용하여 표적물질의 신속한 검출이 가능하다.
본 발명에 따른 검출 방법에 사용되는 광바이오센서는 센싱감도가 탁월하여, 농식품의 잔류농약, 식중독균 등 다성분 유해물질을 수 분내에 동시에 측정할 수 있는 고성능, 고효율의 광바이오센서의 제작이 가능하여, 이를 이용하여 표적물질의 신속하고 정확한 동시 검출이 가능하다.
본 발명에 따르면, 다수의 채널을 가진 광바이오센서를 사용함으로써, 다수의 표적물질의 동시 분석이 가능하여, 수 십 내지 수 백 가지의 유해물질을 동시에 신속하게 정량적 및 정성적으로 분석하는 것이 가능하다.
본 발명에 따르면, 전처리 작업을 포함하여 30분 이내에 표적물질의 측정이 가능하기 때문에 측정에 소요되는 시간을 최소로 할 수 있고, 휴대형 바이오센서를 이용하여 누구나 쉽게 표적물질의 검출이 가능하다.
본 발명에 따르면, 농식품 유해물질 검사 현장에서 즉시 유해물질 등을 측정할 수 있어, 이러한 방법을 이용하여 안전한 먹을 거리를 생산할 수 있으므로 우리 농산물에 대한 신뢰증진과 소비확대를 기대할 수 있다.
또한, 본 발명은 농식품 유해물질 탐색 연구뿐만 아니라 항원항체면역반응 연구, 항체개발 연구, 농식품의 중금속, 곰팡이독소, 각종 식품첨가물 탐색 연구, 인수공통전염병 연구, 인체질병진단 연구분야까지 다양한 학문분야에 응용할 수 있을 것으로 기대된다.
이하, 본 발명에 대하여 도면을 참조하여 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 미세유로관과 레이저도파관이 교차 배치되고 교차점에서 접촉되어 소산장(evanescent field)을 생성할 수 있는 광바이오센서를 이용한 표적물질 검출 방법이 제공된다. 여기서, 상기 검출 방법은 상기 미세유로관과 레이저도파관이 교차 배치되고 교차점에서 접촉되어 소산장(evanescent field)을 생성할 수 있는 광바이오센서를 준비하는 단계; 상기 미세유로관 내부로 검사시료를 통과시켜주는 단계; 상기 검사시료의 통과에 따른 상기 소산장의 굴절률의 변화 또는 스펙트럼 변이를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 소산장의 굴절률의 변화 또는 스펙트럼 변이를 통하여 검사시료 중의 표적물질의 존부 또는 양을 검출하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.
광바이오센서의 준비
상기 광바이오센서는, 미세유로관 및 레이저도파관을 포함하고, 상기 미세유로관과 상기 레이저도파관을 접촉시켜 소산장(evanescent field)을 생성하여, 상기 미세유로관 내를 통과하는 검사시료 중의 표적물질의 존부에 따른 상기 소산장의 굴절률의 변화 또는 스펙트럼 변이를 측정함으로써 표적물질을 검출하는 것이 가능하다.
상기 광바이오센서의 센싱 원리를 도 1a를 통해 살펴보면, 레이저도파관이 미세유로관과 가로질러 접촉하면 접촉부분에 굴절율의 변화에 따른 소산장(evanescent field)을 일으키며 이는 다시 작은 신호를 크게 거동시키면서 전자들의 강한 떨림현상을 발생시킨다. 이러한 소산장은 미세유로관을 통해 흘러가는 생체재료의 종류에 따라 고유의 특성을 보이며 도 1b에서처럼 스펙트럼 신호 변이로 나타난다. 이러한 특성을 검출하고자 하는 표적물질, 예컨대, 농식품에서의 유 해물질을 측정하는 센싱 원리로 이용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 도 1a 및 도 2에서처럼 미세유로관 내에 바이오리셉터를 고정하여 항원항체면역반응을 일으켜 광검출기를 통해 들어오는 신호를 분석하여 리셉터와 결합한 표적물질을 정량 및 정성적으로 분석하는 것이 가능하다.
상기 광바이오센서가 필요한 감도를 가지는 스펙트럼과 소산장을 가지게 하기 위해서, 도 4b에서처럼 상기 미세유로관의 직경은 10～1000㎛이고, 벽두께는 1～30㎛인 것이 바람직하다. 상기 미세유로관의 재질로는 바람직하게는 폴리마이크론(polymicro glass), 콰츠글래스(quartz glass), 알루미노실리케이트(aluminosilicate glass), 실리카(silica galss) 등과 같은 유리소재를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 미세유로관의 제작 방법을 도면을 참조하여 설명하면 다음과 같다. 광바이오센서의 미세유로관 제작을 위한 레이저 스테이션의 구성은 도 5a와 도 5b에서처럼 CO2 레이저, 스텝모터 스테이지, 제어용 컴퓨터로 구성이 될 수 있다. 유리소재로 된 미세유로관의 최초 직경은 1.2mm 모세관을 사용하였다. 미세유로관은 유리모세관의 중앙을 레이저를 이용하여 가열한 다음 좌측 스텝모터 스테이지는 천천히, 우측 스텝모터 스테이지는 조금 빠르게 같은 방향으로 이동시키면서 유리모세관의 직경이 약 10～1,000㎛가 되도록 일정한 속도로 잡아당겨 주어 원하는 두께를 가지는 미세유로관을 제작하였다. 풀링 작업이 끝난 후 미세유로관의 직경은 10~1000㎛이며 이때 벽두께가 1～30㎛가 되도록 적당한 농도의 HF(hydrofluoric acid)를 미세유로관에 천천히 주입주면서 필요한 센싱감도를 가지는 벽 두께를 가지도록 에칭을 하여 주었다. 미세유로관의 벽 두께를 얇게 만들어 주는 이유는 미세유로관은 기본적으로 굴절률을 측정하기 때문에 충분한 굴절률을 얻기 위해서는 벽 두께가 아주 얇아야 센싱 감도가 높아지는 특성을 가지고 있기 때문이다.
상기 미세유로관을 가로질러 접촉하는 레이저도파관은 통상의 레이저도파관이라면 어느 것이라도 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 예컨대, 싱글모드파이버(single mode fiber) 광케이블을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 광바이오센서의 센싱 감도를 높이기 위해 도 4c에서처럼 싱글모드파이버의 크레딩(cladding) 부분을 깨끗하게 벗겨낸 후에, 중심 파이버부분을 수소와 산소가스 조합의 가스토치로 두께 1～2㎛로 가늘게 성장시켜 사용할 수 있다. 상기 레이저도파관을 통해 전달되는 레이저광의 파장은 바람직하게는 900～1550nm 대역을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 레이저도파관의 제작 방법을 도면을 참조하여 설명하면 다음과 같다. 도 6a와 도 6b의 가스 스테이션은 수소와 산소 조합의 크린가스를 이용하여 레이저도파관을 두께 1~2㎛로 가공하는 방법이다. 상기의 구성은 가스토치, 광케이블, 스텝모터 스테이지, 제어용 컴퓨터로 구성된다. 레이저도파관을 제작하기 위해서는 먼저 광케이블의 크레이 부분을 깨끗하게 벗겨낸 후에 도 5a의 레이저 스테이션과 같은 방법으로 가스 스테이션 위에 고정시킨다. 다음은 크레딩이 벗겨진 레이저도파관 부분을 가스토치로 달구면서 좌측 스텝모터 스테이지는 천천히, 우측 스텝모터 스테이지는 조금 빠르게 같은 방향으로 이동시키면서 두께 1~2 ㎛가 될 때까지 가공을 하여 레이저도파관을 완성할 수 있다.
상기 광바이오센서는 단순한 물리학적 원리를 응용하여 예컨대 도 7에서처럼 쉽게 초소형 다채널 광바이오센서를 구현하는 것이 가능하다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 검사시료가 주입되는 미세유로관들을 병렬로 나란히 여러 개 배열하고 미세유로관들을 접촉해서 지나가는 레이저도파관들을 또한 병렬로 나란히 여러 개를 배열하면 교차하는 점들이 각각 하나의 채널을 구성함으로 수십 개에서 수백 개 이상의 채널들을 구성할 수 있다. 이에 따라 미세유로관의 내벽에 각기 서로 다른 바이오리셉터들을 바인딩하여 검사시료에 포함되어있는 미지의 유해물질들을 동시에 검출할 수 있다. 실제로 농식품 유해물질들은 도 8에서와 같이 광검출기 어레이를 통해 측정되며, 각각의 스펙트럼 변이들을 모니터링하는 것이 가능하다.
전술한 광바이오센서, 특히 상기 다채널 광바이오센서의 미세유로관 내벽의 각각의 채널들에 리셉터를 부착할 수 있다. 상기 리셉터로는 표적물질에 특이적 결합이 가능한 바이오리셉터, 예컨대, 표적물질과 항원항체 면역 결합이 가능한 물질을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 리셉터는 잔류농약과 특이적 결합이 가능한 물질로서, 아세틸콜린에스테라제(AChE) 또는 홀셀(whole cell)을 이용하는 것이 가능하며, 또 다른 일 실시예에 따르면, 식중독균에 대한 특이적 결합이 가능한 항체(예컨대, 안티-이콜라이 O157 항체)를 사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 부착 방법은 상기 미세유로관의 내벽을 활성화시키는 단계; pH 3.5 내지 7.0의 버퍼 용액으로 상기 리셉터를 희석하여 리셉터 희석액을 상기 미세유로관의 활성화된 내벽에 흘려주어 상기 내벽의 표면에 리셉터를 고정화하는 단계; 상기 미세유로관 내에 비특이적 반응을 억제하기 위한 블락킹 버퍼를 흘려주는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.
여기서, 상기 미세유로관의 내벽을 활성화시키는 단계는, 상기 리셉터가 내벽에 부착할 수 있도록 미세유로관의 내벽을 활성화시키는 것으로서, 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예컨대, 3-APS(3-aminopropyltrimethoxysilane)을 상기 미세유로관 내벽에 도포하고, 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 크로스링커를 상기 3-APS가 도포된 미세유로관 내벽에 도포하여 미세유로관의 내벽을 활성화시키는 것이 가능하다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 도 9에서와 같은 방법을 사용하여 미세유로관 내벽의 각각의 채널들에 바이오리셉터를 부착하는 것이 가능하다. 상기 방법은 미세유로관의 내벽 표면이 2차원 구조를 가지도록 하는 방법으로서, 바람직한 일 실시예를 구체적인으로 설명하면 다음과 같다. 우선 물과 90% (v/v) 에탄올에 1% 3-아미노프로필트리메톡시실란을 혼합하여 30분 동안 흘려준 다음, 30분 동안 증류수와 순수 에탄올로 린싱(rinsing)한다. 그 다음으로 미세유로관에 1시간동안 1mg/mL BSA를 담가둔 후 0.05 mg/mL biotin-4-fluorescein (B4F)을 주입하고 488 nm 파장의 레이저광에 1～10초 동안 노출시킨다. 그 결과로 레이저광에 노출된 자리의 BSA는 공유결합이 되며 플루오레세인(fluorescein)을 활성화시켜 준다. 이 때 레이저광에 노출된 부분만 공유결합을 하도록 싱글-윈도우(single-window) 포토마스크를 사용한다. 끝으로 20 ㎍/mL 스트렙터비딘(streptavidin)을 미세유로관에 주입한다. 결과적으로 미세유로관과 레이저도파관이 접촉하는 지점에만 바이오리셉터를 고정화 할 수 있는 조건이 갖추어지게 된다. 이 후 잔류농약 검출을 위한 항체나 식중독균 검출을 위한 항체 또는 기타 유해물질 검출을 위한 항체를 고정화 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 도 10에서처럼 광에 반응하는 물질로 B4F 대신에 친수성의 비단백질 표면을 만드는데 주로 사용되는 2-니트로-5-[11-(트리메톡시실릴)운데실]옥시벤질 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 프로파노에이트 (NMPEG-silane)를 사용하는 것이다. 그 다음으로 350nm의 UV광을 미세유로관에 조사를 해 주어 광이 조사된 지역에 폴리에칠렌 글리콜 그룹(polyethylene glycol group)이 결합하지 못하도록 해준다. 종국적으로 아민기를 가지는 바이오리셉터와 공유결합을 할 수 있도록 한다.
상기 두 가지 방법을 사용하여 다채널 광바이오센서를 구현한 결과 도 11에서와 같이 광이 조사된 미세유로관 부분에만 국부적으로 바이오리셉터가 공유결합 되는 것을 확인할 수 있다.
전술한 방법 이외에도 당해 기술분야에 알려진 다양한 방법을 통해 상기 미세유로관 내벽에 리셉터를 결합하는 것이 가능할 것이다.
한편, 전술한 광바이오센서를 이용한 광바이오센싱 시스템을 구성하는 것이 가능하다. 상기 광바이오센싱 시스템은 전술한 광바이오센서; 상기 미세유로관으로 검사시료를 흘려보내주기 위한 마이크로펌프; 상기 레이저도파관의 일측에 배치되어 레이저광을 만드는 레이저광원; 상기 레이저도파관의 타측에 배치되어 상기 교차점에서 발생한 굴절률 변화 또는 스펙트럼 변이를 측정하는 광검출기; 및 상기 광검출기에서 측정된 검출값을 디지털신호로 변환하는 신호처리기를 포함할 수 있다.
여기서, 상기 레이저광원은 레이저다이오드일 수 있으며, 상기 레이저다이오드의 온도조절을 위한 온도제어기, 상기 레이저다이오드의 레이저광의 신호 강도를 조절하는 전류제어기 등을 더 포함할 수 있다. 상기 레이저광원의 레이저광의 파장대역은 바람직하게는 900~1550 nm일 수 있다.
상기 광바이오센싱 시스템의 전체적인 구성은 도 3과 도 4a에서처럼 미세유로관과 레이저도파관, 레이저광을 만들어 내는 레이저다이오드, 미세유로관과 레이저도파관이 접촉하는 부분을 관찰하기 위한 마이크로스코프 카메라, 상기의 접촉부분에서 발생되는 소산파를 측정하는 광검출기, 측정된 검출값을 디지털신호로 변환하고 모니터링 및 저장해 주는 신호처리부, 광바이오센서의 온도조절을 위한 온도제어부, 신호의 강도를 조절하는 전류제어부, 미세유로관을 통해 검사시료를 주입하는 마이크로펌프를 가지는 것일 수 있다.
또한, 전술한 광바이오센서를 이용하여 랩온어칩을 제작하는 것이 가능하다. 상기 랩온어칩은 전술한 바이오센서가 실리콘 웨이퍼 상에 배치된, 표적물질을 검출을 위한 휴대가 가능한 랩온어칩일 수 있다.
상기 휴대용 랩온어칩은 상기 실리콘웨이퍼 위에, SiO2 저굴절층; 상기 저굴절층 위에 Si3N4 고굴절층; 상기 고굴절층 위에 실리카로 증착된 상기 레이저도파관; 및 상기 레이저도파관 위에 교차방향으로 배치된 상기 미세유로관을 포함할 수 있으며, 또한, 상기 미세유로관을 고정시키기 위한 브이(V)자형 고정대를 더 포함할 수 있다. 상기 랩온어칩에 있어서, 상기 미세유로관에 검사시료를 주입하기 위하여 동전기적(electrokinetic) 유체펌핑 방법을 이용하는 것이 가능하다. 또한, 상기 랩온어칩에 있어서, 검출시 열에 의한 노이즈를 최소화하기 위하여 온도변화가 0.005℃ 이하로 안정되게 제어할 수 있는 열전기쿨러를 추가하는 것이 가능하다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 휴대용 랩온어칩은 복수의 상기 미세유로관과, 복수의 상기 레이저도파관이 배치되어, 각각의 교차 접촉되는 교차점이 하나의 분석 채널을 구성하는, 다수의 표적물질의 동시 검출이 가능한 다채널 휴대용 랩온어칩일 수 있다.
상기 다채널 광바이오센서를 위한 휴대형 랩온어칩 구현 방법을 도 12에 도시하였다. 이에 따르면, 레이저광 발생을 위한 레이저다이오드(laser diode)와, 수 마이크로미터 두께의 유리모세관, 신호검출 어레이, 동전기적(electrokinetic) 기법을 이용한 유체펌핑장치, 검사시료를 담는 샘플 저장소, 열전기 쿨러가 결합된 실리콘웨이퍼와 실리콘웨이퍼 상에 형성된 서로 다른 굴절율 층과 미세 레이저도파관을 가진다.
상기의 다채널 광바이오센서를 위한 휴대형 랩온어칩의 구체적인 실시 예를 첨부 도면을 참조하여 상세히 살펴보기로 한다. 먼저, 본 실시 예에 따른 휴대형 랩온어칩 제작 방법을 도 12a를 통해 살펴보면, 상기의 레이저 스테이션에서 성장시킨 긴 레이저도파관을 대략 1cm 정도의 길이로 자른 다음 V자형 홈과 공명이나 굴절이 되지 않도록 제작된 광도파로를 가지는 실리콘칩 상(上)에 설치한다. V자형 홈의 각과 깊이는 미세유로관의 직경에 적합하도록 하며 미세유로관과 레이저도파관 채널이 잘 결합할 수 있도록 제작한다. 검사시료는 온-칩 전극(on-chip electrode)과 미세유로(microfluidics)를 거쳐 동전기적 방법을 이용하여 운송된다. 칩은 유해물질을 검사하는 동안 발생되는 열에 의한 노이즈를 최소화 하고 온도변화를 0.005℃이하로 안정되게 제어할 수 있도록 열전기쿨러 위에 설치를 한다. 광에 대해 공명이나 굴절이 되지 않도록 제작된 온-칩 제작방법은 먼저, 도 12b과 도12c에서처럼 실리콘웨이퍼 상에 저굴절층(low index)을 형성하기위해 굴절률 1.45(n=1.45), 두께 2㎛ 정도로 SiO2를 증착시킨다. 그리고 저굴절층 위에 고굴절층(high index)을 형성하기 위해 굴절률 2.0(n=2.0), 두께 180nm 정도로 Si3N4를 증착시킨다. 마지막으로 레이저광이 지나가는 레이저도파관 채널을 공명이나 굴절이 되지 않도록 굴절률 1.45(n=1.45), 두께 2㎛의 실리카(Silica)로 증착시켜 온-칩의 기본 구조를 완성한다. 만약, 온-칩이 6개의 레이저도파로와 8개의 미세유로관으로 구성이 되었다면 총 48개의 채널을 형성할 수 있다. 결과적으로, 상기의 온-칩은 40개의 독립된 센싱 채널과 8개의 표준 채널로 구성된 다채널 랩온어칩을 만들 수 있다. 끝으로 총 48개 채널에서 발생된 스펙트럼 신호들은 광검출 어레이를 통하여 획득되게 된다.
검사시료의 주입, 소산장의 변화 측정 및 표적물질의 검출
전술한 바와 같이 제조된 광바이오센서를 준비한 후, 상기 미세유로관 내부로 검사시료를 통과시켜준다. 이때 상기 미세유로관과 레이저도파관의 교차점에서 통과되는 검사시료에 표적물질의 존부 및 양에 따라 소산장의 굴절률의 변화 또는 스펙트럼 변이가 일어나게 된다. 이러한 굴절률의 변화 또는 스펙트럼 변이를 예컨대 광검출기를 이용하여 측정하고, 측정된 신호를 분석하여 검사시료 중에 표적물질의 존부 또는 양을 검출하는 것이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 광검출기에서 측정된 검출값을 디지털 신호로 변환하여 모니터 화면에 표시하는 신호처리기를 이용하여 검출결과를 시각화하는 것이 가능하다. 상기 광검출 방법 및 신호처리를 통한 시각화 방법은 당해 기술분야에 알려진 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 이에 대한 구체적인 설명은 생략하기로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 준비된 광바이오센서를 이용하여 상기 검사시료의 주입부터 표적물질의 검출 단계에 이르기까지의 1분 이내의 시간에 수행될 수 있다.
시험예
전술한 방법에 따라 제조된 광바이오센서의 센싱감도를 측정하기 위해 도 13 에서와 같이 에탄올을 굴절률 1.333에서 1.336까지 농도별로 준비하여 미세유로관을 통해 흘려주면서 굴절률 파장에 따른 스펙트럼 변이를 모니터링하였다. 그 결과 농도별 에탄올의 굴절률이 증가할 수록 스펙트럼의 굴절율 변화도 비례적으로 변화하는 것을 관찰할 수 있었다. 이 때 결정계수(R2)는 0.99로 높은 감도를 가진 상관관계를 보여주었다.
항원항체면역반응 실험을 위해 광바이오센서의 표면활성화와 바이오리셉터, 홀셀(whole cell)의 공유결합에 관한 센서그람을 도 14에서처럼 모니터링하였다. 먼저 20% 고농도와 2% 저농도를 가진 HF(hydrofluoric acid)를 순차적으로 미세유로관에 흘려주어 미세유로관의 벽두께가 최초 0.3~0.33 mm에서 1~30 ㎛가 될 때까지 에칭을 하였다. 그 다음으로 미세유로관의 표면을 1:1 비율의 HCl과 에탄올의 혼합용액으로 크리닝 하였다. 그리고 PBS 버퍼로 다시 린싱해 준 후 기준선을 설정하였다(a). 1% 3-APS (b)로 30분간 표면을 활성화시켜준 후에 PBS로 린싱(c)하고 다시 5% 글루타알데하이드 크로스링커(d)를 30분 동안 흘려주어 표면을 아미노기로 활성화 시켜주었다. 10분간 PBS로 린싱(c)해 준 후 0.1mg/ml 항체와 pH 4.0 소듐아세테이트버퍼혼합액을 주입(e)하여 미세유로관 표면에 항체를 공유결합 시켜주었다. 마지막으로 공유결합된 항체의 표면에 카세인 블락킹 버퍼(f)를 흘려주어 비특이적 반응을 억제하였고 다시 PBS 버퍼(c)를 흘려주어 잔류농약 검출을 위한 기준선을 설정해 주었다. 검사물질(항원)을 항원항체면역반응 시킨후 NaCl이나 NaOH를 이용하여 검사물질을 해리시켜주었다. 같은 방법으로 식중독균 E. coli O157을 Anti-E. coli O157 바이오리셉터를 이용하여 검출하였다.
미세유로관의 내부 벽면에 바이오리셉터(whole cell)가 어떻게 공유결합 되어있는가를 확인하기위해 마이크로스코프를 이용하여 도 15a와 도 15b에서처럼 생물학적 분석을 하였다. 표면처리가 된 미세유로관의 표면에 녹색의 바이로리셉터 균일하게 분포하는 것을 관찰할 수 있었다.
본 발명의 광바이오센서를 이용하여 실제 농식품의 잔류농약과 식중독균(E. coli O157) 검출 시험을 도 16에서처럼 각각 실시하였다. 유기인계 농약중 클로르피리포스와 카바메이트 농약중 카보후란을 모델로 선발하여 10-14 몰에서 10- 4몰까지 농도별로 11개의 표준샘플을 준비하였다. 샘플 농도의 변화에 따라 스펙트럼 변이정도가 도 16a에서처럼 시그모이드 형태의 함수 관계를 보이는 것으로 나타났다. 검출한계는 10-11에서 10-6 몰 범위의 선형변이구간을 분석한 결과 10-11 몰(0.01ppb)로 판명되었으며 이 때 결정계수는 0.95이상으로 우수한 결과를 보였다. 비특이적인 결합 반응이 10-12 몰 이하, 10-5 몰 이상에서 나타났으며 이 구간은 선형 센싱구간에서 제외되었다. 잔류농약에 반응하는 반응시간은 6초에서 30초가 소요되어 실시간에 가까운 빠른 동특성을 보였다.
또한, 본 발명의 광바이오센서를 이용하여 워터본(water-borne) E. coli O157을 농도별로 준비하여 도 16b와 같이 검출실험을 실시하였다. 기준 문턱값 80.2 ㎶를 설정하였을 때 가장 낮은 농도의 E. coli O157농도에서 스펙트럼 강도는 음전기값 64.8 ㎶ 값을 보였다. 그러나 103 ml-1 E. coli O157 농도에서는 기준 문턱값보다 높은 105.8±14.5 ㎶의 스펙트럼 강도를 보여주었다. 이 때 스펙트럼 변이는 최소 15 cell 이상의 E. coli O157 일 경우 광바이오센서가 우수한 감도를 가지고 식중독균을 검출하였다. 따라서 광바이오센서의 E. coli O157 검출한계 값은 15 cell 이었으며 스펙트럼 강도의 로그값과 검출된 cell 수와의 상관관계는 도 16c에서처럼 결정계수(R2) 0.965로 나타났다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 광바이오센서의 원리를 나타낸 개념도이고, 도 1b는 상기 광바이오센서에서 나타나는 스펙트럼 신호변이를 나타낸 그래프.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 광바이오센서 신호처러 블럭다이어그램.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 광바이오센싱 시스템의 구성도.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 광바이오센싱 시스템의 전체 사진이고, 도 4b는 상기 광바이오센싱 시스템에서의 미세유로관과 레이저도파관의 사진이며, 도 4c는 상기 광바이오센싱 시스템에서 사용될 수 있는 레이저도파관의 구조도.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유로관의 제조를 위한 레이저 스테이션 구성도이고, 도 5b는 상기 레이저 스테이션 전체 사진.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 레이저도파관의 제조를 위한 가스 스테이션의 구정도이고, 도 6b는 상기 가스 스테이션 전체사진.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 다채널 광바이오센서의 개념도.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 다채널 광바이오센서 사진(좌)과 스펙트럼 변이를 나타낸 그래프(우).
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 다채널 광바이오센서 구현을 위한 포토마스킹 방법의 순서도.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 다채널 광바이오센서 구현을 위한 포토마스킹 방법의 순서도.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 포토마스크와 광을 이용한 국부적인 바이오리셉터 공유결합 방법의 개념도(상) 및 공유결합된 바이오리셉터의 사진(하).
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 다채널 광바이오센서를 위한 랩온어칩 구성도.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 광바이오센서에서 굴절율 변화에 따른 센싱 감도 그래프.
도 14a는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유로관의 표면활성화 과정과 바이오리셉터 공유결합을 도시한 센서그람이고, 도 14b는 상기 미세유로관 내벽 표면에 바이오리셉터 공유결합을 위한 방법의 순서도.
도 15a는 본 발명의 일 실시예에 따른 표면처리 없는 미세유로관과 레이저도파관의 교차 배치 사진이고, 도 15b는 상기 미세유로관에 공유결합된 바이오리셉터(whole cell)를 나타낸 사진.
도 16a는 본 발명의 일 실시예에 따른 광바이오센서를 이용한 잔류농약 클로르피리포스와 카보후란 검출 실험 그래프이고, 도 16b는 본 발명의 일 실시예에 따른 광바이오센서를 이용한 식중독균 E. coli O157 검출 실험 그래프이며, 도 16c는 상기 식중독균 E. coli O157 검출 실험에 있어서 스펙트럼 강도의 로그값과 검출된 세포 수와의 상관관계 그래프.

Claims (18)

  1. 미세유로관과 레이저도파관이 교차 배치되고 교차점에서 접촉되어 소산장(evanescent field)을 생성할 수 있는 광바이오센서를 이용한 표적물질 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미세유로관과 레이저도파관이 교차 배치되고 교차점에서 접촉되어 소산장(evanescent field)을 생성할 수 있는 광바이오센서를 준비하는 단계;
    상기 미세유로관 내부로 검사시료를 통과시켜주는 단계;
    상기 검사시료의 통과에 따른 상기 소산장의 굴절률의 변화 또는 스펙트럼 변이를 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 소산장의 굴절률의 변화 또는 스펙트럼 변이를 통하여 검사시료 중의 표적물질의 존부 또는 양을 검출하는 단계
    를 포함하는 표적물질 검출 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 광바이오센서를 준비하는 단계는,
    상기 미세유로관과 상기 레이저 도파관의 교차점 부분의 미세유로관 내벽에 표적물질과 결합할 수 있는 리셉터를 부착하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적물질의 검출 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 표적물질과 상기 리셉터의 결합은 항원항체반응으로 결합하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 리셉터는 잔류농약 성분의 검출을 위한 아세틸콜린에스테라제(AChE) 또는 홀셀(whole cell)인 것을 특징으로 하는 표적물질의 검출 방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 리셉터는 식중독균인 이콜라이(E. coli) O157의 검출을 위한 안티 이콜라이 O157 항체인 것을 특징으로 하는 표적물질의 검출 방법.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 리셉터를 부착하는 단계는,
    상기 미세유로관의 내벽을 활성화시키는 단계;
    pH 3.5 내지 7.0의 버퍼 용액으로 상기 리셉터를 희석하여 리셉터 희석액을 상기 미세유로관의 활성화된 내벽에 흘려주어 상기 내벽의 표면에 리셉터를 고정화하는 단계;
    상기 미세유로관 내에 비특이적 반응을 억제하기 위한 블락킹 버퍼를 흘려주는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 미세유로관의 내벽을 활성화시키는 단계는,
    3-APS(3-aminopropyltrimethoxysilane)을 상기 미세유로관 내벽에 도포하는 단계; 및
    글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 크로스링커를 상기 3-APS가 도포된 미세유로관 내벽에 도포하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 블락킹 버퍼는 카세인(casein)을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출 방법.
  10. 제3항에 있어서,
    상기 리셉터를 부착하는 단계는, 광활성물질과 포토마스크를 이용한 포토마스킹 방법을 통하여 상기 교차점 부분의 미세유로관 내벽에만 상기 리셉터를 부착하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출 방법.
  11. 제2항에 있어서,
    상기 검출 방법은 준비된 광바이오센서를 이용하여 1분 이내의 시간에 수행되는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 미세유로관은 폴리마이크론(polymicro glass), 콰츠글라스(quartz glass) 및 알루미노실리케이트(aluminosilicate glass)로 이루어지는 군에서 선택되는 유리 재질인 것을 특징으로 하는 표적물질 검출 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 미세유로관은 직경이 10~1000 μm이고, 벽 두께가 1~30 μm인 것을 특징으로 하는 표적물질 검출 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 미세유로관은 유리 재질의 모세관을 레이저로 가열한 후 인장력을 가하여 직경이 10~1000 μm이 되도록 늘리고, 산(acid)을 상기 모세관 내부로 흘려주어 벽 두께가 1~30 μm가 되도록 에칭하여 제조하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 레이저도파관은 직경이 1~2 μm인 것을 특징으로 하는 표적물질 검출 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 레이저도파관은, 싱글모드파이버 광케이블의 피복(outer jacket) 및 크레딩(cladding)을 제거하고, 파이버 부분을 가열하여 직경이 1~2 μm가 되도록 하여 제조된 것을 특징으로 하는 표적물질 검출 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 레이저도파관은 900~1550 nm 파장대역의 레이저광원을 이용하여 레이저를 도파하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출 방법.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 광바이오센서는 복수의 상기 미세유로관과, 복수의 상기 레이저도파관이 배치되어, 각각의 교차 접촉되는 교차점이 하나의 분석 채널을 구성하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출 방법.
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