CN101951890A - 配体缀合的热疗感受器及其制备方法 - Google Patents

配体缀合的热疗感受器及其制备方法 Download PDF

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Abstract

作为几种缀合这样的纳米颗粒的策略，本文描述了在热疗应用中展现出增强的发热能力的磁性纳米颗粒。还提供了针对使用缀合的纳米颗粒的方法。

Description

配体缀合的热疗感受器及其制备方法 
相关申请的交叉引用 
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2007年12月13日递交的美国临时专利申请序列号61/013,412的优先权，其公开通过引用被整体并入本文。 
技术领域
本发明总地涉及有疗效的纳米颗粒组合物，并且更具体地涉及用于热疗的配体缀合的纳米颗粒以及这样的颗粒的制备方法。 
背景技术
针对疾病(例如癌症和一些基于病原体的疾病)的常规治疗包括侵入性的且可能伴随有害副作用(例如，对健康细胞的毒性，正常身体功能的扰乱)的治疗，常导致仅具适度成功的疗法的创伤过程。举例来说，针对癌症的常规治疗典型地包括局部疗法，所述局部疗法包括继以全身性治疗(例如放射性疗法和/或化学疗法)的外科手术。这些技术并非总是有效，并且即便有效，它们也具有一些缺陷的特征。举例来说，外科手术可能导致外形损伤，并且受影响的组织的不完全去除可能伴随癌症复发的较大风险。放射性疗法和化学疗法可能使患者身体精疲力竭，并且不是完全有效地防御复发。 
作为另一个例子，基于病原体的疾病的治疗常常包括作为第一步的广谱抗生素的给予。该行动步骤对抗病毒病原体是没有效果的，并且常常消灭肠中对于食物的适当消化所必须的良性的肠道菌群，导致胃肠不适，直至所述的良性细菌可以繁殖。在其他例子中，耐抗生素的细菌性病原体不响应于抗生素的治疗。此外，旨在治疗病毒性疾病的疗法常常仅靶向于侵入的病毒自身。已被病毒侵入并占用以供产生所述病毒的额外的拷贝的细胞保持存活。因此，所述疾病的进展仅仅是被抗生素的治疗延迟，而非终止。 
常规治疗的可替代选择是免疫疗法，所述免疫疗法是治疗包括癌症的多种人类疾病的一迅速扩展的途径。所具有的工程化改造(engineer)抗体、抗体片段以及具改变的性质(例如抗原亲合力、分子结构和特异性)的肽的能力已经扩展了它们在治疗学中的使用，如在鼠源抗体的嵌合化和人源化以降低在人类中的免疫源应答中具有的进步。此外，噬菌体展示技术、核糖体展示技术和DNA改组已经允许作为靶向于配体使用的抗体片段和具高亲和力以及低免疫原性的肽的发现。这些进步，以及其他的进步，已经使得设计伴随最小免疫应答的具特异抗原结合的亲和力和特异性的免疫疗法方案成为可能。 
免疫治疗方法分成至少三个类别：(1)靶向于生长受体(growth receptors)的抗体的部署，扰乱细胞因子通路或诱导补体或依赖于抗体的细胞毒性；(2)直接装备好的抗体，包括附着于抗体的毒素、放射性核素或细胞因子；以及(3)间接装备好的抗体，所述抗体被附着了免疫脂质体，所述免疫脂质体包含毒素或附着于免疫细胞效应器(双特异性抗体)。依赖于毒素或放射性核素的递送的免疫治疗方法的缺点是这些试剂一直是活性的。就这点而论，存在对非肿瘤细胞的损伤，以及与免疫疗法相关联的毒性问题的潜在可能。举例来说，癌症细胞通常流出(shed)表面表达抗原进入血流，所述表面表达抗原被免疫治疗方法所靶向。作为结果，许多基于抗体的疗法在到达患病组织之前由于所述抗体与流出的抗原而非癌症细胞相互作用而被稀释，从而减少了实际递送至患病组织的剂量。 
因为这些以及其他相关的原因，提供用于治疗疾病的可替换的和改善的技术，特别是比现存技术较少侵入和创伤的技术是合乎期望的。提供仅在被靶向的位置(例如患病组织、病原体或身体内的其他不良事件)有效的治疗也是合乎期望的，所述治疗使不良副作用最小化并且改善效力。进一步地，提供能够在单个的或者极少数的治疗时间(treatment sessions)进行的技术以促进患者的配合度是合乎期望的。 
热疗法作为针对癌症和其他疾病的治疗可能是有希望的，因为其诱导瞬时坏死(典型地被称为“热切除”)和/或细胞中的热休克反应(标准的过热)，导致经由细胞内部一系列生化变化的细胞死亡。因为从约40℃到约46℃的温度可以造成对患病细胞的不可逆损伤，并且健康细胞能够在暴露于高达46.5℃左右的温度存活，将患病组织中细胞的温度提高至约40℃到约46℃之间可以提供选择性破坏患病细胞而不对正常的健康组织造成损伤的治疗选择。进一步地，高于46℃的温度通过造成瞬时的热切除反应针对癌症和其他疾病的治疗可以是有效的。然而，准确和精确的靶向是必须的，以确保最低量的健康组织暴露于这样的温度。 
与电离辐射(例如紫外线、X射线、γ射线、β射线、α射线、中子射线或化学疗法)组合的热疗法经常导致增强的细胞毒作用，所述增强的细胞毒作用可以显著地比从电离能量或化学疗法剂量的相加组合所预期的大。举例来说，对于本为亚致死剂量的化学治疗剂或电离辐射，当其剂量与热疗法结合时，细胞可以展现出高水平的敏感性，即便所述热疗法也是在亚致死剂量给予。这样的结合疗法具有显著的临床潜能，因为来自一剂量的热或电离辐射的损伤副作用可以被最小化或被避免。 
热疗法的有益效果可以通过适当地将所述热疗试剂(即感应器)靶向至患病的细胞、组织或病原体被进一步被复合化(compounded)。 
一些热疗法系统使用微波或射频(RF)过热，例如环形相控阵系统(APAS)，以针对患者中深位的肿瘤的局部发热调整能量。这样的技术受组织导电率的不均一性和高度灌注组织的不均一性所限制。典型的问题包括健康组织中的“热点”和并存的患病组织中的剂量不足，以及足够精确地决定递送至合乎期望的区的热剂量。后者妨碍了规范的临床方 案的发展，而规范的临床方案是确保治疗之后的患者利益的可重复和可预测所必须的。所有这些因素使得以这样的热疗系统选择性加热特异区域非常困难。 
发明概述 
本文描述的本发明针对配体缀合的颗粒，以及在某些实施方案中，所述配体缀合的颗粒可以是热疗试剂。 
各种实施方案的所述配体缀合的颗粒可以包括形成单个磁畴的氨基官能化的纳米颗粒；至少一个与所述氨基官能化的纳米颗粒联系(in communiation with)的接头；以及至少一个偶接到所述氨基官能化纳米颗粒或所述接头的配体。在一些实施方案中，所述接头可以是双官能化合物。在其他实施方案中，所述接头可以是多亚基组合物，所述多亚基组合物包括一个或更多个选自卤代烷基、环氧化物、乙烯基杂累积多烯(vinyl heterocumulene)、环氧丙烷、聚乙二醇、聚丙烯或其组合的亚基。在再一些其他实施方案中，所述接头可以包括一个或更多个亲水性亚基，以及在特别的实施方案中，所述接头可以是化学上不同的化合物的混合物。举例来说，在某些实施方案中，所述接头可以包括至少一种双环氧化合物、至少一个聚乙二醇环氧醚(poly(ethylene glycol)epoxyether)、至少一个聚乙二醇二缩水甘油醚、至少一个表氯醇或其组合，以及在一些实施方案中，所述接头可以包括表氯醇和聚乙二醇二缩水甘油醚的混合物。 
进一步的实施方案的所述接头可以包括一个或更多个选自胺、硫醇、肼、叠氮化物、二硫化物、磺酸、羧酸、马来酰亚胺或其组合的末端反应性基团，以及在其他的实施方案中，所述配体缀合的颗粒的所述末端基团的反应性可以是基于取代或加成化学的。在特别的实施方案中，所述羧酸是基于聚乙二醇醚(poly(ethylene glycol)ether based)的羧酸；所述叠氮化物是5-叠氮-2-硝基苯甲酰胺；所述二硫化物是3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺；所述马来酰亚胺是1，2-二酰基乙烯或3-马来酰亚氨基丙酰胺。 
各种实施方案的所述氨基官能化的颗粒可以包括亚结构(substructures)，所述亚结构包括至少一个接头、至少一个配体、至少一种螯合剂或其组合。 
在某些实施方案中，所述配体可以是抗体。在一些实施方案中，所述配体可以通过选自硫醇或胺的基团的并入(incorporation)被修饰，以及在特别的实施方案中，所述配体可以用N-琥珀酰亚氨基S-乙酰基硫代醋酸酯修饰。 
根据一些实施方案，所述配体缀合的颗粒可以还包括生物相容性覆层。在特别的实施方案中，所述氨基官能化的纳米颗粒的表面形成所述生物相容性覆层。 
各种实施方案的所述配体缀合的颗粒可以是热疗试剂。 
其他实施方案的配体缀合的颗粒可以包括官能化的磁性纳米颗粒和至少一个与所述官能化的磁性纳米颗粒联系的接头，其中所述配体缀合的纳米颗粒的比吸收率(SAR)比20 nm nanomag
Figure BPA00001204450500041
-D-spio颗粒高至少五倍。在某些实施方案中，所述配体缀合的颗粒还包括偶接到所述官能化的磁性纳米粒子或所述接头的配体。 
在各种实施方案中，提供了在受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的本发明各个方面的所述配体缀合的颗粒。 
本发明的其他实施方案包括制备配体缀合的颗粒的方法，包括以下步骤：以氨基或硝基基团官能化形成单个磁畴的颗粒，使所述被官能化的颗粒与接头接触，以及将配体偶接至所述颗粒或所述接头以形成配体缀合的颗粒。在某些实施方案中，所述官能化步骤在约7和约9之间的pH发生。在其他实施方案中，所述制备配体缀合的颗粒的方法，还包括用含水的缓冲溶液冲洗所述配体缀合的颗粒的附加步骤。在一些实施方案中，所述冲洗步骤在约5和约8之间的pH发生。在又一些其他的实施方案中，所述制备配体缀合的颗粒的方法包括灭菌所述配体缀合的颗粒的步骤。根据一些实施方案，所述将所述配体偶接至所述颗粒或所述接头以形成所述配体缀合的颗粒的步骤在使所述官能化的颗粒与所述接头接触的步骤的12小时之内发生。 
根据一些实施方案，所述配体缀合的颗粒的尺寸在从10-80nm的范围。 
在各种实施方案中，提供一种用于热疗法的纳米颗粒，所述纳米颗粒通过包括以下步骤的过程制备：以氨基或硝基基团官能化形成单个磁畴的颗粒；使所述被官能化的颗粒与接头接触；以及将配体偶接至所述颗粒或所述接头以形成配体缀合的颗粒。 
附图简要说明 
为了更充分地理解本发明的性质和优势，应联系附图参考如下详细说明，其中： 
图1图示根据本发明的实施方案的感受器缀合物(susceptor conjugate)； 
图2图示用于制备感受器缀合物的四种合成策略； 
图3是具有25nm(黑色)、50nm(深灰色)和70nm(浅灰色)直径的氨基官能化的颗粒的尺寸分布图； 
图4是描绘在200Hz具有70nm平均直径的磁性颗粒在室温的磁性体积磁化率(magnetic volume susceptibility)的阻抗谱数据的图； 
图5a是图示二级羊抗兔抗体可以与缀合至颗粒表面的兔抗羊抗体相互作用的两种可能方式的示意图； 
图5b是图示仅当所述兔抗羊是在恰当的方向时，羊抗鼠抗体才可以与兔抗羊抗体缀合物相互作用的示意图；以及 
图6是描绘总结合的抗体相比于以图2中所图示策略制备的抗体缀合的颗粒所具的每mg铁的免疫反应性的柱状图。 
详细描述 
本发明不限于所描述的特定方法、组合物或方法学，因为这些可以变化。另外，本描述中所使用的术语仅用于描述特定的变体或实施方案的目的，并且不意图限制本发明的范围。 
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有如本领域普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管与本文所描述的那些相似或等效的任何方法均可以被用于本发明实施方案的实践或测试中，现在描述优选的方法。 
本文提到的所有出版物和参考均通过引用并入。本文不意图被解读为承认由于在先发明，而使本发明无权先于这些公开。 
必须注意，如本文，以及在所附权利要求中使用的，单数形式的“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数含义，除非上下文中清楚地另外指定。 
如本文使用的，术语“约”意指正被使用的所述数字的数值加或减10％。因此约50％意指40％-60％的范围。 
“给予”，如本文中与本发明的有疗效的纳米颗粒组合物协同使用的，意指将治疗剂(therapeutic)直接给予到靶组织中或靶组织上，或者将治疗剂给予患者，藉此，治疗剂对其所靶向的组织产生影响。“给予”治疗剂可以通过，例如，注射、输注，或者通过与其他已知的技术组合的任何方法来实现。这样的组合的技术包括，但不限于，加热、辐射和超声。 
术语“交变磁场”或“AMF”，如本文使用的，指其场矢量周期性改变方向的磁场，典型地以正弦、三角、矩形或类似形状的模式，具有从约80kHz至800kHz的范围的频率。AMF也可以被添加到静磁场，使得仅得到的磁场矢量的AMF分量改变方向。AMF可以伴随以交变电场，并且可以本质上为电磁性的。 
如本文使用的，术语“抗体”包括对与特定的抗原有反应性的免疫球蛋白分子的引用，并且包括多克隆和单克隆抗体两者。 
术语“患病组织”，如本文使用的，指与任何类型的实体瘤(solid tumer)癌症，例如，骨、肺、血管、神经元、结肠、卵巢、乳腺以及前列腺癌相关联的组织或细胞。术语患病组织也可以指免疫系统的组织或细胞，例如受AIDS影响的组织或细胞；病原体媒(pathogen-borne)疾病，其可以是细菌、病毒、寄生虫或真菌引起的，病原体媒疾病的例子包括HIV、结核病和疟疾；激素相关的疾病，例如肥胖症；血管系统疾病；中枢神经系 统疾病，例如多发性硬化；以及不良事件，例如不良血管再生(adverse revascularization)、再狭窄(尤指心瓣)(restenosis)、淀粉样变性(amyloidosis)、毒素、与器官移植相关联的反应副产物，以及其他异常的细胞或组织生长。 
如本文使用的，组合物的“有效量”或“治疗有效量”是经计算以达到期望效果的预定量。 
术语“能源”，如本文使用的，指为了激活治疗剂中潜在的放射源的目的，能够递送除AMF以外形式的能量到所述治疗剂的装置。 
术语“过热”，如本文使用的，指加热组织到40℃和60℃之间的温度。 
术语“效果(impact)”被用来表达正被提供、施用或给予以治疗剂的患者的组织、细胞或区域的外观、形式、特征和/或物理属性中的改变。 
术语“迹象”，如本文使用的，指医疗状况(medical condition)或与医疗状况，例如癌症，相关联的症状。举例来说，疲劳或发热可以是受试者在患病状态中的迹象。 
术语“配体”指特别地以一分子为靶的化合物。 
“可选的”或“可选地”可以用来意指随后描述的结构、事件或环境可以发生或可以不发生，并且所述描述包括所述事件发生的情形和所述事件不发生的情形。 
术语“靶”，如本文使用的，指期望其失活、破裂、扰乱或破坏的物质。举例来说，患病的组织可以是针对治疗的靶。 
总地来说，术语“组织”指联合起来起特定功能的类似的特异细胞的任意集合。 
以其最基本的形式，本文所描述的发明针对用于热疗中的配体缀合的颗粒。本发明的各种实施方案包括颗粒，至少一个接头或交联化合物以及至少一个配体。 
各种实施方案的颗粒为磁性颗粒，以及在其他实施方案中，所述颗粒为当被置于交变磁场(AMF)或其他能源中时能够生成热的磁性颗粒。这样的颗粒可以被称为磁能感受颗粒或“感受器”，并且可以针对提供热疗有用。 
如本文使用的，术语“感受器”和“非靶向感受器”指尚未被修饰以与特异细胞类型、分子或其他靶相互作用的感受器。相反，“靶向感受器”、“配体缀合的”颗粒或感受器以及“感受器缀合物”已使用，举例来说，共价附着到感受器的抗体修饰，以与特定的靶相互作用。非靶向感受器不包含这样的靶向机制。 
图1图示根据本发明实施方案的感受器缀合物100。感受器缀合物100包括磁能感受颗粒或感受器142。所述感受器可以包括完全或部分覆盖所述感受器142的覆层144。至少一个靶向配体140，例如，但不限于，抗体可以位于所述感受器142的外部部分上。靶向配体140可以被选择以找出并附着到特定的靶，例如一类型的细胞或患病的组织。当所述感受器142暴露于能源，例如AMF时，感受器142中生成热。所述覆层144可以增强所述感受器142的发热性质，尤其如果所述覆层144具有高粘度时，例如聚合材料。 
特别涉及感受器，一般地，当被置于AMF中时，感受器所生成的热代表由于感受器的磁性材料响应于AMF而振荡的能量损失。每周期磁场所生成的热量和导致能量损失的机制取决于感受器材料以及所施用的磁场两者的具体特征。在本发明的实施方案中，所述感受器形成单个磁畴。 
根据一些方面，当经受AMF或其他能源时，感受器发热到独特的温度，被称为居里温度。居里温度是这样的温度，在此温度感受器的磁性材料发生可逆的铁磁性到顺磁性的转变。该温度以下，磁性材料在所施用的AMF中生成热，而在居里温度以上，磁性材料为顺磁性并且磁畴对AMF无响应。由此，当在居里温度以上暴露于AMF时，磁性材料不生成热。随着磁性材料冷却到居里温度以下的温度，材料恢复其磁性性质并且当被施用AMF时重新开始发热。在对AMF暴露的过程中，该循环可以连续重复。在本发明的实施方案中，磁性材料可以被选择以具备在约40℃和约150℃之间的居里温度。 
感受器发热达到的温度依赖于感受器材料的磁性性质、磁场的特征，以及靶位点的冷却能力，以及其他因素。感受器材料和AMF特征的选择可以被定制(tailored)，以最优化针对特定靶类型的治疗效力。感受器的许多方面，例如材料构成、大小和形状，直接影响发热性质，并且这些特征可以被定制以达到期望的发热性质。举例来说，热疗中采用的感受器的大小可以依赖于感受器将要被用于的特定应用(如，要达到的温度)，以及依赖于构成所述感受器的材料。 
感受器的大小也可以决定“感受器缀合物”的总大小，所述感受器缀合物包括，举例来说，接头和配体。在各种实施方案中，感受器的大小为从约0.1nm到约250nm。所述感受器缀合物大小也可以依赖于迹象、构成感受器和感受器缀合物的材料、给予路径，以及使用方法。在一些实施方案中，为了达到增加的治疗组合物浓度和在血流中长的停留时间，所述感受器或感受器缀合物，举例来说，经由静脉内注射被给予患者，可以是期望的，避免被网状内皮系统(RES)摄取并随后分布到肝、脾、肺、肾、心和骨髓。为了成功避免被RES摄取，所述感受器或感受器缀合物的直径可以为小于30nm，并且具体地，在所述感受器包含磁石(magnetite)(Fe3O4)的实施方案中，所述感受器缀合物的直径可以在约8nm和约20nm之间。这样的感受器缀合物的感受器保留足够的磁矩用于在施用的AMF中发热，同时允许有疗效的组合物避开被RES摄取。在一些实施方案中，具有大于8nm的直径的铁磁性感受器可以适于热疗应用。在其他实施方案中，其他元素，例如， 举例来说，钴被包括在磁性感受器中。第二元素的包括可以允许感受器以及包括这样的感受器的感受器缀合物的尺寸范围更小。举例来说，钴尽管较磁石更小，一般具有比磁石更大的磁矩，这可以对含钴的磁石感受器的总体磁矩有贡献，同时减小有疗效的组合物的尺寸。 
用于本发明的实施方案的感受器可以包括提供合适的磁矩和尺寸的任意数量的材料。感受器的材料构成可以基于特定的靶来选择。举例来说，实施方案中的感受器包括，但不限于，氧化铁颗粒和FeCo/SiO2颗粒。由于自限制居里温度为递送到靶的总热量而与感受器材料直接相关，感受器组合物可以针对不同的靶类型来被设计。假设基于靶的构成和在患者体内的位置的独特发热和冷却能力，这样的调整对于达到每种靶类型期望的发热可以是需要的。举例来说，位于患者的供血差且相对孤立的区域内的肿瘤，较之位于大血管附近的肿瘤，可能要求较低居里温度的感受器材料用于有效的热疗。位于血流中的靶也将要求具有特定居里温度的感受器材料。由此，除了磁石，各种实施方案的感受器可以包括，举例来说，钴、铁、稀土金属等等及其组合。 
在选择感受器材料中也可以考虑比吸收率(SAR)。针对给定材料，SAR一般被描述为当被暴露于射频(RF)电磁场时，所述材料吸收RF的比率。举例来说，从Ferrotec公司(纳舒厄，新罕布什尔州)可获得的约110nm直径的系列EMG700和EMG1111氧化铁颗粒具有在1,300奥斯特通量密度和150kHz频率的约310瓦每克颗粒的SAR。其他颗粒，例如从Inframat公司(威灵顿，康乃狄克州)可获得的FeCo/SiO2颗粒具有在相同磁场条件下约400瓦每克颗粒的SAR。 
在一些实施方案中，感受器包括覆层。合适的覆层材料可以包括，但不限于，合成的和生物聚合物，共聚物和聚合物共混物，以及无机材料。在采用合成聚合物作为覆层材料的实施方案中，这样的覆层可以包括，举例来说，丙烯酸酯、硅烷、苯乙烯、乙酸酯、亚烷基二醇、亚烷基、环氧烷烃、帕利灵(parylene)、乳酸、乙醇酸，及其组合，以及在某些实施方案中，这样的覆层可以包括水凝胶聚合物，含组氨酸的聚合物，以及水凝胶聚合物和含组氨酸的聚合物的组合。另外的实施方案包括包含生物材料的覆层材料，例如，举例来说，多糖、聚氨基酸、蛋白质、脂类、甘油、脂肪酸、及其组合，以及在其他实施方案中，用作覆层材料的生物材料可以包括肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素、甲壳素、壳聚糖、纤维素、右旋糖酐、藻酸盐、淀粉、碳水化合物和葡萄糖胺聚糖。在采用蛋白质覆层材料的实施方案中，这样的蛋白质可以包括细胞外基质蛋白、蛋白多糖、糖蛋白、白蛋白和明胶。在再一些其他的实施方案中，生物覆层材料与合适的合成聚合物材料组合使用。 
本发明的其他实施方案包括具有无机覆层材料的感受器，所述无机覆层材料例如，但不限于，金属，金属合金，以及陶瓷，例如，举例来说，羟磷灰石、碳化硅、羧酸盐、磺酸盐、磷酸盐、铁酸盐、膦酸盐，以及元素周期表IV族元素的氧化物。在其他实施方案中，所述无机覆层材料是也含有生物或合成聚合物的复合覆层的组分。 
在一些实施方案中，其中感受器由生物相容性的磁性材料形成，所述感受器自身的表面可以充当生物相容性覆层。在其他实施方案中，所述覆层材料可以起到使所述感受器生物相容的作用。在再一些其他的实施方案中，所述覆层材料可以有助于感受器通过，举例来说，转染，运送到细胞中。这样的覆层材料，被称作转染试剂，可以包括，举例来说，载体，例如质粒、病毒、噬菌体、病毒体或病毒外壳(viral coat)、朊病毒、聚氨基酸、阳离子脂质体、两亲物、非脂质体脂质，或其任意组合。在其他实施方案中，生物相容性覆层材料可以是一种或更多种转染试剂与有机和/或无机材料的复合物。在这样的实施方案中，覆层材料和/或转染试剂的组合可以针对特定类型的细胞或患病组织以及在患者体内的具体位置而被定制。 
在本发明的一些实施方案中，接头偶接到感受器或感受器覆层。所述接头，在一些实施方案中，可以是接触并结合到所述感受器的外表面，同时共价结合到配体，由此将所述配体附着到所述感受器外表面的双官能化合物。在其他实施方案中，所述接头结合到感受器的外表面并帮助感受器从避开网状内皮系统(RES)。举例来说，具有聚乙二醇(PEG)接头的感受器通过本领域已知为“聚乙二醇化”的方法的官能化在避免被RES检测和摄取中是有效的，并且帮助肿瘤的改变的血管系统经由增强的渗透性和滞留(EPR)作用的渗透，造成感受器在肿瘤间质组织(interstitium)中的优先累积。 
取决于接头为短或长，刚性或柔性，疏水性或亲水性，所述接头可以影响最终缀合物的性质。各种实施方案的接头包括疏水性或亲水性的有机、无机或化学上不同的化合物的混合物。在一些实施方案中，所述接头可以包括烷基、烯烃、炔烃、卤代烷基、环氧化物、乙烯基或杂累积多烯化合物，以及在其他实施方案中，所述接头可以包括多亚基化合物。这样的实施方案的所述接头不受多亚基化合物中亚基的数目和/或类型的限制，并且可以包括，举例来说，环氧丙烷、聚乙二醇、聚丙二醇等等及其组合的亚基。在再一些其他的实施方案中，所述接头包括一个或更多个表氯醇、双环氧化物或其组合。本发明的实施方案所包括的接头的例子包括，但不限于，聚乙二醇环氧醚、聚乙二醇二缩水甘油醚，以及表氯醇和聚乙二醇二缩水甘油醚的混合物。 
各种实施方案的接头还包括一个或更多个末端反应性基团。所述末端反应性基团的类型可以取决于将特定类型的感受器偶接到某种类型的配体，形成与某种配体的共价结合，或者将感受器结合到这样的配体，所需要的反应化学的类型而变化。在某些实施方案中，末端基团的反应性可以基于取代或加成化学。示例性末端反应性基团可以包括，但不限于，羧酸、胺、肼、叠氮化物、硫醇、二硫化物、磺酸、乙烯基、1，2-二酰基乙烯及其衍生物和组合，以及在具体的实施方案中，所述末端反应性基团可以是胺、硫醇或羧酸部分。在一些实施方案中，所述羧酸末端基团可以是基于羧酸的聚乙二醇醚，所述叠氮化物末端基团可以是5-叠氮-2-硝基苯甲酰胺，所述二硫化物末端基团可以是3-(2-吡啶基硫代)丙酰胺，以及所述1，2-二酰基乙烯末端基团可以是马来酰亚胺或3-马来酰亚氨基丙酰胺。 
本发明实施方案的配体可以被选择以确保感受器选择性地附着于，或者以其他方式关 联于所选择的靶。在一些实施方案中，配体允许在细胞上靶向癌症或疾病标记。在其他实施方案中，配体帮助靶向患者中特定类型的生物物质。各种实施方案包括配体，例如，但不限于，蛋白质、肽、抗体、抗体片段、糖类、碳水化合物、聚糖、细胞因子、趋化因子、核苷酸、凝集素、脂质、受体、类固醇、神经递质、簇指示(Cluster Designation)/分化群(CD)标记、印迹聚合物及其组合。在某些实施方案中，蛋白质配体包括，举例来说，细胞表面蛋白、膜蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白、肽等等；核苷酸配体包括，举例来说，单链核苷酸、双链核苷酸、互补核苷酸，和聚核苷酸片段；以及脂质配体可以包括，举例来说，磷脂、糖脂等等。在其他实施方案中，所述配体是抗体或抗体片段。 
本发明的实施方案中有用的抗体不受抗体的特定类型的限制。在一些实施方案中有用的抗体可以是基因工程改造的，例如，举例来说，嵌合抗体(如，人源化鼠源抗体)和异源缀合抗体(如，双特异性抗体)。抗体还可以包括抗体的抗原结合形势，包括具有抗原结合能力的片段，例如，Fab′、F(ab′)2、Fab、Fv和rIgG，以及重组单链Fv片段(scFv)。这样的片段在本领域是公知的，并且可以在，举例来说，Pierce编目和手册(Pierce Catalog and Handbook)，1994-1995(Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill.和Kuby，J.，Immunology，3.sup.rd Ed.，W.H.Freeman & Co.，纽约(1998)中找到。其他实施方案的抗体包括二价或双特异性分子，例如，但不限于，Kostelny等人在J.Immunol.148：1547(1992)，Pack和Pluckthun在Biochemistry 31：1579(1992)，Hollinger等人在supra，(1993)，Gruber等人在J.Immunol.5368(1994)，Zhu等人在Protein Sci 6：781(1997)，Hu等人在Cancer Res.56：3055(1996)，Adams等人在Cancer Res.53：4026(1993)，以及McCartney等人在Protein Eng.8：301(1995)中所描述的那些。 
本发明实施方案的配体可以被制备以粘附到本领域已知的任何标记或抗原。标记的选择可以取决于所选择的靶而变化，然而一般地，在本发明的实施方案中可能有用的标记包括，但不限于，细胞表面标记，血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族的成员，癌胚抗原(CEA)家族的成员，一种抗个体基因型mAB，一种神经节苷脂模拟物，簇指示/分化群(CD)抗原，表皮生长因子受体(EGFR)家族的成员，一种细胞粘附分子，MUC-类型粘液素家族的成员，癌症抗原(CA)，基质金属蛋白酶，糖蛋白抗原，黑素瘤相关抗原(MAA)，蛋白水解酶，钙调蛋白，肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员，血管生成标记，被T细胞识别的黑素瘤抗原(MART)抗原，黑素瘤抗原编码基因(MAGE)家族的成员，前列腺膜特异性抗原(PMSA)，小细胞肺癌抗原(SCLCA)，T/Tn抗原，激素受体，肿瘤抑制基因抗原，细胞周期调控抗原，癌基因抗原，癌基因受体抗原，增殖标记，涉及细胞外基质降解的蛋白酶，恶性转化相关因子，凋亡相关因子以及人类癌症抗原。举例来说，针对乳腺癌的特定标记可以选自细胞表面抗原，例如，但不限于，MUC-类型粘液素族的成员，表皮生长因子受体(EGFR)，癌胚抗原(CEA)，人类癌症抗原，血管内皮生长因子(VEGF)抗原，黑素瘤抗原(MAGE)，族系抗原，T/Tn抗原，激素受体，生长因子受体，簇指示/分化群(CD)抗原，肿瘤抑制基因产物，细胞周期调控子，癌基因产物，癌基因受体，增殖标记，粘附分子，涉及细胞外基质降解的蛋白酶，恶性转化相关因子，凋亡相关因子，人类癌症抗原，糖蛋白抗原，DF3，4F2，MGFM抗原，乳腺肿 瘤抗原CA 15-3，调宁蛋白(calponin)，组织蛋白酶，CD 31抗原，增殖细胞核抗原10(PC 10)，以及pS2。 
在另一实施方案中，配体可以靶向于与患者的免疫系统疾病相关联的抗原。举例来说，所述配体靶向的一个标记或更多个标记可以被选中以包括在，例如，T细胞或B细胞上存活的靶，或者所述配体可以具有针对与免疫系统疾病相关联的靶，例如，举例来说，蛋白质、细胞因子、趋化因子、传染性器官等等的亲和力。 
在又另一实施方案中，配体可以靶向于与病原体-媒病况相关联的抗原。一般地，病原体可以包括产生疾病的介质，例如，举例来说，细菌、病毒、微生物、真菌、寄生虫或朊病毒。该实施方案的所述配体可以具有针对与病原体相关联的一个细胞标记或多个标记，或者代表受感染细胞上的靶的一个标记或多个标记的亲和力。举例来说，所述配体可以被选择为靶向病原体自身，例如，细菌，包括，但不限于，大肠杆菌或炭疽杆菌；病毒，包括，但不限于，巨细胞病毒(CMV)，爱波斯坦-巴尔病毒(EBV)，肝炎病毒，例如，乙型肝炎病毒，人类免疫缺陷病毒，例如HIV、HIV-1或HIV-2，或者，疱疹病毒，例如疱疹病毒6；寄生虫，包括，但不限于，枯西氏锥虫，动质体、曼氏血吸虫、日本血吸虫或布氏锥虫；或者真菌病况，包括，但不限于，曲霉属、新型隐球菌或根毛霉属真菌。 
在本发明的具体实施方案中，修饰的抗体可以通过将抗体或抗体片段与修饰剂反应而产生。举例来说，有机部分可以通过应用胺反应性修饰剂，举例来说，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，以非位点特异的方式被结合到抗体。本发明其他的实施方案中，修饰的人类抗体或抗原结合片段通过还原抗体或抗原结合片段的二硫键(如，链内二硫键)而被制备。然后使被还原的抗体或抗原结合片段与硫醇反应性修饰剂反应，以将所述抗体共价结合到所述接头。本发明的各方面的被修饰的人类抗体和抗原结合片段——包括被结合到抗体的特定位点的有机部分——可以使用合适的方法被制备，例如，反向蛋白水解作用(Fisch等人Bioconjugate Chem.3：147 153(1992)；Werlen等人Bioconjugate Chem.5：411 417(1994)；Kumaran等人Protein Sci.6(10)：2233 2241(1997)；Itoh等人Bioorg.Chem.，24(1)：59 68(1996)；Capellas等人Biotechnol.Bioeng.，56(4)：456463(1997))和Hermanson 在Bioconjugate Techniques，学术出版社：圣地亚哥，加利福尼亚州(1996)中所描述的方法。 
在又另一实施方案中，配体可以靶向于与不合期望的病况相关联的细胞或组织。这种不合期望的病况可以与疾病相关联，然而也可以存在于正常状况中。所述配体可以直接靶向于与不合期望的病况相关联的蛋白或其他抗原，或者靶向于与有关不合期望的病况的生物分子通路相关联的另一分子。举例来说，低密度脂蛋白(LDL)上的载脂蛋白B可以被用作靶分子，以治疗动脉硬化，或者胃抑制性多肽受体可以被靶向以治疗肥胖症。另外的例子包括针对与激素相关疾病相关联的靶的配体，其中所述靶是激素自身或者与激素产生相关联的激素或信号肽，以及非癌患病组织，其中所述靶是与患病组织相关联的抗原或肽，或者与非癌患病组织的沉积相关联的蛋白或肽。 
在另外的实施方案中，配体可以靶向于与器官移植后的器官排斥相关联的抗原或蛋白质。这样的实施方案中的靶可以取决于所移植的器官的特定类型而变化，并且可以，举例来说，包括诸如T细胞或B细胞的免疫细胞。 
在再一些另外的实施方案中，所述配体可以靶向于患者中的毒素。这样的毒素包括由有机体产生的任何毒物，例如，但不限于，细菌毒素、植物毒素、昆虫毒素、动物毒素以及人造毒素。 
本发明实施方案的配体的另外的例子可以在美国专利申请序列号10/696,399中找到，所述申请通过引用被整体并入本文。 
某些实施方案中的配体，可以被共价结合到感受器，与所述感受器相关联的覆层或结合到所述感受器表面的接头。在一些实施方案中，所述配体可以被修饰以增强配体共价结合到接头或覆层的能力，并且实施方案不限于这样的修饰。举例来说，在某些实施方案中，所述配体可以是硫醇-修饰的。用于制备修饰的配体的方法在本领域是公知的，并且可商业获得。 
本发明另外的实施方案包括用于制备配体缀合的颗粒或“感受器缀合物”的方法。用于制备感受器缀合物的各种方法的示意图在图2中提供，并且这样的方法可以包括以下步骤：制备颗粒(I)，氨基官能化所述颗粒(II)，使接头，如以上描述的那些，与所述氨基官能化的颗粒(II)反应以形成，举例来说，颗粒(III、V、VII和XI)，以及使所述接头上的第二官能团与所述配体反应以形成配体缀合的颗粒或感受器缀合物(IV、VI、VIII和X)。本领域已知的各种修饰，可以被用在图2中所提供的以及本文描述的方案的任何步骤中，或者一个或更多个步骤可以被另一等效的步骤代替。这样的修饰被包括在本发明的范围内。举例来说，颗粒或“感受器”可以用硫醇或其他反应性基团官能化，或者可以组合各种步骤使得多于一种接头或配体被偶接到所述感受器。本发明其他的实施方案中，所述感受器被优化以特定比率的缀合的对非缀合的表面区，使得有效量的接头或配体与用于疾病的治疗的感受器相关联。在另外的实施方案中，冲洗和/或灭菌所述感受器缀合物的步骤被包括在所述方法中。所述冲洗和/或灭菌步骤可以包括微孔过滤或其他本领域已知的这种方法。 
本发明其他的实施方案包括用于制备配体缀合的颗粒的方法，包括以下步骤：以氨基或硝基基团官能化形成单个磁畴的颗粒，使所述官能化的颗粒与接头接触，以及将配体偶接到所述颗粒或所述接头以形成配体缀合的颗粒。 
再一些其他的实施方案包括用于使用本发明的感受器和感受器缀合物治疗疾病的方法。可以使用感受器缀合物治疗的疾病包括宽范围的疾病，并且仅受针对疾病的标记的可获得性限制。未靶向的感受器的使用不受这样的标记的可获得性的限制。由此，目前已知 的或将来发现的任何疾病被实施方案的方法包括。举例来说，在一个实施方案中，其中配体被靶向于癌细胞的感受器缀合物被给予患者，所述感受器缀合物变为附着于所述癌细胞或变为与所述癌细胞相关联，并且所述患者被暴露于交变磁场(AMF)。因为AMF而由所述感受器生成的热立即，或随时间破坏(即，引起凋亡)所述癌细胞或以其他方式使所述癌细胞失活。另外，由所述感受器生成的热和/或凋亡可以刺激热休克蛋白，例如，举例来说，HSP 70，的产生和释放，所述热休克蛋白的存在可以刺激抵抗任何剩下的癌细胞的免疫反应。这样的刺激免疫应答也可以起到保护个体免受癌症及其他疾病的未来发展的作用。 
本发明其他的实施方案中，修饰的表面电荷和颗粒尺寸可以对所述感受器和感受器缀合物在疾病的治疗中的效力有贡献。举例来说，本发明的一个方面中，感受器表面电荷被修饰以减少纳米颗粒的间隙(clearance)。在本发明的一个实施方案中，感受器表面的大部分被官能化以提供期望的表面电荷和ζ电势。在另一实施方案中，允许感受器表面的选择性官能化的封阻剂，例如，举例来说，磺酸基-NHS-乙酸酯，被用于精细调节表面电荷和ζ电势。 
感受器或感受器缀合物的配体的表面化学或孔隙率也可以被定制，使得感受器或感受器缀合物保留在靶细胞之外，或者，可替换地，内在化到靶细胞中。一旦或外部地或内部地与靶细胞相关联，感受器或感受器缀合物可以由于AMF能量被吸收而被能量化，并且可以，举例来说，加热，并且所生成的热可以通过，举例来说，对流、传导、辐射或传热机制的组合，而通过所述覆层或接头，并通过间隙区域到靶细胞。暴露于热的所述靶细胞可以被损伤，并且在具体实施方案中，这样的靶细胞可以被损伤到所述损伤不可修复的程度。在某些实施方案中，当足够的能量被传递到所述靶细胞时，所述靶细胞经由坏死、凋亡或另一种机制死亡。 
给予患者的感受器或感受器缀合物的量可以变化，并且可以取决于正被治疗的疾病，以及患病组织的位置。此外，剂量可以取决于给予的模式而变化。举例来说，如果所述感受器或感受器缀合物被局部地给予到，例如，肿瘤中或肿瘤附近区域，或全身地给予，则可能需要较低的剂量。要被给予的剂量可以还取决于正被治疗的受试者的特征(如，年龄、体重、性别、健康、同步治疗的类型，如果有的话、以及治疗频率)。提供这样的信息，确定将构成治疗有效量的感受器或感受器缀合物的量在熟练技术人员(如，临床医师)的职权范围(purview)内。为了获得最佳临床响应，给予的特定途径的选择和给药方案可以由这样的临床医师根据本领域已知的方法调整或滴定。 
在本发明的实施方案中预期各种给予途径，并且所述感受器或感受器缀合物可以以常规方式通过任何其为活性的途径被给予。举例来说，给予可以是，但不限于，系统的、肠胃外的、皮下的、静脉内的、肌内的、腹膜内、表面的、透皮的、经口的、经颊的或经眼的途径，或者经阴道地，通过吸入，通过积存注射，或通过植入。针对本发明某些实施方案的感受器或感受器缀合物(或者单独或者与其他药物组合)的给予模式可以是，但不限 于，舌下的，可注射的(包括短效、积存、植入以及皮下或肌内注射的小球形式)，或者通过使用阴道乳膏、栓剂、子宫托、阴道环、直肠栓剂、子宫内器件，以及透皮形式，如贴膏和乳膏。另外，在一些实施方案中，给予的方法可以包括，但不限于，血管内注射、静脉内注射、腹膜内注射、皮下注射和肌内注射。在其他实施方案中，感受器或感受器缀合物可以使用围手术(perisurgical)给予技术被给予，所述围手术给予技术包括，但不限于，冲洗、灌洗，如用海绵或其他外科纱布漂洗。在其他实施方案中，给予途径包括与其他已知技术组合的注射或输注，所述其他已知技术包括，但不限于，加热、辐射和超声。 
本发明某些实施方案的方法可以还包括配制在药物组合物中与药学上可接受的赋形剂、媒质或载体一起的感受器或感受器缀合物。举例来说，在一个实施方案中，药物组合物通过分散或分离感受器或感受器缀合物，掺和感受器或感受器缀合物与药学上可接受的赋形剂、媒质或载体，以及可选地，其他成分被制备，以配制药物组合物。 
含有本发明的各方面的感受器和感受器缀合物的药物制剂和适当的载体可以是固体剂型，其包括，但不限于，片剂、胶囊剂、扁囊剂、小片、丸剂、粉末和细粒；表面剂型，其包括，但不限于，溶液、粉末、流体乳液、流体悬浮液、半固体、软膏、糊剂、乳膏、凝胶剂和果胶剂(jellies)，以及泡沫；和肠胃外剂型，其包括，但不限于，溶液、悬浮液、乳剂，和干粉。本领域也已知，所述活性成分可以与药学上可接受的稀释剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、疏水性媒质、水溶性媒质、乳化剂、缓冲剂、润湿剂、保湿剂、增溶剂、防腐剂等等一起包含在这样的制剂中。给予的手段和方法在本领域是已知的，并且技术人员可以参考各种药理学参考文献获得指导。举例来说，可以查阅Modern Pharmaceutics(现代药剂学)，Banker & Rhodes，Marcel Dekker，Inc.(马塞尔德克尔公司)(1979)；以及Goodman & Gilman的The Pharmaceutical Basis of Therapeutics (治疗剂的药剂学基础)，第6版，麦克米兰出版公司，纽约(1980)。 
具体参照肠胃外给予途径，本发明某些实施方案中的感受器或感受器缀合物可以被配制用于通过注射(如，通过团注或连续输注)的肠胃外给予。所述感受器或感受器缀合物可以通过在约15分钟到约24小时的时期皮下连续输注被给予。用于注射的制剂可以以与添加的防腐剂一起的单位剂型(如，在安瓶中或在多剂量容器中)存在。所述制剂可以采用如在油性或水性媒质中的悬浮液、溶液或乳剂这样的形式，并且可以含有诸如悬浮、稳定和/或分散试剂的配方试剂。 
针对经口给予，所述感受器或感受器缀合物可以通过组合这些化合物与本领域已知的药学上可接受的载体而被配制。这样的载体使所述感受器或感受器缀合物能够被配制为用于由患者经口摄入的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆料、悬浮剂等等。用于经口给予的药物制剂可以通过添加固体赋形剂、可选地研磨所得到的混合物而获得，并且在添加合适的辅助剂之后，如果期望的话，加工所述混合物的细粒，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂包括，但不限于，诸如食糖的填充剂，包括，但不限于，乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨糖醇，以及纤维素制备物，例如，但不限于，玉米淀粉、小 麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠，以及聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果期望的话，可以添加崩解剂，例如，但不限于，交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂，或海藻酸或其盐，如海藻酸钠。 
糖衣丸芯可以被提供以合适的包衣。为此目的，可以使用浓缩的食糖溶液，其可以可选地包含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇，和/或二氧化钛、亮漆溶液，以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或颜料可以被添加到所述片剂或糖衣丸包衣，用以识别或用来特征化不同组合的活性化合物药剂。 
可以经口使用的药物制剂可以还包括，但不限于，由明胶制作的推入配合式胶囊剂，以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨糖醇)制作的软的密封胶囊剂。所述推入配合式胶囊剂可以含有与填充剂掺和的感受器或感受器缀合物，所述填充剂例如，举例来说，乳糖、诸如淀粉的粘结剂和/或诸如滑石或硬脂酸镁的润滑剂，以及可选地，稳定剂。在软胶囊剂中，感受器或感受器缀合物可以被溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以可选地添加稳定剂。所有用于经口给予的制剂应为适于这样的给予模式的用量。 
在经颊给予途径中，感受器或感受器缀合物可以使用本领域已知的常规技术被配制为片剂或锭剂。 
针对通过吸入的给予，感受器或感受器缀合物以气溶胶喷雾或薄雾的形式，使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)，从加压包装或雾化器被递送。在加压气溶胶给予的情况中，计量单位可以通过提供阀来确定，以递送计量的量。明胶的胶囊和套筒，举例来说，针对在吸入器或吹入器中使用，可以被配制为含有感受器或感受器缀合物与合适的粉末基础剂(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。 
本发明其他方面中的感受器或感受器缀合物可以被配制在直肠组合物中，例如栓剂或保留灌肠，例如，举例来说，含有诸如可可脂或其他甘油酯的常规栓剂基础剂的那些。 
感受器或感受器缀合物还可以被配制为积存制备物。这样的长效制剂在一个实施方案中通过(如，皮下或肌内地)植入或通过肌内注射被给予。积存注射可以在约1至约6个月或更长的间隔被给予。如此，感受器或感受器缀合物与合适的聚合或疏水性材料(如，作为可接受的油中的乳液)，或离子交换树脂，或作为微溶性衍生物，举例来说，作为微溶性盐一起被配制，以有助于延长的且受控的释放。 
在透皮给予路径中，本发明的某些实施方案的感受器或感受器缀合物可以被应用到膏药或其他本领域已知的透皮治疗系统。 
感受器或感受器缀合物的药物组合物可以还包括合适的固相或凝胶相载体或赋形剂。这样的载体或赋形剂的例子包括，但不限于，碳酸钙、磷酸钙、二氧化硅、食糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶，以及聚合物(如，聚乙二醇(PEG)，聚乳酸(PLA)、聚(D，L-乙交酯)(PLG)、聚(丙交酯-co-乙交酯)(PLGA)和聚(氰基丙烯酸酯)(PCA))。 
本发明的各方面的感受器和感受器缀合物可以与其他活性成分组合被给予，所述活性成分例如，举例来说，佐剂、蛋白酶抑制剂或其他相容的药物或化合物，其中这样的组合被视为在达到本文所描述的方法的期望效果中为合乎期望的或有利的。 
一旦被给予患者，基于颗粒的磁特性，感受器或感受器缀合物向靶的递送可以通过在患病组织的区域中对患者施用静磁场而被增强。 
实施例
为了更有效地理解本文所公开的发明，提供以下实施例。应理解，这些实施例仅用于举例说明的目的，并且不应被解读为以任何方式限制本发明。 
实施例1.BNF感受器的制备和特征化 
根据Grüttner等人J.Magn.Magn.Mater.311：181(2006)中所描述的核-壳方法通过高压匀浆(HPH)组装生物相容性均质化纳米铁氧体(bionized nanoferrite，BNF)感受器。用过量的右旋糖酐在高于500巴的压力和高于70℃的温度均质化单分散水性氧化铁悬浮液(25mg/mL)30分钟。在NdFeB永磁体的结晶盘中磁沉降，并用去离子水冲洗之后，获得具有大于50％(w/w)的铁含量的BNF感受器。所述感受器的铁含量通过颗粒浓度的重力测量，以及在用浓盐酸分解氧化铁之后，颗粒悬浮液的铁浓度的分光光度测量(Spectroquant
Figure BPA00001204450500161
-Kit，默克)来确定。 
使用改良的Josephson方法，于室温使所述BNF感受器与聚乙二醇二缩水甘油醚，MW＝526(Aldrich)和表氯醇(ACROS)的混合物在pH 11-12交联24小时。磁力分离并用去离子水冲洗之后，获得具有20-25mg/mL铁浓度的BNF感受器悬浮液。通室温与氨水一起振摇24小时，来以氨基基团官能化所述感受器。通过磁力分离，并通过0.22mm Millex-GP过滤器(Millipore)过滤，用去离子水冲洗所述BNF感受器三次。 
取决于制备条件，分别在70-100、40-70和20-40nm三种不同直径范围中获得具有窄的颗粒尺寸分布的BNF感受器。交联和氨基化不影响初始颗粒直径。图3显示三批具有25nm(#0850684G)、50nm(#0840684G)和70nm(#0440684G)平均直径的交联且氨基官能化的BNF感受器(图2II)的尺寸分布，所述平均直径通过光子相关光谱(PCS)测量。 
所述BNF感受器悬浮液的磁特性的初步评估通过以阻抗谱(IS)测量在磁场中的频率相关的体积磁化率获得。对于磁特性，BNF感受器的体积磁化率依赖于磁场的频率通过IS在从0.1到0.5mT范围内变化的外部磁场振幅被测量。图4描绘体积磁化率在室温的阻抗谱数据，磁性颗粒具有在约200Hz 70nm的平均直径(#0440684G)。BNF感受器批次0440684G在约200Hz在室温的磁化率虚部的共振峰与有关支配性Brownian弛豫的期望一致。相应的低频实际磁化率(real susceptibility)由于所述感受器悬浮液的高磁石含量，而具有0.115的值。这些结果暗示BNF感受器在这些频率以及在室温含有显著部分的热封闭单畴颗粒。 
BNF感受器的比吸收率(SAR)在适当改良的AMF量热计中通过以具有15371kHz的固定频率和变化的通量密度的AMF诱导所述颗粒发热而确定。如表1中所示，针对每种感受器类型的SAR值由当所述颗粒悬浮液被螺管线圈中生成的AMF加热时，在水中测量的温度的上升率来计算。使用合适的参比空白、水或磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)，针对量热计和线圈的热性质修正所述SAR值，并通过铁含量归一化。如表1中还显示的，BNF感受器的SAR数据较之20nm nanomag-D-spio颗粒的相应数据高6-7倍。这些结果暗示，当有效浓度的联接到抗肿瘤单克隆抗体的BNF感受器到达癌症细胞时，并且当它们被外部AMF源诱导发热时，应发生肿瘤响应中的显著增加。 
表1.作为AMF的振幅的函数的BNF感受器的SAR数据 
Figure BPA00001204450500172
实施例2.BNF感受器表面上的共价结合抗体 
使用免疫分析，以羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(HRP)和羊抗鼠IgG-HRP评价将模式抗体，兔抗羊IgG共价结合到所述BNF感受器的各种策略。将基于与抗体分子的氨基基团的反应的抗体结合策略与要求巯基标记的抗体的那些相比较。 
实施例3.表面上有聚乙二醇COOH基团的BNF感受器的合成以及与兔抗羊IgG的缀合 
五毫克(26μmol)N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和14μl(26μmol)聚乙二醇600二酸被溶解在1mL的0.5M 2-(N-吗啉基)乙基磺酸(MES)缓冲液(pH＝6.3)中，并在50℃孵育10分钟。所述混合物被添加到4mL的氨基官能化的BNF感受器(图2II)(34.4mg Fe，48mg颗粒)中并于室温在Labquake
Figure BPA00001204450500181
混合器上振摇2小时。以去离子水通过磁力分离并通过0.22mm Millex-GP过滤器(Millipore)过滤来冲洗得到的BNF-PEG-COOH感受器三次，以得到5mL具有5.3mg/mL铁浓度的悬浮液(图2III)。 
将五百微升的该悬浮液与在125mL 0.5M MES缓冲液(pH＝6.3)中的0.6mg(3μmol)EDC和1.2mg(10μmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的溶液混合，并于室温振摇90分钟。在以磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)(pH＝7.4)伴随磁力分离冲洗所述颗粒两次之后，添加100mL的兔抗羊IgG(400mg/mL)。振摇所述混合物3小时，并通过在PBS中添加甘氨酸来猝灭反应，用PBS缓冲液通过磁力分离冲洗三次，以得到1.2mL具有2mg/mL铁浓度的抗体缀合的BNF-PEG-COOH感受器(图2IV)。 
实施例4.表面上带ANB基团的BNF感受器的合成以及与兔抗羊IgG的缀合 
所有涉及N-5-叠氮-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺(ANB-NOS)的反应在避光保护下进行。将碳酸盐溶液(pH＝8.5)中的ANB-NOS(1.5mL的1mM)与500μl的氨基官能化的BNF感受器(图2II)(4.3mg Fe，6mg颗粒)混合，并与室温振摇2小时。用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)(pH＝7.4)伴随磁力分离冲洗所述BNF-ANB感受器两次，得到1mL具有3.8mg/mL的铁浓度的悬浮液(图2V)。添加一百微升的兔抗羊IgG(400mg/mL)到所述感受器，并在暴露于302nm光的同时振摇所述混合物2小时。添加PBS中的甘氨酸溶液来猝灭所述反应，然后用PBS缓冲液伴随磁力分离冲洗三次，以得到1.2mL具有2.1mg/mL的铁浓度的抗体缀合的BNF-ANB感受器(图2IV)的悬浮液。 
实施例5.兔抗羊IgG的巯基标记 
通过与N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)反应，并随后使用制造商的说明用羟胺脱乙酰基，来用巯基基团标记兔抗羊IgG。五百微升的兔抗羊IgG(400mg/mL)和2mL的在二甲基甲酰胺(DMF)中的SATA溶液(4mg/mL)于室温被孵育30分钟。二十微升的在0.1M PBS缓冲液中的羟胺溶液，0.005M EDTA(5mg/100mL)被添加到抗体溶液，并于室温孵育2小时。然后所述抗体用G25柱被纯化。SH-标记的兔抗羊IgG的浓度通过在280nm的吸收测量确定。 
实施例6.表面上带2-吡啶基二硫基基团的BNF感受器的合成以及与巯基标记的兔抗羊IgG的缀合 
将五百微升的氨基官能化的BNF感受器(图2II)(4.3mg Fe，6mg颗粒)与500mL的PBS缓冲液和800μl的20mM N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)混合。于室温振摇所述混合物1小时并用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)通过磁力分离冲洗三次，以得到1mL具有4.1mg/mL铁浓度的BNF-SPD感受器(图2VII)悬浮液。使用制造商的说明测量附着的2-吡啶基二硫基基团的数目。一百微升在PBS中的BNF-SPDP感受器(图2VII)(4.1mg/mL Fe)和100mL在PBS中的参比氨基官能化的BNF感受器(图2II)(4.0mg/mL Fe)，每个用100mL在PBS中的50mM二硫苏糖醇(DTT)溶液孵育，并于室温振摇15分钟。然后，于15,000rpm离心所述感受器15分钟，并于343nm测量上清液的吸收并记录。BNF-SPDP感受器与参比氨基官能化的BNF感受器的上清液的吸收的差异被用来计算2-吡啶基二硫基浓度，使用343nm处8080M-1 cm-1的摩尔消光系数。得到的BNF-SPDP感受器(图2VII)表面上2-吡啶基二硫基基团浓度为37nmol/mg铁。 
具有4.1mg/mL铁浓度的九百微升的BNF-SPDP感受器(图2VII)悬浮液用1mL在PBS中的巯基-修饰的兔抗羊IgG(96μg/mL)于室温孵育3小时，并用PBS缓冲液通过磁力分离冲洗三次，得到1mL具有3.6mg/mL铁浓度的抗体缀合的BNF-SPDP感受器(图2VIII)的悬浮液。 
实施例7.表面上带马来酰亚胺基团的BNF感受器的合成以及与巯基标记的兔抗羊IgG的缀合 
7.5mmol N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和7.7mmol N-马来酰基-b-丙氨酸被溶解到125mL 0.5M 2-(N-吗啉基)乙基磺酸(MES)缓冲液(pH＝6.3)中，并于50℃孵育10分钟。所述混合物被添加到500mL氨基官能化的BNF感受器(图2II)(4.3mg Fe，6mg颗粒)并于室温振摇2小时。用去离子水通过磁力分离并通过0.22mm Millex-GP过滤器过滤冲洗得到的BNF-马来酰亚胺感受器(图2IX)三次，以得到1mL具有4.0mg/mL铁浓度的悬浮液。用1mL在磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中的巯基-修饰的兔抗羊IgG(96mg/mL)于室温孵育该BNF-马来酰亚胺感受器悬浮液3小时，并用PBS缓冲液通过磁力分离冲洗三次，得到1mL具有3.8mg/mL铁浓度的抗体缀合的BNF-马来酰亚胺感受器(图2X)悬浮液。 
实施例8.BNF-抗体感受器缀合物的免疫反应性研究 
进行两步的免疫分析，以比较图2中所描绘的不同抗体结合策略的效力。第一个步骤中，结合的兔抗羊IgG的总量使用HRP-标记的羊抗兔IgG作为二级抗体被特征化。该二级抗体可以以各种方式与兔抗羊颗粒缀合物相互作用。图5a是示意图，图示二级羊抗兔抗体可以与缀合到BNF感受器表面的兔抗羊抗体相互作用的两种方式。在第二个步骤中，使用HRP-标记的羊抗鼠IgG确定结合的免疫反应性兔抗羊IgG的总量。如果一级抗体在合适的方向被附着，该二级抗体仅可以结合在感受器表面上。图5b是示意图，图示当兔 抗羊在合适的方向时，羊抗鼠抗体仅可以与兔抗羊抗体缀合物相互作用。 
用含有0.05％聚山梨醇酯20(Tween 20)的0.01M磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)(pH＝7.4)冲洗两次兔抗羊IgG标记的感受器(图2IV、VI、VIII和X)。用1mL含有0.05％聚山梨醇酯20和1％双(三甲基硅基)乙酰胺(BSA)的0.01M PBS(pH＝7.4)于室温振摇，封闭所述感受器2小时。用含有0.05％聚山梨醇酯20的0.01M PBS(pH＝7.4)冲洗三次之后，特征化并调整了所述感受器悬浮液的铁浓度，使得每种悬浮液具有相同的铁浓度。以HRP-标记的羊抗兔IgG于室温在摇床上孵育2小时之后，在23,000rpm离心所述感受器15分钟。将含有未结合的HRP-标记的羊抗兔IgG的200mL等分的上清液于室温与含有0.012％ 30％过氧化氢的50mL 2.2mM 1，2-苯二胺二盐酸盐(OPD)一起进行反应10分钟。通过添加50mL的1.8M硫酸使所述反应停止，并测量在492nm的吸收。通过监控在与兔抗羊IgG标记的感受器(图2IV，VI，VIII and X)一起孵育之后二级HRP-标记的羊抗兔IgG的消失，确定共价结合到所述感受器表面的兔抗羊IgG的量。 
使用HRP-标记的羊抗鼠IgG作为二级抗体，以与以上所描述的相同的方式确定感受器表面上的免疫反应性抗体部分。结合的HRP-标记的羊抗鼠IgG二级抗体的；量仅代表感受器表面上的免疫反应性一级抗体分子。当与对照的氨基官能化的BNF感受器(图2II)相比较时，非特异性结合的HRP-标记的羊抗兔和羊抗鼠抗体的量可忽略不计。 
四种不同的抗体-感受器缀合策略以获得抗体-标记的BNF感受器(图2IV、VI、VIII和X)的免疫分析结果的比较在图6中显示。图6是柱状图，描绘总的结合的抗体相比于使用图2图示的策略制备的抗体缀合的感受器所具的每毫克铁的免疫反应性。使用基于SPDP和马来酰亚胺的缀合方法结合到感受器表面的抗体总量较之针对使用PEG-COOH或ANB基团缀合到表面上的抗体高28-30％。尽管基于PEG-COOH和ANB-NOS的缀合策略仅导致感受表器表面上约24-27％的免疫反应性抗体，基于SPDP和马来酰亚胺的方法导致与共价附着的一级抗体的总量相关的66-67％百分数的免疫反应性抗体。 
实验结果证明，用生物相容性材料合成稳定的高SAR磁性感受器是可能的。另外，使用各种技术，在保持颗粒完整性和胶体稳定性的同时，将抗体缀合到感受器是可能的。 
实施例10.BNF抗体感受器缀合物的制备及特征化 
首先使用2-亚氨基硫烷将曲妥珠单抗转化为硫醇。然后，总量为1至2mL的在脱气磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中的约2x10-5M巯基化曲妥珠单抗被添加到20mL(400mg)在脱气PBS中的BNF-马来酰亚胺感受器。所述反应混合物于室温被振摇至少一小时。然后添加足够的N-乙基马来酰亚胺(NEM)以达到在所述反应物中的10mM溶液。所述混合物被振摇约40分钟并然后经受磁力分离约30分钟。上清液被移除并添加新鲜的缓冲液用于下一次磁力分离。冲洗重复两次或更多次，并然后将所述感受器缀合物再次悬浮在2mM巯基乙醇中。然后振摇所述悬浮液并继续冲洗顺序两次或更多次，每次冲洗时，抗体 -官能化的感受器缀合物都被再次悬浮在PBS中。 
在感受器缀合物的最终悬浮液上进行铁分析。所测量的铁浓度与20mg/mL颗粒标准(来自相同的Micromod批次)的铁浓度的对比有助于最终体积调整，以获得大体为20mg/mL的感受器缀合物。 
使用FISO技术UMI4通用多通路仪器与FISO Commander 2标准版获得比吸收率(W/g铁)(SAR)，校正曲线通过Techtronix TDS 2024B获得。 
感受器缀合物的结合能力使用改写自Lindmo等人发表的方法的直接细胞结合分析法确定。表达靶抗原的无限增值化人类肿瘤细胞收获自组织培养。细胞被冲洗并以足以提供反应管中过量抗原的细胞浓度，典型地从每管2至5千万个，取决于细胞上的抗原表达，再次悬浮在封闭缓冲液中。准备多个具有增加的细胞浓度的微型管。小量的感受器-抗体缀合物，典型地小于2μg，被添加到每个微型管。在4℃伴随持续混合孵育细胞核感受器-抗体缀合物4小时。使用5微米尼龙过滤器将未结合的感受器缀合物从结合的感受器缀合物分离。通过测量未结合部分中的铁，并从添加到测试中的初始的铁的量减去未结合部分中的铁，来计算结合部分的铁含量。报告的结果为对在无限抗原过剩时细胞浓度绘图的结合的感受器缀合物的部分。通过使用结合到无关抗体的感受器缀合物进行的相同分析，来确定非特异性结合的感受器缀合物。 
在针对结合研究的准备中，贴壁细胞(针对ING-1的HT-29，针对赫赛汀的SKBR-3)在合适培养基中的96-孔板中生长至汇合。 
针对饱和结合实验，浓度从0-1000nM范围内的125-I标记的配体(ING-1，赫赛汀或BNF-感受器缀合物)是通过在96-孔板上跨行梯度稀释(典型地1∶1或1∶3)来制备的，每井的典型最终体积为100μL。在4℃或室温孵育板2-20小时(伴随或不伴随振摇)，以达到平衡结合。结合后，用100μL冲洗缓冲液(典型地1xPBS/0.1％BSA或McCoy’s5a/10％FCS)冲洗所述井3次。以100μL 0.1N的NaOH于室温从所述井洗脱结合的计数，20-30分钟。洗脱溶液被转移到试管，并在γ计数器中计数。计数被输入到GraphPad Prism中，其执行非线性曲线拟合并计算Bmax和Kd值。 
针对竞争性结合实验，将125-I标记的高比活性配体(微量-典型的[微量]＝0.1-5.0nM)与未标记的配体混合，其中未标记的配体浓度在从0-1000nM的范围内变化，所述浓度范围的未标记配体是通过在96-孔板上跨行梯度稀释来制备的，每井的典型最终体积为100μL。在4℃或室温孵育板2-20小时(伴随或不伴随振摇)，以达到平衡结合。结合后，用100μL冲洗缓冲液(典型地1xPBS/0.1％BSA或McCoy’s 5a/10％FCS)冲洗所述井3次。以100μL 0.1N的NaOH于室温从所述井洗脱结合的计数，20-30分钟。洗脱溶液被转移到试管，并在γ计数器中计数。计数被输入到GraphPad Prism中，其执行非线性曲线拟合并计算EC50和Ki值。 
表1.ING-1-BNF、HER-BNF和对照(IgG)缀合制备物汇总。 
1根据以上描述的程序，使用商业上可获得的多克隆人类IgG制备的无结合对照感受器缀合物。 
2根据以上描述的程序，使用c人源化抗-EpCAM抗体(被命名为ING-1)制备的感受器缀合物。 
尽管已参照本发明某些优选的方面相当详细地描述了本发明，其他的变体是可能的。因此所附权利要求的精神和范围不应被限制为该说明书中所包含的描述和优选的变体。 

Claims (50)

1.一种配体缀合的颗粒，包括：
形成单个磁畴的氨基官能化纳米颗粒；至少一个与所述氨基官能化纳米颗粒联系的接头；以及至少一个偶接到所述氨基官能化纳米颗粒或所述接头的配体。
2.如权利要求1所述的配体缀合的颗粒，其中所述磁性纳米颗粒包括生物相容性均质化纳米铁氧体。
3.如权利要求1所述的配体缀合的颗粒，其中所述磁性的纳米颗粒具有大于50％(w/w)的铁含量。
4.如权利要求1所述的配体缀合的颗粒，其中所述接头是双官能化合物。
5.如权利要求1所述的配体缀合的颗粒，其中所述接头是多亚基组合物，所述多亚基组合物包括一个或更多个选自卤代烷基、环氧化物、乙烯基杂累积多烯、环氧丙烷、聚乙二醇、聚丙烯或其组合的亚基。
6.如权利要求1所述的配体缀合的颗粒，其中所述接头包括一个或更多个亲水性亚基。
7.如权利要求1所述的配体缀合的颗粒，其中所述接头包括化学上不同的化合物的混合物。
8.如权利要求1所述的配体缀合的颗粒，其中所述接头包括至少一种双环氧化合物，至少一个聚乙二醇环氧醚、至少一个聚乙二醇二缩水甘油醚、至少一个表氯醇或其组合。
9.如权利要求1所述的配体缀合的颗粒，其中所述接头包括表氯醇和聚乙二醇二缩水甘油醚的混合物。
10.如权利要求1所述的配体缀合的颗粒，其中所述氨基官能化的颗粒包括亚结构，所述亚结构包括至少一个接头、至少一个配体、至少一种螯合剂或其组合。
11.如权利要求1所述的配体缀合的颗粒，其中所述接头包括一个或更多个选自胺、硫醇、肼、叠氮化物、二硫化物、磺酸、羧酸、马来酰亚胺或其组合的末端反应性基团。
12.如权利要求11所述的配体缀合的颗粒，其中所述末端基团的反应性是基于取代或加成化学的。 
13.如权利要求11所述的配体缀合的颗粒，其中所述羧酸是基于聚乙二醇醚的羧酸。
14.如权利要求11所述的配体缀合的颗粒，其中所述叠氮化物是5-叠氮-2-硝基苯甲酰胺。
15.如权利要求11所述的配体缀合的颗粒，其中所述二硫化物是3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺。
16.如权利要求11所述的配体缀合的颗粒，其中所述马来酰亚胺是1，2-二酰基乙烯或3-马来酰亚氨基丙酰胺。
17.如权利要求1所述的配体缀合的颗粒，其中所述配体是抗体。
18.如权利要求1所述的配体缀合的颗粒，其中所述配体通过选自硫醇或胺的基团的并入被修饰。
19.如权利要求1所述的配体缀合的颗粒，其中所述配体以N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯修饰。
20.如权利要求1所述的配体缀合的颗粒，还包括生物相容性覆层。
21.如权利要求20所述的配体缀合的颗粒，其中所述氨基官能化纳米颗粒的表面形成所述生物相容性覆层。
22.如权利要求1所述的配体缀合的颗粒，其中所述颗粒是热疗试剂。
23.一种配体缀合的颗粒，包括：
官能化的磁性纳米颗粒和至少一个与所述官能化的磁性纳米颗粒联系的接头，其中所述配体缀合的纳米颗粒的比吸收率比20nm nanomag
Figure FPA00001204450400021
-D-spio颗粒高至少五倍。
24.如权利要求23所述的配体缀合的颗粒，还包括偶接到所述官能化磁性纳米颗粒或所述接头的配体。
25.一种在受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的如权利要求1所述的配体缀合的颗粒。
26.一种用于制备配体缀合的颗粒的方法，包括：
(i)以氨基或硝基基团官能化形成单个磁畴的颗粒；
(ii)使所述被官能化的颗粒与接头接触；以及 
(iii)将配体偶接至所述颗粒或所述接头以形成配体缀合的颗粒。
27.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述形成单个磁畴的纳米颗粒包括生物相容性均质化纳米铁氧体。
28.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述形成单个磁畴的纳米颗粒具有大于50％(w/w)的铁含量。
29.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述接头是双官能化合物。
30.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述接头是多亚基组合物，所述多亚基组合物包括一个或更多个选自卤代烷基、环氧化物、乙烯基杂累积多烯、环氧丙烷、聚乙二醇、聚丙烯或其组合的亚基。
31.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述接头包括一个或更多个亲水性亚基。
32.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述接头包括化学上不同的化合物的混合物。
33.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述接头包括至少一种双环氧化合物，至少一个聚乙二醇环氧醚、至少一个聚乙二醇二缩水甘油醚、至少一个表氯醇或其组合。
34.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述接头包括表氯醇和聚乙二醇二缩水甘油醚的混合物。
35.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述接头包括一个或更多个选自胺、硫醇、肼、叠氮化物、二硫化物、磺酸、羧酸、马来酰亚胺或其组合的末端反应性基团。
36.如权利要求35所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述末端基团的反应性是基于取代或加成化学的。
37.如权利要求35所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述羧酸是基于聚乙二醇醚的羧酸。
38.如权利要求35所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述叠氮化物是5-叠氮-2- 硝基苯甲酰胺。
39.如权利要求35所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述二硫化物是3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺。
40.如权利要求35所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述马来酰亚胺是1，2-二酰基乙烯或3-马来酰亚氨基丙酰胺。
41.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述配体是抗体。
42.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述配体通过选自硫醇或胺的基团的并入被修饰。
43.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述配体是以N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯修饰的。
44.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述官能化步骤在约7和约9之间的pH发生。
45.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，还包括用含水的缓冲溶液冲洗所述配体缀合的颗粒的附加步骤。
46.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，还包括灭菌所述配体缀合的颗粒的附加步骤。
47.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述冲洗步骤在约5和约8之间的pH发生。
48.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述将所述配体偶接至所述颗粒或所述接头以形成配体缀合的颗粒的步骤在使所述官能化的颗粒与所述接头接触的步骤的12小时之内发生。
49.如权利要求26所述的制备配体缀合的颗粒的方法，其中所述配体缀合的颗粒的尺寸在从10-80nm的范围。
50.一种用于热疗的纳米颗粒，所述纳米颗粒通过包括以下步骤的过程制备：
(i)以氨基或硝基基团官能化形成单个磁畴的颗粒；
(ii)使所述被官能化的颗粒与接头接触；以及
(iii)将配体偶接至所述颗粒或所述接头以形成配体缀合的颗粒。 
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