KR20100110947A - 발암물질에 대한 바이오마커로서 ｅｂｐ50 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 발암 물질을 검출하는 방법: (a) EBP50(Ezrin-radixin-moesin-binding phosphoprotein 50) 유전자를 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 세포에서 EBP50 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 상기 단백질의 발현이 증가하면 발암 물질로 판정한다; 그리고, 발암 물질 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명에서 발굴된 EBP50 바이오마커는 발암물질에 대하여 매우 우수한 지표효율성을 나타낸다. 본 발명은 특정 물질의 발암 가능성을 보다 개선된 정확도로 판정하는 데 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 신약 개발 과정 중 안전성 평가에 이용될 수 있다.

EBP50, 발암, 마커, 유전독성

Description

발암물질에 대한 바이오마커로서 ＥＢＰ50{EBP50 Serving as Biomarkers for Carcinogens}

본 발명은 발암 물질을 검출하는 방법 및 발암 물질 검출용 키트에 관한 것이다.

유전체 및 단백질체 연구는 2000년 게놈프로젝트 완성 이후 발전하기 시작했다. 미국은 유전체 및 단백질체 연구를 독성 연구에 활용하기 위해 National Center for Toxicogenomics를 2000년 9월에 창립하여 마이크로어레이 기술을 활용한 유전체 연구 및 단백질체 연구를 수행하고 있다. 유전체 및 단백질체 연구는 거의 모든 질병 연구에도 적용되고 있으며, 우리나라에서도 활발히 연구되고 있다. 그러나 일반 질병에 대한 유전체 및 단백질체 연구는 선진국의 연구비 투자 규모 및 연구자의 수 등에 비해 매우 열세인 상태이다. 우리나라의 단백질체 관련 연구 활동은 전세계적인 추세에 맞추어 2000년대 초반부터 이루어져 기술은 어느 정도 수준에 달하였으나 독성 유전체, 독성 단백질체 독성 예측, 독성 정보 분야는 외국에 비하여 큰 격차를 보이고 있다. 이러한 문제점을 개선하기 위하여 2003년 11월에 “유전체 및 단백질체 환경독성센터”가 개설되었으며, 2004년 11월 “대한 독성 유전단백질체 학회”가 창립되어 독성 등을 평가하는 국제 수준의 안전성 평가 시스템의 확립에 있어서도 제도적인 경쟁력이 강화되고 있다.

최근에 여러 제약회사에서 신약 개발 연구를 위해 ADME/Tox(Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, Toxicity)에 관련된 연구를 진행하고 있으며, 단백질체학을 이용한 ADME/Tox 예측은 비용 절감에 크게 기여할 것으로 사료되고 있다. 이미 2004년 12월부터 일본 산업 기술 종합 연구소에서는 1만 종이 배열된 단백질 칩을 개발하여 알레르기 진단 등 약제 독성 및 안전성 평가 등에 활용하고 있다. 동물 실험과 달리 인간을 대상으로 독성 영향을 평가하는 경우에는 독성물질 노출에 대한 평가가 매우 중요하다. 노출 평가 연구는 바이오마커 및 유전적 다양성 연구 등을 중심으로 발전하고 있으며 노출 평가 전문가의 중요성이 더욱 증대되고 있다. 특히 인간은 다양한 생활 습관이 독성 노출 및 건강 영향에 모두 영향을 주고 있기 때문에 다양한 생활 습관에 대한 정량적인 평가도 필요하다.

분자 생물학의 발전에 힘입어, 유전체, 단백질체 연구는 세계적인 추세이며, 이를 독성학에 응용한 독성 유전체학 및 독성 단백질체학의 활용성은 기초연구분야뿐만 아니라, 신약 개발, 예방 의학, 식품 안전성, 환경 위해성, 법의학 등 실생활의 여러 분야에서 활용될 수 있는 응용 및 예측 기술로서 주목받고 있다. 국내에서도 유해성 평가, 독성 평가 등에 있어서 독성 유전체학 및 독성 단백질체 연구가 진행되고 있으나, 국제적 기술 진보에 비하여 단백질체학을 활용한 데이터베이스의 구축이 아직 미흡한 실정이다. 인체 위해성 평가와 신약개발 중 안전성 평가에 있어 Omics 기술을 활용한 발암 가능성 예측 프로그램 개발은 인체 위해 가능성이 있는 물질의 발암성 평가에 있어 매우 중요하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 발암물질의 여러 클래스, 예컨대 유전독성/발암물질 및 비유전독성/발암물질에 관계없이 조절되는 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, EBP50이 발암물질 처리에 의해 발현량이 증가되어 발암물질 검출에 대한 지표효율성이 있는 것으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 발암 물질을 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 발암 물질 검출용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 발암 물질을 검출하는 방법을 제공한다:

(a) EBP50 유전자를 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 세포에서 EBP50 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 상기 단백질의 발현이 증가하면 발암 물질로 판정한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 EBP50 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 발암 물질 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 EBP50 단백질에 특이적으로 결 합하는 항체를 포함하는 발암 물질 검출용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 발암물질의 여러 클래스, 예컨대 유전독성/발암물질 및 비유전독성/발암물질에 관계없이 조절되는 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, EBP50이 발암물질 처리에 의해 발현량이 증가되어 발암물질 검출에 대한 지표효율성이 있는 것으로 확인하였다.

EBP50은 ERM(ezrin-radixin-moesin)에 결합하는 모티브를 통해 ERM(ezrin-radixin-moesin) 단백질의 FERM(band four-point one, ezrin-radixin- moesin domain) 부분에 결합할 수 있으며, FERM은 세포 골격 재구성에 관여하는 F-actin에 결합한다. EBP50은 필수적인 막 단백질의 세포 골격에의 연결에 관여하고, 세포 신호에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. EBP50 단백질의 세포 내 축적은 73.5~80%의 유방암 조직에서 이미 발견되었으며, 이것은 EBP50 mRNA의 발현 정도와도 연관성이 크다. 또한 EBP50은 간세포 암에서도 과발현 되어 있는 것으로 알려져 있어 발암 기전과 관련성이 있는 것으로 판단되며, 상기의 내용은 Song et al ., Histopathology 51, 40, 2007 을 참조하였다.

본 발명에 따르면, EBP50 유전자를 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시킨다.

일반적으로, 포유동물 세포는 EBP50 유전자를 포함한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 세포는 1차 배양(primary cultured) 포유동물 세포, 구축된(established) 포유동물 세포 또는 암 세포주이다. 이용될 수 있는 포유동물 세포는, 예컨대 마우스, 래트, 염소, 양, 소, 말, 돼지 또는 인간 세포이다.

또한, 본 발명에서 이용될 수 있는 세포는 EBP50 유전자로 형질전환된 세포를 포함한다.

본 발명에 의해 발암 물질인지 여부가 판정되는 시험물질은 특별하게 제한되지 않으며, 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)을 포함한다. 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입이 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입이 가능하다.

시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션(deconvolution)이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med . Chem . 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew . Chem . Int . Ed . Engl . 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew . Chem. Int . Ed . Engl . 33, 2061; Gallop et al., J. Med . Chem . 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.(개시가 맞습니다. 개시는 영어 "disclosing"을 번역한 것입니다)

시험물질을 세포에 접촉시킨 다음, 이 세포에서 EBP50 유전자(NC_000077.5)의 발현 정도를 측정한다. 만일, 상기 세포에서 유전자의 발현이 증가한 것으로 측정되면 발암 물질로 판정한다.

“EBP50 유전자의 발현 정도가 증가하였다”는 것은, 무처리 세포에서의 상기 유전자의 발현 정도와 비교하여 발현 정도가 증가한 것을 의미한다. 이러한 발현 정도는 당업계에서 통상적으로 실시되는 웨스턴 블롯팅(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 등의 방법에 의해 측정된 발현 정도이다.

보다 상세하게는, 무처리 세포에서의 상기 유전자의 발현 정도와 비교하여 1.5배 이상의 발현 정도를 나타내는 경우, 유의한 발현 증가로 판정하고 시험물질을 발암 물질로 판정한다.

EBP50 유전자의 발현 정도는 당업계의 통상적인 과정에 따라 유전적 분석(genetic assay) 방식 또는 면역분석(immunoassay)으로 측정할 수 있다.

유전적 분석에 기초하여 본 발명을 실시하는 경우, EBP50 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브가 이용된다.

프라이머를 이용하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 EBP50 유전자의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 EBP50 유전자의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 세포에서 EBP50 유전자의 mRNA 양을 조사하여 유전자의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep ., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal . Biochem . 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다.

이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg^{2 +}와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 희망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 필요하다.

증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따 라서 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다.(엄격조건은 stringent conditions를 번역한 것입니다. 특허분야에서 통상적으로 사용되는 용어입니다) 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 명세서에 기술된 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프 라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중개 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 이 시험법을 다양하게 변형하거나 응용한 시험법들이 많이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명에서 증폭 반응에 이용되는 프라이머는 EBP50 유전자의 cDNA 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 본 명세서에서 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머 세트는 주형인 EBP50 cDNA 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 프라이머는 EBP50 cDNA 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 갖는 것이다.

이러한 프라이머의 디자인은 EBP50 유전자의 cDNA 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

이렇게 증폭된 EBP50 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 유전자의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 EBP50 유전자의 발현 정도를 조사한다.

이러한 증폭 반응을 통하여, 세포에서 EBP50 유전자의 발현이 무처리 세포 보다 높게 나오는 경우에는 시험물질을 발암물질로 판정한다.

EBP50 유전자 또는 cDNA에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 간암을 진단할 수 있다. 본 명세서에서 용어 “프로브”는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 이점, 즉 혼성화 특이성의 개선이 손상되지 않는 범위 내에서, 본 발명의 프로브를 변형할 수 있다. 이들 변형된 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, EBP50의 cDNA에 혼성화 되는 프로브는 불용성 담체(예컨대, 니트로셀룰로오스 또는 나일론 필터, 유리판, 실리콘 및 플루오로카본 지지체)에 고정화되어, 마이크로어레이를 제조할 수 있다. 마이크로어레이에 있어서 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용된다. 불용성 담체에로의 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 담체에 결합될 수 있다.

EBP50의 cDNA는 상술한 과정에 의해 얻을 수 있다. 프로브 대신에 EBP50의 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적 합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용하기 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 니트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다.

상술한 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 시험물질이 발암물질인지 여부를 판정할 수 있다. 즉, 시험물질을 처리한 세포에서 EBP50 cDNA에 대한 시그널이 무처리 세포보다 강하게 나오는 경우에는 시험물질을 발암물질로 판정한다.

본 발명은 EBP50 발현 산물, 즉 단백질을 면역분석 방법에 따라 검출하여 발암물질을 검출하는 데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은 웨스턴 블롯팅, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 EBP50 단백질을 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 EBP50 단백질에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트 이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 EBP50 단백질에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 세포 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, EBP50 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질((예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

본 발명을 웨스턴 블롯팅 방식으로 실시하는 경우, 종래 일반적으로 실시되는 방법을 이용할 수 있다(참조: Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 108-121, CRC press). 상기 웨스턴 블롯팅의 예시적인 방법은 (ⅰ) 시험물질이 처리된 세포 시료를 용해하는 단계; (ⅱ) 용해된 세포로부터 단백질을 수득하는 단계; (ⅲ) 수득된 단백질을 SDS 및 2-머르캅토에탄올을 포함하는 용액으로 변성시키는 단계; (ⅳ) 변성된 단백질을 SDS-PAGE하는 단계; (ⅴ) SDS-PAGE가 완료된 젤 상의 변성 단백질을 NC 멤브레인으로 전이하는 단계; (ⅵ) NC 멤브레인상의 단백질과 1차 항체인 EBP50 단백질에 대한 항체를 반응시키는 단계; (ⅶ) 발색반응을 촉매하는 효소가 결합된 1차 항체와의 결합능을 갖 는 2차 항체를 상기 1차 항체와 반응시키는 단계; (ⅷ) 2차 항체에 결합된 효소의 기질을 첨가하여 발색반응을 유도하는 단계; 및 (ⅸ) 발색반응에 의해 전개된 발색의 정도를 측정하는 단계를 포함한다.

웨스턴 블롯팅을 실시한 다음, 발색된 밴드를 갖는 NC 멤브레인을 직접적으로 덴시토미터(densitometor)로 읽거나, 또는 발광 기질을 이용하는 경우(예: 루미놀)에는 필름으로 현상하여 그 필름을 덴시토미터로 읽어 그 차이를 정량화하여 시험물질이 발암물질인지 여부를 판정한다.

상기 면역분석 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 EBP50 단백질의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 EBP50 단백질에 대한 항체는 폴리클로날 항체이다.

EBP50 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 EBP50 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 발암물질을 검출할 수 있다. 즉, 시험물질을 처리한 세포에서 EBP50 단백질에 대한 시그널이 무처리 세포보다 강하게 나오는 경우에는 시험물질을 발암물질로 판정한다.

본 발명의 발암물질 검출용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, RT-PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, 역전사효소, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 인간 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, EBP50은 발암물질에 대하여 매우 우수한 지표효율성을 나타내며, 특히 유전독성/발암성 물질에 대하여 거의 90%의 지표효율성을 나타낸다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명에서 발굴된 EBP50 바이오마커는 발암물질에 대하여 매우 우수한 지표효율성을 나타낸다.

(b) 본 발명은 특정 물질의 발암 가능성을 보다 개선된 정확도로 판정하는 데 이용될 수 있다.

(c) 또한, 본 발명은 신약 개발 과정 중 안전성 평가에 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 방법

시험물질 및 처리 조건

L5178Y 마우스 림포마 세포(한국 세포주 은행)는 10% 말 혈청이 포함된 RPMI 1640(Gibco BRL) 배지에서 5%의 CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하면서 2-3일마다 한 번씩 계대하였다. 2-DE(2-Dimensional Electrophoresis)을 위한 시험물질의 처리 조건은 배양 세포를 플라스크에 1 x 10⁶ cells/ml이 되도록 파종을 한 후, 각 시험물질의 농도로 2시간 처리 후 배지를 교환하여 22시간 배양 후 세포를 회수하는 방식으로 수행하였다. 시험물질의 종류와 사용 농도는 하기 표 1에 기재되어 있다.

2-DE(2- Dimensional Electrophoresis )

시료 완충액 1 ml 당 프로테아제 억제제를 40 ㎕ 넣어주었다. 시료는 약 0.5-1 mg 단백질이 되도록 세포를 준비하고, 시료 완충액을 시료 무게의 약 1-1.5 배 되는 양을 넣었다. 시료가 녹으면 5초 간 소니케이션과 5초 간 휴식을 15번 정도 반복하였고, 시료에 DNase 10 ㎕ 넣어주고, 4℃에서 30분 방치하였다. 시료를 튜브에 옮겨 담은 후, 14000 rpm에서 20분 동안 원심분리한 후, 상등액을 새로운 튜브에 넣었다. 스펙트로포토미터로 단백질을 정량하였다. pH 3-10일 경우 단백질 1 mg을 새로운 튜브에 넣고, 총 부피가 350-400 ㎕가 되도록 나머지를 시료 완충액으로 채웠다.

전기영동시스템인 Multiphor(GE Healthcare) 총 부피의 2% 만큼의 IPG(Immobilized pH gradient) 완충액를 넣고, 상온에서 30분 방치한 다음, 12000rpm에서 10분 동안 원심분리 하였다. 재수화(rehydration)는 다음과 같이 하였다. 수평을 맞춘 트레이 홈에 시료를 넣고, pH 3-10(다른 pH 영역인 경우에도 동일) 건조 스트립을 골고루 적셔준 다음 시료가 마르지 않게 커버 유체(미네랄 오일)를 시료 위에 붓고, 16-20 시간 방치하였다. 각 시료를 비닐 트레이 홈에 옮기고 양끝 쪽에 2.5 cm의 전극 스트립(염 다리)을 올려놓은 후, 세팅 시켜 놓은 Multiphor를 31시간 런닝 하였다(20℃ 유지). 이어, 시료를 젤이 벽에 닿지 않게 유리 튜브에 옮겨 담은 다음 TBP 평형액을 각 시료에 10 ml씩 넣고, 시료가 모두 적셔지도록 눕혀 90-95 rpm에서 25분 동안 쉐이킹 시켰다(환원, 알킬화를 동시에 하는 방법). 세팅 된 젤 판에 시료를 넣고 그 위에 아가로스 임베딩 용액을 부어 굳혔다. 젤 판을 끼우고 1 x SDS 완충액을 상부 완충액으로 500 ml씩 붓고, 2DE를 내렸다. 그런 다음, 젤을 빼내어 고정액을 넣어주고 40 rpm으로 쉐이킹 시킨 다음, 쿠마쉬 염색을 12시간 이상 한 후 증류수로 탈염색 하였다.

아가로스 임베딩 용액

성분	함량
0.5% 아가로스	0.5 g
0.001% 브로모페놀 블루	0.1% 용액 1 ml
1 X 런닝 완충액	100 ml까지

시료 완충액

성분	함량
7M 우레아	21 g 건조 우레아
2M 티오우레아	7.6g
100mM DTE	0.77125g
4.55% CHAPS	2g
0.5% 캐리어 앰포라이트	25ml 또는 62.5ml
40mM Tris	242mg
0.002% 브로모페놀블루 다이	1% 용액 10 ml
물	50 ml까지
1 ml씩 튜브에 분주

TBP 평형액

성분	함량
우레아	36g
SDS	2g
5 x Tris/HCl 젤 완충액	20ml
50% 글라이세롤	40ml
25% 아크릴아미드 액	10ml
총	100ml

이미지 분석

쿠마쉬 염색한 젤을 GS-710 이미징 덴시오미터(Bio-Rad)에서 스캔하여 파일로 변환한 후 이미지 매스터 프라티눔 5(GE Healthcare, USA) 프로그램을 이용하여 이미지 분석을 행하였다. 단백질 스팟을 탐지하여 부피와 %vol을 결정하여 시험물질을 처리한 각각의 젤을 페어링 한 후 데이터 분석을 행하였다.

부피(volume)는 면적과 피크 높이를 고려한 값으로, 스팟 검출에 의해 설정된 스팟 경계의 부정확 가능성을 보정하기 위해 피크에서부터 계산하여 부피의 75%에 해당하는 부분에 대한 부피를 부피라고 정의하였다.

%vol은 특정 젤에 나타난 모든 스팟들의 부피 값의 총합에 대한 특정 스팟의 부피 값의 백분율 환산 값을 나타낸다.

인-젤 절단

젤로부터 스팟을 잘라낸 후, 튜브에 젤 슬라이스를 옮기고 물로 세척하였다. 이어, 50 μl의 50 mM NH₄HCO₃(pH 7.8):아세토니트릴 = 6 : 4을 각 튜브에 넣고 쉐이킹 한 다음, 염색약이 완전히 빠질 때까지 용액을 바꿔가면서 쉐이킹 하고, 진공에서 건조시켰다. 그런 다음, 트립신(12.5 ㎍/㎕ in 50 mM NH₄HCO₃)를 10 ㎕씩 각각의 튜브에 가한 후 얼음에서 45분 간 방치한 후, 트립신 용액을 제거하고, 10 ㎕의 50 mM NH₄HCO₃를 가하고, 37℃에서 12시간 반응시켰다.

절단된 펩타이드의 탈염 및 농축

젤 로딩 팁의 끝부분으로부터 3 mm 정도 되는 지점을 눌러 평평하게 한 후, 팁 끝을 잡고 한번 비틀었다. Poros R2 레진(in 70% 아세토니트릴, Applied Biosystems)을 팁 안에 위로부터 넣고, 1 ml 시린지를 이용하여 로딩 팁에 패킹 하였다(2-3 mm 정도가 되도록). 패킹이 끝나면, 20 ㎕의 2% 포름산을 가한 후 1 ml 시린지를 이용하여 같은 방법으로 흘려주어 레진을 평형화 시켰다. 10 ㎕의 상기 펩타이드 용액에 30 ㎕ 2% 포름산을 첨가하고 흘려주어 레진에 결합시켰다. 이어, 20 ㎕의 2% 포름산으로 세척한 후, 70% 아세토니트릴 용액 내의 0.5 ㎕ matrix(α-사이아노 신남산, 재결정)로 펩타이드를 MALDI 플레이트에 직접 용출하면서 스팟팅 하였다. 스팟팅이 끝난 컬럼은 100% 아세토니트릴과 2% 포름산으로 세척하였다.

MALDI - TOF 및 펩타이드 매스 핑거프린팅

4800 MALDI-TOF/TOF 매스 스펙트로미터(Applied Biosystems)를 이용하여 펩타이드 매스 핑거프린팅(PMF)을 분석하였다. 리플렉션/지연 익스트랙션 모드(reflection/delayed extraction mode)에서 질량 스펙트럼을 구하였다. Data Explorer 3.5(PerSeptive Biosystems)를 사용하여 단동위원소 펩타이드 질량(monoisotopic peptide mass)을 얻었다. MASCOT(www.matrixscience.com) 검색엔진을 이용하여 단백질을 동정하였고, MASCOT 점수가 75점 이상일 경우 95%의 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

웨스턴 블롯팅

1. SDS-PAGE

완충액

완충액	조성
해상 젤 완충액	1.5M Tris-Cl, pH8.8
스태킹 젤 완충액	0.5M Tric-Cl, pH6.8
6X 시료 완충액	0.35M Tris-Cl, pH6.8, 10% SDS, 30% 글라이세롤, 9.3% DTT
10X 런닝 완충액	0.025M Tris-Cl, pH8.3, 0.192M 글라이신, 0.1% SDS

시료 완충액으로 세포를 파쇄하고, 80℃ 이상에서 5분간 가열하였다. 젤을 고정하고 런닝 완충액을 넣은 후 런닝 완충액이 새지 않는지 확인하였다. 이어, 시료를 젤에 로딩하고, 스태킹 젤을 80V에서 내리고, 해상 젤은 120V로 내렸다. 젤을 판에서 떼어내고 스태킹 부분을 제거한 다음, 트랜스퍼에 필요한 완충액을 준비하였다.

완충액

완충액	조성
10X 트랜스퍼 완충액	Tris, 글라이신
트랜스퍼 완충액	10X 트랜스퍼 완충액, 20% MeOH
10X TBS	.0.5M Tris base, 9% NaCl, pH7.6
1X TBS	10X TBS
1% TBSt	10X TBS, Tween 20
블록킹 완충액	3% 스킴 밀크, 1% TBSt

트랜스퍼 완충액에 PVDF 막과 젤을 20분간 담가둔 다음, 트랜스퍼 틀에 고정시켰다. 이어, 240 mA에서 80분간 반응시켰다. 막을 크기에 맞게 잘라 블록킹 완충액에 넣고 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 새로운 블록킹 완충액에 제1차 항체(Abcam Inc.)를 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 다음, 1% TBST로 5분씩 3번 세척하였다. 새로운 블록킹 완충액에 제2차 항체(GE Inc.)를 넣고 상온에서 1시간동안 반응시킨 다음, 1% TBST로 5분씩 3번 세척하였다. 이어, 기질(인핸서 용액:퍼옥사이드 용액 = 1 : 1)을 막 위에 뿌려 반응시킨 다음, 암실에서 필름 촬영을 하였다.

실험 결과

발암물질(1,2-다이브로모메에탄/글라이사이돌/다이에틸 스틸베스테롤/우레탄/메틸 카바메이트/O-나이트로 톨루엔/1,4-다이옥산/테트라클로로에틸렌/다이옥신) 9종에 대하여 시험 물질을 L5178Y 세포에서 회수한 단백질에 대하여 2-DE를 수행하였다(도 1).

시험 물질의 발암성에 대한 생체지표 단백질 후보를 선출하기 위해서 각 시험 물질의 젤들의 스팟들을 이미지 분석을 통하여 정규화(normalization)하고 페어링 하여 각 시험 물질의 같은 단백질에 대하여 스팟 ID를 부여하였으며, %vol(정규화된 vol., 보정된 스팟의 세기) 값을 가지고 상대적 발현 증감을 비교하였다(도 2).

시험 물질에 해당하는 같은 스팟 ID의 %vol. 평균값을 구하여 대조군과 비교하여 상대적으로 2배 이상 발현 정도에 증가 또는 감소 패턴을 보이는 스팟들을 선별하였다.

상기 표에서, C는 발암성 물질을 나타낸다.

스팟 ID 1155는 MALDI-TOF/TOF 매스 스펙트로포토미터를 이용한 펩타이드 매스 핑거프린팅(peptide mass fingerprinting: PMF) 분석 결과, EBP50 (Ezrin-radixin-moesin-binding phosphoprotein 50)으로 동정되었다(도 3). EBP50은 발암물질에서 증가 패턴을 나타내었다.

바이오마커로서의 이용성에는 증가 패턴을 나타내는 것이 감소 패턴보다 검출 면에서 용이하므로 증가 패턴을 보이는 바이오마커 후보 단백질인 EBP50에 대하여 중점적으로 검증을 수행하였다.

위와 같이 선정된 생체지표 후보군 단백질의 발현 변화 검증을 위하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 처리 조건은 2-DE 조건과 동일하게 화합물을 L5178Y 세포에 2시간 처리하였다(도 4, 도 5).

위의 결과를 좀 더 구체적으로 확인하기 위하여, 발암성에 관련된 9 종류 화합물(1,2-다이브로모에탄, 글라이시돌, 다이에틸 스틸베스테롤, 우레탄, 메틸 카바메이트, O-니트로톨루엔, 1,4-다이옥산, 테트라클로로에틸렌, 다이옥신)을 선택하여 2, 12, 24시간 별로 세포(L5178Y)에 처리하였을 때 단백질의 발현 변화를 검증함과 아울러 선별된 지표 단백질의 효율성을 확인하였다(도 6). 이 결과와 전체 20종에 대한 결과를 종합하여 아래 표와 같이 지표 효율성을 검증하였다.

상기 표에서 지표효율성(%)은 다음과 같이 계산 하였다:

증가 패턴: 발현증가율 150% 이상인 시험물질 개수/전체 시험물질 개수 (G/C; 4, NG/C; 5) x 100

2-DE 결과에서 유전독성 및 발암성 관련되는 시험 물질 처리 시 발현 증가 패턴을 보여 선별된 지표 단백질인 EBP50을 대상으로 선정된 9개 발암성 시험 물질을 2시간 처리하였을 때 발현증가율을 측정하였다. EBP50의 경우 발암성에서 높은 지표효율성을 보이므로 일반적인 발암성에의 지표로서 사용될 수 있을 것으로 판단하였다. 따라서 EBP50은 발암성 시험 물질을 선정하는 데에 지표로 사용될 수 있을 것으로 판단된다. 이 결과를 통해 전체 시험 물질에서 검증되었던 생체지표 후보군 단백질에 대한 재현성을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 시험물질 2시간 처리 후의 2-DE 젤 사진이다. 대조군 1, 2는 각각 무처리, DMSO 용매를 나타내고, 발암성 시험물질 9가지는 각각 1,2-다이브로모메에탄, 글라이시돌, 다이에틸 스틸베스테롤, 우레탄, 메틸 카바메이트, O-니트로톨루엔, 1,4-다이옥산, 테트라클로로에틸렌, 다이옥신을 나타낸다.

도 2는 도 1의 2-DE 젤을 이미지 분석한 사진이다. 사진 상에서 초록색은 모든 gel에 있는 점을 나타내며, 빨간색은 특정 젤에만 존재하는 점을 나타낸다. 대조군과 발암성 시험물질의 순서는 도 1과 같다.

도 3은 도 2에서 이미지 분석한 결과 선정된 spot #1155의 부분적인 2-DE 젤 사진이다. 대표적인 시험물질로서 1,2-다이브로모메에탄, 글라이사이돌, 다이에틸 스틸베스테롤의 처리 시에 무처리 대조군과 비교하여 spot #1155가 증가함을 확인할 수 있다.

도 4는 도 2에서 이미지 분석한 결과 선정된 spot #1155에 대해 MALDI-TOF/TOF 매스 스펙트로미터(Applied Biosystems)를 이용하여 펩타이드 매스 핑거프린팅(PMF)을 분석한 결과이다.

도 5는 시험물질 2시간 처리 시 단백질의 발현 변화를 보여 주는 웨스턴 블롯팅 사진이다. 대조군으로서 N은 무처리, D는 DMSO 용매를 나타내며, 1~9는 도 1의 발암성 시험물질 순서와 같다.

도 6은 시험물질 2시간 처리 시 EBP50의 단백질 발현 변화를 보여 주는 그래프이다. 그래프에서 y 축은 발현 증감률을 나타내고, x 축은 시험물질 번호를 나타낸다. 시험물질 번호는 도 1의 순서와 동일하다.

도 7은 시험물질의 시간대별 처리시(2시간, 12시간 및 24시간) 단백질의 발현 변화를 보여주는 웨스턴 블롯팅 결과에 대한 그래프이다. 그래프에서 y 축은 발현 증감률을 나타내고, x 축은 시험물질의 처리 시간을 나타내며, 시험물질 번호는 각각의 선에 명시되어 있다. 시험물질 번호는 도 1의 순서와 동일하다.

Claims (4)

1. 다음의 단계를 포함하는 발암 물질을 검출하는 방법:

   (a) EBP50 유전자를 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및

   (b) 상기 세포에서 EBP50 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 상기 단백질의 발현이 증가하면 발암 물질로 판정한다.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질의 발현 정도 측정은 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. EBP50 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 발암 물질 검출용 키트.
4. EBP50 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 발암 물질 검출용 키트.

Images