KR20100130218A - 예정된 세균 숙주 균주를 감염시킬 수 있는 박테리오파지를 탐지 및/정량화시키는 방법 및 시스템, 상기 박테리오파지 탐지 그리고 상기 방법을 실행하기 위한 마이크로전자공학 센서 장치 - Google Patents
예정된 세균 숙주 균주를 감염시킬 수 있는 박테리오파지를 탐지 및/정량화시키는 방법 및 시스템, 상기 박테리오파지 탐지 그리고 상기 방법을 실행하기 위한 마이크로전자공학 센서 장치 Download PDFInfo
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Abstract
청구된 프로세스, 시스템 및 장치는 원하는 박테리오파지 탐지를 위하여 숙주 균주 박테리아가 미리 흡착된 전극의 인터페이스에서 만들어지는 임피던스의 변화 측정에 기초된다. 전극-박테리아 인터페이스에서 만들어지는 변화는 마이크로전자 센서 장치의 작업 전극 표면에 흡착된 박테리아에서 박테리오파지의 파지(phagic) 작용에 의한 것이다.
Description
본 발명은 미리결정된 세균성 숙주 균주를 감염시킬 수 있는 박테리오파지를 탐지하고 및/또는 정량화할 수 있는 시스템 및 공정에 관한 것이며, 전기적 임피던스 분광 기술(electrical impedance spectroscopy technique)을 이용하여 분석될 매질 또는 용액의 전기적 임피던스를 측정하는 것에 기초된다.
본 발명은 또한 이 공정을 실행하기 위한 마이크로전자 센서 장치 및 박테리오파지를 탐지하고 정량화하기 위하여 이 마이크로전자 센서 장치의 이용에 관계한다.
박테리오파지는 단백질 피복 또는 “캡시드”내에 싸여있는 핵산(DNA 또는 RNA)로 형성된 박테리아를 감염시키는 바이러스다. 이들 바이러스는 이들이 감염시키는 박테리아에 대해 높은 특이성을 가지며, 박테리오파지 또는 특정 박테리오파지 군은 선택된 숙주 균주에 근거하여 탐지될 수 있다.
간략하게 설명하면, 박테리오파지 사이클은 4개 상(phase)으로 구성되는데, 제 1 상은 박테리오파지-박테리아 인지 및 새로운 박테리오파지 형성을 위한 필수적인 유전 정보를 포함하는 파아지 핵산 주입이 일어난다. 그 다음, 박테리오파지의 유전 물질이 DNA 형태의 박테리아 염색체내로 통합된다. 일단 통합되면, 숙주 세포의 감염은 감염되는 박테리오파지 타입에 따라 두 가지 형태의 반응을 일으킬 수 있다. 따라서, 우리는 온건성(temperate) 박테리오파지-숙주세포의 게놈에 무한정으로 통합될 수 있거나 또는 다양한 인자들에 의해 용균이 유도될 때까지 게놈에 통합될 수 있는-와 용균(lytic) 박테리오파지- 잠복기간 후에, 숙주 세포의 생합성 기전덕택에 새로운 비리온을 만들기 위한 필수 물질을 복제하고, 숙주 세포의 용해를 통하여 외부로 방출되는-를 구별해낼 수 있다.
장내세균의 박테리오파지 탐지 및/또는 정량화는 물에서 미생물 제어 및 배설물 오염의 기원을 결정하는데 특히 중요하다. 이와 같은 박테리오파지는 이들의 거동이 바이러스와 유사하기 때문에, 바이러스 존부의 미생물 지표로 제안되었었다. 바이러스 기원의 배설물 오염의 지표로 이용된 세가지 군의 장내세균 박테리오파지가 있다: 체세포 콜리파지(somatic coliphages), F-특이적 RNA 파지 및 박테로이드(Bacteroides spp)균을 감염시키는 파지.
박테리오파지의 탐지 및 정량화가 특히 관심이 되는 또 다른 군의 박테리오파지는 치즈 또는 다른 유산 발효된 산물을 만드는데 이용되는 유산균을 감염시키는 박테리오파지에 의해 형성된 것이다. 이와 같은 박테리오파지는 유산 생성물을 심각하게 영향을 미치며, 유산균 산업에 실질적인 경제적 손실로 이어진다.
박테리오파지의 존재를 탐지하는 전통적인 방법은 이들 숙주 박테리아에 끼치는 영향에 기초한다. 전통적으로, 박테리오파지는 이중-층 한천 배양을 이용하여 정량화되었는데, 이때, 특정 숙주 균주(정량화되는 박테리오파지에 따라)를 포함하는, 그리고 분석될 샘플을 포함하는 반-고형 한천 층을 한천 층위에 배치시킨다. 용해 부위 또는 감염에 의한 플락 그리고 숙주 균주의 배양후, 샘플내에 존재하는 박테리오파지 또는 박테리오파지 군에 의한 숙주 박테리아의 용해를 통하여 박테리오파지의 정량화가 실행된다.
한천 플레이트의 소잉(sowing)에 기초된 방법은 매우 느리다는 단점이 있는데, 그 이유는 최소한 24시간의 항온배양 시간을 요구하기 때문이다.
박테리오파지를 탐지하는 다른, 좀더 최근에 설명되는 방법은 PCR 기술을 이용하여 이와 같은 박테리오파지를 탐지하는 것에 기초된다. 그러나, 이와 같은 방법도 매우 느리고, 힘들다.
유럽 특허 EP0149383 및 EP0714450는 유산균의 박테리오파지를 특히 탐지하는, 박테리오파지를 탐지하는 기타 방법을 설명한다.
특허 EP0714450는 루시페라제와 같은 효소에 의해 촉매화된 효소 반응에서 생물발광 방출을 이용하여 용해시 박테리아의 내부 성분들을 탐지하는 것과 관련되며, 특허 IP0149383는 미생물 활성을 탐지하기 위하여 pH 지시물질을 이용하여 생장 저해를 탐지하는 것과 관련된다.
상기 언급된 특허들에서 명시된 방법들은 실질적으로 매우 신뢰성이 없기 때문에 활성 상태에 있는 박테리오파지의 탐지를 못한다. 다른 한편, 이들 방법은 많은 반응물을 이용하기 때문에, 매우 복잡하고 비용이 많이 든다.
스페인 특허 출원 200800109(출원시점에서 공개되지 않음)은 장치의 작업 전극 표면상에 바이오매스의 흡착에 의해 생성되는 임피던스 시그날의 변화를 측정하기위한 전기화학 임피던스 분광(EIS) 기술을 이용하는 바이오매스 농도를 측정하는 프로세스 및 장치에 관한 것이다.
상기 언급된 특허 출원의 구체예에서, 인터페이스 임피던스 측정을 실행하는 전극들은 용액내 바이오매스 농도가 측정되는 매질내에 담기게 될 플랫 마이크로전자 장치, 특히 칩 센서의 기질 물질에 통합된 형태로 배치된다.
명시된 특허 출원에 개시된 프로세스 및 장치에서, 바이오메스 농도는 바이오매스의 정전기적 흡착에 의해 생성되는 전극-용액 인터페이스의 전기적 이중 층의 전기용량 값의 변화에 기초하여 결정된다.
전극-용액 인터페이스의 전기 이중 층의 전기용량 변화는 용액에 있는 바이오매스 농도에 따라 달라지는 것으로 관찰되는데, 그 이유는 상기 층의 전기용량의 변화를 모니터하면, 상응하는 교정곡선(calibration curve)을 통하여 간단하고 매우 신뢰성있는 방식으로 용액내 바이오매스 농도 탐지가 가능하기 때문이다.
상기 내용을 더 잘 이해하기 위하여 도면이 첨부되어있다:
도 1은 박테리오파지 탐지에 사용되는 마이크로전자 센서 장치, 특히 임피던스 센서 칩 구조의 평면도를 보여준다.
도 2a 및 2b는 도 1의 칩의 상세도인데, 이때 슈도모다스 푸티다( Pseudomonas putida) 바이오필름이 칩상에서 자라나도록 만들어져 있다. 도 2a는 박테리오파지의 작용을 받기 전 바이오필름이 있는 칩의 작업 전극을 보여주고, 도 2b는 슈도모다스 푸티다(Pseudomonas putida)를 감염시키는 박테리오파지의 작용을 받은 후의 전극상의 동일한 표면을 보여준다.
도 3은 대조군 용액과 슈도모다스 푸티다(Pseudomonas putida)를 감염시키는 박테리오파지를 포함하는 용액내에서 도 1의 칩상에서 자라난 바이오필름의 전기용량(Cb)의 전개를 그래프도 나타낸 것이다.
도 4는 인터페이스에서 바이오필름 전기용량(Cb)을 형성시키는데 이용되는 등가 전기 회로를 나타낸다.
도 1은 박테리오파지 탐지에 사용되는 마이크로전자 센서 장치, 특히 임피던스 센서 칩 구조의 평면도를 보여준다.
도 2a 및 2b는 도 1의 칩의 상세도인데, 이때 슈도모다스 푸티다( Pseudomonas putida) 바이오필름이 칩상에서 자라나도록 만들어져 있다. 도 2a는 박테리오파지의 작용을 받기 전 바이오필름이 있는 칩의 작업 전극을 보여주고, 도 2b는 슈도모다스 푸티다(Pseudomonas putida)를 감염시키는 박테리오파지의 작용을 받은 후의 전극상의 동일한 표면을 보여준다.
도 3은 대조군 용액과 슈도모다스 푸티다(Pseudomonas putida)를 감염시키는 박테리오파지를 포함하는 용액내에서 도 1의 칩상에서 자라난 바이오필름의 전기용량(Cb)의 전개를 그래프도 나타낸 것이다.
도 4는 인터페이스에서 바이오필름 전기용량(Cb)을 형성시키는데 이용되는 등가 전기 회로를 나타낸다.
본 발명의 제 1 목적은 박테리아가 이미 부착된 전극의 인터페이스에서 생성된 전기적 임피던스의 변화를 측정하여 박테리오파지를 탐지하고 및/또는 정량화시키는 대안 프로세스 및 시스템을 개발하는 것이다.
설명된 프로세스 및 시스템은 간단하고, 저렴하고, 신뢰성이 높아, 기존의 프로세스보다 장점을 가진다.
이와 같은 제 1 측면의 목적에 따라, 본 발명은 다음의 단계로 구성된 특징을 가지는, 미리결정된 박테리아성 숙주 균주를 감염시킬 수 있는 박테리오파지를 탐지하고 및/또는 정량화시키는 프로세스를 제공한다:
a) 전기적 임피던스를 측정하는 수단을 포함하는 장치의 작업 전극(2)의 표면상에 최소 하나의 숙주 균주로부터 박테리아를 흡착시키고;
b) 전극(2) 및 흡착된 박테리아를 박테리오파지를 포함하는 것으로 의심이 가는 분석될 물질의 용액에 노출시키고;
c) 전극(2)과 함께 b) 단계의 용액을 미리 결정된 조건에서 항온처리시켜, 박테리아가 박테리오파지에 의해 감염된 경우, 전극상에 부착된 박테리아의 용해가 일어나며;
d) 단계 c)의 항온처리 단계 동안 용액의 전기적 임피던스에서 변화를 측정하고;
e) e-i) 등가의 전기 회로에서, 임피던스 값 상에 변화에 근거하여 전극-박테리아 인터페이스의 전기 용량의 변화를 측정하며; 또는
e-ii) 임피던스 값상에서 변화에 근거하여 숙주 균주에 따라 미리결정된 주파수에서 가상 임피던스 컴포넌트의 크기에 있어서 변화치를 측정하고; 그리고
f) 용액에서 박테리오파지의 존부 또는 농도는 용액내 박테리오파지의 농도와 가상 임피던스 컴포넌트의 크기에 변화 또는 전기용량치에 변화와 상관 관계를 가진 대응 교정곡선을 이용하여, 가상 임피던스 컴포넌트의 크기에 변화 또는 전기용량치에 변화를 결정하는 단계로 구성된다.
두 번째 측면에 따른 동일한 목적에 따라, 본 발명은 미리결정된 박테리아 숙주 균주를 감염시킬 수 있는 박테리오파지를 탐지 및/또는 정량화시킬 수 있는 시스템을 제공하는데, 이 시스템은 전기적 임피던스 측정을 실행하는 최소 두 개 전극, 상기 전극중 최소 하나의 표면에 부착된 최소 하나의 숙주 균주의 박테리아 및 등가회로(equivalent circuit)에서 전극상에 부착된 박테리아의 용해 결과로써 박테리오파지에 의해 감염된 박테리아상에서 발생되는 전극-박테리아 인터페이스의 전기 용량의 변화 또는 숙주 균주에 따라 미리 결정된 진동수에서 가상 임피던스 컴포넌트의 크기의 변화를 결정하는 프로세싱 및 콘트롤 수단을 포함한다.
본 발명의 두 번째 목적은 전기적 임피던스 변화를 측정하기 위한 최소 한 쌍의 전극을 포함하는 마이크로전자 센서 장치를 제공하는 것이다. 상기 센서 장치는 전극중 최소 하나의 표면상에 부착된 박테리아성 바이오필름을 포함하는데, 바이오필름의 박테리아는 최소 하나의 숙주에 대해 미리결정된 특이성을 가진 박테리오파지에 의해 감염되기 쉬운 숙주 균으로부터 나온 것이다.
끝으로, 본 발명의 세 번째 목적은 마이크로전자 센서 장치의 용도인데, 이 장치는 전기화학적 임피던스 분광기수단을 이용하여, 미리결정된 박테리아 숙주 균주를 감염시킬 수 있는 박테리오파지를 탐지 및 정량화시키기 위한 재료 기질에 통합된 최소 한 쌍의 전극을 포함한다.
본 발명에서, “마이크로전자 장치”는 플랫(flat) 센서 컴포넌트로써, 바람직하게는 박막(thick-film) 또는 박막 마이크로전자 기술을 이용하여 만든 것으로 이해해야 한다.
“바이오필름(Biofilm)”은 마이크로전자 장치의 작업 전극의 표면상에서 생장하는 이형성 박테리아 형성으로 이해하면 되고, 바람직하게는 마이크로전자 장치의 작업 전극 표면상에 부착된 엑소폴리사카라이드 매트릭스에 박혀서 생장하는 박테리아 군집이다.
발명의 상세한 설명
청구되는 프로세스 및 시스템은 원하는 박테리오파지 또는 박테리오파지 군을 탐지하기 위하여 숙주 균주의 박테리아가 미리 부착되어 있는 전극의 인터페이스에서 생산된 임피던스 변화를 측정에 기초된다. 전극-박테리아 인터페이스에서 만들어지는 변화는 작업 전극의 표면상에 부착된 바이러스상에서 박테리오파지의 작용으로 인한 것이다. 상기 전극은 전기화학적 임피던스 분광기를 이용하여 임피던스를 측정하는 마이크로전자 센서 장치에 속한다.
실행된 실험에서, 마이크로전자 센서 장치의 작업 전극상에 부착된 박테리아의 박테리오파지에 의해 실행된 용해로 인하여 전기적 임피던스 수단을 이용하여 실시간으로 모니터될 수 있는 반응이 생성된다는 것이 밝혀졌다.
특히, 박테리아의 용해를 야기시키는 박테리오파지의 위상성 변화(phagic activity)로 인하여 박테리아가 부착된 전극의 임피던스의 전기용량 값이 변화될 수 있다는 것이 관찰되었다. 임피던스 스펙트럼의 등가의 전기적 회로에서 결정된 인터페이스 전기용량 변화 값은 전극 표면에서 일어나는 위상상 활성(용해) 정도에 따라 달라지며, 이는 분석되는 매질 또는 용액내 박테리오파지의 농도에 비례한다.
그럼에도 불구하고, 박테리오파지에 의해 일어나는 감염은 미리결정된 진동수에서 가상 임피던스 컴포넌트 크기의 변화를 직접적으로 측정함으로써, 더 신속하고 더 간단한 방식으로 모니터될 수 있다는 것도 관찰되었다. 가상 임피던스 컴포넌트는 회로의 임피던스의 용량 컴포넌트와 관련되는데, 이는 용액내 박테리오파지의 존재에 따라 달라지는(감소) 것으로 관찰되었다.
이와 같은 사실들에 의해 활성 상태의 박테리오파지를 탐지하기 때문에, 박테리오파지를 탐지 및/또는 정량화시키는, 그리고 매우 신뢰성있는 장점을 가지는 시스템 및 프로세스의 개발을 가능하게 되었다. 추가적으로, 쉽게 재생되고 자동화되는, 매우 간단한 방법 및 시스템으로, 샘플내에 박테리오파지 농도를 실시간으로 모니터할 수 있게 한다. 다른 한편, 어떠한 임의의 타입의 매질(오수, 오수 식물 진흙, 삼출액, 바이오고형물 등)내에 존재하는 박테리오파지를 탐지할 수 있는 장점을 가진다.
청구된 시스템 및 프로세스는 원하는 박테리오파지 또는 박테리오파지 군을 탐지하기 위하여, 작업 전극의 표면상에 숙주 균주의 부착을 요구한다. 상기 박테리아 흡착은 여러 상이한 기술에 의해 실행될 수 있다.
제 1 구체예에 따르면, 흡착은 박테리아를 고정시키도록 예정된 화합물 또는 용액으로 작업 전극 표면의 사전 기능화작업을 통하여 실행될 수 있다.
또 다른 구체예에 따르면, 흡착은 작업 건극상에 박테리아의 정전기적 흡착을 유도하는 목적으로 장치의 전극에 전위를 제공하여 실행될 수 있다.
그럼에도 불구하고, 바람직한 구체예에 따르면, 박테리아 흡착은 작업 전극의 표면상에 박테리아 바이오필름을 형성하는 것인데, 바람직하게는 최소 25미크론의 두께를 가지거나 또는 104 PFU(Plaque-Forming Units)/㎖를 가진다. 이와 같은 두께 또는 농도는 이 방법에 더 높은 감도를 부여한다는 것이 증명되었다.
바이오필름 형성은 기질 표면상에 박테리아 흡착의 가역적 상으로 시작하여, 비가역적 흡착 및 박테리아 분할이 시작되고, 이에 따라 바이오필름의 생장 및 후속적 성숙이 수반되는 특징적 프로세스에 따른다. 이 프로세스는 등가 회로에 전기화학적 임피던스 분광기 기술을 이용하여 모니터될 수 있는데, 여기에서 바이오필름의 전기용량(Cb)는 인터페이스내 전극상에 부착된 바이오필름을 만드는 회로의 전기적 컴포넌트 또는 변수로 정의된다. 바이오필름의 전기용량은 바이오필름이 성숙하는 동안 바이오필름의 두께가 증가될 때 증가되는 방식으로, 바이오필름 두께와 양성적 관계가 있음을 보여준다.
유익하게는, 본 발명의 바이오필름 형성은 작업 전극을 숙주 균주의 박테리아를 포함하는 배양 배지에 노출시키고, 그리고 숙주 균주에 따라 예정된 시간 동안 작업 전극의 동시 극성화(polarisation)를 포함한다.
조밀한 바이오필름은 전극 항온처리 동안 동시 극성화를 통하여 단 몇시간내에 형성될 수 있으며, 이것은 이 프로세스에서 매우 긍정적인 영향을 가진다.
바이오필름 형성을 포함하는 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 다음의 프로세스를 청구한다:
- 단계 e-i)에서, 바이오필름의 전기용량(Cb)를 결정하는 것을 포함하는 인터페이스 전기용량에서 변화를 결정하고, 이때 전기용량은 인터페이스에 있는 바이오필름에 의해 만들어진 등가 전기 회로의 파라미터이며,
그리고 단계 e-i)에 이어서, 박테리오파지의 존재 또는 농도는 바이오필름의 전기용량(Cb)에서의 변화에 근거하여 결정되고, 전기용량에서 변화는 용해로 인한 바이오필름의 악화와 연관된다.
바이오필름의 형성이 포함된 동일한 바람직한 구체예에 따라, 본 발명은 다음의 시스템을 청구하는데, 이때 마이크로전자 센서 장치의 작업 전극에 부착된 박테리아는 바이오필름의 일부분을 형성하고, 그리고 이때 프로세싱 및 콘트롤 수잔은 바이오필름의 전기용량(Cb)에서의 변화 또는 가상 임피던스 컴포넌트의 크기에서의 변화를 결정하고, 전기용량에서의 변화 또는 가상 임피던스 컴포넌트의 크기에서의 변화는 박테리아성 용해 결과로 동일한 바이오필름의 악화와 연관된다.
실행된 실험에서, 마이크로전자 센서 장치의 작업 전극상에 형성된 바이오필름이 박테리오파지 용액이 포함된 시료에 노출될 때, 박테리오파지에 의해 야기되는 박테리아 용해로 바이오필름의 두계가 감소되며, 그 결과로써 바이오필름의 전기용량(Cb)이 변화되거나 또는 회로의 전기용량과 관련된 가상 임피던스 컴포넌트의 크기가 변화된다.
놀라운 것은, 바이오필름의 두께의 변화 및 바이오필름의 전기용량(Cb)의 변화 모두 또는 가상 임피던스 컴포넌트 크기의 변화는 마이크로전자 장치의 표면상에 부착된 바이오필름으로부터 박테리아를 제거하는 역할을 하는 박테리오파지의 용해성 사이클과 연관이 있을 것이다.
전술한 것에 근거하여, 본 발명은 매우 간단하고 신뢰성있는 시스템 및 프로세스를 제공하는데, 바람직한 구체예에 따르면, 마이크로전자 센서 장치의 표면에 부착된 바이오필름의 악화와 연관된 임피던스의 변화를 탐지함으로써, 용액안에 박테리오파지의 존재가 탐지되고 정량화된다.
전술한 것에 근거하여, 본 발명은 전기적 임피던스에서의 변화를 측정하기 위한 최소 한 쌍의 전극을 포함하는 마이크로전자 센서 장치를 제공하는데, 이때 이 장치는 최소 한 쌍의 전극 표면에 부착된 박테리아성 바이오필름을 포함하고, 바이오필름의 박테리아는 숙주 균주에 대한 사전 결정된 특이성을 가지는 박테리오파지에 의해 감염될 여지가 있는 숙주 균주에 속한다.
유익하게는, 바이오필름을 포함하는 마이크로전자 센서 장치는 전기화학적 임피던스 분광기의 수잔, 바이오필름의 최소 하나의 숙주 균주 박테리아를 감염시킬 수 있는 박테리오파지에 의해 탐지되고 정령화된다.
바람직하게는 장치의 바이오필름은 최소 25미크론의 두께 또는 최소 104 PFU/ml(Plaque-Forming Units)의 숙주 균주 박테리아의 농도를 가진다.
또한 바람직하게는, 마이크로전자 장치는 박막 석판술 기술을 이용하여 바람직하게 제조된, 편평한, 소형화된 마이크로전자 센서 칩 또는 장치다.
칩은 작은 크기로 인하여 매우 작은 샘플 용적에서 측정을 가능하게 하는 고감도 센서로 구성된다.
청구된 프로세스 및 시스템은 숙주 균주에 대하여 예정된 특이성을 가지는 박테리오파지를 이용할 수 있다면, 임의 타입의 박테리오파지 탐지에 응용될 수 있다. 상기 박테리오파지는 매우 다양한 재료들의 시료로부터 유래될 수 있는데, 예를 들면, 하수오물 식물 진흙, 침출수 또는 박테리오파지의 탐지가 중요한 임의 형태의 고체 또는 액체 재료가 된다.
특정 물 시료의 경우, 박테리오파지 탐지가 특히 중요한데, 그 이유는 바이이러스 타입의 배설물 오염의 지표 미생물로 제안되어왔기 때문이다.
바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 물의 미생물 제어 및/또는 배설물 오염의 측정에 중요한 박테리오파지 탐지에 관계하는데, 예를 들면, 체세포 콜리파지(somatic coliphages), F-특이적 RNA 파지 및 박테로이드 프라질리스(Bacteroides fragilis)를 감염시키는 박테리오파지를 포함한다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 박테리오파지는 슈도모나스 푸티다( Pseudomonas putida) 또는 젖산균 예를 들면, 락토바실러스 불가리스(Lactobacillus bulgaris), 락토바실러스 라티스(Lactobacillus lactis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 그리고 스트렙토코커스 터모필러스(Streptococcus thermophilus)와 같은 균을 감염시키는 박테리오파지다.
바람직한 구체예의 설명
슈도모다스 푸티다(Pseudomonas putida)를 감염시키는 박테리오파지를 탐지하기 위한 본 발명의 프로세스 및 시스템의 제 1 구체예는 하기에서 설명된다.
이용된 마이크로전자 센서 장치는 도 1에 나타낸 것과 같은 센서 칩(1)인데, 단일 기질내에 작업 전극(2) 및 두 개의 카운터(counter) 전극(3)이 플라티늄 마이크로-디스크 형태로 통합되어 있다.
본 발명의 상세한 설명에서 언급된 것과 같이, 청구되는 프로세스 및 시스템은 전극의 인터페이스에서 생성되는 임피던스의 변화 측정에 기초하며, 원하는 박테리오파지 또는 박테리오파지 군을 탐지하기 위하여 전극상에 숙주 균주 박테리아가 미리 부착되어 있다.
설명되는 구체예에서, 박테리아는 도 1의 칩(1) 표면에 슈도모다스 푸티다( Pseudomonas putida)의 바이오필름(4) 형성을 통하여 부착되어 있다. 도 2a에서는 도 1의 센서 칩을 상세하게 보여주는데, 칩 상에서 바이오필름(4)이 자라도록 만들어졌다.
언급된 바이오필름(4)의 형성을 위하여, 센서 칩(1) 자체를 제어된 최소 배지(AB 최소 배지)내에서 지수증식기에 있는 슈도모다스 푸티다(Pseudomonas putida) 배양물이 있는, 교반 및 일정하게 환기되는 반응기에로 도입시켰다. 이 반응기에서, 칩(1)은 5년간 항온처리되도록 허용되었다. 이 기간 후에, 칩(1)상에 형성된 바이오필름(4)이 도 2a에서 보여지는 것과 같이 나타났다.
다음의 용액 혼합물로부터 준비된 AB 최소 배지를 준비하는 방법 및 조성물은 하기에서 상세하게 설명된다:
o 875 ml의 멸균 증류수
o 100 ml의 A 용액
o 25 ml의 B 용액
o 10 ml의 20% 포도당(20g/100ml 증류수)
A 용액은 1,000 ml의 증류수내에 다음을 포함한다:
o (NH4)SO4:20g
o Na2HPO4:73.1g
o KH2PO4:78.5g
o NaCl:30.0 g
o NaSO4:0.11g
B 용액은 다음의 성분들을 포함하는데, 각 성분들은 개별적으로 증기살균된 후에 함께 혼합된다:
o 16g MgCl2.6H2O, 500ml의 증류수 안에
o 0.58g CaCl2, 250mg의 증류수 안에
o 0.032 g FeCl3, 6H20, 250ml의 증류수 안에
바이오필름(4)이 칩(1)상에 형성된 후, 칩(1)은 108(PFU/ml) (Plaque-Forming Units)에서 박테리오파지 현탁액을 포함하는 용액내로 도입된다. 이 용액은 최소 AB 배지 4.5㎖에 박테리오파지가 포함된 오수 0.5㎖을 접종시켜 수득되었다.
그 다음, 칩(1)이 포함된 전술한 용액은 37℃에서 24시간 항온처리된다. 항온처리 프로세스 동안, 바이오필름(4) 악화를 모니터할 목적으로 전기적 임피던스 측정이 실시되었다.
임피던스 측정은 전기화학적 임피던스 분광기를 이용하여 실행되는데, 다음과 같은 측정 조건이 이용된다:
§ 온도: 37ºC
§ 배양 배지: 상기 언급된 조성물에 따라 AB 최소 배지
§ 개회로(Open circuit) DC 전위: +0.26 ± 0.5 V
§ AC 전위: 25 mV
§ 주파수 범위: 10 Hz 내지 100 KHz
이와 같은 전기적 환경에서, 칩(1)의 표면상에 부착된 바이오필름(4)는 유전제 물질과 같이 거동하여, 임피던스 스펙트럼의 등가 전기 회로에서 바이오필름 전기용량(Cb)을 만든다. 바이오필름(4) 전기용량(Cb)에 의해 정의되는 식은 다음과 같다:
이때 ε0 는 진공에서 유전율(permittivity) 계수이며, εbiofilm은 바이오필름의 유전율이며; A는 바이오필름 코팅의 면적이며, 그리고 d는 바이오필름의 두께를 나타낸다.
도 4는 전술한 등가 회로를 나타내는데 바이오필름 전기용량(Cb)에 추가하여 다음과 같이 변수들이 정의된다 :
§ Cr: 언급된 전극과 연관된 전기용량.
§ Rs: 용액 저항.
§ Rb: 바이오필름(4) 저항.
§ Cc: 인터페이스의 전기 이중 층의 전기용량.
§ Rc: 부하 전환 저항.
본 발명의 상세한 설명에서 언급된 것과 같이, 박테리오파지의 작용에 바이오필름(4)이 노출되면, 반응이 생성되고, 이 반응은 등가 전기적 회로 변수 예를 들면 바이오필름(4)의 전기용량의 변화에 대하여 임피던스적으로 측정가능하다.
도 3의 그래프는 슈도모다스 푸티다(Pseudomonas putida)를 감염시키는 박테리오파지를 포함하는 오수 시료 용액안에, 그리고 기준 용액안에 도입된 센서 칩(1)에 배치된 바이오필름(4)의 전기용량의 시간에 따른 변화를 보여준다. 도 3에서, 박테리오파지가 포함된 용액안에 도입된 칩을 항온처리후 6시간 뒤 바이오필름(4)의 전기용량(Cb)이 감소된 것(기준 용액과 비교하여 8%)으로 관찰되었다. 그러나, 박테리오파지가 포함안된 기준 용액에 동일한 칩(1)을 넣어두면 동일한 전기용량(Cb)이 유지되었다.
본 발명의 설명에서 언급된 바와 같이, 실행된 실험에서 바이오필름(4) 전기용량(Cb)에서 변화는 공촛점 레이져 현미경을 이용하여 관찰하였을 때, 동일한 바이오필름(4)의 두께 변화와 연관이 있는 것으로 설명되었다. 이들 두 가지 변수들에서의 변화는 바이오필름(4)으로부터 박테리아 제거를 맡고 있는 박테리오파지의 용해 사이클과 연관된다.
설명된 구체예에서, 박테리오파지의 작용에 노출된 칩(1)상에 바이오필름(4)의 두께가 약 50% 감소된 것으로 감지되었는데, 측정되었는데, 박테리아(UFC/ml)(Colony-Forming Units)의 전체적인 감소는 대략 20% 정도인데, 그 이유는 박테리아 밀도가 적은 바이오필름(4)의 외측 층만이 파지에 의해 감염될 수 있기 때문이다.
바이오필름(4)의 두께를 감소시키는 이와 같은 측정치는 도 3에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 박테리오파지의 존재로 인하여 생성되는 바이오필름 전기용량(Cb)의 감소와 관련있었다.
본석될 용액내 박테리오파지의 농도는 작업 범위내에 용액의 농도와 전기용량(Cb) 값의 변화와 관련된 대응 교정곡선에 의한 바이오필름 전기용량(Cb)에서의 변화에 근거하여 결정된다.
그 다음, 대장균(Escherichia coli)을 감염시키는 박테리오파지를 탐지하기 위한 본 발명의 프로세스 및 시스템의 두 번째 구체예가 다음에서 설명된다.
두 번째 구체예에서, 이용된 마이크로전자 센서 장치는 도 1과 동일한 센서 칩(1)으로, 이 경우, 바이오필름은 30 미크론 두께와, 105 PFU/㎖의 박테리아 농도가 형성된다.
전술한 두께 및 박테리아 농도의 조밀한 바이오필름이 신속하게 형성되도록, 센서 칩(1) 자체를 제어된 최소 배지(AB 최소 배지)내에서 지수증식기에 있는 슈도모다스 푸티다(Pseudomonas putida) 배양물이 있는, 교반 및 일정하게 환기되는 반응기에로 도입시켰다. 이 반응기에서, 바이오반응기내에 센서를 조건화시킨 3분 후, 칩(1)은 10초간 지속되는 펄스 트레인을 이용하여 제공되는 3볼트에 의해 작업 마이크로전극을 극성화시켜 강요된 항온처리를 받는다. 이와 같은 조건하에, 전술한 성질을 가지는 바이오필름이 수득된다. 이와 같은 바이오필름은 도 2a에서 볼 수 있는 것과 같이 수일간 자연적으로 항온처리된 정상적인 바이오필름과 동일한 외양을 가진다.
일단 바이오필름(4)이 칩(1)상에 형성되면, 제 1 구체예에서 설명된 것과 동일한 감염 프로토콜에 따라, 108 (PFU/ml) (Plaque-Forming Units)의 박테리오파지 현탁액을 포함한 용액안에 바이오필름이 있는 칩을 도입시킨다. 그 다음, 칩이 포함된 전술한 용액은 37℃ 온도에서 6시간 동안 항온처리된다. 항온처리 프로세스 동안, 바이오필름 악화를 모니터링하기 위하여 전기화학적 임피던스 측정이 실행된다.
제 1 구체예의 경우에서와 같이, 박테리오파지의 작용에 바이오필름이 노출되면, 반응이 생성되고, 이 반응은 인터페이스에서 바이오필름에 의해 형성되는 등가 전기적 회로 변수 예를 들면 바이오필름(4)의 전기용량의 변화에 대하여 임피던스적으로 측정가능하다.
표 1은 마이크로칩상에서 생성된 대장균(Escherichia coli)의 바이오필름을 감염시킬 수 있는 두 가지 타입의 박테리오파지에 대한 두 번째 구체예에서 수득된 결과를 나타낸다. 이 결과는 바이오필름의 전기용량의 감소 비율로 나타낸다.
| 박테리오파지 | Cbiofilm 시그날에서 감소 % | |
| 2 h | 6 h | |
| AEscherichia coli | 2 % | 24 % |
| BEscherichia coli | 3.5 % | 19 % |
상기 표에서 관찰될 수 있는 것과 같이, 대장균(Escherichia coli)에 대한 박테리오파지 A는 6시간 항온처리후, 바이오필름의 전기용량 시그날이 24% 감소되었지만, 박테리오파지 B의 경우에는 19% 감소되었다.
제 2 구체예에서, 30미크론 두께와 104 UFC/ml을 가지는 조밀한 바이오필름 형성으로 더 감소가 큰 방법이 제공된다는 결과를 보여준다. 이와 같은 조밀한 바이오필름은 작업 전극의 동시적 극성화 수단에 의해 칩을 강제 항온처리시킴으로써 신속하게(몇 시간안에) 형성될 수 있다.
본 발명의 설명에서 이미 언급된 것과 같이, 박테리오파지의 작용에 바이오필름이 노출되면, 특정 주파수에서 수득되는 가상 임피던스 컴포넌트 (Zi) 크기의 변화로 임피던스 측정가능한 반응이 생성된다.
대장균(Escherichia coli)을 감염시키는 박테리오파지를 탐지하는 본 발명의 프로세스 및 시스템의 세 번째 구체예의 결과를 하기에서 설명하는데, 이때 박테리오파지의 탐지는 가상 임피던스 컴포넌트의 크기 값에 변화에 기초하여 실행된다.
제 3 구체예에서, 이용된 마이크로전자 장치는 도 1과 동일한 센서 칩(1)이며, 40미크론의 두께와 3.105 PFU/ml의 박테리아 농도를 가지는 바이오필름이 형성되었다.
표 2는 마이크로칩상에서 생성된 대장균(Escherichia coli)의 바이오필름을 감염시킬 수 있는 두 가지 타입의 박테리오파지에 대한 세 번째 구체예에서 수득된 결과를 나타낸다. 이 결과는 가상 임피던스 컴포넌트의 크기에 변화 비율로 나타낸다.
| 박테리오파지 | % 변화 Zi(6 시간) | ||
| 50 Hz | 500 Hz | 1,000 Hz | |
| AEscherichia coli | 17 % | 15 % | 12 % |
| BEscherichia coli | 14 % | 11 % | 10 % |
표에서 볼 수 있는 것과 같이, 이 구체예에서, 수득된 변화 값은 두 번째 구체예에서 수득된 것보다는 약간 감도가 떨어지는데, 이때 전기용량에서 변화 비율이 측정된다. 그러나, 주파수에서 가상 임피던스 컴포넌트를 측정하는 것은 실질적으로 탐지 프로세스를 단순화시키는 장점을 가진다.
50 Hz에서, 결과는 감도가 더 크며, 다른 값은 약간 감도가 더 낮다.
본 발명의 세 가지 특정 구체예를 설명하였지만, 당업자는 첨부된 청구범위에 의해 한정되는 보호범위를 벗어나지 않고, 변화 및 변형을 도입하거나 또는 기타 기술적으로 등가의 것으로 대체할 수 있다.
예를 들면, 설명된 모든 구체예에서, 임피던스 측정은 마이크로전자 칩(1) 타입 센서 장치를 이용하여 실행된다. 그럼에도 불구하고, 임의의 기타 등가의 마이크로전자 장치, 예를 들면, 박막 마이크로전자 기술을 이용하여 제조된 마이크로전자 장치는 본 발명의 측정을 실행하는데 유용할 것이다.
유사하게, 설명된 구체예에서, 작업 전극(2)의 표면상에 박테리아 흡착은 바이오필름(4)의 형성을 통하여 실행되었다. 그럼에도 불구하고, 박테리아의 흡착은 아비딘과 같은 화합물의 직접적인 흡착을 통하여 작업 전극(3)의 기능화를 실행하는 것과 같이 임의 기타 다른 기술이 이용되어 실시될 수 있으며, 아비딘-바이오틴 결합 수단에 의해 기존에 바이오티닐화된 박테리아의 흡착을 실시한다.
설명된 구체예는 슈도모다스 푸티다(Pseudomonas putida)를 감염시키는 박테리오파지와 대장균(Escherichia coli)을 감염시키는 체세포 콜리파지를 탐지하는 것에 관한 것이다. 그럼에도 불구하고, 앞서 언급된 바와 같이, 본 발명은 박테리오파지에 의해 감염될 소지가 있는 박테리아 숙주가 있다면 임의 다른 형태의 박테리오파지의 탐지 및/또는 정량화에도 적용할 수 있다.
Claims (16)
- 본 발명은 다음의 단계로 구성된 특징을 가지는, 미리결정된 박테리아성 숙주 균주를 감염시킬 수 있는 박테리오파지를 탐지하고 및/또는 정량화시키는 프로세스에 있어서,
a) 전기적 임피던스를 측정하는 수단을 포함하는 장치의 작업 전극(2)의 표면상에 최소 하나의 숙주 균주로부터 박테리아를 흡착시키고;
b) 전극(2) 및 흡착된 박테리아를 박테리오파지를 포함하는 것으로 의심이 가는 분석될 물질의 용액에 노출시키고;
c) 전극(2)과 함께 b) 단계의 용액을 미리 결정된 조건에서 항온처리시켜, 박테리아가 박테리오파지에 의해 감염된 경우, 전극상에 부착된 박테리아의 용해가 일어나며;
d) 단계 c)의 항온처리 단계 동안 용액의 전기적 임피던스에서 변화를 측정하고;
e) e-i) 등가의 전기 회로에서, 임피던스 값 상에 변화에 근거하여 전극-박테리아 인터페이스의 전기 용량의 변화를 측정하며; 또는
e-ii) 임피던스 값상에서 변화에 근거하여 숙주 균주에 따라 미리결정된 주파수에서 가상 임피던스 컴포넌트의 크기에 있어서 변화치를 측정하고; 그리고
f) 용액에서 박테리오파지의 존부 또는 농도는 용액내 박테리오파지의 농도와 가상 임피던스 컴포넌트의 크기에 변화 또는 전기용량치에 변화와 상관 관계를 가진 대응 교정곡선을 이용하여, 가상 임피던스 컴포넌트의 크기에 변화 또는 전기용량치에 변화를 결정하는, 단계로 구성된 프로세스. - 청구항 1에 있어서, 단계 a)의 박테리아 흡착은 전극(2)의 표면상에 최소 하나의 숙주 균주의 박테리아 바이오필름(4)의 형성을 포함하는, 프로세스.
- 청구항 2에 있어서, 이때
단계 e-i)에서, 전극(2)상에 흡착된 바이오필름의 전기용량(Cb) 변화를 결정하는 것을 포함하고, 이때 전기용량(Cb)은 바이오필름이 인터페이스에서 형성하는 등가 전기 회로의 분수가 되며,
그리고 단계 e-i)에 이어서, 단계 f)에서 박테리오파지의 존재 또는 농도는 바이오필름(4)의 전기용량(Cb)에서의 변화에 근거하여 결정되고, 전기용량에서 변화는 용해로 인한 바이오필름의 악화와 연관되는, 프로세스. - 청구항 2 내지 3에 있어서, 바이오필름(4)은 최소 25미크론의 두께를 가지거나 또는 104 PFU(Plaque-Forming Units)/㎖의 숙주 균주 박테리아 농도를 가지는, 프로세스.
- 청구항 2 내지 4중 임의의 한 항에 있어서, 단계 a)에서 바이오필름(4)의 형성은 전극(2)을 숙주 균주의 박테리아를 포함하는 배양 배지에 노출시키고, 동시에 숙주 균주에 따라 미리 결정된 시간 동안 작업 전극(2)을 극성화시키는 것을 포함하는, 프로세스.
- 청구항 1에 있어서, 단계 a)의 박테리아 흡착은 전극(2)의 표면상에 박테리아를 고정시키기 위한 화합물의 흡착을 통하여 전극(2)의 표면을 사전 기능화시키는 것을 포함하는, 프로세스.
- 전술한 어느 한 항에 있어서, 작업 전극(2)은 전기적 임피던스 측정을 위한 최소한의 또 다른 전극(3)을 포함하는 마이크로전자 장치(1)의 재료 기질에 통합된, 프로세스.
- 미리 결정된 박테리아 숙주 균주를 감염시킬 수 있는 박테리오파지를 탐지 및/또는 정량화시키는 시스템에 있어서,
-전기적 임피던스 측정 실행을 위한 최소 두 개 전극(2,3)을 포함하는 마이크로전자 센서 장치(1),
-최소 한 개 전극(2)의 표면에 흡착된 최소 하나의 숙주 균주의 박테리아, 그리고
-숙주 균주에 따라 예정된 주파수에서 가상 임피던스 컴포넌트의 크기의 변화 또는 등가 회로에서 전극-박테리아 인터페이스의 전기용량의 변화를 결정하기 위한 프로세싱 및 콘트롤 수단을 포함하고,
이때 가상 임피던스 컴포넌트의 크기 변화 또는 전기용량의 변화는 박테리오파지에 의해 감염된 박테리아의 전극(2)상에 흡착된 박테리아의 용해 결과로 발생되는 것을 특징으로 하는 시스템. - 청구항 8에 있어서, 상기 박테리아는 전극(2)의 표면에 흡착된 박테리아 바이오필름(4)의 일부분을 형성하고, 그리고 프로세싱 및 콘트롤 수단은 박테리아 용해 결과로 인한 인터페이스에서 바이오필름(4)에 의해 형성된 등가 전기 회로의 변수의 전기용량(Cb) 변화를 결정하거나 또는 박테리아 용해 결과로 인한 바이오필름(4)의 악화와 관련된 가상 임피던스 컴포넌트의 크기의 변화를 결정하는, 시스템.
- 전기적 임피던스에서 변화를 측정하기 위한 최소 한 쌍의 전극(2, 3)을 포함하는 마이크로전자 장치에 있어서,
장치는 전극중 최소 하나(2)의 표면상에 흡착된 박테리아 바이오필름(4)을 포함하고, 바이오필름(4)의 박테리아는 균주에 대해 예정된 특이성을 가지는 박테리오파지에 의해 감염될 여지가 있는 숙주 균주로부터 기인된, 시스템. - 청구항 10에 있어서, 바이오필름(4)은 최소 25미크론의 두께를 가지거나 또는 104 PFU(Plaque-Forming Units)/㎖의 숙주 균주 박테리아 농도를 가지는, 장치.
- 청구항 10 또는 11에 있어서, 마이크로전자 장치(1)는 센서 칩이 되는, 장치.
- 전기화학적 임피던스 분광기를 이용하여 물질 기질에 통합된 최소 한 쌍의 전극(2, 3)을 포함하는 마이크로전자 센서 장치(1)는 사전 결정된 박테리아 숙주 균주를 감염시킬 수 있는 박테리오파지의 탐지 및/또는 정량화에 사용되는 용도.
- 청구항 13에 있어서, 장치는 장치의 표면에 흡착된 박테리아 바이오필름(4)을 포함하고, 바이오필름(4)의 박테리아는 숙주 균주중 최소 하나로부터 기인되며, 바이오필름은 바람직하게는 최소 25미크론의 두께를 가지거나 또는 104 PFU(Plaque-Forming Units)/㎖의 숙주 균주 박테리아 농도를 가지는, 용도.
- 청구항 1의 프로세스, 청구항 8의 시스템, 청구항 10의 장치 또는 청구항 13의 용도에서, 박테리오파지는 체세포 콜리파지 또는 대장균(Escherichia coli)을 감염시킬 수 있는 박테리오파지 또는 슈도모다스 푸티다(Pseudomonas putida) 균주를 감염시킬 수 있는 박테리오파지가 되는, 프로세스, 시스템, 장치 또는 용도.
- 청구항 1의 프로세스, 청구항 8의 시스템, 청구항 10의 장치 또는 청구항 13의 용도에서, 분석될 재료 용액은 물 시료에서 얻는, 프로세스, 시스템, 장치 또는 용도.
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