KR20100107008A - 리간드 접합 온열요법 서셉터 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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KR20100107008A
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로버트 이브코브
코르둘라 그루트너
크누트 뮐러
요아힘 텔러
프리츠 베스트팔
알랜 포레만
다비드 비. 칸
시아오-링 친
파울 씨. 친
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아두로 바이오테크
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Abstract

온열요법 적용에서 증대된 가열 능력을 나타내는 자성 나노입자를, 그와 같은 나노입자를 접합하기 위한 몇 개의 전략과 마찬가지로 기재하고 있다. 또한 접합된 나노입자를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

리간드 접합 온열요법 서셉터 및 이의 제조 방법 {LIGAND CONJUGATED THERMOTHERAPY SUSCEPTORS AND METHODS FOR PREPARING SAME}
본 발명은 일반적으로 치료용 나노입자 조성물, 보다 구체적으로, 온열요법에 사용하기 위한 리간드 접합 나노입자 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
예를 들면, 암 및 특정 병원균계 질환과 같은 질환의 종래의 치료법에는 침습적이고, 유해한 부작용(예: 건강한 세포에 대한 독성, 정상 신체 기능의 붕괴)을 수반할 수 있는 치료법이 포함되며, 이들 치료법은 흔히 치료의 외상적 진행(traumatic course)을 조장하고, 성공률이 높지 않다. 예를 들면, 종래의 암 치료법에는 전형적으로 수술을 포함하는 국소 치료 후 방사선 및/또는 화학요법과 같은 전신 요법이 포함된다. 이들 치료법은 항상 효과적인 것은 아니며, 효과적이라 하더라도, 몇 가지 단점을 특징으로 한다. 예를 들면, 수술 과정은 외관 손상을 야기할 수 있고, 이환[罹患]된 조직의 불완전한 제거는 암 재발의 큰 위험성과 관련될 수 있다. 방사선 요법 및 화학요법은 물리적으로 환자를 지치게 하고 재발에 완전히 효과적인 것은 아니다.
또 다른 예로써, 병원균계 질환의 치료법에는 흔히 제1 단계로서 광범위 항생제의 투여가 포함된다. 이러한 실행 과정은 바이러스성 병원균에 대해서는 효과가 없고, 흔히 음식물의 적당한 소화를 위해 필요한 소화관내 양성 장내 세균을 제거하여 양성 세균이 다시 살 수 있을 때까지 위장통을 야기한다. 다른 경우, 항생제 내성 세균성 병원균은 항생제 치료에 반응하지 않는다. 더구나, 바이러스성 질환을 치료하기 위해 고안된 요법은 흔히 침습성 바이러스 자체만을 표적으로 한다. 바이러스가 침범하고 바이러스의 추가 복제물을 생성하는 데 사용하기 위해 이용되었던 세포는 생존한 체 잔류한다. 따라서, 질환의 진행은 항생제 치료에 의해 지연될 뿐이지 종결되는 것은 아니다.
종래의 치료법에 대한 대안이 면역 요법이며, 이는 암을 포함한 사람의 각종 질환을 치료하기 위해 급속히 확대된 방법이다. 사람의 면역성 반응을 감소시키기 위한 뮤린 항체의 키메리제이션(chimerization) 및 인간화의 진보에 따라, 항원 결합 친화성, 분자 구성 및 특이성과 같은 변경된 특성을 갖는 항체, 항체 단편 및 펩티드를 제작하는 능력을 치료에 널리 이용하게 되었다. 또한, 파지 디스플레이 기술, 리보솜 디스플레이 및 DNA 셔플링(shuffling)에 의해 표적 리간드로서 사용하기 위한 높은 친화도와 낮은 면역원성을 갖는 항체 단편 및 펩티드를 발견하게 되었다. 특히 이러한 진보로 인해 최소 면역 반응과 함께 특이적 항원 결합 친화성 및 특이성을 갖는 면역요법을 고안할 수 있었다.
면역요법은 적어도 다음 3개의 부류에 속한다: (1) 성장 수용체를 표적으로 하거나 시토카인 경로를 붕괴시키거나 상보적 또는 항체 의존성 세포 독성을 유발하는 항체의 배치; (2) 독소, 방사성핵종 또는 항체에 결합된 시토카인을 포함하는 직접 보강된 항체; 및 (3) 독소를 함유하거나 면역학적 세포 효과기(이중특이적 항체)에 부착된, 부착된 면역 리포좀인 간접 보강된 항체. 독소 또는 방사성핵종의 전달에 의존하는 면역요법의 단점은 이들 제제가 항상 활성이라는 점이다. 따라서, 면역요법과 관련된 독성 문제 및 비종양 세포에 대한 손상 가능성이 있다. 예를 들면, 암 세포는 일반적으로 표면 발현된 항원을 면역요법이 표적으로 하는 혈류로 흘려보낸다. 그 결과, 다수의 항체계 요법은 암 세포보다는 유입된 항원과 항체의 상호작용으로 인해 병변 조직에 도달하기 전에 희석되어 병변 조직으로 전달되는 실제 투여량은 감소된다.
이들 및 기타 관련 이유로, 질환을 치료하기 위한 대안적이고 개선된 기술, 특히 현존 기술보다 환자에게 덜 침습성이고 덜 외상성인 기술을 제공할 필요가 있다. 또한, 표적 부위, 예를 들면, 병변 조직, 병원균, 또는 기타 바람직하지 못한 체내 물질에만 유효해서 부작용을 최소화하고 효능을 향상시키는 치료법을 제공할 필요가 있다. 또한, 환자의 순응도를 조장하기 위해 단일 또는 매우 적은 치료 회기수에 수행될 수 있는 기술을 제공할 필요가 있다.
온열요법은 즉각적인 괴사(통상적으로 "열-소작(thermo-ablation)"이라고 한다) 및/또는 세포에서 열 충격 반응(고전적인 고온요법)을 유발하여 세포 내의 일련의 생화학적 변화를 통해 세포사를 야기하므로 암 및 기타 질환의 치료법으로서 유망할 수 있다. 약 40℃ 내지 약 46℃의 온도는 병변 세포에 비가역적 손상을 일으키고 건강한 세포는 약 46.5℃까지의 온도에 노출되어도 생존할 수 있기 때문에, 병변 조직에서 세포의 온도를 약 40℃ 내지 약 46℃로 상승시킴으로써 정상의 건강한 조직을 손상시키지 않으면서 병변 세포를 선택적으로 파괴하는 치료 옵션을 제공할 수 있다. 또한, 46℃ 초과의 온도는 즉각적인 열 소작 반응을 일으킴으로써 암 및 기타 질환의 치료에 효과적일 수 있다. 그러나, 정확하고 정밀한 표적화가 최소량의 건강한 조직을 상기 온도에 노출시키는 것을 보장하는 데 필요하다.
전리 방사선, 예를 들면, 자외선, x-선, 감마, 베타, 알파, 중성자 또는 화학요법과 병용으로 세포 또는 병변 조직에 적용된 온열요법은 흔히 증가된 세포독성 효과를 일으키고, 이 효과는 이온화 에너지 또는 화학요법 용량의 추가적 조합으로부터 예상되는 것보다 상당히 클 수 있다. 예를 들면, 화학요법제 또는 전리 방사선의 치사 미만(sub-lethal) 용량이 온열요법와 병용되는 경우, 온열요법이 또한 치사 미만 용량으로 투여되는 경우에도 세포는 화학요법제 또는 전리 방사선의 치사 미만 용량에 대해 높은 수준의 감수성을 나타낼 수 있다. 이러한 병용 요법은 열 또는 전리 방사선의 용량으로부터의 손상 부작용을 최소화하거나 방지할 수 있기 때문에 중요한 임상적 잠재력을 갖는다.
온열요법의 유익한 효과는 병변 세포, 조직 또는 병원균에 온열요법제(즉, 서셉터)를 적합하게 표적화함으로써 추가로 증가시킬 수 있다.
일부 온열요법 시스템은 환자에서 심층부의 종양의 국부 가열을 위해서 에너지를 조율하기 위해 윤상배열장치(APAS)와 같은 마이크로파 또는 무선 주파수(RF) 고열요법을 사용한다. 이러한 기술은 조직 전기전도도의 이질성 및 고도로 관류된 조직의 이질성에 의해 제한된다. 전형적인 문제는 병변 조직에서의 정량 이하의 투여를 수반하는 건강한 조직에서의 "핫 스폿(hot spot)" 및 목적하는 영역으로 전달되는 열 용량을 충분히 정밀하게 측정하는 데 있어서의 어려움을 포함한다. 후자는 치료 후 재현가능하고 예측가능한 환자 이점을 보장하는 데 필요한 관례적인 임상 프로토콜의 개발을 방해한다. 이들 인자 모두는 이러한 온열요법 치스템을 사용한 특정 영역의 선택적 가열을 매우 어렵게 한다.
발명의 요약
본 명세서에 기재된 발명은 리간드 접합 입자에 관한 것이며, 특정 구현예에 있어서, 리간드 접합 입자는 온열요법제일 수 있다.
다양한 구현예의 리간드 접합 입자는 단일 자성 도메인을 형성하는 아미노 관능화된 나노입자; 상기 아미노 관능화된 나노입자와 연통하는 적어도 하나의 링커(linker); 및 상기 아미노 관능화된 나노입자 또는 상기 링커에 커플링된 적어도 하나의 리간드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 2관능성 화합물일 수 있다. 다른 구현예에서, 링커는 할로알킬, 에폭사이드, 비닐 헤테로큐뮬린, 에폭시프로펜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 또는 그의 조합물로부터 선택된 하나 이상의 서브유닛을 갖는 다중 서브유닛 조성물일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 링커는 하나 이상의 친수성 서브유닛을 포함할 수 있고, 특정 구현예에서, 링커는 화학적으로 상이한 화합물들의 혼합물일 수 있다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 링커는 하나 이상의 디에폭사이드, 하나 이상의 폴리(에틸렌 글리콜)에폭시에테르, 하나 이상의 폴리(에틸렌 글리콜)디글리시딜 에테르, 하나 이상의 에피클로로히드린 또는 그의 조합물을 포함할 수 있고, 일부 구현예에서, 링커는 에피클로로히드린과 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르의 혼합물을 포함할 수 있다.
추가 구현예의 링커는 아민, 티올, 히드라진, 아지드, 디설파이드, 설폰산, 카르복실산, 말레이미드 또는 그의 조합물로부터 선택된 하나 이상의 말단 반응성 그룹을 포함할 수 있고, 다른 구현예에서, 리간드 접합 입자의 말단 그룹의 반응성은 치환 또는 부가 화학에 근거할 수 있다. 특정 구현예에서, 카르복실산은 폴리(에틸렌 글리콜) 에테르계 카르복실산일 수 있고, 아지드는 5-아지도-2-니트로벤즈아미드일 수 있고, 디설파이드는 3-(2-피리딜디티오) 프로피온아미드일 수 있고, 말레이미드는 1,2-디아실에텐 또는 3-말레이미딜프로피온아미드일 수 있다.
다양한 구현예의 아미노 관능화된 입자는 하부구조(substructure)를 포함할 수 있고, 상기 하부구조는 적어도 하나의 링커, 적어도 하나의 리간드 및 하나 이상의 킬레이터 또는 그의 조합물을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 리간드는 항체일 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드는 티올 또는 아민으로부터 선택된 기의 혼입에 의해 변성될 수 있고, 특정 구현예에서, 리간드는 N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트로 변성될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 리간드 접합 입자는 생체적합성 피막을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 아미노 관능화된 나노입자의 표면은 생체적합성 피막을 형성한다.
다양한 구현예의 리간드 접합 입자는 온열요법제일 수 있다.
다른 구현예의 리간드 접합 입자는 관능화된 자성 나노입자 및 이 관능화된 자성 나노입자와 연통하는 적어도 하나의 링커를 포함할 수 있고, 상기 리간드 접합 나노입자의 전자파 흡수율(SAR, specific absorption rate)은 20nm 나노맥-D-스피오(nanomag®-D-spio) 입자보다 적어도 5배 이상 높다. 특정 구현예에서, 리간드 접합 입자는 관능화된 자성 나노입자 또는 링커에 커플링된 리간드를 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 대상체의 질환을 치료하는 방법은 대상체에게 본 발명의 측면의 리간드 접합 입자를 유효량으로 투여함을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는 단일 자성 도메인 형성 입자를 아미노 또는 니트로 그룹으로 관능화하는 단계, 관능화된 입자를 링커와 접촉시키는 단계 및 리간드를 상기 입자 또는 링커에 커플링시켜 리간드 접합 입자를 형성시키는 단계를 포함하는 리간드 접합 입자의 제조 방법을 포함한다. 특정 구현예에서, 관능화 단계는 약 7 내지 약 9 의 pH 에서 일어난다. 다른 구현예에서, 리간드 접합 입자의 제조 방법은 리간드 접합 입자를 수성 완충 용액으로 세정하는 추가 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 단계는 약 5 내지 약 8 의 pH 에서 일어난다. 또 다른 구현예에서, 리간드 접합 입자의 제조 방법은 리간드 접합 입자를 살균하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 리간드를 상기 입자 또는 상기 링커에 커플링시켜 리간드 접합 입자를 형성시키는 단계는 관능화된 입자를 링커와 접촉시키는 단계의 12시간 이내에 일어난다.
일부 구현예에 따르는 리간드 접합 입자의 크기 범위는 10 내지 80nm이다.
다양한 구현예에서, 단일 자성 도메인 형성 입자를 아미노 또는 니트로 그룹으로 관능화하는 단계, 관능화된 입자를 링커와 접촉시키는 단계 및 리간드를 상기 입자 또는 링커와 커플링시켜 리간드 접합 입자를 형성시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 온열요법용 나노입자를 제공한다.
본 발명의 성질 및 이점을 보다 충분히 이해하기 위해서, 첨부된 도면과 연합된 다음 상세한 설명을 참조할 수 있다.
도 1은 본 발명의 구현예에 따르는 서셉터 접합체를 나타내고,
도 2는 서셉터 접합체를 제조하기 위한 4가지 합성 방법을 나타내고,
도 3은 직경이 25nm(흑색), 50nm(진한 회색) 및 70nm(연한 회색)인 아미노 관능화된 입자 (Ⅱ)의 크기 분포 그래프이고,
도 4는 200Hz에서 평균 입자 직경이 70nm인 자성 입자의 실온에서 용적 자화율의 임피던스 분광법 데이터를 도시한 그래프이고,
도 5a는 2차 고우트 안티-래빗(goat anti-rabbit) 항체가 입자 표면에 접합된 래빗 안티-고우트 항체와 상호작용할 수 있는 2가지 가능한 방법을 나타내는 도면이고,
도 5b는 래빗 안티-고우트가 적합한 배향으로 존재하는 경우, 고우트 안티-마우스 항체가 래빗 안티-고우트 항체와만 상호작용할 수 있음을 나타내는 도면이고,
도 6은 도 2에 도시된 방법을 사용하여 제조된 항체 접합된 입자를 사용하는 경우, 철 mg 당 면역반응성과 비교하여 전체 결합된 항체를 나타내는 막대 그래프이다.
본 발명은 설명된 특정 공정, 조성물 또는 방법론에 제한되지 않고, 이들은 달라질 수 있다. 또한, 본 설명에 사용된 용어는 특정 버젼 또는 구현예만을 설명하기 위한 것이지 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 학술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 방법과 유사하거나 동등한 어떠한 방법도 본 발명의 구현예의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 지금은 바람직한 방법을 설명한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 참조문헌은 참고로 인용된다. 본 명세서에 임의의 것도, 선행 발명이라는 이유로, 본 발명이 이러한 개시를 앞설 자격이 없음을 승인하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용된 바와 같이, 단수형은 그 내용이 명백히 그렇지 않음을 나타내지 않는 한, 복수 표현도 포함함에 주목해야 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 이와 함께 사용되는 수치의 ±10％를 의미한다. 따라서, 약 "50％"는 40％ 내지 60％의 범위를 의미한다.
본 발명의 치료용 나노입자 조성물과 함께 본 명세서에서 사용되는 "투여하다"는 치료제를 표적 조직 내에 또는 상에 직접 투여하거나 치료제를 환자에게 투여함으로써 표적으로 하는 조직에 치료적 영향을 주는 것을 의미한다. 치료제를 "투여"하는 것은, 몇 가지를 나열해보면, 주사, 주입에 의해 달성되거나 이중 하나의 방법과 기타 공지된 기술과 병용하여 달성될 수 있다. 이러한 병용 기술은 가열, 방사선 및 초음파를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "교번 자기장" 또는 "AMF"는, 이의 장(field) 벡터의 방향이 주기적으로, 통상 사인형, 삼각형, 사각형 또는 유사 형태의 패턴으로, 약 80kHz 내지 약 800kHz 범위의 주파수로 변화시키는 자기장을 나타낸다. AMF는 또한 정자기장에 첨가되어 생성된 자기장 벡터의 AMF 성분만이 방향을 변화하도록 할 수 있다. AMF는 교번 전기장에 동반될 수 있고 특성상 전자기성일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 특정 항원과 반응성인 면역글로불린 분자에 대한 언급을 포함하고 다클론 및 단일클론 항체 모두를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "병변 조직"은 임의 유형의 고형 종양 암, 예를 들면, 뼈암, 폐암, 혈관암, 신경암, 대장암, 난소암, 유방암 및 전립선암과 관련된 조직 또는 세포를 의미한다. 용어 병변 조직은, 또한 면역계의 조직 또는 세포, 예를 들면, AIDS 의 영향을 받은 조직 또는 세포; 세균성, 바이러스성, 기생충성 또는 진균성일 수 있는 병원균계 질환, 예를 들면, HIV, 결핵 및 말라리아; 호르몬 관련 질환, 예를 들면, 비만; 혈관계 질환; 중추신경계 질환, 예를 들면, 다발성 경화증; 및 바람직하지 않은 문제, 예를 들면, 역 혈관신생, 재협착성 아밀로이드증, 독소, 장기 이식과 관련된 반응 부산물 및 기타 비정상 세포 또는 조직 성장에 의해 이환된 조직 또는 세포를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 조성물의 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 목적하는 효과를 달성하기 위해 계산된, 예정된 양이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "에너지 공급원"은 치료제 중의 잠재적인 방사성 공급원을 활성화시키기 위해 AMF 이외의 형태의 에너지를 치료제에 전달할 수 있는 장치를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "고열 요법"은 조직을 40℃ 내지 60℃의 온도로 가열함을 의미한다.
용어 "영향을 주다"는 치료제가 제공되거나 적용되거나 투여된 환자의 조직, 세포 또는 영역의 외관, 형태, 특성 및/또는 물리적 속성의 변화를 나타내기 위해 사용된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "징후"는 암과 같은 의학적 상태와 관련된 의학적 상태 또는 증상을 의미한다. 예를 들면, 피로 또는 열이 대상체의 병변 상태의 징후일 수 있다.
용어 "리간드"는 분자를 특이적으로 표적으로 하는 화합물을 의미한다.
"임의의" 또는 "임의로"는 후속적으로 기재하는 구조, 사건 또는 상황이 일어나거나 일어나지 않을 수 있고, 상기 기재가 사건이 일어나는 경우와 사건이 일어나지 않는 경우를 포함함을 의미하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적"은 불활성화, 파열, 붕괴 또는 파괴가 필요한 물질을 의미한다. 예를 들면, 병변 조직은 치료를 위한 표적일 수 있다.
일반적으로 말해서, 용어 "조직"은 유사하게 분화된 세포의 임의의 집합체를 의미하며, 이는 특정 기능의 수행시 일체화된다.
이의 가장 기본적인 형태로, 본 명세서에 설명된 발명은 온열요법에 사용하기 위한 리간드 접합 입자에 관한 것이다. 본 발명의 다양한 구현예는 입자, 적어도 하나의 링커 또는 가교결합 화합물 및 적어도 하나의 리간드를 포함한다.
다양한 구현예의 입자는 자성 입자이고, 다른 구현예에서, 입자는 교번 자기장(AMF) 또는 다른 에너지 공급원에 위치하는 경우, 열을 발생시킬 수 있는 자성 입자이다. 이러한 입자는 자성 에너지 민감성 입자 또는 "서셉터"라고 할 수 있고, 온열요법을 제공하는 데 유용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "서셉터" 및 "비표적화 서셉터"는 특정 세포 유형, 분자 또는 다른 표적과 상호작용하기 위해서 변성되지 않은 서셉터를 의미한다. 대조적으로, "표적화 서셉터", "리간드 접합" 입자 또는 서섭터 및 "서셉터 접합체"는, 예를 들면, 서셉터에 공유결합된 항체를 사용하여 특정 표적과 상호작용하기 위해 변성되었다. 비표적화 서셉터는 이러한 표적화 메카니즘을 포함하지 않는다.
도 1은 본 발명의 구현예에 따르는 서셉터 접합체(100)를 나타낸다. 서셉터 접합체(100)는 자성 에너지 민감성 입자 또는 서셉터(142)를 포함한다. 서셉터는 서셉터(142)를 완전히 또는 부분적으로 덮는 피막(144)을 포함할 수 있다. 이로써 제한되지 않지만 항체와 같은 하나 이상의 표적화 리간드(140)가 서셉터(142)의 외부에 위치할 수 있다. 표적화 리간드(140)는 세포 또는 병변 조직의 유형과 같은 특정 표적을 찾아내어 부착하도록 선택될 수 있다. 열은 서셉터(142)가 AMF와 같은 에너지 공급원에 노출되는 경우에 서셉터(142)에서 발생된다. 피막(144)은 특히, 예를 들어 중합체성 물질과 같이 피막(144)이 높은 점도를 갖는 경우, 서셉터(142)의 가열 특성을 향상시킬 수 있다.
서셉터를 구체적으로 언급하면, 일반적으로 AMF에 위치할 때 서셉터에 의해 발생된 열은 서셉터의 자성 물질이 AMF에 반응하여 진동함에 따른 에너지 손실을 나타낸다. 자기장의 주기당 발생된 열의 양 및 에너지 손실을 초래하는 메카니즘은 서셉터 물질 및 적용된 자기장 둘 다의 구체적인 특성에 좌우된다. 본 발명의 구현예에서, 서셉터는 단일 자성 도메인을 형성한다.
일부 측면에 있어서, 서셉터는 AMF 또는 다른 에너지 공급원에 적용되는 경우, 퀴리 온도라고 하는 독특한 온도까지 가열된다. 퀴리 온도는 서셉터의 자성 물질의 강자성에서 상자성으로의 가역적 전이가 일어나는 온도이다. 상기 온도 미만에서, 자성 물질은 적용된 AMF에서 열을 발생시키지만, 상기 퀴리 온도 초과에서, 자성 물질은 상자성이고, 자성 도메인은 AMF에 비반응성이다. 따라서, 자성 물질은 퀴리 온도 초과에서 AMF에 노출시 열을 발생시키지 않는다. 자성 물질이 퀴리 온도 미만의 온도로 냉각됨에 따라, 물질은 이의 자기적 특성을 회복하고 AMF의 적용시 승온을 재개한다. 이러한 주기는 AMF에 노출하는 동안 계속적으로 반복될 수 있다. 따라서, 서셉터의 자성 물질은 가열 온도를 자가 조절할 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 자성 물질은 약 40℃ 내지 약 150℃의 퀴리 온도를 갖도록 선택될 수 있다.
서셉터가 가열되는 온도는 다른 인자들 중에서도 서셉터 물질의 자기적 특성, 자기장의 특성 및 표적 부위의 냉각 능력에 좌우된다. 서셉터 물질 및 AMF 특성의 선택은 특정 표적 유형에 대해 치료 효능을 최적화하도록 맞출 수 있다. 서셉터의 다수의 측면, 예를 들면, 물질 조성, 크기 및 형태는 가열 특성에 직접적으로 영향을 미칠 수 있고, 이들 특성은 목적하는 가열 특성을 달성하도록 맞춰질 수 있다. 예를 들면, 온열요법에 이용되는 서셉터의 크기는 서셉터가 사용될 특정 용도(즉, 달성될 온도) 및 서셉터를 포함하는 물질에 좌우될 수 있다.
서셉터의 크기가 또한, 예를 들면, 링커 및 리간드를 포함하는 "서셉터 접합체"의 전체 크기를 결정할 수 있다. 다양한 구현예에서, 서셉터의 크기는 약 0.1nm 내지 약 250nm이다. 서셉터 접합체 크기는 또한 징후, 서셉터 및 서셉터 접합체를 포함하는 물질, 투여 경로 및 사용방법에 좌우될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자에게, 예를 들면, 정맥내 주사를 통해서 투여되는 서셉터 또는 서셉터 접합체는 혈류에서의 증가된 치료 조성물 농도 및 긴 체류 시간을 달성하기 위해서, 세망내피계(RES)에 의한 흡수 및 이후 간, 비장, 폐, 신장, 심장 및 골수로의 분포를 피하는 것이 바람직할 수 있다. RES에 의한 흡수를 성공적으로 피하기 위해서, 서셉터 또는 서셉터 접합체의 직경은 약 30nm 미만일 수 있고, 특히 서셉터가 자철광(Fe3O4)을 함유하는 구현예에서, 서셉터 접합체의 직경은 약 8nm 내지 약 20nm일 수 있다. 이러한 서셉터 접합체의 서셉터는, 치료 조성물의 RES에 의한 흡수를 피하도록 하면서, 적용된 AMF에서 가열을 위한 충분한 자기 모멘트를 보유한다. 일부 구현예에서, 직경이 약 8nm를 초과하는 강자성 서셉터가 온열요법 용도에 적합할 수 있다. 다른 구현예에서, 기타 원소, 예를 들면, 코발트가 자철광 서셉터에 포함된다. 2차 원소가 포함됨으로써 서셉터 및 이러한 서셉터를 포함하는 서셉터 접합체의 크기 범위가 작아질 수 있다. 예를 들면, 코발트는 자철광보다 작지만 일반적으로 자철광보다 큰 자기 모멘트를 갖고, 이는 치료 조성물의 크기를 감소시키면서 코발트 함유 자철광 서셉터의 전체 자기 모멘트에 기여할 수 있다.
본 발명의 구현예에 사용하기 위한 서셉터는 적합한 자기 모멘트 및 크기를 제공하는 임의의 수의 물질을 포함할 수 있다. 서셉터의 물질 조성은 특정 표적에 근거하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 구현예들에서 서셉터는 산화철 입자 및 FeCo/SiO2 입자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 자가 제한 퀴리 온도는 전체 열이 표적에 전달되는 서셉터 물질에 직접 관련되기 때문에, 서셉터 조성물은 상이한 표적 유형을 위해 설계될 수 있다. 이러한 조율은, 표적의 환자의 체내에서의 위치 및 조성에 근거한 독특한 가열 및 냉각 능력이 주어진 경우, 각각의 표적 유형의 목적하는 가열을 달성하는 데 필요할 수 있다. 예를 들면, 환자의 혈액이 원활히 공급되지 않고 비교적 고립된 영역에 위치한 종양은, 효과적인 온열요법을 위해서 주요 혈관 근처에 위치하는 종양보다 낮은 퀴리 온도 서셉터 물질을 필요로 할 수 있다. 혈류에 위치하는 표적 또한 특정 퀴리 온도를 갖는 서셉터 물질을 요구할 것이다. 따라서, 다양한 구현예의 서셉터는 자철광 이외에, 예를 들면, 코발트, 철, 희토류 금속 등 및 그의 조합물을 포함할 수 있다.
전자파 흡수율 (SAR)은 또한 서셉터 물질의 선택시 고려될 수 있다. 소정 물질에 대한 SAR 은, RF 전자기장에 노출될 때, 물질이 무선 주파수 (RF) 에너지를 흡수하는 비율로서 통상 기재된다. 예를 들어, Ferrotec Corp (Nashua, NH)로부터 이용가능한 약 110 nm 직경의 시리즈 EMG 700 및 EMG 1111 철 산화물 입자는 1,300 에르스텟(Oerstedt) 유속 밀도 및 150 kHz 주파수에서 약 310 Watt/입자 1 g 의 SAR 을 갖는다. 다른 입자, 예컨대, Inframat Corp. (Willington, Connecticut)로부터 이용가능한 FeCo/SiO2 입자는 동일한 자기장 조건 하에서 약 400 Watt/입자 1 g 의 SAR 을 갖는다.
일부 구현예에서, 서셉터는 코팅제를 포함한다. 적당한 코팅 물질은 합성 및 생물학적 폴리머, 코폴리머 및 폴리머 배합물, 및 무기 물질을 포함할 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 코팅 물질로서 합성 폴리머를 이용하는 구현예에서, 그와 같은 코팅제는 예를 들어 아크릴레이트, 실록산, 스티렌, 아세테이트, 알킬렌 글리콜, 알킬렌, 알킬렌 옥시드, 파릴렌, 락트산, 글리콜산 및 이의 조합물을 포함할 수 있고, 특정 구현예에서, 그와 같은 코팅제는 히드로겔 폴리머, 히드티딘 함유 폴리머 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 추가 구현예는 예를 들어, 폴리삭카라이드, 폴리아미노산, 단백질, 지질, 글리세롤, 지방산, 및 이의 조합물과 같은 생물학적 물질을 포함하는 코팅 물질을 포함하고, 다른 구현예에서, 코팅 물질로서 사용하기 위한 생물학적 물질은 헤파린, 헤파린 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 키틴, 키토산, 셀룰로오스, 덱스트란, 알기네이트, 전분, 탄수화물, 및 글리코스아미노글리칸을 포함할 수 있다. 단백질 코팅 물질을 이용하는 구현예에서, 그와 같은 단백질은 세포외 기질 단백질, 프로테오글리칸, 글리코단백질, 알부민, 및 젤라틴을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 생물학적 코팅 물질은 적당한 합성 폴리머 물질과 조합하여 사용된다.
본 발명의 다른 구현예는 예를 들어, 원소주기율표 IV족 원소의 히드록시아파타이트, 실리콘 카바이드, 카르복실레이트, 설포네이트, 포스페이트, 페라이트, 포스포네이트, 및 산화물과 같은, 이들로 한정되지 않는 금속, 금속 알로이 및 세라믹과 같은 무기 코팅 물질을 갖는 서셉터를 포함한다. 다른 구현예에서, 무기 코팅 물질은 생물학적 또는 합성 폴리머를 또한 함유하는 복합 코팅제의 성분이다.
일부 구현예에서, 서셉터가 생체적합성인 자성 물질로부터 형성되는 경우에, 서셉터 자체의 표면은 생체적합성 코팅제로서 작용할 수 있다. 다른 구현예에서, 코팅 물질은 서셉터를 서셉터 생체적합성으로 만드는데 도움이 될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 코팅 물질은 예를 들어 트랜스펙션에 의한 서셉터의 세포로의 수송을 촉진할 수 있다. 트랜스펙션제 (transfection agent)로 불리는 그와 같은 코팅 물질은 예를 들어, 벡터, 예컨대, 플라스미드, 바이러스, 파아지(phage), 바이론(viron) 또는 바이러스 코트(viral coat), 프리온(prion), 폴리아미노산, 양이온성 리포좀, 양친매성 물질, 비(非)-리포솜 지질, 또는 그의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 생체적합성 코팅 물질은 트랜스펙션제(들)과 유기 및/또는 무기 물질의 복합물일 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 코팅 물질 및/또는 트랜스펙션제의 조합은 환자 신체 내의 세포 또는 이환(diseased) 조직의 특정 타입 및 특정 위치에 대해 맞춰질 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 링커는 서셉터 또는 서셉터 코팅에 커플링된다. 링커는, 일부 구현예에서, 서셉터의 외부 표면에 접촉하고 그 표면에 결합하고, 한편 리간드에 공유적으로 결합하여 리간드를 서셉터의 외부 표면에 부착하는 2관능성 화합물일 수 있다. 다른 구현예에서, 링커는 서셉터의 외부 표면에 결합하고 세망내피계 (RES)로부터 서셉터의 탈출(evasion)을 용이하게 한다. 예를 들어, "페길화(pegylation)"로서 당업계에 공지된 방법을 통한, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커에 의한 서셉터의 관능화는 RES 에 의한 탐지 및 흡수를 피하는 데 효과적이고, 증가된 투과 및 지연(EPR) 효과를 통해 종양의 변경된 맥관구조의 침투를 촉진하고, 이에 따라 종양 간질(間質, interstitium)에서 서셉터가 우선적으로 축적된다.
링커가 짧은지 긴지, 딱딱한지 유연한지, 수소성인지 친수성인 지에 따라, 링커는 최종 접합체의 특성에 영향을 미칠 수 있다. 다양한 구현예의 링커는 소수성 또는 친수성 유기 또는 무기 화합물, 또는 화학적으로 상이한 화합물의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 알킬, 알켄, 알킨, 할로알킬, 에폭사이드, 비닐 또는 헤테로큐뮬린 화합물을 포함할 수 있고, 다른 구현예에서, 링커는 다중-서브유닛 화합물을 포함할 수 있다. 그와 같은 구현예의 링커는 다중-서브유닛 화합물에서 서브유닛의 수 및/또는 타입에 의해 한정되지 않고, 예를 들어 에폭시프로펜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 등의 서브유닛, 및 이의 조합물을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 링커는 하나 이상의 에피클로로히드린, 디에폭사이드 또는 이의 조합물을 포함한다. 본 발명의 구현예에 의해 포함되는 링커의 예는 폴리(에틸렌 글리콜), 에폭시에테르, 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르, 및 에피클로로히드린과 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르의 혼합물을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
다양한 구현예의 링커는 또한 하나 이상의 말단 반응성 기를 포함한다. 말단 반응성 기의 타입은 특정 타입의 서셉터를 임의의 타입의 리간드에 커플링시키거나, 임의의 리간드와 공유결합을 형성하거나 서셉터를 그와 같은 리간드에 결합하는데 필요한 반응 화학의 타입에 따라 변할 수 있다. 특정 구현예에서, 말단 기의 반응성은 치환 또는 부가 화학에 근거할 수 있다. 예시적인 말단 반응성 기는 카르복실산, 아민, 히드라진, 아지드, 티올, 디설파이드, 설폰산, 비닐, 1,2-디아실에텐, 및 그의 유도체 및 조합물을 포함하지만, 이들로 한정되지 않고, 특정 구현예에서, 말단 반응성 기는 아민, 티올 또는 카르복실산 잔기일 수 있다. 일부 구현예에서, 카르복실산 말단 기는 폴리(에틸렌 글리콜) 에테르계 카르복실산일 수 있고, 아지드 말단 기는 5-아지도-2-니트로벤즈아미드일 수 있고, 디설파이드 말단 기는 3-(2-피리딜티오) 프로피온아미드일 수 있고, 1,2-디아실에텐 말단 기는 말레이미드 또는 3-말레이니딜프로피온아미드일 수 있다.
본 발명의 구체예의 리간드는, 서셉터가 선택된 표적에 선택적으로 부착하거나 그 표적에 연합하는 것을 보장하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드는 세포 상의 암 또는 질병 마커의 표적화를 가능하게 한다. 다른 구현예에서, 리간드는 환자의 특정 타입의 생물학적 물질의 표적화를 촉진한다. 다양한 구현예는 하기 리간드를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다: 예컨대, 단백질, 펩타이드, 항체, 항체 단편, 삭카라이드, 카보히드레이트, 글리칸, 사이토킨, 케모카인, 뉴클레오티드, 렉틴, 지질, 수용체, 스테로이드, 신경전달물질, 세포표면항원군 (Cluster Designation/Differentiation; CD) 마커, 각인 폴리머, 및 이의 조합물. 특정 구현예에서, 단백질 리간드는 예를 들어, 세포 표면 단백질, 막 단백질, 프로테오글라이칸, 글리코단백질, 펩타이드 등을 포함하고; 뉴클레오티드 리간드는 예를 들어, 단일가닥 뉴클레오티드, 이중가닥 뉴클레오티드, 상보 뉴클레오티드, 및 폴리 뉴클레오티드 단편을 포함하고; 지질 리간드는 예를 들어, 인지질, 당지질 등을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 리간드는 항체 또는 항체 단편이다.
본 발명의 구현예에 유용한 항체는 특정 타입의 항체에 의해 제한되지 않는다. 일부 구현예에 유용한 항체는 예를 들어, 키메라 항체 (예를 들어, 인간화 뮤린 항체) 및 헤테로콘쥬게이트 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)와 같이 유전자조작될 수 있다. 항체는 또한 Fab', F(ab')2, Fab, Fv 및 rIgG 와 같은 항원 결합 능력을 갖는 단편, 및 재조합 단일 사슬 Fv 단편 (scFv) 을 포함하는, 항체의 항원 결합 형태를 포함할 수 있다. 그와 같은 단편은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 하기에서 발견될 수 있다: Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co. Rocktbrd, Ⅲ 및 Kuby, J., Immunology, 3 sup. rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York (1998). 다른 구현예의 항체는 하기에 기재되어 있는 것과 같은 2가 또는 이중특이적 분자를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다: Kostelny et al. J. Immunol 148:1547 (1992), Pack and Pluckthun Biochemistry 31:1579(1992), Hotlinger et al. supra, (1993), Gruber et al. J. Immunol . 5368 (1994), Zhu et al. Protein Sci 6:781 (1997), Hu et al. Cancer Res. 56:3055 (1996), Adams et al. Cancer Res . 53:4026 (1993), and McCartno et al. Protein Eng. 8:301 (1995).
본 발명의 구현예의 리간드는 당업계에 공지된 임의의 마커 또는 항원에 부착하도록 제조될 수 있다. 마커의 선택은 선택된 표적에 따라 변할 수 있지만, 일반적으로, 본 발명의 구현예에 사용될 수 있는 마커는 하기를 포함하며, 이들로 한정되지 않는다: 세포 표면 마커, 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR) 패밀리의 멤버, 암 태아성 항원 (CEA) 패밀리의 멤버, 안티-이디오타입(anti-idiotypic) mAB 의 타입, 강글리오사이드 모방체의 타입, 세포표면항원무리 (CD) 항원, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 패밀리의 멤버, 세포 부착 분자의 타입, MUC형 뮤신 패밀리의 멤버, 암 항원(CA), 기질 메탈로프로테이나제, 글리코단백질 항원, 흑색종 관련 항원 (MAA), 단백질분해 효소, 칼모듈린, 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 패밀리의 멤버, 혈관신생 마커, T 세포 항원에 의해 인식된 흑색종 항원(MART), 흑색종 항원 인코딩 유전자 (MAGE) 패밀리의 멤버, 전립선 특이 세포막항원(PMSA), 소세포 폐 암종 항원 (SCLCA), T/Tn 항원, 호르몬 수용체, 종양 억제자 유전자 항원, 세포 주기 조절자 항원, 암유전자 항원, 암유전자 수용체 항원, 증식 마커, 세포외 기질의 변성(degradation)과 관련된 프로테이나제, 악성 형질변환 관련 인자, 세포사 관련 인자, 및 인간 암종 항원. 예를 들어, 유방암용 특이적 마커는 하기와 같은 세포 표면 항원으로부터 선택될 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다: MUC 타입 뮤신 패밀리의 멤버, 상피세포 성장 인자 (EGFR) 수용체, 암 배아 항원 (CEA), 인간 암종 항원, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 항원, 흑색종 항원 (MAGE), 패밀리 항원, T/Tn 항원, 호르몬 수용체, 성장 인자 수용체, 세포표면항원무리 (CD) 항원, 종양 억제자 유전자 산물, 세포 주기 조절자, 암유전자 산물, 암유전자 수용체, 증식 마커, 부착 분자, 세포외 기질의 변성와 관련된 프로테이나제, 악성 형질변환 관련 인자, 세포사 관련 인자, 인간 암종 항원, 글리코단백질 항원, DF3, 4F2, MGFM 항원, 유방암 항원 CA 15-3, 칼포닌, 카텝신, CD 31 항원, 증식 세포 핵 항원 10 (PC 10), 및 pS2.
다른 구현예에서, 리간드는 환자의 면역계의 질환과 관련된 항원을 표적으로 할 수 있다. 예를 들어, 마커, 또는 리간드가 표적으로 하는 마커는 예를 들어 T 세포 또는 B 세포 상에 생존가능(viable) 표적을 포함시키도록 선택될 수 있고, 또는 리간드는 예를 들어 단백질, 사이토킨, 케모카인, 감염성 유기체 등과 같은, 면역계 질환과 관련된 표적에 대한 친화성을 가질 수 있다.
또 다른 구현예에서, 리간드는 병원균 생성 조건과 관련된 항원을 표적으로 할 수 있다. 일반적으로, 병원균은 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 미생물, 진균, 기생충, 또는 프리온과 같은 임의의 질병 유발제를 포함할 수 있다. 이 구현예의 리간드는 병원균과 관련된 세포 마커 또는 마커들, 또는 감염 세포 상의 표적을 나타내는 마커 또는 마커들에 대해 친화성을 가질 수 있다. 예를 들어, 리간드는 하기와 같은 병원균 자체를 표적으로 하기 위해 선택될 수 있다: 대장균 또는 탄저균을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 박테리아; 사이토메갈로바이러스 (CMV), 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 (EBV), B형 간염 바이러스와 같은 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 예컨대, HIV, HIV-1 또는 HIV-2, 또는 포진(疱疹) 바이러스, 예컨대, 포진 바이러스 6를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 바이러스; 쿠루스파동편모충(Trypanasoma cruzi), 키네토플라스티드(Kinetoplastid), 만손주혈흡충(Schistosoma mansoni), 일본주혈흡충(Schistosoma japonicum) 또는 브루스 주혈흡충(Schistosoma brucei)을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 기생충; 또는 아스퍼질러스 (Aspergillus), 크립토코쿠스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans) 또는 리조무코 (Rhizomucor)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 진균 상태.
본 발명의 특정 구현예에서, 변성된 항체는 항체 또는 항체 단편을 변성제와 반응시켜서 생산될 수 있다. 예를 들어, 유기 잔기는 아민 반응성 변성제, 예를 들어 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 사용하여 부위 비특이적(non-site specific) 방법으로 항체에 결합될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 변성된 인간 항체 또는 항원 결합 단편은 항체 또는 항원 결합 단편의 디설파이드 결합 (예, 사슬내 디설파이드 결합)을 환원시켜서 제조될 수 있다. 그 다음, 환원된 항체 또는 항원 결합 단편은 티올 반응성 변성제와 반응하여 항체를 링커에 공유결합시킨다. 항체의 특이적 부위에 결합된 유기 잔기를 포함하는, 본 발명의 측면의 변성된 인간 항체 및 항원 결합 단편은 역 단백질분해와 같은 적합한 하기 방법을 사용하여 제조될 수 있다: (Fisch et al. Bioconjugate Chem. 3:147 153(1992); Werlen et al. Biococonjugate Chem. 5:411 417 (1994); Kumaran et al. Protein Sci .6(10):2233 2241 (1997); Itoh et al., Bioorg . Chem ., 24(1): 59 68 (1996); Capellas et al., Biotechnol . Bioeng ., 56(4) 456 463 (1997), 및 Hermanson Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif (1996).
또 다른 구현예에서, 리간드는 바람직하지 않은 상태와 관련된 세포 또는 조직을 표적으로 할 수 있다. 그와 같은 바람직하지 않은 상태는 질병과 연합될 수 있지만, 정상 상태로 존재할 수 있다. 리간드는 바람직하지 않은 상태와 연합된 단백질 또는 다른 항원, 또는 바람직하지 않은 상태와 관련된 생물학적 분자 기전과 연합된 다른 분자를 직접 표적으로 할 수 있다. 예를 들어, 저밀도 지질단백질 (LDL) 상의 아포리포프로테인(apolipoprotein) B는 동맥경화증을 치료하기 위해 표적 분자로서 사용될 수 있거나, 또는 위 억제성 폴리펩타이드 수용체는 비만을 치료하기 위해 표적이 될 수 있다. 추가 예는, 표적이 호르몬 자체, 또는 호르몬 생산과 연합된 호르몬 또는 신호 펩티드인 호르몬 관련 질환, 및 표적이 질환 조직과 연합된 항원 또는 펩타이드, 또는 비암(non-cancerous) 질환 조직의 축적과 연합된 단백질 또는 펩타이드인 비암 질환 조직과 연합된 표적에 대한 리간드를 포함한다.
추가 구현예에서, 리간드는 장기 이식에 뒤따르는 장기 거부반응과 연합된 항원 또는 단백질을 표적으로 할 수 있다. 그와 같은 구현예에서의 표적은 이식된 장기의 특정 타입에 따라 변할 수 있고, 예를 들어 T 세포 또는 B 세포와 같은 면역 세포를 포함할 수 있다.
추가 구현예에서, 리간드는 환자의 독소를 표적으로 할 수 있다. 그와 같은 독소는 박테리아 독소, 식물 독소, 곤충 독소, 동물 독소, 및 인공 독소를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 유기체에 의해 생산된 임의의 독소를 포함한다.
본 발명의 구현예의 리간드의 추가 예는 그 전체가 참고로 본 명세서에 통합된 U.S. 특허 출원 시리즈 제10/696,399호에 발견될 수 있다.
특정 구현예에서의 리간드는 서셉터, 이 서셉터 연합된 코팅, 또는 이 서셉터의 표면에 결합된 링커에 공유적으로 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드는 이 리간드를 링커 또는 코팅에 공유적으로 결합시키는 능력을 향상시키기 위해 변성될 수 있고, 구현예는 이 유형의 변성에 의해 제한되지 않는다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 리간드는 티올 변성될 수 있다. 변성된 리간드를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 상업적으로 이용가능하다.
본 발명의 추가 구현예는 리간드 접합 입자 또는 "서셉터 접합체"를 제조하는 방법을 포함한다. 서셉터 접합체를 제조하는 다양한 방법의 개략도는 도 2 에 제공되고, 그와 같은 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: 입자 (I) 를 제조하는 단계, 입자 (Ⅱ) 를 아미노 관능화하는 단계, 상기에 기재된 것과 같은 링커를 아미노 관능화된 입자 (Ⅱ)와 반응시켜 예를 들어 입자 (Ⅲ, V, Ⅶ 및 XI)를 형성하는 단계, 및 링커 상의 제2 관능기를 리간드와 반응시켜 리간드 접합 입자 또는 서셉터 접합체(IV, Ⅵ, Ⅷ 및 X)을 형성하는 단계. 당업계에 공지된 다양한 변성은 도 2 에 제공되고 본 명세서에 기재된 개략도의 임의의 단계에 대해 행해지거나, 하나 이상의 단계는 다른 동등한 단계로 치환될 수 있다. 그와 같은 변형은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 입자 또는 "서셉터"는 티올 또는 다른 반응성 기로 관능화될 수 있고, 또는 다양한 단계들이 결합되어 하나의 타입 초과의 링커 또는 리간드가 서셉터와 커플링된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 서셉터는 접합 표면적 대 비접합 표면적의 특정 비로 최적화되고, 이에 따라, 유효량의 링커 또는 리간드가 질환의 치료를 위해 서셉터와 연합된다. 추가 구현예에서, 서셉터 접합체를 세정 및/또는 살균하는 단계가 상기 방법에 포함된다. 세정 및/또는 살균 단계는 마이크로 여과, 또는 당업계에 공지된 기타 그와 같은 방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는 단일 자기 도메인을 형성하는 입자를 아미노 또는 니트로 기로 관능화하는 단계, 상기 관능화 입자를 링커와 접촉시키는 단계, 및 리간드를 입자 또는 링커에 커플링하여 리간드 접합 입자를 형성하는 단계를 포함하는 리간드 접합 입자의 제조 방법을 포함한다.
또 다른 구현예는 본 발명의 서셉터 및 서셉터 접합체를 사용하여 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 서셉터 접합체를 사용하여 치료될 수 있는 질병은 넓은 범위의 질병을 포함하고, 단지 질병용 마커의 이용가능성에 의해 제한된다. 비(非)표적 서셉터의 사용은 그와 같은 마커의 이용가능성에 의해 제한되지 않는다. 따라서, 현재 알려진 또는 미래에 발견될 임의의 질환은 구현예의 방법에 의해 포함된다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 리간드가 암 세포를 표적으로 하는 서셉터 접합체는 환자에 투여되고, 서셉터 접합체는 암 세포에 부착 또는 결합되게 되며, 환자는 교번 자기장 (AMF)에 노출된다. AMF의 결과로서 서셉터에 의해 발생한 열은 즉시 또는 경시적으로 암 세포를 파괴하거나 (즉, 세포사를 유도하거나), 탈활성화시킨다. 또한, 서셉터 및/또는 세포사에 의해 발생한 열은 열충격 단백질, 예컨대, HSP 70의 생성 및 방출을 자극할 수 있고, 열충격 단백질의 존재는 임의의 잔류 암 세포에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. 그와 같은 자극된 면역 반응은 또한 암 및 다른 질환의 장차의 진행으로부터 개인을 보호하는데 도움이 될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 변성된 표면 전하 및 입자 크기는 질병의 치료에서 서셉터 및 서셉터 접합체의 유효성에 기여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 하나의 측면에서, 서셉터 표면 전하는 변성되어 나노입자의 클리어런스(clearance)를 감소시킨다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 서셉터 표면의 상당한 부분은 관능화되어 목적하는 표면 전하 및 제타 포텐셜(zeta potential)을 제공한다. 다른 구현예에서, 예를 들어, 설포-NHS-아세테이트와 같은 서셉터 표면의 선택적 관능화를 허용하는 차단제가 사용되어 표면 전하 및 제타 포텐셜을 미세하게 조절한다.
서셉터 또는 서셉터 접합체의 리간드의 표면 화학 또는 다공성은 상기 서셉터 또는 서셉터 접합체가 표적 세포의 외부에 남겨 지거나, 또는 표적 세포 내에 내재화되도록 조절될 수 있다. 일단 외부적으로 또는 내부적으로 표적 세포와 연합되면, 서셉터 또는 서셉터 접합체는, AMF 에너지가 흡수됨에 따라 고에너지 상태, 예를 들어 뜨겁게 되고, 발생한 열은 예를 들어, 대류, 전도, 방사, 또는 열전달 메커니즘의 조합에 의해 코팅 또는 링커를 통과하고, 간질(interstitial) 부위를 통해 표적 세포로 통과할 수 있다. 열에 노출된 표적 세포는 손상되고, 특정 구현예에서, 그와 같은 표적 세포는 돌이킬 수 없을 정도로 손상될 수 있다. 특정 구현예에, 표적 세포는, 충분한 양의 에너지가 표적 세포로 이동될 때, 괴사, 세포사, 또는 다른 메커니즘을 통해 사멸한다.
환자에 투여된 서셉터 또는 서셉터 접합체의 양은 달라질 수 있으며, 치료될 질환, 및 질환 조직의 위치에 따라 결정될 수 있다. 더욱이, 투여량은 투여 방식에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 서셉터 또는 서셉터 접합체가 종양 근처의 부위에 국소적으로, 또는 전신적으로 투여된다면, 더 낮은 투여량이 필요할 수 있다. 투여될 투여량은 또한 치료될 대상체의 특성(예, 연령, 체중, 성별, 건강상태, 동시 치료의 타입(있을 경우), 및 치료 빈도)에 좌우될 수 있다. 그와 같은 정보가 제공되면, 당업자(예, 임상의)는 치료적 유료량을 구성하는 서셉터 또는 서셉터 접합체의 양을 역량 내에서 결정할 수 있다. 투여의 특정 경로의 선택 및 투여 계획은 최적의 임상 반응을 얻기 위해 당업자에게 공지된 방법에 따라 그와 같은 임상의에 의해 조절 또는 적정(滴定)될 수 있다.
투여의 다양한 경로가 본 발명의 구현예에서 고려될 수 있고, 서셉터 및 서셉터 접합체는 이들이 활성인 임의의 경로에 의해 종래의 방법으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여는 전신, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복막내, 국소, 경피, 경구, 구강(buccal), 또는 눈 경로, 질내, 또는 흡입으로, 데포(depot) 주사로 또는 임플란트에 의할 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 특정 구현예의 서셉터 및 서셉터 접합체의 투여 방식은 (단독으로 또는 다른 약품과 조합하여) 설하, 주사가능 (피하 또는 근육 내로 주사된 단기 작용하는 데포, 임플란트 및 펠렛 형태를 포함함), 또는 질 크림, 좌약, 질 좌약, 질 링(ring), 직장 좌약, 자궁내 장치, 및 경피 형태, 예컨대, 패치 및 크림의 사용일 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 또, 특정 구현예에서, 투여 방법은 혈관내 주사, 정맥내 주사, 복막내 주사, 피하 주사, 및 근육내 주사를 포함할 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 다른 구현예에서, 서셉터 또는 서셉터 접합체는 세척, 세척(lavage), 스펀지에 의한 린스(rinse) 또는 다른 수술용 천을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 페리서지컬(perisurgical) 투여 기술을 사용하여 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 투여 경로는 가열, 조사 및 초음파를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 다른 공지 기술과 조합된 주사 또는 주입을 포함한다.
본 발명의 임의의 구현예의 방법은 서셉터 또는 서셉터 접합체를 약제학적으로 허용가능한 부형제, 비히클 또는 담체와 함께 약제학적 조성물로 제형화하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 약제학적 조성물은 서셉터 또는 서셉터 접합체를 분산 또는 분리하고, 서셉터 또는 서셉터 접합체를 약제학적으로 허용가능한 부형제, 비히클 또는 담체, 및 임의의 다른 성분과 혼합하여 약제학적 조성물을 제형하여 제조된다.
본 발명의 측면의 서셉터 및 서셉터 접합체 및 적당한 담체를 함유하는 약제학적 제형은 정제, 캅셀, 캐세이(cachet), 펠렛, 필(pill), 분말 및 과립을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 고형 투여 형태; 용액, 분말, 유체 에멀젼, 유체 서스펜션, 반고체, 연고, 페이스트, 크림, 겔 및 젤리, 및 폼(foam)을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 국소 투여 형태; 및 용액, 서스펜션, 에멀젼, 및 건조 분말을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 비경구 투여 형태일 수 있다. 활성 성분이 약제학적으로 허용가능한 희석제, 충전제, 붕해제, 바인더, 활제, 계면활성제, 소수성 비히클, 수용성 비히클, 에멀젼화제, 완충용액, 휴멕턴트(humcetant), 습윤제, 가용화제, 보존제 등과 함께 상기 제형에 함유될 수 있음이 또한 당업계에 공지되어 있다. 투여 수단 및 방법은 당업계에 공지되어 있고, 당업자는 안내용 다양한 약리학 참조문헌을 참조할 수 있다. 예를 들어, Modern Pharmaceutics, Banker & Rhodes, Marcel Dekker, Inc (1979); 및 Gtoodman & Gilman's 'The Pharmaceutical Basis of Therapeutics', 6th Edition, MaeMillan Publishing Co., New York (1980) 을 고려할 수 있다.
특히 비경구 투여 경로를 참조하여, 본 발명의 임의의 구현예에서의 서셉터 및 서셉터 접합체는 주사(예, 순간 주사 또는 연속 주입)에 의한 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 서셉터 및 서셉터 접합체는 약 15분 내지 약 24시간에 걸쳐 피하로 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 주사용 제형은 추가된 보존제와 함께 단일 투여 형태(예, 앰풀 또는 다중 투여 용기)로 제공될 수 있다. 제형은 오일성 또는 수성 비히클 중 서스펜션, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다.
경구 투여에 대해, 서셉터 및 서셉터 접합체는 이들 화합물을 당업계에 공지된 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 제형화될 수 있다. 그와 같은 담체는, 환자의 경구 섭취를 위해 서셉터 및 서셉터 접합체가 정제, 필(pill), 당의정, 캅셀, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 서스펜션 등으로서 제형화될 수 있도록 한다. 경구 투여용 약제학적 제형은 고형 부형제를 첨가하고, 수득한 혼합물을 임의로 분쇄하고, 과립의 혼합물을 가공하여 얻을 수 있고, 그후, 정제 또는 당의정 코아(core)를 얻기 위해 필요하다면 적당한 보조제를 첨가한다. 적당한 부형제는 락토오스, 수크로오스, 만니톨 및 소르비톨을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 당과 같은 충전제, 및 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸스, 메틸 셀룰로오스, 히드록시 프로필 메틸-셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸-셀룰로오스, 및 폴리비닐피롤리돈 (PVP)를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 셀룰로오스 제제를 포함하며, 이들로 한정되지 않는다. 필요하다면, 붕해제가 첨가될 수 있고, 그 예는 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 그의 염, 예컨대, 나트륨 알기네이트이고, 이들로 한정되지 않는다.
당의정 코어(core)에는 적당한 코팅이 제공될 수 있다. 이를 위해, 농축 당 용액을 사용할 수 있고, 그 용액은 임의로 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 티타늄 디옥사이드, 래커 용액, 및 적당한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 임의로 함유할 수 있다. 염료 또는 안료는 구별을 위해, 또는 활성 화합물 용량의 상이한 조합에 특성을 부여하기 위해 정제 또는 당의정 코팅물에 첨가될 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 약제학적 제형은 하기를 추가로 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다: 젤라틴으로 만들어진 푸시핏(push-fit) 캅셀, 및 젤라틴 및 가소제, 예컨대, 글리세롤 및 소르비톨로 만들어진 연질 밀봉 캅셀. 상기 푸시핏(push-fit) 캅셀은 예를 들어, 락토오스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제, 및/또는 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 활제 및 임의의 안정화제와 혼합된 서셉터 또는 서셉터 접합체를 함유할 수 있다. 연질 캅셀에서, 서셉터 또는 서셉터 접합체는 적당한 액체, 예컨대, 지방 오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제는 임의로 첨가될 수 있다. 경구 투여용 모든 제형은 그와 같은 투여 방식에 적합한 투여량이어야 한다.
구강(buccal) 투여 경로에서, 서셉터 또는 서셉터 접합체는 당업계에 공지된 종래 기술을 사용하여 정제 또는 (마름모꼴) 정제로서 제형화될 수 있다.
흡입에 의한 투여에 대해, 서셉터 또는 서셉터 접합체는 적당한 추진제 (예, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적당한 가스)의 사용과 함께 에어로졸 스프레이 형태 또는 가압 팩 또는 네뷸라이저(nebulizer)로부터 미스트(mist) 형태로 전달된다. 가압 에어로졸 투여의 경우에, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 젤라틴의 캅셀 및 카트리지는 서셉터 또는 서셉터 접합체 및 적당한 분말 베이스, 예컨대, 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서의 서셉터 또는 서셉터 접합체는 직장 조성물, 예컨대, 좌약 또는 정체 관장, 예컨대, 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드와 같은 종래 좌약 베이스를 함유하는 조성물로 제형화될 수 있다.
서셉터 또는 서셉터 접합체는 또한 데포(depot) 제제로 제형화될 수 있다. 그와 같은 장시간 작용 제형은 하나의 구현예에서 이식 (예, 피하로 또는 근육내로) 또는 근육내 주사로 투여된다. 데포 주사는 약 1 내지 6개월 또는 그 이상의 간격으로 투여될 수 있다. 그러한 것으로, 서셉터 또는 서셉터 접합체는 느린 방출 및 제어 방출을 용이하게 하기 위해 적당한 폴리머성 또는 소수성 물질 (예, 허용가능한 오일 중 에멀젼으로서) 또는 이온교환 수지와 함께, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어, 난용성 염으로서 제형화된다.
경피 투여 경로에서, 본 발명의 임의의 구현예의 서셉터 또는 서셉터 접합체는 플라스터, 또는 당업계에 공지된 다른 경피 치료 시스템에 적용될 수 있다.
서셉터 또는 서셉터 접합체의 약제학적 조성물은 적당한 고형 또는 겔형 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 그와 같은 담체 또는 부형제의 예는 하기를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다: 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 실리카, 당, 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 및 폴리머 (예, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리락트산(PLA), 폴리(D,L-글리콜라이드) (PLG), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA), 및 폴리(시아노아크릴레이트) (PCA)).
본 발명의 측면의 서셉터 및 서셉터 접합체는 다른 활성 성분, 예컨대, 보조제(adjuvant), 프로테아제 억제제, 또는 다른 상용성 의약 또는 화합물과 조합하여 투여될 수 있고, 여기서 그와 같은 조합은 본 명세서에 기재된 방법의 목적하는 목적을 달성함에 있어 바람직하거나 유익하게 보인다.
일단 환자에 투여되면, 서셉터 또는 서셉터 접합체의 표적에의 전달은 입자의 자성 특성에 근거하여 이환 조직의 부위에서 정자기장을 환자에 적용함으로써 향상될 수 있다.
실시예
본 명세서에 개시된 본 발명을 더욱 효과적으로 이해하기 위해, 하기에 실시예를 제공하고, 이들 실시예는 단지 예시하기 위한 것이고 임의의 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되서는 안 된다.
실시예 1. BNF 서셉터의 제조 및 특성화
바이오화 나노페라이트 (BNF) 서셉터를 하기에 기재된 코아-쉘법에 따라 고압 균질화 (HPH)에 의해 제작했다: Gruttner et al. J. Magn . Magn . Mater . 311:181 (2006). 단분산 수성 철 산화물 서스펜션 (25 mg/ml)을 500 bar 초과의 압력 및 70 ℃ 초과의 온도에서 30분 동안 과량의 덱스트란으로 균질화했다. 50％ (w/w) 초과의 철 함량을 갖는 BNF 서셉터를, NdFeB 영구자석에서 결정화 디스크에서 자가 침강 및 탈이온수로 세정한 후 얻었다. 서셉터의 철 함량을, 철 산화물을 농축 염산으로 분해한 후 입자 서스펜션의 입자 농도의 중량 측정법 및 철 농도의 분광광도 측정법(Spectroquant®-Kit, Merck) 으로 측정했다.
BNF 서셉터를, 실온에서 24시간 동안 pH 11 내지 12 에서 변성된 요셉슨(Josephson)법을 사용하여 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르, MW=526 (Aldrich) 및 에피클로로히드린 (ACROS) 의 혼합물로 가교결합했다. 자기 분리, 및 탈이온수에 의한 세정 후, 20-25 mg/ml 의 철 농도를 갖는 BNF 서셉터 서스펜션을 얻었다. 서셉터를, 24시간 동안 실온에서 암모니아와 함께 흔들어서 아미노 기로 관능화했다. BNF 서셉터를, 자기 분리로 탈이온수로 3회 세정하고, 0.22 mm Millex-GP 필터 (Millipore)를 통해 여과했다.
좁은 입자 크기 분포를 갖는 BNF 서셉터를, 제조 조건에 따라 각각 70-100, 40-70 및 20-40 nm 의 3개의 상이한 직경 범위로 얻었다. 가교결합 및 아민화는 초기 입자 직경에 영향을 주지 않았다. 도 3은 광자상관법 (PCS)으로 측정된 바와 같은 25 nm (#0850684G), 50 nm (#0840684G) 및 70 nm (#0440684G)의 평균 직경을 갖는, 3개 로트(lot)의 가교결합되고 아미노 관능화된 BNF 서셉터(도 2Ⅱ)의 크기 분포를 보여준다.
BNF 서셉터 서스펜션의 자기 특성의 예비 평가를, 임피던스 분광법 (IS)으로 자기장에서 용적 자화율의 주파수 의존성을 측정하여 얻었다. 자기 특성화에 대해, BNF 서셉터의 용적 자화율을, 0.1 내지 0.5 mT 범위의 외부 자기장의 진폭에서 IS 에 의해 자기장의 주파수에 대한 의존성으로 측정했다. 도 4는 약 200 Hz (#0440684G)에서 70 nm의 평균 직경을 갖는 실온 자기 입자에서 자기 용적 자화율의 임피던스 분광법 데이터를 묘사하고 있다. 약 200 Hz 에서 BNF 서셉터 로트 #0440684G 의 실온에서의 자화율의 가상부의 공명 피크는 지배적 브라운(Brownian) 완화와 관련된 예상에 따랐다. 상응하는 저주파수 실제 자화율은 서셉터 서스펜션의 고 자철석 함량에 기인하여 0.115 의 값을 갖는다. 이들 결과는, 이들 주파수 및 실온에서 열적으로 차단된 단일 도메인 입자의 상당한 분획을 함유한다는 것을 암시한다.
BNF 서셉터의 전자파 흡수율(SAR)을, 15371 kHz 의 고정 주파수를 갖는 AMF 로 입자를 가열시키고 유속 밀도를 변화시켜서 적당히 변성된 AMF 열량계로 측정했다. 표 1에서 보는 바와 같이, 각 서셉터 타입에 대한 SAR 값을, 솔레노이드 코일에서 산출된 AMF 로 입자 서스펜션을 가열했을 때 물에서 측정된 온도 상승률로부터 계산했다. SAR 값을, 적당한 참조 대상, 물 또는 인산염 완충 식염수 (PBS)를 사용하여 열량계 및 코일의 열적 특성에 대해 보정했고, 철 함량으로 규정화했다. 추가로 표 1에 나타낸 바와 같이, BNF 서셉터의 SAR 데이터는 20 nm 의 nanomag® D-spio 입자의 상응하는 데이터보다 6 내지 7 배 더 높다. 이들 결과는, 종양 반응에서의 상당한 증가는 항종양 모노클로날 항체에 연결된 유효 농도의 BNF 서셉터가 암 세포에 도달하고 외부 AMF 공급원에 의해 가열되도록 할 때 일어난다는 것을 암시한다.
AMF 의 진폭의 함수로서 BNF 서셉터에 대한 SAR 데이터
서셉터 타입 (직경) SAR (W/'g 철)
29 kA/m 58 kA/m 86 kA/m 104 kA/m
BNF-1 (90 nm) 140 437 528 642
BNF-2 (60 nm) 131 389 476 523
BNF-3 (30 nm) 90 253 380 438
nanomag®-D-spio (20 nm) 27 66 76 105
(비교하기 위해 제공된 nanomag®-D-spio SAR 데이타)
실시예 2 . BNF 서셉터의 표면 상의 공유적 항체 결합
항체 모델인 래빗 안티-고우트(rabbit anti-goat) IgG 를 BNF 서셉터에 공유적으로 결합시키기 위한 각종 전략을, 고우트 안티-래빗 IgG-호오스(horse) 무(raddish) 페록시다아제 (HRP) 및 고우트 안티-마우스 IgG-HRP 로 면역검사를 사용하여 평가했다. 항체 분자의 아미노 기와의 반응에 기반을 둔 항체 결합 전략을, 설프히드릴 표지된 항체를 필요로 하는 것과 비교했다.
실시예 3 . 표면 상에 폴리에틸렌 글리콜 COOH 기를 가지며 래빗 안티-고우트 IgG 와 접합된 BNF 서셉터의 합성
5 mg (26 μmol) N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 14 ㎕ (26 μmol) 폴리에틸렌 글리콜 600 2산을 1 ml 의 0.5 M 2-(N-모폴리노)에탄설폰산(MES) 완충용액 (pH = 6.3)에 용해시키고, 10분 동안 50℃에서 인큐베이팅했다. 혼합물을 4 ml 의 아미노 관능화된 BNF 서셉터 (도 2Ⅱ) (34.4 mg Fe, 48 mg 입자)에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 Labquake® 믹서 상에서 흔들었다. 수득한 BNF-PEG-COOH 서셉터를 자기 분리에 의해 탈이온수로 3회 세정하고, 0.22 mm 의 Millex-GP 필터를 통해 여과하여 5.3 mg/ml 의 철 농도를 갖는 5 ml 의 서스펜션 (도 2 Ⅲ)을 얻었다.
500 ㎕ 의 상기 서스펜션을, 125 ml 의 0.5M 의 MES 완충용액 (pH = 6.3) 중 0.6 mg (3 μmol) EDC 및 1.2 mg (10 μmol) N-히드록시숙신이미드 (NHS)의 용액과 혼합하고, 실온에서 90분 동안 흔들었다. 입자를 인산염 완충 식염수 (PBS) (pH =7.4)로 자기 분리로 2회 세정한 후, 100 ml 의 래빗 안티-고우트 IgG (400 mg/ml)를 첨가했다. 혼합물을 3시간 동안 흔들고, 반응물을 PBS 중 글리신의 첨가로 퀀칭시키고, 자기 분리에 의해 PBS 완충용액으로 3회 세정하여 2 mg/ml 의 철 농도를 갖는 1.2 ml 의 항체 접합 BNF-PEG-COOH 서셉터 (도 2 IV)를 얻었다.
실시예 4 . 표면 상에 ANB 기를 가지며 래빗 안티-고우트 IgG 와 접합된 BNF 서셉터의 합성
N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드 (ANB-NOS)를 포함하는 모든 반응을, 광으로부터 보호 하에서 수행했다. 카보네이트 용액 (pH = 8.5) 중 ANB-NOS (1 mM 의 1.5 ml)을 500 ㎕ 의 아미노 관능화 BNF 서셉터 (도 2Ⅱ) (4.3 mg Fe, 6 mg 입자)와 혼합하고, 2시간 동안 실온에서 흔들었다. BNF-ANB 서셉터를, 자기 분리로 인산염 완충 식염수 (PBS) (pH = 7.4)로 2회 세정하여 3.8 mg/ml 의 철 농도를 갖는 1 ml 의 서스펜션 (도 2 V)을 얻었다. 100 ㎕ 의 래빗 안티-고우트 IgG (400 mg/ml)를 서셉터에 첨가하고, 302 nm 광에 노출시키면서 혼합물을 2시간 동안 흔들었다. 반응물을, PBS 중 글리신의 용액을 첨가하여 퀀칭시키고, 그 다음, 자기 분리로 PBS 완충용액으로 3회 세정하여 2.1 mg/ml 의 철 농도를 갖는 항체 접합 BNF-ANB 서셉터 (도 2 IV)의 1.2 ml 서스펜션을 얻었다.
실시예 5 . 래빗 안티-고우트 IgG의 설프히드릴 표지화
래빗 안티-고우트 IgG을, 제조자 설명서를 사용하여 N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트 (SATA)와의 반응, 그 다음, 히드록실아민에 의한 탈아세틸화로 설프히드릴 기로 표지화했다. 500 ㎕ 의 래빗 안티-고우트 IgG (400 mg/ml), 및 디메틸포름아미드(DMF) (4 mg/ml) 중 2 ml 의 SATA 용액을 30분 동안 실온에서 인큐베이팅했다. 0.1 M PBS 완충용액 중 20 ㎕ 의 히드록실아민 용액, 및 0.005M EDTA (5 mg/100 ml)을 항체 용액에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 인큐베이팅했다. 그 다음, 항체를 G25 칼럼으로 정제했다. SH-표지화된 래빗 안티-고우트 IgG 의 농도를 280 nm 에서 흡수 측정법으로 측정했다.
실시예 6. 표면 상에 2-피리딜디설파이드 기를 가지며 설프히드릴 표지화된 래빗 안티-고우트 IgG 와 접합된 BNF 서셉터의 합성
500 ㎕ 의 아미노 관능화 BNF 서셉터 (도 2Ⅱ) (4.3 mg Fe, 6mg 입자)를 500 ml 의 PBS 완충용액 및 800 ㎕ 의 20 mM N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP)와 혼합했다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 흔들고, 자기 분리에 의해 인산염 완충 식염수 (PBS)로 3회 세정하여 4.1 mg/ml 의 철 농도를 갖는 BNF-SPD 서셉터 (도 2 Ⅶ)의 1 ml 서스펜션을 얻었다. 부착된 2-피리딜디설파이드 기의 수를, 제조자 설명서를 사용하여 측정했다. PBS 중 100 ㎕ 의 BNF-SPDP 서셉터 (도 2 Ⅶ) (4.1 mg/ml Fe) 및 PBS 중 100 ml 의 참조 아미노 관능화 BNF 서셉터 (도 2Ⅱ) (4.0 mg/ml Fe) 각각을 PBS 중 100 ml 의 50 mM 디티오트레이톨(DTT) 용액으로 인큐베이팅하고, 15분 동안 실온에서 흔들었다. 그 다음, 서셉터를 15분 동안 15,000 rpm 에서 원심분리하고, 상청액의 흡수도를 343 nm 에서 측정하고, 기록했다. BNF-SPDP 서셉터의 상청액 및 참조 아미노 관능화 BNF 서셉터의 흡수도의 차이를 사용하여 343 nm 에서 8080 M-1 cm- 1 의 몰 흡광 계수를 사용하여 2-피리딜디설파이드 농도를 계산했다. 수득된 BNF-SPDP 서셉터의 표면 상의 2-피리딜디설파이드 기의 농도(도 2 Ⅶ)는 37 nmol/mg 철이었다.
4.1 mg/ml의 철 농도를 갖는 900 ㎕ 의 BNF-SPDP 서셉터 (도 2 Ⅶ) 서스펜션을, 실온에서 3시간 동안 PBS 중 1 ml 의 설프히드릴 변성 래빗 안티-고우트 IgG (96 ㎍/ml)와 함께 인큐베이팅하고, 자기 분리로 PBS 완충용액으로 3회 세정하여 3.6 mg/ml 의 철 농도를 갖는 항체 접합 BNF-SPDP 서셉터 (도 2 Ⅷ)의 1 ml 서스펜션을 얻었다.
실시예 7. 표면 상에 말레이미드 기를 가지며 설프히드릴 표지화된 래빗 안티-고우트 IgG 와 접합된 BNF 서셉터의 합성
7.5 mmol 의 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 히드로클로라이드(EDC) 및 7.7 mmol 의 N-말레오일-b-알라닌을 125 ml 의 0.5 M 의 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 완충용액 (pH = 6.3)에 용해시키고 10분 동안 50℃에서 인큐베이팅했다. 혼합물을 500 ml 의 아미노 관능화된 BNF 서셉터 (도 2Ⅱ) (4.3 mg Fe, 6 mg 입자)에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 흔들었다. 수득한 BNF-말레이미드 서셉터 (도 2 IX)를 자기 분리로 탈이온수로 3회 세정하고, 0.22 mm 의 Millex-GP 필터를 통해 여과하여 4.0 mg/ml의 철 농도를 갖는 1 ml 의 서스펜션을 얻었다. 이 BNF-말레이미드 서셉터 서스펜션을, 인산염 완충 식염수 (PBS) 중 1 ml 의 설프히드릴 변성 래빗 안티-고우트 IgG (96 mg/ml)과 함께 실온에서 3시간 동안 인큐베이팅하고, 자기 분리로 PBS 완충용액으로 3회 세정하여 3.8 mg/ml 의 철 농도를 갖는 항체 접합 BNF-말레이미드 서셉터 (도 2X)의 1 ml 의 서스펜션을 얻었다.
실시예 8. BNF-항체 서셉터 접합체의 면역반응성 연구
2단계 면역검사를 전개하여 도 2에서 묘사된 상이한 항체 결합 전략의 효능을 비교했다. 첫 번째 단계에서, 결합된 래빗 안티-고우트 IgG의 총량을, 2차 항체로서 HRP 표지된 고우트 안티-래빗 IgG 를 사용하여 특성화했다. 이러한 2차 항체는 다양한 방식으로 래빗 안티-고우트 입자 접합체과 상호작용할 수 있다. 도 5a 는 2가지 방식을 설명하는 개략도인데, 여기서 2차 고우트 안티-래빗 항체는 BNF 서셉터의 표면에 접합된 래빗 안티-고우트 항체와 상호작용할 수 있다. 두 번째 단계에서, 결합된 면역반응성 래빗 안티-고우트 IgG 의 총량을, HRP 표지된 고우트 안티-마우스 IgG 를 사용하여 측정했다. 이러한 2차 항체는, 1차 항체가 정확한 방위로 부착된다면, 단지 서셉터 표면 상에서 결합될 수 있다. 도 5b는, 래빗 안티-고우트가 알맞은 방위에 있을 때 고우트 안티-마우스 항체가 오직 래빗 안티-고우트 항체 접합체과 상호반응할 수 있다는 것을 설명하는 개략도이다.
래빗 안티-고우트 IgG 표지된 서셉터 (도 2IV, Ⅵ, Ⅷ 및 X)를, 0.05％ 폴리소르베이트 20 (Tween 20)을 함유하는 0.01 M 인산염 완충 식염수 (PBS) (pH = 7.4)로 2회 세정했다. 서셉터를, 실온에서 2시간 동안 흔들면서 0.05％ 폴리소르베이트 20 및 1％ 비스(트리메틸실릴)아세트아미드 (BSA) 를 함유하는 1 ml 의 0.01 M PBS (pH = 7.4)로 차단했다. 0.05％ 폴리소르베이트 20 을 함유하는 0.01 M PBS (pH = 7.4)로 3회 세정한 후, 서셉터 서스펜션의 철 농도를 특성화하고, 각 서스펜션이 동일한 철 농도를 갖도록 조정했다. 록커(rocker) 상에서 실온에서 2시간 동안 HRP 표지된 고우트 안티-래빗 IgG 로 인큐베이팅한 후, 서셉터를 15분 동안 23,000 rpm 에서 원심분리했다. 비결합된 HRP 표지된 고우트 안티-래빗 IgG 을 함유한 상청액의 200 ml 분취량을, 0.012％ 의 30％ 과산화수소를 함유하는 50 ml 의 2.2 mM 1,2-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 (OPD)로 10분 동안 실온에서 전개시켰다. 반응을 50 ml 의 1.8 M 황산의 첨가로 중지시키고, 흡수도를 492 nm 에서 측정했다. 서셉터의 표면 상에 공유적으로 결합된 래빗 안티-고우트 IgG 의 양을, 래빗 안티-고우트 IgG 표지된 서셉터 (도 2 IV, Ⅵ, Ⅷ 및 X)로 인큐베이팅한 후, 2차 HRP 표지된 고우트 안티-래빗 IgG 의 사라짐을 모니터하여 측정했다.
서셉터 표면 상의 면역반응성 항체 분획을, 상기에 기재된 것과 동일한 방법으로 2차 항체로서 HRP 표지된 고우트 안티-마우스 IgG 을 사용하여 측정했다. 결합된 HRP 표지된 고우트 안티-마우스 IgG 2차 항체의 양은 서셉터 표면 상의 면역반응성 1차 항체 분자만을 나타낸다. 비특이적으로 결합된 HRP 표지된 고우트 안티-래빗 및 고우트 안티-마우스 항체의 양은, 대조 아미노 관능화 BNF 서셉터와 대비하여 비교할 때 무시할 정도였다 (도 2Ⅱ)
항체 표지된 BNF 서셉터를 얻기 위해 4개의 상이한 항체-서셉터 접합 전략의 면역검사 결과의 비교 (도 2 IV, Ⅵ, Ⅷ 및 X)는 도 6에 나타나 있다. 도 6은, 도 2 에서 예시된 전략을 사용하여 제조된 항체 접합 서셉터와, 면역반응성/철 1 mg 에 대해 비교된 총 결합 항체를 묘사하는 막대 그래프이다. SPDP 및 말레이미드계 접합 방법을 사용하여 서셉터 표면에 결합된 항체의 총량은 표면 상의 PEG-COOH 또는 ANB 기를 사용하여 접합된 항체보다 28％ 내지 30％ 더 높다. PEG-COOH 및 ANB-NOS계 접합 전략은 단지 서셉터 표면 상의 면역반응성 항체의 약 24％ 내지 27％ 로 귀결되지만, SPDP 및 말레이미드계 방법은 공유적으로 부착된 1차 항체의 총량에 대해 관련 면역반응성 항체의 66-67％ 로 된다.
실험 결과에 따르면, 안정한 높은 SAR 자기 서셉터의 합성은 생체적합성 물질로 가능할 수 있다. 또, 입자 완전성 및 콜로이드 안전성을 유지하면서, 다양한 기술을 사용하여 항체를 서셉터에 접합할 수 있다.
실시예 10. BNF-항체 서셉터 접합체의 제조 및 특성화
먼저, 트라스투주맙 (Trastuzumab)을 2-이미노티올란을 사용하여 티올로 전환한다. 그 다음, 탈가스된 인산염 완충 식염수 (PBS) 중 약 2×10-5 M 티올화 트라스투주맙의 총 1 내지 2 ml 를, 탈가스된 PBS 중 20 ml (400 mg) 의 BNF-말레이미드 서셉터에 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 적어도 1시간 동안 흔든다. 그 다음, 충분한 N-에틸말레이미드(NEM)를 첨가하여 그 시약 중 10 mM 용액을 달성했다. 혼합물을 약 40분 동안 흔든 다음, 약 30분 동안 자기 분리를 수행한다. 상청액을 제거하고, 새로운 완충용액을 다음 자기 분리를 위해 첨가한다. 세정을 2회 이상 반복한 다음, 서셉터 접합체를 2 mM 머캅토에탄올에 재현탁시킨다. 그 다음, 서스펜션을 흔들고, 항체-관능화 서셉터 접합체가 PBS 에서 재현탁되는 시점에서 2회 이상의 세정물에 대해 연속 세정을 계속했다.
서셉터 접합체의 최종 현탁액에 대해 철 분석을 수행하였다. 측정된 철 농도를 20mg/ml 입자 표준(동일한 마이크로모드 로트로부터 수득)의 철 농도와 비교함으로써 서셉터 접합체 약 20mg/ml를 수득하기 위한 최종 용적 조정을 용이하게 할 수 있었다.
전자파 흡수율(W/철 g)(SAR)을 FISO Technologies UMI4 유니버셜 멀티채널 기기(FISO Commander 2 Standard Edition, Techtronix IDS 2024B에 의한 보정 곡선)를 사용하여 수득하였다.
서셉터 접합체의 결합 능력을 린드모(Lindmo) 등의 방법으로부터 개조된 직접 세포 결합 분석법을 사용하여 측정하였다. 표적 항원을 발현하는 불사화(immortalized) 사람 종양 세포를 조직 배양액으로부터 수거하였다. 세포를 세척하고, 세포에 대한 항원 발현에 따라 반응 튜브에 과량의 항원을 제공하기에 충분한 농도로, 통상적으로 튜브당 2천만 내지 5천 만개로 차단 완충액에 재현탁시켰다. 세포 농도를 증가시키면서 다중 마이크로튜브를 제조하였다. 소량의 서셉터-항체 콘주게이트, 통상적으로 2㎍ 미만을 각각의 마이크로튜브에 가하였다. 세포 및 서셉터-항체 콘주게이트는 4시간 동안 4℃에서 일정하게 혼합하면서 배양하였다. 결합되지 않은 서셉터 접합체를 5마이크론 나일론 필터를 사용하여 결합된 서셉터 접합체로부터 분리하였다. 결합된 부분의 철 함량을, 결합되지 않은 부분 중의 철을 측정하고, 시험에 첨가된 철의 초기 양으로부터 빼서 계산하였다. 결과를 무한 항원 과량의 세포 농도에 대해 플로팅된 결합 서셉터 접합체의 부분으로서 보고하였다. 서셉터 접합체의 비특이적 결합을 비관련 항체에 결합된 서셉터 접합체를 사용하여 동일한 분석을 수행함으로써 측정하였다.
결합 조사를 위한 준비시, 부착성 세포(ING-1에 대한 HT-29, 허셉틴에 대한 SKBR-3)를 96웰 플레이트에서 적합한 배지에서 컨플루언시(confluency)로 성장시켯다.
포화 결합 실험을 위해서, 농도가 0 내지 1000nM인 125-I 표지된 리간드(ING-1, 허셉틴 또는 BNF-서셉터 접합체)를 96웰 플레이트의 줄을 가로질러 순차 희석(통상적으로 1:1 또는 1:3)에 의해 제조하고, 웰당 통상적인 최종 용적은 100ul이다. 플레이트를 4℃ 내지 실온에서 2 내지 20시간 동안 (진탕시키거나 진탕시키지 않으면서) 배양하여 평형 결합을 이루었다. 결합시킨 후, 웰을 100ul 세척 완충액(통상적으로 1×PBS/0.1％ BSA 또는 McCoy의 5a/10％ FCS)으로 3회 세척하였다. 실온에서 20 내지 30분 동안 0.1N NaOH 100ul로 웰로부터 결합된 카운트(count)를 스트립핑하였다. 스트립핑 용액을 튜브로 옮기고 감마 카운터로 계수하였다. 카운트를, 비선형 곡선을 작성하고 Bmax 및 Kd 값을 계산하는 GraphPad Prism에 도입하였다.
경쟁적 결합 실험을 위해서, 125-I 표지된 고특이성 활성 리간드(극소량-전형적 [극소량]=0.1 내지 5.0nM)를 96웰 플레이트의 줄을 교차하여 연속 희석에 의해 제조된 농도 0 내지 1000nM의 표지되지 않은 리간드와 혼합하였고, 웰당 통상적인 최종 용적은 100ul이다. 플레이트를 4℃ 내지 실온에서 2 내지 20시간 동안 (진탕시키거나 진탕시키지 않으면서) 배양하여 평형 결합을 이루었다. 결합시킨 후, 웰을 100ul 세척 완충액(통상적으로 1×PBS/0.1％ BSA 또는 McCoy의 5a/10％ FCS)으로 3회 세척하였다. 실온에서 20 내지 30분 동안 0.1N NaOH 100ul로 웰로부터 결합된 카운트를 스트립핑하였다. 스트립핑 용액을 튜브로 옮기고 감마 카운터로 계수하였다. 카운트를, 비선형 곡선을 작성하고 EC50 및 Ki 값을 계산하는 GraphPad Prism에 도입하였다.
ING-1-BNF, HER-BNF 및 대조용 (IgG) 복합체 제제의 요약
BNF-Her BNF-IgG1 BNF-ING2 BNF-ING2
로트#1 로트#2
세포당 Ab 20 30 30 24
Z-평균/PDI 158/0.170 155/0.133 158/0.177 156/0.206
Fe mg/ml 11.8 12.9 13.7 13
고형물 mg/ml 18.6 19.7 21.7 19.5
SAR 1:1
물로 희석		 249w/g Fe 247w/g Fe 235w/g Fe 274 w/g Fe
희석되지 않은 SAR 133w/g Fe 201 w/g Fe 278 w/g Fe
면역반응성 결합된 SKBR-3 세포: 64 내지 68％
배경: 21 내지 36％		 SKBR-3 세포
배경: 21 내지 36％		 결합된 HT-29 세포: 80％
배경: 26％		 결합된 HT-29 세포: 75％
배경: 25％
경쟁적 결합
I-125
log EC50 BNF-Ab
대 순수 Ab

델타EC50:
1.0 내지 1.1


결합하지 않음


측정되지 않음


측정되지 않음
1: 상기된 방법에 따라 시판되는 다클론성 사람 IgG를 사용하여 제조된 비결합 대조용 서셉터 접합체.
2: 상기한 방법에 따라 인간화된 항-EpCAM 항체(지정된 ING-1)를 사용하여 제조된 서셉터 접합체.
본 발명을 특정의 바람직한 측면과 관련하여 상당히 상세히 설명하였지만, 다른 버젼도 가능하다. 따라서, 첨부된 청구의 범위의 취지 및 범위는 이 명세서에 함유된 설명 및 바람직한 버젼으로 제한되어서는 안된다.

Claims (50)

  1. 단일 자성 도메인을 형성하는 아미노 관능화된 나노입자; 상기 아미노 관능화된 나노입자와 연통하는 적어도 하나의 링커; 및 상기 아미노 관능화된 나노입자 또는 상기 링커에 커플링된 적어도 하나의 리간드를 포함하는, 리간드 접합 입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 자성 나노입자는 바이오화(bionized) 나노페라이트를 포함하는, 리간드 접합 입자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 자성 나노입자는 50％ (w/w) 초과의 철 함량을 갖는, 리간드 접합 입자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 링커는 2관능성 화합물인, 리간드 접합 입자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 링커는 할로알킬, 에폭사이드, 비닐 헤테로큐뮬린, 에폭시프로펜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 또는 그의 조합물로부터 선택된 하나 이상의 서브유닛을 포함하는 다중 서브유닛 조성물인, 리간드 접합 입자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 링커는 하나 이상의 친수성 서브유닛을 포함하는, 리간드 접합 입자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 링커는 화학적으로 상이한 화합물의 혼합물을 포함하는, 리간드 접합 입자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 링커는 적어도 하나의 디에폭사이드, 적어도 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 에폭시에테르, 적어도 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르, 적어도 하나의 에피클로로히드린 또는 그의 조합물을 포함하는, 리간드 접합 입자.
  9. 제1항에 있어서, 상기 링커는 에피클로로히드린 및 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르의 혼합물을 포함하는, 리간드 접합 입자.
  10. 제1항에 있어서, 상기 아미노 관능화된 입자는 하부구조를 포함하고, 상기 하부구조는 적어도 하나의 링커, 적어도 하나의 리간드, 적어도 하나의 킬레이터 또는 그의 조합물을 포함하는, 리간드 접합 입자.
  11. 제1항에 있어서, 상기 링커는 아민, 티올, 히드라진, 아지드, 디설파이드, 설폰산, 카르복실산, 말레이미드 또는 그의 조합물로부터 선택된 하나 이상의 말단 반응성 그룹을 포함하는, 리간드 접합 입자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 말단 그룹의 반응성은 치환 또는 부가 화학에 기반을 둔, 리간드 접합 입자.
  13. 제11항에 있어서, 상기 카르복실산은 폴리(에틸렌 글리콜)에테르계 카르복실산인, 리간드 접합 입자.
  14. 제11항에 있어서, 상기 아지드는 5-아지도-2-니트로벤즈아미드인, 리간드 접합 입자.
  15. 제11항에 있어서, 상기 디설파이드는 3-(2-피리딜디티오) 프로피온아미드인, 리간드 접합 입자.
  16. 제11항에 있어서, 상기 말레이미드는 1,2-디아실에텐 또는 3-말레이미딜 프로피온아미드인, 리간드 접합 입자.
  17. 제1항에 있어서, 상기 리간드는 항체인, 리간드 접합 입자.
  18. 제1항에 있어서, 상기 리간드는 티올 또는 아민으로부터 선택된 기의 혼입에 의해 변성되는, 리간드 접합 입자.
  19. 제1항에 있어서, 상기 리간드는 N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트로 변성되는, 리간드 접합 입자.
  20. 제1항에 있어서, 생체적합성 피막을 추가로 포함하는, 리간드 접합 입자.
  21. 제20항에 있어서, 상기 아미노 관능화된 나노입자의 표면은 생체적합성 피막을 형성하는, 리간드 접합 입자.
  22. 제1항에 있어서, 상기 입자는 온열요법제인, 리간드 접합 입자.
  23. 관능화된 자성 나노입자, 및 상기 관능화된 자성 나노입자와 연통하는 적어도 하나의 링커를 포함하며, 여기서 리간드 접합 나노 입자의 전자파 흡수율(SAR)은 20 nm 나노맥-D-스피오 (nanomag® D-spio) 입자보다 적어도 5배 높은, 리간드 접합 입자.
  24. 제23항에 있어서, 상기 관능화된 자성 나노입자 또는 링커에 커플링된 리간드를 추가로 포함하는, 리간드 접합 입자.
  25. 유효량의 제1항에 따른 리간드 접합 입자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 질병을 치료하는 방법.
  26. (i) 단일 자성 도메인을 형성하는 입자를 아미노 또는 니트로 그룹으로 관능화하는 단계, (ⅱ) 상기 관능화된 입자를 링커와 접촉시키는 단계, 및 (ⅲ) 리간드를 상기 입자 또는 상기 링커에 커플링시켜 리간드 접합 입자를 형성하는 단계를 포함하는, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 단일 자성 도메인을 형성하는 나노입자는 바이오화 나노페라이트를 포함하는, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 단일 자성 도메인을 형성하는 나노입자는 50％ (w/w) 초과의 철 함량을 갖는, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  29. 제26항에 있어서, 상기 링커는 2관능성 화합물인, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  30. 제26항에 있어서, 상기 링커는 할로알킬, 에폭사이드, 비닐 헤테로큐뮬린, 에폭시프로펜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 또는 그의 조합물로부터 선택된 하나 이상의 서브유닛을 포함하는 다중 서브유닛 조성물인, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  31. 제26항에 있어서, 상기 링커는 하나 이상의 친수성 서브유닛을 포함하는, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  32. 제26항에 있어서, 상기 링커는 화학적으로 상이한 화합물의 혼합물을 포함하는, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  33. 제26항에 있어서, 상기 링커는 적어도 하나의 디에폭사이드, 적어도 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 에폭시에테르, 적어도 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르, 적어도 하나의 에피클로로히드린 또는 그의 조합물을 포함하는, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  34. 제26항에 있어서, 상기 링커는 에피클로로히드린 및 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르의 혼합물을 포함하는, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  35. 제26항에 있어서, 상기 링커는 아민, 티올, 히드라진, 아지드, 디설파이드, 설폰산, 카르복실산, 말레이미드 또는 그의 조합물로부터 선택된 하나 이상의 말단 반응성 그룹을 포함하는, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 말단 그룹의 반응성은 치환 또는 부가 화학에 기반을 둔, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 카르복실산은 폴리(에틸렌 글리콜)에테르계 카르복실산인, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  38. 제35항에 있어서, 상기 아지드는 5-아지도-2-니트로벤즈아미드인, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  39. 제35항에 있어서, 상기 디설파이드는 3-(2-피리딜디티오)프로피온아미드인, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  40. 제35항에 있어서, 상기 말레이미드는 1,2-디아실에텐 또는 3-말레이미딜프로피온아미드인, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  41. 제26항에 있어서, 상기 리간드는 항체인, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  42. 제26항에 있어서, 상기 리간드는 티올 또는 아민으로부터 선택된 기의 혼입에 의해 변성되는, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  43. 제26항에 있어서, 상기 리간드는 N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트로 변성되는, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  44. 제26항에 있어서, 상기 관능화 단계는 약 7 내지 약 9의 pH에서 일어나는, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  45. 제26항에 있어서, 리간드 접합 입자를 수성 완충용액으로 세정하는 추가의 단계를 추가로 포함하는, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  46. 제26항에 있어서, 리간드 접합 입자를 살균하는 단계를 추가로 포함하는, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  47. 제26항에 있어서, 상기 세정 단계는 약 5 내지 약 8의 pH에서 일어나는, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  48. 제26항에 있어서, 상기 리간드를 상기 입자 또는 상기 링커에 커플링시켜 리간드 접합 입자를 형성하는 단계는 관능화된 입자를 링커와 접촉시키는 단계의 12시간 이내에 일어나는, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  49. 제26항에 있어서, 상기 리간드 접합 입자는 10 내지 80 nm 범위의 크기인, 리간드 접합 입자의 제조 방법.
  50. (i) 단일 자성 도메인을 형성하는 입자를 아미노 또는 니트로 그룹으로 관능화하는 단계, (ⅱ) 상기 관능화된 입자를 링커와 접촉시키는 단계, 및 (ⅲ) 리간드를 상기 입자 또는 상기 링커에 커플링시켜 리간드 접합 입자를 형성하는 단계를 포함하는 방법으로 제조한 온열요법용 나노입자.
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