KR20100063002A - 항독소 탈안정화 기술 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 변성 및 탈변성 절차를 거치지 않고 독소 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.
Description
우선권 주장
본 출원은 2007년 7월 12일 출원된 미국가출원 60/959,399호의 우선권을 주장하며, 그 설명은 그 전체로서 본원에 참조로서 포함된다.
서열 목록에 대한 진술
본원에서 서면으로 제출된 형태 및 컴퓨터 판독가능한 형태는 본원에 명시된 아미노산 서열의 목록이다. 첨부된 서열 목록은 출원된 국제 출원의 설명을 벗어나지 않는다. 컴퓨터 판독가능한 형태로 기록된 정보는 이와 관련하여 서면으로 된 서열 목록과 동일하다.
세균은 일반적으로 소위 독소-항독소(TA) 또는 "자멸" 유전자 시스템을 구비하며, 이것은 성장 조절, 세포 치사 및 스트레스 조건하에 잠복에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 여겨진다. 정상적인 성장 조건하에서, 독소는 동일한 오페론으로부터 엔코딩된 동족(cognate) 항독소와 안정한 복합체 (TA "복합체")를 형성함으로써, 독소는 이의 세포 표적 상에서의 작용에 대해 무능력해진다. 그러나, 스트레스 조건하에서, 불안정한 항독소는 세포질에서 유리 독소를 방출시키며 신속하게 분해되고, 이후 유리 독소는 특수한 세포 표적 상에 이의 독성 효과를 발휘한다.
세균 유전체 상에 존재하는 독소 또는 자멸 유전자의 수는 매우 다양하다: 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli)는 전형적으로 각각 한 쌍의 항독소와 이의 동족 독소를 엔코딩하는 6개의 독립적인 TA 오페론을 함유하는 반면, 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)는 약 40개의 그러한 오페론을 함유한다. 지금까지 서열화된 모든 병원성 세균 유전체는 클라미디아 및 미코플라슴과 같이 숙주 세포와 의무적으로 동거하는 세균을 제외하고는 실제로 하나 이상의 TA 오페론을 함유한다. 이. 콜라이(E. coli)의 6개의 TA 오페론 중에서, 3개는 잘 특성규명되어 있다; ReIE는 리보솜의 엔도-리보누클레아제 활성을 자극하는 리보솜-관련 인자이고, MazF 및 ChpBK는 mRNA 인터페라아제(MIase)라 불리는 서열-특이적인 엔도-리보누클레아제로서 기능한다. MazF는 유도될 때 ACA 서열에서 세포의 mRNA를 절단함으로써 세포 단백질 합성과, 이에 따라 세포 성장을 효과적으로 억제하는 것으로 입증되었다. MazF는 이의 항독소인 MazE와 안정한 복합체를 형성하고 MazF-MazE 복합체의 X-선 구조가 결정되어 있다. TA 복합체는 세포에 독성이 아니므로, 이들은 이. 콜라이(E. coli)에서 잘 발현되고 매우 높은 수율로 용이하게 정제된다. 최근에, ReIE-ReIB 및 YoeB-YefM 복합체의 X-선 구조도 결정되었고, 이는 TA 복합체에서 독소와 항독소와 어떻게 상호작용하는지를 나타내었다.
대부분의 세균은 이의 유전체에 다수의 독소 또는 "자멸" 유전자를 함유한다. 중요하게는, 이러한 유전자로부터 생성된 독소가 이의 서식처에서 다른 세균을 치사시키지 않고 감염 과정에서 동물 세포를 치사시키지도 않는다. 대신, 이들은 세포내에서 생성되고 자체적으로 독성이다. 이렇게 새로운 분야에서의 최근의 발전은 세균 생리학, 다중약물 내성에서의 지속성, 병원성, 균막 형성 및 진화에 있어서 이러한 독소들의 역할에 대한 많은 흥미로운 통찰을 제공하였다. 이러한 독소들의 연구는 감염성 질환 및 의과학에서 매우 중요한 관련을 지님이 이제 명백하다. 이러한 독소들 대부분은 오페론에서 이들의 동족 항독소와 공동-전사되고 (따라서 독소-항독소 또는 TA 오페론이라 불림), 정상적인 성장 조건하에 세포에서 안정한 복합체를 형성하므로 이러한 독소들의 독성 효과는 통상적으로 발휘되지 않는다 (Bayles, 3002; Engelberg-Kulka et al., 2004; Hayes, 2003; Rice and Baytes, 2003). 그러나, 항독소의 안정성이 이들의 동족 독소보다 훨씬 낮기 때문에, 세포 손상 또는 성장 억제를 야기하는 임의의 스트레스는 세포에서 독소와 항독소간 균형에 영향을 미치고, 세포에서 독소의 방출을 초래한다. 많은 논쟁이 있으나, TA 오페론으로부터 엔코딩된 이러한 독소들이 스트레스의 특성에 따라 두 상이한 방식으로 기능한다고 고려되는 것이 가장 타당하다. 하나는 DNA 복제 및 단백질 합성과 같은 특정 세포 기능을 억제함에 의해 성장 속도를 조절하는 것이다. 독소의 양이 항독소를 초과하는 광범한 스트레스하에, 세포 성장은 완전히 저지될 수 있다. 성장 조절에 있어서 TA 독소의 역할이 이들의 주요 기능인 것 같다. 그러나, 이들의 두 번째 기능은 그 자신의 숙주 세포를 치사시키기 위한 자살성이다. 특정 조건하에서, TA 독소는 건강한 집단을 유지하기 위해 고도로 손상된 (예를 들어, DNA 손상이나 파지 감염) 세포를 제거하도록 기능할 수 있다. TA 오페론은 또한 종종 플라스미드에서 발견되며, 여기서 분리(segregational) 후 치사로서 공지된 현상인 세포 분열 후 플라스미드를 잃은 세포를 치사시키는 임무를 수행한다. 따라서, TA 독소는 살균성이 아닌 주로 정균성(bacteriostatic)이나 (Gerdes et al., 2005), 특정 조건하에서만 세포가 세포 치사를 초래하는 회귀불능 지점(point of no return)에 도달할 수 있다 (Amitati et al., 2004). 최근에, 엔겔베르그-쿨카(Engelberg-Kulka)는 이. 콜라이(E. coli) 독소인 MazF가 세포 치사의 실행자가 아니라 오히려 다운스트림 시스템을 활성화시키는 매개체라고 제안하였다 (Engelberg-Kulka et al., 2005).
독소의 과발현은 세포 성장에 매우 독성인 것으로 공지되어 있으므로, 독소 정제를 위해 이들의 항독소를 공동-발현시키는 것이 필수적이다. 독소 단백질을 이들의 TA 복합체로부터 정제시키기 위한 통상적인 프로토콜은 His-tag 친화성 컬럼 크로마토그래피에 이어 항독소를 제거하기 위한 변성과 탈변성 절차를 이용하며; 이러한 절차는 매우 지루한 것이다.
따라서, 이러한 변성 및 탈변성 절차를 요구하지 않고 독소 단백질을 정제하는 효율적인 방법에 대한 요구가 존재한다.
발명의 개요
본 발명의 특정 구체예의 목적은 이전의 통상적인 방법의 변성 및 탈변성 절차를 회피하며 TA 복합체로부터 독소 단백질을 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 탈안정화 서열을 독소-항독소 복합체에 삽입하고, 독소-항독소 복합체를 독소와 항독소의 공동-발현을 자극하는 조건에 노출시키는 것을 포함하여, 독소-항독소 복합체에서 항독소 단백질로부터 독소 단백질을 해리시키는 방법에 관한 것이고, 여기서 탈안정화 서열은 공동-발현 동안 항독소로 하여금 독소로부터 해리되게 한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 탈안정화 서열을 독소-항독소 복합체의 항독소 단백질에 삽입하고, 독소-항독소 복합체를 독소와 항독소의 공동-발현을 자극하는 조건에 노출시키는 것을 포함하여, 독소-항독소 복합체에서 항독소 단백질로부터 독소 단백질을 해리시키는 방법에 관한 것이고, 여기서 탈안정화 서열은 공동-발현 동안 항독소로 하여금 독소로부터 해리되게 한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 탈안정화 서열을 독소-항독소 복합체의 항독소 단백질에 삽입하고, 독소-항독소 복합체를 독소와 항독소의 공동-발현을 자극하는 조건에 노출시키고, 해리된 항독소를 적합한 프로테아제와 접촉시키는 것을 포함하여, 독소-항독소 복합체에서 독소 단백질을 정제시키는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 탈안정화 서열에 의해 공동-발현 동안 항독소가 독소와 해리되고, 상기 프로테아제는 해리된 항독소를 분해시킴으로써 독소를 정제시킨다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 탈안정화 서열을 독소-항독소 복합체에 삽입시키는 것을 포함하여, 독소-항독소 복합체를 탈안정화시키는 방법에 관한 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 독소-항독소 복합체를 엔코딩하는 유전자 물질을 포함하는 독소-항독소 공동-발현 시스템에 관한 것이고, 여기서 독소-항독소 복합체는 트롬빈 인식 서열 (서열번호 3)을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 탈안정화 서열은 인자 Xa, TEV 프로테아제 또는 트롬빈에 의해 절단될 수 있는 서열이다. 특히 바람직한 구체예에서, 탈안정화 서열은 서열번호 3에 따른 트롬빈 인식 서열이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 MazE 항독소로 트롬빈 인식 서열의 도입을 묘사한다.
도 2는 트롬빈 처리에 의해 정제된 MazF 샘플로부터 잔류하는 MazE 항독소의 제거를 묘사한다.
도 3은 본 발명의 일 구체예의 도식적인 모델을 묘사한다.
도 4는 정제된 MazF의 엔도리보누클레아제 활성을 묘사한다.
발명의 상세한 설명
상기 논의된 대로, 인간 병원체를 포함하는 거의 모든 세균은 독소를 함유하며, 이것은 세포에서 이들의 동족 항독소와 안정한 복합체 (TA 복합체)를 형성한다. 이러한 양상으로, 정상적인 성장 조건하에서, 독소는 세포에서 이들의 독성 효과를 발휘할 수 없다. 독소의 과발현은 세포 성장에 고도로 독성인 것으로 공지되어 있으므로, 독소 정제를 위해 이들의 항독소를 공동-발현시키는 것이 필수적이다. 본 발명의 발명자들은 변성과 탈변성 절차를 거치지 않고 독소 단백질을 정제하는 매우 효율적이고 단순한 방법을 개발하였다.
특정 구체예에서, 신규한 아미노산 서열 ("탈안정화 서열")을 항독소 단백질에 도입시켜 세포의 TA 복합체 내에서 항독소를 탈안정화시킴에 의해 독소 단백질을 정제할 수 있다. 탈안정화 서열은 인자 Xa, TEV 프로테아제 및 트롬빈과 같이 특수한 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 공지된 서열일 수 있다. 인자 Xa는 아미노산 인식 서열 IEGR (서열번호 1)에서 절단을 수행하고; TEV 프로테아제는 아미노산 인식 서열 ENLYFQG (서열번호 2)에서 절단을 수행하며; 트롬빈은 아미노산 인식 서열 LVPRGS (서열번호 3)에서 절단을 수행한다.
항독소 단백질의 3차원 구조가 공지된 경우, 탈안정화 서열을 예컨대 루프(loop) 영역에 삽입할 수 있다. 외래 펩티드의 도입 결과, 항독소는 불안정해질 것이고, 이로써 세포에서의 독소와 항독소의 공동-발현 동안 TA 복합체로부터 항독소를 해리시킬 것이다. 많은 항독소가 Lon 및 ClpAp와 같은 고유의 프로테아제에 의해 분해되는 것으로 공지되어 있으므로, 해리된 항독소는 생체내에서 이러한 프로테아제에 의해 용이하게 제거될 것이다. 이러한 방식으로, 독소 단백질은 항독소의 제거없이 정제될 수 있다.
특정 구체예에서, 잔류하는 항독소가 원스텝(one-step) His-tag 크로마토그래피를 이용하여 독소와 공동-용리되는 경우, 용리된 독소 샘플을 항독소로 도입된 특정 서열을 인식하는 특수한 프로테아제로 처리할 수 있다.
본 발명의 방법은 임의의 세균으로부터의 여하한 TA 복합체 시스템에 광범하게 적용될 수 있어서 독소의 대규모 해리를 가능하게 한다. 생성된 정제된 독소는 기초 과학뿐만 아니라 인감의 암 및 기타 질병을 치료하기 위한 치료적 도구로서 이용될 수 있고, 예를 들어 비-통상적인 항생제로서 이용된다. 이들은 또한 다양한 산업적 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 방법을 하기 개시된 대로 MazE-MazF 시스템을 모델로서 이용하여 예시한다.
트롬빈-인식 서열 LVPRGS (서열번호 3)가 위치 38 내지 41에 위치한 VDGK 아미노산 서열 (서열번호 4) 대신에 베타 가닥 S3과 S4의 사이에 있는 MazE 상의 루프 영역에 도입된 IPTG-유도가능한 mazE - mazF 공동-발현 시스템을 구성하였다 (도 1). 이 플라스미드를 포함하는 세포를 IPTG의 존재하에 인큐베이션시켜 MazE 및 MazF 둘 모두를 과발현시켰다. His-tag 크로마토그래피로 정제된 MazF 샘플을 아무것도 없이(레인 1) 또는 0.01 유닛(레인 2), 0.02 유닛(레인 3), 0.04 유닛(레인 4) 및 0.08 유닛(레인 5)의 비오티닐화된 트롬빈(Novagen)의 존재하에 실온에서 밤새 인큐베이션하였다 (도 2 참조). 샘플을 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 ("SDS-PAGE")으로 처리하고 쿠마시-브릴리언트 블루로 염색하였다. MazE는 SDS-PAGE에 이어 염색시에 검출될 수 없었다. 항독소인 MazE가 생체내에서 내인성 프로테아제에 의해 분해되었을 것으로 가정되었다. His-태깅된 MazF 단백질을 His-tag 크로마토그래피를 이용하여 정제하고 100 mM 인산나트륨 (pH 7.6)-300 mM NaCl-20% 글리세롤-5 mM 베타-메르캅토에탄올에 대해 투석하였다. 도 2에 도시된 대로, 고도로 순수한 MazF 단백질이 수득되었다. 비록 SDS-PAGE 겔 상에서 MazF 밴드 바로 아래에 매우 희미한 MazE 밴드가 검출되었으나 (레인 1), 남아있는 MazE 단백질은 트롬빈 처리에 의해 정제된 MazF 샘플로부터 성공적으로 제거되었다 (레인 2 내지 5). 정제된 MazF의 엔도리보누클레아제 활성을 이. 콜라이(E. coli) 세포로부터 추출된 전체 RNA를 분해시킴에 의해 확인하였다. 고온 페놀 방법으로 이. 콜라이(E. coli)로부터 추출된 전체 RNA를 10분 동안 37℃에서 아무것도 없이(레인 1) 또는 0.375 ㎍(레인 2), 0.75 ㎍(레인 3), 1.5 ㎍(레인 4), 3 ㎍(레인 5) 및 6 ㎍ (레인 6)의 정제된 MazF 단백질의 존재하에 인큐베이션하였다 (도 4 참조). 샘플을 3.5% 아크릴아미드 겔 전기영동으로 처리한 후 에티디움 브로마이드 염색시켰다. 본 발명의 본 구체예의 도식적인 모델은 도 3에 묘사된다.
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Leu Val Pro Arg Gly Ser
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sequence
<220>
<221> SITE
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Val Asp Gly Lys
1
Claims (25)
- (a) 탈안정화 서열을 독소-항독소 복합체에 삽입하는 단계, 및
(b) 상기 독소-항독소 복합체를 독소와 항독소의 공동-발현을 자극하는 조건에 노출시키는 단계로서, 상기 탈안정화 서열에 의해 공동-발현 동안 항독소가 독소와 해리되는 단계를 포함하여, 독소-항독소 복합체에서 항독소 단백질로부터 독소 단백질을 해리시키는 방법. - 제 1항에 있어서, 상기 탈안정화 서열이 독소-항독소 복합체의 항독소 단백질에 삽입되는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 탈안정화 서열이 인자 Xa, TEV 프로테아제 또는 트롬빈에 의해 절단될 수 있는 서열인 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 탈안정화 서열이 서열번호 1에 따른 인자 Xa 인식 서열인 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 탈안정화 서열이 서열번호 2에 따른 TEV 프로테아제 인식 서열인 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 탈안정화 서열이 서열번호 3에 따른 트롬빈 인식 서열인 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 탈안정화 서열이 항독소 단백질의 루프(loop) 영역에 삽입되는 방법.
- (a) 탈안정화 서열을 독소-항독소 복합체의 항독소 단백질에 삽입하는 단계,
(b) 상기 독소-항독소 복합체를 독소와 항독소의 공동-발현을 자극하는 조건에 노출시키는 단계로서, 상기 탈안정화 서열에 의해 공동-발현 동안 항독소가 독소와 해리되는 단계, 및
(c) 해리된 항독소를 적합한 프로테아제와 접촉시키는 단계로서, 상기 프로테아제는 해리된 항독소를 분해시킴으로써 독소를 정제시키는 단계를 포함하여, 독소-항독소 복합체에서 독소 단백질을 정제하는 방법. - 제 8항에 있어서, 상기 탈안정화 서열이 인자 Xa, TEV 프로테아제 또는 트롬빈에 의해 절단될 수 있는 서열인 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 탈안정화 서열이 서열번호 1에 따른 인자 Xa 인식 서열인 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 탈안정화 서열이 서열번호 2에 따른 TEV 프로테아제 인식 서열인 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 탈안정화 서열이 서열번호 3에 따른 트롬빈 인식 서열인 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 탈안정화 서열이 항독소 단백질의 루프 영역에 삽입되는 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 프로테아제가 생체내에서 항독소와 접촉되는 방법.
- 제 8항에 있어서, 원스텝(one step) His-tag 크로마토그래피를 이용하여 독소와 공동-용리된 후 상기 프로테아제가 항독소와 접촉되는 방법.
- 탈안정화 서열을 독소-항독소 복합체에 삽입시키는 것을 포함하여, 독소-항독소 복합체를 탈안정화시키는 방법.
- 제 16항에 있어서, 상기 탈안정화 서열이 독소-항독소 복합체의 항독소 단백질에 삽입되는 방법.
- 제 16항에 있어서, 상기 탈안정화 서열이 서열번호 1에 따른 인자 Xa 인식 서열인 방법.
- 제 16항에 있어서, 상기 탈안정화 서열이 서열번호 2에 따른 TEV 프로테아제 인식 서열인 방법.
- 제 16항에 있어서, 상기 탈안정화 서열이 서열번호 3에 따른 트롬빈 인식 서열인 방법.
- 독소-항독소 복합체를 엔코딩하는 유전자 물질을 포함하는 독소-항독소 공동-발현 시스템으로서, 상기 독소-항독소 복합체가 서열번호 3을 포함하는 독소-항독소 공동-발현 시스템.
- 제 21항에 있어서, 상기 독소-항독소 복합체가 MazF 및 MazE를 포함하는 독소-항독소 공동-발현 시스템.
- 제 22항에 있어서, 상기 서열번호 3이 베타 가닥 S3과 S4 사이에 있는 MazE의 루프 영역에 위치하는 독소-항독소 공동-발현 시스템.
- 제 21항에 있어서, 상기 유전자 물질이 플라스미드인 독소-항독소 공동-발현 시스템.
- (a) 탈안정화 서열을 독소-항독소 복합체의 항독소 단백질에 삽입하는 단계, 및
(b) 상기 독소-항독소 복합체를 독소와 항독소의 공동-발현을 자극하는 조건에 노출시키는 단계로서, 상기 탈안정화 서열에 의해 공동-발현 동안 항독소가 독소와 해리되는 단계를 포함하여, 독소-항독소 복합체에서 항독소 단백질로부터 독소 단백질을 해리시키는 방법.
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