KR20100114873A

KR20100114873A - 자연 살해 ｔ 세포의 리간드와 항원을 적재한 단핵구 또는 미분화 골수성 세포를 포함하는 백신

Info

Publication number: KR20100114873A
Application number: KR1020100099443A
Authority: KR
Inventors: 강창율; 고현정; 이정미; 김연정
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2010-10-12
Filing date: 2010-10-12
Publication date: 2010-10-26
Also published as: KR101055666B1

Abstract

본 발명은 자연 살해 T 세포의 리간드와 항원을 적재한 단핵구(monocyte) 또는 미분화 골수성 세포(Immature myeloid cells; 이하, IMC)를 포함하는 면역 치료 및 예방용 백신에 관한 것으로, 구체적으로 자연살해 T 세포 리간드이자 당지질의 일종인 알파-갈락토실세라마이드(alpha-galactosylceramide; 이하, αGalCer)가 적재된 단핵구 또는 IMC를 포함하는 면역 치료 및 예방용 백신에 관한 것이다. 본 발명의 조성물인 단핵구 또는 IMC가 수지상 세포에 비해 수득이 용이하며 자연 살해 T 세포의 리간드와 항원을 적재한 단핵구 또는 IMC의 면역화는 유의한 수준의 세포독성 T 림프구 반응을 유도할 뿐 아니라 악성종양의 예방 및 치료 효과가 있으므로 항암 면역 치료제로 이용될 수 있다.

Description

자연 살해 Ｔ 세포의 리간드와 항원을 적재한 단핵구 또는 미분화 골수성 세포를 포함하는 백신{Vaccine comprising Monocyte or immature myeloid cells(IMC) which was loaded with the ligand of natural killer T cell and antigen}

본 발명은 자연 살해 T 세포의 리간드와 항원을 적재한 단핵구 또는 미분화 골수성 세포(Immature myeloid cells; IMC)를 포함하는 면역 치료 및 예방용 백신에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 자연살해 T 세포 리간드이자 당지질의 일종인 알파-갈락토실세라마이드(alpha-galactosylceramide; 이하, αGalCer)가 적재된 단핵구 또는 IMC를 포함하는 면역 치료 및 예방용 백신에 관한 것이다.

최근 의학이 발달함에 따라 암환자의 생존율이 증가하고 있지만, 변화하는 환경적 요인과 평균 수명의 증가 등에 의해 암 발생 빈도 역시 증가하고 있다. 현재까지 암을 치료하기 위한 많은 연구가 진행되고 있으며, 암에 대한 새로운 약제와 치료법이 개발되고 있어 암환자들의 치료효과가 많이 향상되고 있다. 그러나, 악성종양의 경우 미세수술요법과 방사선 치료의 발달, 화학요법과 같은 새로운 치료제의 개발에도 그 치료 효과가 제한적이며, 비특이적 항암 효과에 따른 부작용 및 암의 재발 등의 한계점이 있다. 이를 보완하기 위해 현재 활발히 사용되거나 개발되고 있는 치료법이 면역 요법이다. 종양 특이적 독성(tumor-specific toxicity)을 유도함으로써 전신 독성에 의한 부작용을 줄이고, 암 및 암 항원에 대한 능동적인 기억반응(memory response)을 확립함으로써 기존의 암 치료법을 보완할 수 있는 특징이 있기 때문이다.

항원제시세포를 이용한 항암 면역 세포 백신은 효과적으로 CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포를 활성화할 수 있으므로 우수한 항암효과를 나타낸다. 현재 항원제시세포 백신으로 가장 많이 사용되는 세포는 수지상 세포(Dendritic cells)로 항원을 포식하여 효과기 세포(effector cells)에 강한 공자극(costimulatory signal)과 함께 전달해 주기 때문에 효율적으로 효과기 세포를 활성화하고 강한 면역반응을 유도한다. 실제 임상적으로 수지상 세포를 이용한 세포치료제는 우선 환자의 골수나 말초혈액으로부터 수지상 세포 혹은 그 전구체인 단핵구(monocyte)를 분리하여 대량 증식 및 분화시킨 후, 항원을 가하고 활성화시켜 다시 환자에 주입하는 방법을 사용한다. 체내에 주입된 수지상 세포는 특이적인 항원 정보를 T 세포에 전달하고 이를 활성화시켜 항원 특이적인 면역반응을 효과적으로 유도하게 된다. 이러한 장점에도 혈액과 림프 조직에 직접적으로 얻을 수 있는 수지상 세포의 수가 극히 소수이며 분리하기가 까다롭고, 단핵구로부터 분화시키는 경우 수일 동안 체외에서 배양해야 하기 때문에 수지상 세포를 이용한 세포 면역치료제 개발에 장애가 되고 있다. 따라서 이를 개선하거나 대체할 만한 다른 세포 면역치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

불변성 자연살해 T 세포(invariant Natural Killer T cell; iNKT cell)가 여러 면역 반응 및 면역 병리현상을 총괄하는 중추적인 역할을 담당한다는 것은 최근의 연구를 통해 잘 알려져 있다. 한편, 리간드로 활성화된 불변성 자연살해 T 세포는 수지상 세포뿐만 아니라 T, B 및 자연살해 세포의 활성화를 유도할 수 있으며, 불변성 자연살해 T 세포의 리간드인 알파-갈락토실세라마이드(alpha-galactosylceramide; 이하, αGalCer)를 주입하면 자연살해 세포와 T 세포의 활성화를 통해 항암면역을 일으키는 것이 보고되었다(Moodycliffe AM et al ., Nat Immunol 1:521-525, 2000). 상기 자연살해 T 세포는 자가 항원 및 외래 항원에 대한 반응을 관리하고 자가 면역 또는 면역반응을 유도할 것인지 여부를 결정한다고 보고된 바 있다(Kronenberg M, Annu Rev Immunol 23:877-900, 2005; Park SH & Bendelac A, Nature 406:788-792, 2000).

알파-갈락토실세라마이드(αGalCer)는 원래 해면동물에서 추출된 당지질(glycolipid)로 Vα14+ T 세포 수용체(TCR)를 가지고 있는 불변성 자연살해 T 세포의 리간드(ligand)이고, 항원제시세포( antigen presenting cell, APC) 표면에 존재하는 CD1d 분자에 의해 NKT세포에 제시됨이 알려져 있다(Kawano et al ., Science 278:1626, 1997). 자연살해 T 세포 리간드에 의해 자연살해 T 세포가 활성화되면 많은 양의 IFN-γ 및 IL-4를 비롯한 많은 사이토카인을 생산하고, 이것은 특정 질병 또는 감염에 대한 면역 반응을 조절할 수 있다(Chen et al ., J Immunol 159:2240, 1997; Wilson et al ., Proc Natl Acad Sci USA 100:10913, 2003).

일반인의 경우와 달리 암환자의 경우, 혈액 및 골수, 그리고 암 조직에 있어서 비활성화 대식세포, 과립구, 비활성화 수지상 세포, 단핵구 및 분화 초기의 골수성 세포를 포함하는 미분화 골수성 세포(Immature myeloid cells; IMC)가 증식하여 존재하는 것이 보고되고 있다. 뿐만 아니라 암세포가 이식된 동물의 혈액, 골수, 비장, 암 조직에서 있어서도 IMC가 유의하게 증가하여 있다. 마우스 모델에 있어서 IMC는 세포 표면에 특징적으로 CD11b와 Gr-1을 함께 발현하고 있다. 건강한 마우스의 혈액과 비장에서 CD11b⁺/Gr-1⁺ 세포가 4% 이내로 적은 수가 존재하고, 이것은 CD11b⁺/Gr-1⁺ 세포는 대식세포, 수지상 세포의 전구체이므로 적절한 사이토카인이 존재하는 환경에서는 성숙한 대식세포, 과립구, 수지상 세포로 분화할 수 있기 때문이다. 그러나 암환자의 경우 암세포가 분비하는 요소(tumor derived factor: IL-6, IL-10, VEGF, GM-CSF 등) 등에 의하여 CD11b⁺/Gr-1⁺ 세포가 더 이상 분화하지 못하고 축적되어 있다. IMC는 암환자의 혈액에 많이 축적되어 있기 때문에 다량의 세포를 얻기 용이하며 수지상 세포 백신의 제작 등의 목적으로 단핵구를 분리할 경우 상당수의 IMC가 혼입되는 것을 막기는 힘든 상황이다. 일반적으로 암환자 또는 암 이식 동물에 증식하여 존재하는 IMC는 면역억제 기능을 하는 것으로 알려져 있으나(Sergei K et al ., J Immunol 175:4583-4592, 2005), 적절한 자극을 통해 면역원성을 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.

최근 자연살해 T 세포 활성화에 따른 면역 증강 효과가 수지상 세포를 통해 나타난다는 증거가 제시되었고(Kronenberg M et al ., Annu Rev Immunol 23:877-900, 2005; Park SH et al., Nature 406:788-792, 2000), 이러한 결과를 근거로 하여 본 발명자들에 의해 최초로 자연살해 T세포 리간드를 B 세포에 제시하여 자연살해 T세포를 활성화하였고 그 도움으로 B 세포의 면역원성을 증가시킴으로써 B 세포에 적재한 항원에 대한 세포독성 T 세포 반응을 유도하였고, 이는 수지상 세포 백신과 유사한 정도의 효과를 나타냄을 확인하였다(Chung Y et al ., Cancer Res 66(13):6843-6850, 2006). 그러나 이러한 자연살해 T 세포 활성화에 따른 면역 증강 효과가 B 세포 외에 수지상 세포의 전구체인 단핵구 또는 미분화 골수세포에서도 나타날 것이라고 보고한 예는 전혀 없는 실정이다. 이에 본 발명자들은 단핵구와 IMC가 세포치료 백신의 제조에 효과적으로 이용될 수 있는지 확인하기 위하여, αGalCer가 적재된 단핵구 또는 IMC에 항원 펩티드를 적재하거나 항원을 발현하는 아데노바이러스(adenovirus)로 형질 도입하여 체내로 투여할 경우, 항원 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있었으며, 유의한 항암 효과를 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 자연 살해 T 세포 리간드, 특히 알파-갈락토실세라마이드와 항원을 적재한 단핵구 또는 미분화 골수성 세포(Immature myeloid cells; IMC)를 이용하여 자연 살해 T 세포를 활성화하고 항원 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 면역 치료 및 예방용 백신을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자연 살해 T 세포의 리간드와 항원을 적재한 단핵구 또는 미분화 골수성세포(Immature Myeloid Cells; IMC)를 포함하는 면역 치료 및 예방용 백신을 제공한다.

또한, 본 발명은 알파-갈락토실세라마이드(alpha-galactosylceramide; 이하, αGalCer)가 적재된 단핵구 또는 IMC를 포함하는 자연 살해 T 세포 활성화제를 제공한다.

또한, 본 발명은 암 항원을 발현하는 단핵구 또는 IMC를 포함하는 세포 독성 반응 유도제를 제공한다.

아울러, 자연 살해 T 세포의 리간드와 항원을 적재한 단핵구 또는 미분화 골수성세포를 포함하는 면역 치료 및 예방용 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 항원의 발현을 지표로 하는 질환의 면역 치료 및 예방 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

이미, 알파-갈락토실세라마이드(alpha-galactosylceramide; 이하, αGalCer)가 적재된 수지상 세포(dendritic cell, DC)가 불변성 자연 살해 T(invariant Natural Killer T cell; iNKT) 세포를 활성화한다는 것은 공지된 사실이므로(van der Vliet HJ et al., J Immunol Methods 1, 247(1-2):61-72, 2001), 본 발명자들은 알파-갈락토실세라마이드가 적재된 단핵구 또는 IMC가 상기의 수지상 세포와 유사한 효과를 나타내는지 확인하였다.

상기 단핵구는 수지상 세포(dendritic cell, DC) 또는 대식세포(macrophage)로 분화할 수 있는 골수(bone marrow) 유래의 미분화 전구체 세포이다. 본 발명자들은 마우스로부터 CD11b를 발현하는 단핵구 세포를 분리하여 αGalCer 및 항원 펩티드를 적재한 단핵구 백신을 제조하였고, 상기 백신의 항암 효과를 세포 독성 T 림프구 항원결정기를 포함하는 암 항원인 Her-2/neu를 발현하는 암세포 HER-2/CT26(Penichet ML et al ., Lab Anim Sci 49:179-88, 1999)를 이용하여 확인한 결과, 유의한 항암효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 1 참조). 또한 상기 백신이 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구를 활성화시켜 세포 독성 면역 반응을 유도할 수 있는지 알아보기 위해 생체 내 세포 독성 시험(in vivo CTL assay)을 실시한 결과, 높은 수준으로 표적을 파괴하는 능력을 가진 세포 독성 반응을 나타내었고(도 6 참조), 1 × 10⁶개의 세포만으로도 효과적인 세포 독성 반응을 유도시킬 수 있었다(도 7 참조).

그러나 항원 펩티드를 적재한 세포 백신은 임상적으로 이용할 경우, 개인의 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC)의 일배체형에 제한적으로 사용되므로 누구에게나 보편적으로 사용될 수 없으며, 단일 항원결정기(epitope)만을 제시하는 단점이 있다. 이에 비해, 상기 항원을 발현할 수 있는 바이러스를 이용할 경우 전체 항원을 도입할 수 있어 특정 주조직 적합성 복합체의 일배체형에 국한되지 않고 모든 사람에 적용가능하며, 세포성 면역 반응뿐만 아니라 체액성 면역반응도 유도할 수 있다는 장점을 지닌다. 이에 본 발명자들은 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입되고 αGalCer이 적재된 단핵구 백신을 제조하여 그 항암효과를 확인한 결과, 상기 단핵구 백신을 투여한 경우 암을 투여한 마우스의 생존기간이 현저히 연장되어 실제 암세포에 대해 뛰어난 항암효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다(도 2 참조). 또한 상기 백신이 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구를 활성화시켜 세포 독성 면역 반응을 유도할 수 있는지 알아보기 위해 생체 내 세포 독성 시험(in vivo CTL assay)을 실시한 결과, 2 × 10⁶개의 세포만으로도 효과적인 세포 독성 반응을 유도시킬 수 있었다(도 8 참조). 이 경우, 항원 펩티드가 적재된 단핵구 백신과 비교하여 세포 독성 반응이 더 낮게 측정되었지만 실제 항암 효과 측면에서는 항원 펩티드가 적재된 단핵구 백신에 비해 생존기간을 연장하는 능력이 더 뛰어났으므로 아데노바이러스 백신이 세포 독성 T 세포 반응 이외의 면역 반응을 추가로 생성시킬 수 있다는 것을 유추해 볼 수 있었다. 이에 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 단핵구 백신이 세포성 면역 반응 뿐만 아니라 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는지 알아보고자, 상기 단핵구 백신의 투여가 Her-2/neu 특이적인 항체를 생성시킬 수 있는지 살펴본 결과, 2 × 10⁶개의 세포를 투여한 군의 항체 생성이 가장 높게 나타났고, 1 × 10⁶또는 5 × 10⁵개의 세포를 투여한 군에서도 유의하게 항체 생성이 관찰 되었다(도 12 참조). 그러나 2.5 × 10⁵개의 세포 이하로 투여한 군에서는 항체 생성이 관찰되지 않았다. 또한, 상기 항원 펩티드를 오브알브민 항원으로 대체하여 동일한 방법으로 IMC 백신을 제조하고 C57BL/6 마우스를 대상으로 세포 독성을 확인한 결과 오브알브민 항원에 대해서도 효과적인 세포 독성 반응을 나타낼 수 있음을 확인하였고, 이를 통해 IMC 백신에 의한 효과적인 면역 반응이 특정 항원에 국한된 것이 아니라 다양한 항원에 대해서도 적용될 수 있음을 알 수 있었다(도 13 참조).

마우스에 이식암(transplantable tumors) 또는 만성 염증(chronic inflammation)이 생성될 경우 암과 비장 등에서 미분화 골수성세포(Immature Myeloid Cells; IMC)가 현저히 증가하고, 또한 실제 암환자의 말초혈액에서도 IMC의 증가가 관찰된다. 이런 IMC는 다양한 분화 단계의 골수성 세포의 전구체로서, 과립구, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 등을 포함하며 아르기나아제 I, 산화질소, 활성산소종, TGF-ß 등의 작용을 통해 암 항원 특이적 혹은 비특이적인 T 림프구 기능을 억제함으로써 암의 증식을 더욱 악화시키는 것이 잘 알려져 있다. 또한 암세포를 이식한 마우스에서 증식하여 존재하는 IMC는 표면에 Gr-1과 CD11b를 동시에 발현한다고 알려져 있으며 단핵구와 유사한 성격의 세포를 높은 비율로 포함한다. 이에 본 발명자들은 단핵구 백신과 유사한 방법으로 IMC를 사용하여 세포 백신으로 제작하였을 때 항암 효과를 나타낼 수 있는지 확인해 보았다. 본 발명자들은 HER-2/CT26 암세포를 이식한 마우스의 비장으로부터 비장세포를 얻고 B세포 및 수지상세포를 제거한 후, αGalCer를 적재한 다음 CD11b를 발현하는 세포를 분리하여 항원 펩티드를 적재한 IMC 백신을 제조하였다. 상기 방법으로 제작된 백신의 경우 배양하는 과정에서 자연 살해 T 세포가 IMC와 함께 존재하므로, 자연살해 T 세포가 αGalCer를 적재한 IMC 표면의 CD1d를 인식하여 배양액 중에서 활성화시켜 더욱 효과적인 백신으로 작용할 수 있게 한다는 장점을 갖게 된다. 상기 백신의 항암 효과를 HER-2/CT26을 이용하여 확인한 결과, 유의한 항암효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 3 참조). 또한 상기 백신이 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구를 활성화시켜 세포 독성 면역 반응을 유도할 수 있는지 알아보기 위해 생체 내 세포 독성 시험(in vivo CTL assay)을 실시한 결과, 현저히 높은 수준의 세포 독성 반응을 나타내었다(도 9 참조). 이는 IMC 백신이 효과적으로 항원 특이적인 세포 독성 반응을 유도시켜 암세포를 파괴함으로써 유의하게 항암 효과를 나타낼 수 있었음을 의미한다.

또한, 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입되고 αGalCer이 적재된 IMC 백신을 제조하여 그 항암효과를 확인한 결과, 상기 IMC 백신을 투여한 경우 생존기간이 현저히 연장되어 실제 암세포에 대해 뛰어난 항암효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다(도 4 참조). 상기 IMC 백신은 NK 세포(도 5a 참조) 또는 CD8+ 세포(도 5b 참조)가 제거된 동물군에서는 상기 IMC 백신의 항암 치료 효과가 유의 적으로 낮아져서 상기 두 세포가 IMC 백신의 항암 치료에 중요한 역할을 수행하는 면역 세포임을 알 수 있었고, 반대로 CD4+ 세포가 제거된 동물군에서는 상기 IMC 백신의 항암 치료 효과가 제거되지 않은 군과 별 차이가 없는 것을 토대로(도 5b 참조), 상기 IMC 백신이 CD4+ T세포가 없는 경우에도 면역 반응을 유도하므로 CD4+T 세포의 수가 현저하게 감소되어 면역 결핍이 나타나는 HIV 환자를 면역화하는데도 이용될 수 있음을 예상할 수 있었다. 또한 상기 백신이 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구를 활성화시켜 세포 독성 면역 반응을 유도할 수 있는지 알아보기 위해 생체 내 세포 독성 시험(in vivo CTL assay)을 실시한 결과, 높은 수준의 세포 독성 반응을 나타내었다(도 10 참조). 펩티드로 적재한 IMC 백신을 이용한 결과와 비교하였을 때 그 수치가 높지는 않지만, 펩티드 백신의 경우 세포 독성 세포의 항원결정기 펩티드만을 적재한 반면 전체 항원을 갖는 바이러스로 형질 도입한 경우는 항원결정기만을 특이적으로 발현시킨 것이 아니고 형질 도입 효율이 완벽하지 않기 때문에 상대적으로 특정 항원 펩티드 특이적인 세포 독성 반응이 낮게 측정될 수 있다. 그러나 항원 펩티드 이외의 면역 반응을 동시에 유도할 수 있다는 장점이 있으며, 상기 백신 8 × 10⁶개의 세포로 면역화한 경우에서 90%에 가까운 효과적인 세포 독성 반응이 나타내는 결과는 바이러스로 형질 도입된 IMC 백신으로 효과적인 세포 독성 반응을 유도할 수 있음을 보여주었다(도 11 참조).

본 발명은 자연 살해 T 세포의 리간드와 항원을 적재한 단핵구 또는 IMC를 포함하는 면역 치료 및 예방용 백신을 제공한다.

상기 자연 살해 T 세포의 리간드는 스핑고모나스 속(Sphingomonas spp.) 기원의 알파-갈락투로노실세라마이드(alpha-galacturonosylceramide, GSL-1')와 알파-글루쿠로노실세라마이드(alpha-glucuronosylceramide GSL-1; Mattner J et al ., Nature 434:525, 2005; Kinjo Y et al ., Nature 434:520, 2005), GSL-4(Eur J Immunol 35:1692, 2005), M. 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 유래의 포스파티딜이노시톨테트라만노사이드(phosphatidylinositoltetramannoside; Fischer K et al ., PNAS 101:10685, 2004), 자가 항원인 이소글로보트리헥소실세라마이드(isoglobotrihexosylceramide, Zhou D et al ., Science 306:1786, 2004)와 갱글리오사이드 GD3(ganglioside GD3, Wu DY et al ., J Exp Med 198:173, 2003), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, J Immunol 175:977, 2005), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)과 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol, Immunity 12:211), 설파타이드(sulfitide, J Exp Med 199:947, 2004), 베타-갈락토실세라마이드(beta-galactosylceramide, β-GalCer, Ortaldo JR et al ., J Immunol 172:943), Leishmania 표면 당결합 리포포스포글리칸(lipophosphoglycan)과 글리코이노시톨 포스포리피드(glycoinositol phospholipids, J Exp Med 200:895, 2004), 알파-갈락토실세라마이드의 유사체인 베타-아노머 갈락토실세라마이드들(beta-anomeric GalCer)과 알파-아노머 갈락토실세라마이드들(alpha-anomeric GalCer; J Immunol 173:3693, 2004), 알파-갈락토실세라마이드의 변이체(Nature 413:531, 2001; Angew Chem Int Ed Engl 43:3818, 2004; J Am Chem Soc 126:13602, 2004; PNAS 102:1351, 2004; PNAS 102:3383, 2005; J Am Chem Soc 128:9022, 2006; J Immunol Methods 312:34, 2006; J Med Chem 50:585, 2007; PNAS 104:10299, 2007) 및 박테리아 지질 항원, 예를 들어 노카디아 팔시니카(Nocardia falcinica) 유래의 글루코스 모노마이콜레이트(glucose monomycolate, Moody DB et al ., J Exp Med 192:965, 2000)를 포함한다.

상기 항원은 백신으로 사용되어 면역반응을 일으킬 수 있는 항원은 모두 사용 가능하며, 병원균(pathogenic bacteria), 바이러스 및 기생충을 포함하는 병원체(pathogen) 유래의 항원 또는 암 항원을 포함하고, 상기 항원의 전장 또는 단편일 수 있다. 상기 병원균 유래의 항원은 백일해균(Bordetella pertussis) 항원(pertussis toxin, filamentous haemagglutinin, pertactin), 파상풍균 항원(tetanus toxoid), 디프테리아균(diphtheria) 항원(diphtheria toxoid), 헬리코박터파이로리(Helicobacterpylori) 항원(capsula polysaccharides of serogrup A, B, C, Y 및 W-135), 폐렴균(pneumococcal) 항원(Streptococcus pnemoniae type 3 capsular polysaccharide), 결핵균(tuberculosis) 항원, 콜레라(cholera) 항원(cholera toxin B subunit), 포도상구균(staphylococcal) 항원(staphylococcal enterotoxin B), 적리균(shigella) 항원(shigella polysaccharides), 보렐리아(Borrelia sp.) 항원, 칸디다(Candida albicans) 항원 및 플라스모디움(Plasmodium) 항원을 포함하며, 상기 바이러스 유래의 항원은 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 항원(haemagglutinin 및 neuraminidase 항원), 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus, HPV) 항원(glycoprotein), 소수포성 입안염 바이러스(vesicular stomatitis virus) 항원(vesicular stomatitis virus glycoprotein), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 항원, 간염(hepatitis)바이러스 항원(hepatitis A(HAV), B(HBV), C(HCV), D(HDV) 및 G(HGV) 항원)(core antigen and surface antigen), 호흡기 다핵체 바이러스(respiratory synctytial virus, RSV) 항원, 허피스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 항원(GP-120, GP-160, p18, Tat, Gag, Pol, Env) 및 그의 조합을 포함한다. 아울러, 암 항원은 Her-2/neu에 의해 발현되는 유방암 단백질, Proteinase 3, WT-1, 뮤리노글로브린(MUC-1), PAP, PSA, PSMA, G250, 멜라노마 항원 유전자(MAGE, melanoma antigen gene), BAGE, GAGE, NY-ESO-1, 티로시나제(tyrosinase), 티로시나제-관련 단백질-1(TRP-1), TRP-2, gp100, MART-1, MCIR, Ig Idiotype, CDK4, caspase-8, β-catenin, CIA, BCR/ABL, 인간 유두종 바이러스(HPV E6/E7), EBV LMP2a, HCV, HHV-8, 5T4, 암 배아항원(carcinoembryonic antigen; CEA), p53 및 알파-페토프로테인(α-fetoprotein)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 항원은 펩티드, 지질다당류, 다당류, 당단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 형태를 갖음으로써 단핵구 또는 IMC에 직접 적재될 수 있으며, 재조합 바이러스에 의해 단핵구 또는 IMC에 형질 도입되어 발현되어 적재될 수 있다. 펩티드를 적재한 세포 백신에 반해 바이러스를 매개로 하여 전체 항원을 도입한 세포 백신은 주조직 적합성 복합체의 일배체형에 국한되지 않고 모든 사람에 적용 가능하며, 여러 항원결정기에 특이적인 면역반응을 유도할 수 있으며, 특히 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응을 동시에 유도할 수 있다는 장점이 있다.

상기에서 항원 발현을 위해 단핵구 또는 IMC에 도입되는 바이러스는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스(Pox virus), 신드비스(Sindbis virus) 등이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 바이러스를 이용한 방법 외에도 항원 유전자 전달로 적용 가능한 것은 1) DNA를 리포좀(liposome)에 결합시켜 형질도입하여 효소 분해로부터 DNA를 보호하거나 엔도솜(endosome)으로 흡수하도록 하는 방법, 2) DNA에 단백질로 구성된 분자 콘쥬게이트(molecular conjugate)나 합성 리간드를 결합하여 세포로 DNA를 전달 효율을 높이는 방법[예: 아시알로글리코프로테인(Asialoglycoprotein), 트랜스페린(transferrin), 폴리머 IgA(polymeric IgA)], 3) PTD(Protein transduction domain)을 이용한 새로운 DNA 전달 시스템으로 세포로 DNA의 전달 효율을 높임으로써 항원 유전자를 전달하는 방법[예: Mph-1], 4) 상기 방법 외에도 펩티드를 사용하거나 항원 단백질을 단핵구 또는 IMC에 적용함으로써 단핵구 또는 IMC가 항원을 제시하도록 할 수 있다.

본 발명의 백신은 자연 살해 T 세포의 리간드와 단핵구 또는 IMC에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 상기 백신은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제 성분을 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형 등으로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근 판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 백신은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 자연 살해 T 세포의 리간드를 적재한 단핵구 또는 IMC, 자연 살해 T 세포의 리간드와 펩티드를 적재한 단핵구 또는 IMC 또는 암 항원을 발현하는 바이러스로 감염된 단핵구 또는 IMC는 안정제 또는 완충제와 함께 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다.

본 발명의 백신은 투여 경로에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 백신은 주사용도에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액의 형태로 제조될 수 있거나, 또는 동결-건조 기술을 이용하여 냉동건조된 형태로 제조될 수 있다. 냉동건조된 백신은 전형적으로 약 4 ℃에서 유지되며, 보조제를 함유하거나 함유하지 않은 안정화 용액, 예를 들면, 식염수 또는/및 HEPES에 의해 복원될 수 있다.

본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 투여될 백신의 양에 영향을 미치는 인자들로는, 이에 한정되는 것은 아니지만 투여 방식, 투여 빈도, 치료가 진행 중인 특정 질병, 질병의 심각성, 질병의 병력, 개체가 다른 치료제와 함께 협력 치료법이 진행중인 지의 여부, 및 치료가 진행중인 개체의 연령, 키, 체중, 건강, 및 신체 조건을 포함한다. 일반적으로 치료가 진행중인 환자의 체중이 증가할수록 이 제제를 더 많은 양으로 투약하는 것이 바람직하다.

백신은 환자에게서 면역반응을 자극하기에 효과적인 양으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 백신은 인간에게 일 회 내지 수회로 투여될 수 있고, 투여량은 세포 수가 1×10³개/kg ~ 1×10⁹/kg 개, 바람직하게는 1×10⁴개/kg ~ 1×10⁸ 개/kg 이다. 알파-갈락토실세라마이드를 적재한 단핵구 또는 IMC 백신을 제작하는 경우, 단핵구 또는 IMC 1×10⁶ ~ 1×10⁷ 개/㎖ 당 알파-갈락토실세라마이드 1~2 ㎍/㎖가 든 배지를 사용하여 배양한다. 알파-갈락토실세라마이드와 펩티드를 적재한 단핵구 또는 IMC 백신을 제작하는 경우, 단핵구 또는 IMC 세포 1×10⁶ ~ 1×10⁷ 개/㎖ 당 알파-갈락토실세라마이드 1~2 ㎍/㎖가 든 배지를 사용하고, 펩티드는 단핵구 또는 IMC 세포 1×10⁶ ~ 1×10⁷ 개/㎖를 1~10 ㎍/㎖ 펩티드가 포함된 배지에서 배양하여 세포에 적재시킨다.

알파-갈락토실세라마이드는 설치류 및 원숭이에서 독성을 유도하지 않는 것으로 보이고 있다(Nakata et al ., Cancer Res 58:1202-1207, 1998). 2200 ㎍/㎏의 αGalCer가 주입된 마우스에도 부작용은 보고되고 있지 않다(Giaccone et al ., Clin Cancer Res 8:3702, 200). 진행 중인 임상 시험에서도 αGalCer의 전신 투여에 의하여 경미한 두통과 같은 부작용이 일부 보고되었으나(Mie Nieda et al ., Blood 103:383-389, Giaccone et al ., Clin Cancer Res 8:3702, 200) 파라세타몰(paracetamol) 투여에 의해 예방될 수 있었고, 이들 대상에서도 미약한 전신적 부작용이 반드시 나타나는 것은 아니다(Giaccone et al ., Clin Cancer Res 8:3702, 2002).

또한, 본 발명은 알파-갈락토실세라마이드(alpha-galactosylceramide; 이하, αGalCer)가 적재된 단핵구 또는 IMC를 매개로 하는 자연 살해 T 세포 활성화제를 제공한다.

상기에서와 같이, 본 발명의 αGalCer가 적재된 단핵구 또는 IMC는 생체 내에서 불변성 자연살해 T 세포를 활성화하여 결과적으로 항암면역을 유도하였다. 따라서, 본 발명의 αGalCer가 적재된 단핵구 또는 IMC는 기존의 수지상 세포와 마찬가지로 자연 살해 T 세포 활성화제로 이용될 수 있다.

아데노바이러스로 형질 도입된 단핵구 또는 IMC 백신은, 세포성 면역 반응을 유도하기 위해 펩티드를 적재한 단핵구 또는 IMC 백신과는 달리 세포성 면역반응 및 체액성 면역 반응을 동시에 유도할 수 있다는 장점이 있다(도 8, 10 및 도 12 참조).

본 발명이 적용가능한 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 더욱 바람직하게는 인간을 제외한 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.

본 발명의 조성물인 단핵구 또는 IMC가 수지상 세포에 비해 수득이 용이하며, 자연 살해 T 세포의 리간드 특히, 알파-갈락토실세라마이드(αGalCer)와 항원을 적재한 단핵구 또는 IMC의 면역화는 유의한 수준의 세포독성 T 림프구 반응을 유도할 뿐 아니라 악성종양의 예방 및 치료 효과가 있으므로 상기 세포를 포함하는 백신은 암 예방 및 치료제로 이용될 수 있다. 더불어, 본 발명의 백신은 CD4+ T 세포가 없는 경우에도 면역 반응을 유도하므로 CD4+T 세포의 수가 현저하게 감소하여 면역 결핍이 나타나는 HIV 환자를 면역화하는데도 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 αGalCer와 항원 펩티드가 함께 적재된 단핵구 백신의 항암효과를 나타낸 도이다.
도 2는 αGalCer를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 단핵구 백신의 항암 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 αGalCer와 항원 펩티드가 함께 적재된 IMC 백신의 항암효과를 나타낸 도이다.
도 4는 αGalCer를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 IMC 백신의 항암 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 IMC 백신에 의한 항암 효과를 나타내는 면역세포를 확인한 결과를 나타낸 도이다:
a: NK 세포 제거; 및,
b: CD4 또는 CD8 세포 제거.
도 6은 αGalCer와 항원 펩티드가 함께 적재된 단핵구 백신에 의한 항원 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구의 활성을 나타낸 도이다.
도 7은 αGalCer와 항원 펩티드가 함께 적재된 단핵구 백신의 용량별 항원 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구의 활성을 나타낸 도이다.
도 8은 αGalCer를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 단핵구 백신에 의한 항원 특이적인 세포 독성 T 림프구의 활성을 나타낸 도이다.
도 9는 αGalCer와 항원 펩티드가 함께 적재된 IMC 백신의 용량별 항원 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구의 활성을 나타낸 도이다.
도 10은 αGalCer와 항원 펩티드가 함께 적재된 IMC 백신에 의한 항원 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구의 활성을 나타낸 도이다.
도 11은 αGalCer를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 IMC 백신의 용량별 항원 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구의 활성을 나타낸 도이다.
도 12는 αGalCer를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 단핵구 백신에 의해 유도되는 항원 특이적인 항체 반응을 나타낸 도이다.
도 13은 αGalCer와 OT-1 항원 펩티드가 함께 적재된 IMC 백신의 항원 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구의 활성을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 제제예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제제예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 항원과 알파-갈락토실세라마이드( alpha - galactosylceramide ; 이하, αGalCer)가 함께 적재된 단핵구(monocytes) 백신의 항암효과

단핵구는 수지상 세포(dendritic cell, DC) 또는 대식세포(macrophage)로 분화할 수 있는 골수(bone marrow) 유래의 미분화 전구체 세포이다. 본 발명에서는 수지상 세포 또는 대식세포로 분화하기 이전 상태의 단핵구가 자연살해 T 세포에 의해 항원 특이적인 항암효과를 나타낼 수 있는지 확인하였다.

<1-1> α GalCer 와 항원 펩티드가 함께 적재된 단핵구 백신의 항암효과

BALB/c 마우스로부터 단핵구를 분리하였다.

우선, BALB/c 마우스(오리엔트, 한국)의 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)와 비장(spleen)을 적출한 후, 균질화(homogenization)하였고 Ficoll(Sigma, 미국) 밀도 구배를 수행하여 아래로 침전되는 과립구(granulocytes) 및 적혈구(red blood cells; RBC)를 제거하였다. 이에 항-B220 마이크로비드(Miltenyibiotec, 독일) 및 항-CD11c 마이크로비드(Miltenyibiotec, 독일)로 표면에 B220 또는 CD11c를 발현하는 B세포 또는 수지상 세포를 제거한 후, 다시 항-CD11b 마이크로비드(Miltenyibiotec, 독일)를 사용하여 CD11b+ 세포를 얻었다.

상기 방법으로 분리 정제한 단핵구를 알파-갈락토실세라마이드(1.5 ㎍/㎖) 또는 용매(0.5% Tween in PBS)와 함께 이산화탄소 배양기에서 14시간 배양한 후, 세포 독성 T 림프구의 항원결정기(epitope) 펩티드인 Her-2/neu₆₃ _-71(애니젠, 한국) 펩티드 2.5 ㎍/㎖를 1시간 동안 세포 배양액에 넣고 인큐베이션하여 적재하고, 적재되지 않은 펩티드를 씻어내어 단핵구 백신을 제작하였다.

마지막으로, 상기 αGalCer 및/또는 항원 펩티드가 적재된 단핵구 백신의 항암 효과를 특성이 잘 규명되어 있고 세포 독성 T 림프구 항원결정기를 포함하는 암 항원인 Her-2/neu를 발현하는 암세포인 HER-2/CT26(Penichet ML et al ., Lab Anim Sci 49:179-88, 1999)를 이용하여 확인하였다.

우선, 2 × 10⁵ 개의 HER-2/CT26 세포를 BALB/c 마우스에 정맥 주사하여 이식하고 하루 뒤 단핵구/pep(항원 펩티드만 적재한 군), 단핵구/αGC(αGalCer만 적재한 군) 및 단핵구/pep/αGC(항원 펩티드 및 αGalCer을 함께 적재한 군) 백신을 각각 투여한 후 생존기간을 비교해 보았다.

그 결과, 단핵구/pep를 투여한 경우에는 암세포만 정맥주사 한 것(대조군)과 유사한 생존을 보였고, 단핵구/αGC를 투여한 경우에는 생존기간을 조금 연장시켰다. 그러나 단핵구/pep/αGC 백신을 투여한 경우 유의하게 생존기간이 연장되어 실제 암세포에 대해 항암효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다(도 1).

<1-2> α GalCer 를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 단핵구 백신의 항암 효과

실시예 1-1의 방법으로 분리 정제한 단핵구를 Her-2/neu 항원의 세포외 영역 및 세포막 영역(Her-2/neu extracellular domain + transmembrane domain)을 발현하는 유전자를 가진 아데노바이러스(이하, AdHM; (주)바이로메드, 대한민국)를 이용하여 혈청을 첨가하지 않은 배지에서 100 MOI(multiplicity of infection)로 90분 동안 이산화탄소 배양기에서 감염시킨 후, 혈청을 보충하고 αGalCer(1.5 ㎍/㎖) 또는 용매(0.5% Tween in PBS)를 넣어주어 14시간을 추가로 배양하여 백신을 제작하였다.

마지막으로, 상기 αGalCer의 적재 및/또는 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 단핵구 백신의 항암 효과를 실시예 1-1과 동일한 방법으로 HER-2/CT26를 이용하여 확인하였다.

우선, 2 × 10⁵ 개의 HER-2/CT26 세포를 BALB/c 마우스에 정맥 주사하여 이식하고 하루 뒤 단핵구/AdHM(항원 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 군), 단핵구/αGC(αGalCer만 적재한 군) 및 단핵구/AdHM/αGC(항원 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입되고 αGalCer을 함께 적재한 군) 백신을 각각 투여한 후 생존기간을 비교해 보았다.

그 결과, 단핵구/AdHM을 투여한 경우에는 암세포만 정맥주사 한 것(대조군)과 유사한 생존을 보였고, 단핵구/αGC를 투여한 경우에는 생존기간을 조금 연장시켰다. 그러나 단핵구/AdHM/αGC 백신을 투여한 경우 생존기간이 현저히 연장되어 실제 암세포에 대해 뛰어난 항암효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다(도 2).

<실시예 2> 항원과 α GalCer 가 함께 적재된 미분화 골수성세포( Immature Myeloid Cells; 이하, IMC) 백신의 항암효과

<2-1> α GalCer 와 항원 펩티드가 함께 적재된 IMC 백신의 항암효과

BALB/c 마우스로부터 IMC를 분리하였다.

우선, BALB/c 마우스에 HER-2/CT26 세포를 이식하고 약 4주가 지나 암세포의 부피가 1500mm³ 이상으로 성장하였을 때 마우스에서 비장을 적출한 후, 균질화하였다. 이에 항-B220 마이크로비드(Miltenyibiotec, 독일) 및 항-CD11c 마이크로비드(Miltenyibiotec, 독일)로 표면에 B220 또는 CD11c를 발현하는 B세포 또는 수지상 세포를 제거하였다.

상기 방법으로 분리 정제한 IMC를 αGalCer(1.5 ㎍/㎖), 비타민 A(ATRA, all trans-retinoic acid, 20 μM; Sigma, 미국), GM-CSF(granulocyte macrophage colony-stimulating factor, 20 ng/㎖; R&D systmes, 미국) 또는 용매(0.5% Tween in PBS; Sigma, 미국)와 함께 이산화탄소 배양기에서 14시간 배양한 후, 이로부터 항-CD11b 마이크로비드(Miltenyibiotec, 독일)를 이용하여 CD11b+ 세포를 얻었다. 이후, Her-2/neu₆₃ _-71(애니젠, 한국) 펩티드 2.5 ㎍/㎖으로 1시간 동안 적재하여 IMC 백신을 제작하였다.

마지막으로, 상기 αGalCer 또는 항원 펩티드가 적재된 IMC 백신의 항암 효과를 암세포인 HER-2/CT26를 이용하여 확인하였다.

우선, 2 × 10⁵ 개의 HER-2/CT26 세포를 BALB/c 마우스에 정맥 주사하여 이식하고 하루 뒤 IMC/pep(항원 펩티드만 적재한 군), IMC/pep/ATRA(항원 펩티드 및 비타민 A를 함께 적재한 군), IMC/pep/GM-CSF(항원 펩티드 및 GM-CSF를 함께 적재한 군) 및 IMC/pep/αGC(항원 펩티드 및 αGalCer을 함께 적재한 군) 백신을 각각 투여한 후 생존기간을 비교해 보았다.

그 결과, IMC/pep 및 IMC/pep/ATRA를 투여한 경우에는 생존기간을 전혀 연장시키지 못했고, IMC/pep/GM-CSF를 투여한 경우는 어느 정도 생존기간을 연장시켰다. 그러나 IMC/pep/αGC 백신을 투여한 경우 유의하게 생존기간이 연장되어 실제 암세포에 대해 항암효과를 나타내는 것을 알 수 있었다(도 3).

<2-2> α GalCer 를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 IMC 백신의 항암 효과

αGalCer를 적재하고 아데노바이러스로 형질 도입된 IMC 백신을 수득하였다.

실시예 <2-1>의 방법으로 분리 정제한 IMC를 혈청을 첨가하지 않은 배지에서 100 MOI의 AdHM으로 60분 동안 이산화탄소 배양기에서 감염시킨 후, 혈청을 보충하고 5시간을 추가로 배양하여 IMC 백신을 제작하였다.

이어서, 2 × 10⁵ 개의 HER-2/CT26 세포를 BALB/c 마우스에 정맥 주사하여 이식하고 하루 뒤 IMC, IMC/AdHM(항원 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 군), 및 IMC/AdHM/αGC(항원 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입되고 αGalCer을 함께 적재한 군) 백신을 각각 투여한 후 생존기간을 비교해 보았다.

그 결과, IMC/AdHM을 투여한 경우에는 생존기간을 조금 연장했지만, IMC/AdHM/αGC 백신을 투여한 경우 생존기간이 현저히 연장되어 실제 암세포에 대해 뛰어난 항암효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다(도 4).

<실시예 3> IMC 백신에 의한 항암 효과를 나타내는 면역세포 확인

IMC 백신에 의한 항암 효과를 나타내는 면역세포를 확인하였다.

우선, BALB/c 마우스에 HER-2/CT26 암세포를 정맥 주사하기 하루 전부터 4일 간격으로 각각의 면역 세포를 제거하기 위한 항체[항 CD4 제거 항체: GK1.5 hybrodoma(ATCC, 미국), 항 CD8 제거 항체: 2.43 hybridoma(ATCC, 미국), 항 NK 제거 항체(Wako,미국): α-asialoGM1 항체(Wako,미국)]를 복강 주사한 후, 암세포 주입 하루 뒤에 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 제작된 IMC/AdHM/αGC 백신을 정맥 주사하여 마우스의 생존기간을 비교했다.

그 결과, NK 세포를 제거한 군(IMC/AdHM/αGC/a-NK)에서는 암세포만을 주입한 군(대조군)과 유사한 생존율을 보여 NK 세포가 IMC 백신의 항암 치료 효과를 나타내는데 중요한 면역 세포라는 것을 알 수 있었다(도 5a). 또한, CD8+ 세포를 제거한 군(IMC/AdHM/αGC/a-CD8)에서도 면역 세포 제거 없이 IMC 백신을 투여한 군(IMC/AdHM/αGC)에 비해 생존기간이 유의하게 감소하는 경향을 보여 IMC/AdHM/αGC 백신에 의한 항암 효과가 CD8+ T 세포에 의해 매개 됨을 확인하였다(도 5b). 그러나 CD4+ 세포를 제거한 군(IMC/AdHM/αGC/a-CD4)에서는 백신만을 투여해준 군(IMC/AdHM/αGC)과 유사하거나 조금 더 증가한 정도의 생존율을 보여 CD4+ 세포가 항암 효과를 나타내는데 별 영향을 미치지 못하였음을 시사하였다(도 5b).

<실시예 4> 항원과 α GalCer 가 함께 적재된 단핵구 백신에 의한 항원 특이적인 세포 독성 T 림프구의 활성화

단핵구 백신이 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구를 활성화시켜 세포 독성 면역 반응을 유도할 수 있는지 알아보기 위해 생체 내 세포 독성 시험(in vivo CTL assay)을 실시하였다.

<4-1> α GalCer 와 항원 펩티드가 함께 적재된 단핵구 백신에 의한 항원 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구의 활성화

αGalCer와 항원 펩티드가 함께 적재된 단핵구 백신이 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구를 활성화시켜 세포 독성 면역 반응을 유도할 수 있는지 알아보기 위해 생체 내 세포 독성 시험(in vivo CTL assay)을 실시하였다.

구체적으로, BALB/c 마우스를 실시예 <1-1>의 방법으로 수득한 단핵구 단독, 단핵구/pep, 단핵구/pep/αGC로 각각 면역화한 다음, 9일 후에 세포 독성 시험을 진행하였다. 먼저 동종의 면역화되지 않은 마우스의 비장 단일 세포를 동량의 두 군으로 나눈 후, 한 군은 Her-2/neu₆₃ _-71 펩티드(2.5 ㎍/㎖)를 적재한 다음 20 μM의 CFSE(carboxyfluorescein. diacetate succinimidyl ester, Invitrogen, 미국)로 표지하였고(CFSE^high), 다른 군은 펩티드 적재 없이 2.5 μM의 CFSE로 표지하여 대조세포로 하였다(CFSE^low). 상기 두 군의 세포를 동량씩 혼합하여 면역화한 마우스에 투여한 다음, 하루 뒤에 비장 단일 세포를 적출하여 CFSE^high와 CFSE^low 세포집단을 유세포분석기를 통하여 측정하였다. 이때, CFSE^high의 비율이 낮을수록 세포 독성 면역 반응이 높게 나타난 것을 의미한다.

또한, 단핵구/pep/αGC 백신의 세포의 수를 5 × 10⁶, 1 × 10⁶, 2 × 10⁵ 및 4 × 10⁴로 달리하여 면역화한 다음, 9일 후에 CFSE를 이용한 상기 방법과 동일하게 세포 독성 시험을 수행하였다.

그 결과, 단핵구 단독, 단핵구/pep을 투여한 군에서는 세포 독성 반응이 거의 나타나지 않았고, 단핵구/pep/αGC을 투여한 군에서만 높은 정도로 펩티드가 적재된 표적을 파괴하는 능력을 가진 세포 독성 반응을 나타내었다(도 6). 또한, 단핵구/pep/αGC 백신의 세포 수를 달리하여 생체 내 세포 독성 시험을 동일하게 진행한 결과, 1 × 10⁶개의 세포만으로도 효과적인 세포 독성 반응을 유도시킬 수 있음을 알 수 있었다(도 7).

<4-2> α GalCer 를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 단핵구 백신에 의한 항원 특이적인 세포 독성 T 림프구의 활성화

αGalCer를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 단핵구 백신이 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구를 활성화시켜 세포 독성 면역 반응을 유도할 수 있는지 알아보기 위해 생체 내 세포 독성 시험(in vivo CTL assay)을 실시하였다.

구체적으로, BALB/c 마우스에 실시예 <1-2>의 방법으로 수득한 단핵구/AdHM/αGC 백신의 세포의 수를 2 × 10⁶, 1 × 10⁶, 5 × 10⁵ 및 2.5 × 10⁵로 달리하여 면역화한 다음, 10일 후에 실시예 <4-1>의 방법으로 세포 독성 시험을 진행하였다

그 결과, 2 × 10⁶개의 단핵구 백신으로 면역화한 경우에는 효과적으로 세포 독성 반응이 나타났지만, 1 × 10⁶개 이하로 면역화한 경우에는 낮은 정도의 세포 독성 반응이 관찰되었다(도 8). 이 경우, 단핵구/pep/αGC 백신과 비교하여 세포 독성 반응이 더 낮게 측정되었지만 실제 항암 효과 측면에서는 단핵구/pep/aGalCer 백신에 비해 생존기간을 연장하는 능력이 더 뛰어났으므로 아데노바이러스 백신이 세포 독성 T 세포 반응 이외의 면역 반응을 추가로 생성시킬 수 있다는 것을 미루어 유추해 볼 수 있다.

<실시예 5> 항원과 α Galcer 가 함께 적재된 IMC 백신에 의한 항원 특이적인 세포 독성 T 림프구의 활성화

IMC 백신이 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구를 활성화시켜 세포 독성 면역 반응을 유도할 수 있는지 알아보기 위해 생체 내 세포 독성 시험(in vivo CTL assay)을 실시하였다.

<5-1> α GalCer 와 항원 펩티드가 함께 적재된 IMC 백신에 의한 항원 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구의 활성화

구체적으로, BALB/c 마우스를 실시예 <2-1>의 방법으로 수득한 IMC/pep, IMC/pep/αGC, IMC/pep/ATRA, IMC/pep/GM-CSF로 각각 면역화한 다음, 10일 후에 실시예 <4-1>의 방법으로 세포 독성 시험을 진행하였다.

그 결과, IMC/pep 투여군 및 IMC/pep/ATRA 투여군에서는 낮은 정도의 세포 독성이 관찰되었고, IMC/pep/GM-CSF 투여군에서는 이보다 조금 높은 정도의 세포 독성을 나타내었다. 그러나 IMC/pep/αGC 백신을 투여한 군에서는 현저히 높은 수준의 체내 세포 독성을 유도시킴을 확인할 수 있었다(도 9). 이는 IMC/pep/αGC 백신이 효과적으로 항원 특이적인 세포 독성 반응을 유도시켜 암세포를 파괴함으로써 실시예 <2-1>에서와 같이 유의하게 항암 효과를 나타낼 수 있었음을 의미한다.

<5-2> α GalCer 를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 IMC 백신에 의한 항원 특이적인 세포 독성 T 림프구의 활성화

αGalCer를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 IMC 백신이 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구를 활성화시켜 세포 독성 면역 반응을 유도할 수 있는지 알아보기 위해 생체 내 세포 독성 시험(in vivo CTL assay)을 실시하였다.

구체적으로, BALB/c 마우스에 실시예 <2-2>의 방법으로 수득한 IMC, IMC/AdHM, IMC/αGC, IMC/AdHM/αGC로 각각 면역화한 다음, 10일 후에 실시예 <4-1>의 방법으로 세포 독성 시험을 진행하였다.

또한, IMC/AdHM/αGC 백신의 세포의 수를 8 × 10⁶, 2 × 10⁶, 5 × 10⁵ 및 1.25 × 10⁵로 달리하여 면역화한 다음, 10일 후에 실시예 <4-1>의 방법으로 세포 독성 시험을 진행하였다.

그 결과, IMC 단독, IMC/αGC를 투여한 군에 비해 IMC/AdHM을 투여하였을 때 세포 독성 반응이 유의하게 증가하였고 IMC/AdHM/αGC을 투여한 군에서 더욱 증가하여 나타났다(도 10). 실시예 <5-1>의 펩티드 백신을 이용한 결과와 비교하였을 때 그 수치가 높지는 않지만, 펩티드 백신의 경우 세포 독성 세포의 항원결정기 펩티드만을 적재한 반면, 전체 항원을 갖는 바이러스로 형질 도입한 세포 백신의 경우 항원결정기만을 특이적으로 발현시킨 것이 아니고, 형질 도입 효율이 완벽하지 않기 때문에 상대적으로 특정 항원 펩티드 특이적인 세포 독성 반응이 낮게 측정될 수 있다.

또한, IMC/AdHM/αGC 백신의 세포 수를 달리하여 생체 내 세포 독성 시험을 동일하게 진행한 결과, 8 × 10⁶개의 세포로 면역화한 경우에서 90%에 가까운 세포 독성 반응이 나타내어 IMC/AdHM/αGC이 효과적으로 항원 특이적인 세포 독성 반응을 유도함을 확인할 수 있었다(도 11).

<실시예 6> α GalCer 를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 단핵구 백신에 의해 유도되는 항원 특이적인 항체 반응

항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 단핵구 백신이 세포성 면역 반응 뿐만 아니라 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는지 알아보고자, AdHM으로 형질도입된 단핵구 백신의 투여가 Her-2/neu 특이적인 항체를 생성시킬 수 있는지 살펴보았다.

구체적으로, 실시예 <1-2>의 방법으로 수득한 단핵구/AdHM/αGC 백신을 세포 수를 달리하여 BALB/c 마우스에 정맥 투여하였다. 아무 처리도 하지 않은 동종의 마우스 혈청을 대조군으로 하였다. 10일 뒤, 안와채혈로 각각의 마우스에서 혈액을 추출하여 상온에서 2시간 방치한 다음 8000 rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 중의 항-Her-2/neu 항체의 생성 정도를 알아보기 위해 Her-2/neu를 세포 표면에 발현하는 마우스 암세포인 HER-2/CT26 세포와 4℃에서 60분간 배양하였다. 여기에 FITC로 표지 된 마우스 항체에 결합하는 2차 항체를 사용하여 HER-2/CT26 세포에 결합한 마우스 항체의 결합 정도를 유세포 분석을 통해 확인하였다.

그 결과, 2 × 10⁶개의 세포를 투여한 군의 항체 생성이 가장 높게 나타났고, 1 × 10⁶또는 5 × 10⁵개의 세포를 투여한 군에서도 유의하게 항체 생성이 관찰 되었다(도 12). 그러나, 2.5 × 10⁵개의 세포 이하로 투여한 군에서는 항체 생성이 관찰되지 않았다.

<실시예 7> α GalCer 와 오브알브민 ( ovalbumin ) 펩티드가 함께 적재된 IMC 백신에 의한 항원 펩티드 특이적인 세포 독성 T 림프구의 활성화

IMC 백신의 투여가 앞서 확인한 Her-2/neu 항원 이외의 다른 다양한 항원에 대해서도 특이적인 세포 독성 T 림프구를 활성화시켜 세포 독성 면역 반응을 유도할 수 있는지 알아보기 위해 αGalCer와 일반적으로 모델항원으로 널리 사용되고 있는 오브알브민(ovalbumine)의 OT-1 펩티드(H-2K^b-presented ovalbumin 257-264 aa peptide, 서열번호 1 SIINFEKL)가 함께 적재된 IMC 백신에 대하여 생체 내 세포 독성 시험(in vivo CTL assay)을 실시하였다.

우선, C57BL/6 마우스(오리엔트, 한국)에 뮤린 흉선종 세포주(murine thymoma cell line)인 EL4 세포(ATCC, 미국)를 이식하고 약 4주가 지나 암세포의 부피가 1500 ㎣ 이상으로 성장하였을 때 마우스에서 비장을 적출한 후 균질화 하였고, 항-B220 마이크로비드(Miltenyibiotec, 독일)로 표면에 B220를 발현하는 B세포를 제거하였다.

상기 방법으로 분리 정제한 IMC를 αGalCer(1.5 ㎍/㎖) 또는 용매(0.5% Tween in PBS)와 함께 이산화탄소 배양기에서 14시간 배양한 후, 이로부터 항-CD11b 마이크로비드(Miltenyibiotec, 독일)를 이용하여 CD11b+ 세포를 얻었다. 이후, OT-1 펩티드 2 ㎍/㎖으로 1시간 동안 적재하여 IMC 백신을 제작하였다.

구체적으로, C57BL/6 마우스에서 상기 방법으로 수득한 IMC/pep 또는 IMC/pep/αGalCer로 각각 면역화한 다음, 10일 후에 세포 독성 시험을 진행하였다. 먼저 동종의 면역화되지 않은 마우스의 비장 단일 세포를 동량의 두 군으로 나눈 후, 한 군은 OT-1 펩티드(2 ㎍/㎖; 애니젠, 한국)를 적재한 다음 20 μM의 CFSE(carboxyfluorescein. diacetate succinimidyl ester, invitrogen, 미국)로 표지하였고(CFSE^high), 다른 군은 펩티드 적재 없이 2.5 μM의 CFSE로 표지하여 대조세포로 하였다(CFSE^low). 상기 두 군의 세포를 동량씩 혼합하여 면역화한 마우스에 투여한 다음, 하루 뒤에 비장 단일 세포를 적출하여 CFSE^high와 CFSE^low 세포집단을 유세포 분석기를 통하여 측정하였다.

그 결과, 도 13에서 나타난 바와 같이 IMC/pep를 투여한 경우에는 아무것도 투여하지 않은 마우스에서와 유사하게 세포 독성 반응을 거의 유도시키지 못한 반면, IMC/pep/αGalCer로 면역화한 경우에는 거의 100%에 가까운 높은 수준의 세포 독성 반응을 유도시킴을 확인하였다. 즉, IMC/pep/αGalCer의 투여가 IMC에 항원 펩티드만을 적재한 것(IMC/pep)에 비해 Her-2/neu 항원뿐만 아니라 이종의 항원인 오브알브민 항원에 대해서도 효과적인 세포 독성 반응을 나타낼 수 있음을 확인하였고, 이를 통해 IMC 백신에 의한 효과적인 면역 반응이 특정 항원에 국한된 것이 아니라 다양한 항원에 대해서도 적용될 수 있음을 알 수 있었다.

< 제제예 1> 단핵구/ AdHM /α GC 백신을 유효성분으로 포함하는 주사액제의 제조방법

본 발명의 항암용 백신의 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

알파-갈락토실세라마이드 1~2 ㎍/㎖, 단핵구/AdHM/αGC 백신 5 × 10⁶ 개/㎖, 펩티드 1~2 ㎍/㎖, 5‘-클로로-3,2’-디하이드록시찰콘 또는 5‘-클로로-2,3’-디하이드록시찰콘 염산염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 상기 용액을 병에 넣고 20℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

< 제제예 2> IMC / AdHM /α GC 백신을 유효성분으로 포함하는 주사액제의 제조방법

알파-갈락토실세라마이드 1~2 ㎍/㎖, IMC/AdHM/αGC 백신 8 × 10⁶ 개/㎖, 펩티드 1~2 ㎍/㎖, 5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘 또는 5'-클로로-2,3'-디하이드록시찰콘 염산염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 상기 용액을 병에 넣고 20℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

<110> Seoul national university industry foundation <120> Monocyte- or immature myeloid cells(IMC)- based vaccine loaded with the ligand of natural killer T cell and antigen <130> 10P-10-23 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-2Kb-presented ovalbumin 257-264 aa peptide <400> 1 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5

Claims

CD1d 분자에 자연 살해 T 세포의 리간드가 적재되고 MHC 분자에 항원이 적재된 단핵구(monocyte)를 포함하는 면역 치료 및 예방용 백신.
제 1항에 있어서, 자연 살해 T 세포의 리간드는 알파-갈락토실세라마이드, 알파-글루쿠로노실세라마이드, 포스파티딜이노시톨테트라만노사이드, 이소글로보트리헥소실세라마이드, 갱글리오사이드 GD3, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 설파타이드, 베타-갈락토실세라마이드, 리포포스포글리칸, 글리코이노시톨 포스포리피드, 알파-갈락토실세라마이드의 유사체인 베타-아노머 갈락토실세라마이드 및 알파-아노머 갈락토실세라마이드, 박테리아 지질 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 치료 및 예방용 백신.
제 1항에 있어서, 상기 항원은 병원균(pathogenic bacteria), 바이러스 및 기생충을 포함하는 병원체(pathogen) 유래의 항원 또는 암 항원인 것을 특징으로 하는 면역 치료 및 예방용 백신.
제 3항에 있어서, 병원균 유래의 항원은 백일해균(Bordetella pertussis) 항원(pertussis toxin, filamentous haemagglutinin, pertactin), 파상풍균 항원(tetanus toxoid), 디프테리아균(diphtheria) 항원(diphtheria toxoid), 헬리코박터파이로리(Helicobacterpylori) 항원(capsula polysaccharides of serogrup A, B, C, Y 및 W-135), 폐렴균(pneumococcal) 항원(Streptococcus pnemoniae type 3 capsular polysaccharide), 결핵균(tuberculosis) 항원, 콜레라(cholera) 항원(cholera toxin B subunit), 포도상구균(staphylococcal) 항원(staphylococcal enterotoxin B), 적리균(shigella) 항원(shigella polysaccharides), 보렐리아(Borrelia sp.) 항원, 칸디다(Candida albicans) 항원 및 플라스모디움(Plasmodium) 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 치료 및 예방용 백신.
제 3항에 있어서, 바이러스 유래의 항원은 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 항원(haemagglutinin 및 neuraminidase 항원), 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus, HPV) 항원(glycoprotein), 소수포성 입안염 바이러스(vesicular stomatitis virus) 항원(vesicular stomatitis virus glycoprotein), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 항원, 간염(hepatitis)바이러스 항원(hepatitis A(HAV), B(HBV), C(HCV), D(HDV) 및 G(HGV) 항원)(core antigen and surface antigen), 호흡기 다핵체 바이러스(respiratory synctytial virus, RSV) 항원, 허피스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 항원(GP-120, GP-160, p18, Tat, Gag, Pol, Env) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 치료 및 예방용 백신.
제 3항에 있어서, 암항원은 Her-2/neu에 의해 발현되는 유방암 단백질, Proteinase 3, WT-1, 뮤리노글로브린(MUC-1), PAP, PSA, PSMA, G250, 멜라노마 항원 유전자(MAGE, melanoma antigen gene), BAGE, GAGE, NY-ESO-1, 티로시나제(tyrosinase), 티로시나제-관련 단백질-1(TRP-1), TRP-2, gp100, MART-1, MCIR, Ig Idiotype, CDK4, caspase-8, β-catenin, CIA, BCR/ABL, 인간 유두종 바이러스(HPV E6/E7), EBV LMP2a, HCV, HHV-8, 5T4, 암 배아항원(CEA: carcinoembryonic antigen), p53 및 알파-페토프로테인(α-fetoprotein)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 치료 및 예방용 백신.
제 1항에 있어서, 상기 항원은 재조합 바이러스에 의해 도입되어 발현되는 것을 특징으로 하는 면역 치료 및 예방용 백신.
제 7항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 항원을 발현하는 유전자가 도입된 아데노바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스, 신드비스 바이러스(Sindbis virus)인 것을 특징으로 하는 면역 치료 및 예방용 백신.
CD1d 분자에 알파-갈락토실세라마이드가 적재되고 MHC 분자에 항원이 적재된 단핵구를 포함하는 항암제.