KR20100061245A - 석류 추출물을 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
석류 추출물을 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 뇌 신경 세포 보호물질을 포함하는 석류 추출물을 포함하는 뇌 신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 뇌 신경 세포 보호물질로서 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)을 포함하고, 산화적 스트레스(oxidative stress) 유발을 감소시키며 세포 활성(cell viability)을 증대시킬 뿐만 아니라 치매 모델 동물실험의 대안행동(alternative behavior) 및 스텝 쓰루 레턴시(step through latency) 수동회피검사에서 기억 학습 능력을 유지시키는 석류 추출물이 포함된 인체에 무해한 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
석류, 2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol, 아밀로이드 베타 펩티드(amyloid β peptide (Aβ)), 산화적 스트레스, 알츠하이머
Description
본 발명은 석류 추출물 또는 그의 활성 성분을 포함하는 뇌 신경계 질환 특히, 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 아밀로이드 베타 펩티드에 의해 유도된 산화적 스트레스의 저해 활성과 세포 활성 효과를 갖는 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol), 이를 포함하는 뇌 신경계 질환 예방 또는 치료용 조성물 및 상기 유효성분인 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)를 분리 또는 정제하는 방법에 관한 것이다.
최근 평균수명이 증가하고 사회의 고령화가 진행되면서 노화에 대한 관심 및 노화와 관련된 질병 특히, 뇌졸증, 치매, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD),파킨슨병 등의 뇌신경질환과 같이 뇌신경세포 손상과 관련된 퇴행성 신경질환 등에 대한 관심이 증대되고 있다.
상기 뇌신경계 질환들은 특정 뇌세포의 사멸 또는 퇴화가 일시적 또는 오랜 기간에 걸쳐 진행하는 것이 특징인데, 한번 죽은 뇌세포는 재생이 되지 않기 때문에 결국 치명적인 뇌기능의 손실로 이어진다. 특히, 인지기능, 감각기능, 운동기능, 전신기능의 진행성 저하를 수반하는 뇌기능 부전은 결국 성격과 행동의 변화를 가져오고, 환자들이 스스로 자신을 돌볼 수 없는 지경에 이르게 한다. 이러한 뇌세포 사멸의 주요 경로로는 산화적 스트레스에 의한 산화적 독성, 흥분적 독성, 아폽토시스(apoptosis) 등이 제시되고 있으며, 각각은 특이한 신호전달과정을 통하여 세포사멸을 유발하게 된다.
구체적으로, 뇌졸증, 뇌손상, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨 병 환자에서 뇌세포 사멸의 주원인으로 활성 산소종(Reactive Oxygen Species)의 축적 후 단백질, 핵산, 지질의 산화적 손상이 제시되었다. 특히 자유 라디칼(free radicals)에 의한 산화적 스트레스는 체 내의 각 조직에서 일어나는 세포 사멸의 주원인으로 보고되고 있으며, 뇌신경질환에서 나타나는 세포사멸의 주기전의 하나로도 제시되어 왔다(Schapira, A. H., Curr. Opin. Neurol., 9(4):260-264, 1996). 뇌신경질환에서 신경세포의 사멸에 자유 라디칼이 관여한다는 증거로는, 허혈 후 활성 산소종의 생성 증가 및 항산화제에 의한 허혈성 신경세포의 사멸억제효과(Flamm, E. S. et al., Stroke 9(5): 445-447, 1978; Chan, P. H., J. Neurotrauma 9 Suppl.2:S417-423, 1992); 헌팅턴병의 선조체에서 Fe2+의 증가(Dexter, E. T. et al., Ann. Neutol., 32 Suppl:S94-100,1992), 알츠하이머 질환에서 나타나는 베타 아밀로이드에 의한 자유 라디칼의 생성(Richardson J. S. et al., Ann. N. Y.Acad. Sci., 777:362-367, 1996), 가족성 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)에서 Cu/Zn SOD-1 유전자에서의 점 돌연변이(Rosen, D. R. et al., Nature, 362(6415):59-62, 1993) 등이 있다.
대표적인 뇌신경계 질환으로서, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)은 퇴행성 신경계 질환으로서, 80세 이상 노인의 50% 정도가 고통을 받고 있는 병이다. 알츠하이머 병은 암, 심장질환 및 뇌졸증에 이어 노인 사망의 네 번째 원인이 되고 있으며, 미국에서는 매년 250,000명 이상이 알츠하이머 병으로 진단받고 있고, 현재 400만명의 환자가 이 병을 앓고 있는 것으로 추정되고 있다.
미국의 경우 알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)은 전체 인구의 사망 원인 중 심혈관질환, 악성종양 및 뇌졸증에 이어 제4위를 차지하며, 치료경비 면에서도 암 및 심장병에 이어 제3위를 점유하고 있어 사회 경제적으로 미치는 영향도 상당한 것으로 보인다.
알츠하이머 병은 크게 유전성 알츠하이머 병(familial Alzheimer's disease, FAD)과 산발성 알츠하이머 병(sporadic Alzheimer's disease, SAD)으로 분류된다. 유전성 알츠하이머 병은 전체 알츠하이머 병 환자의 5~10% 정도를 차지하며, 원인 유전인자로 알려진 프레세닐린 1(presenilin 1, PS1), 아밀로이드 전구단백질 (amyloid precursor protein, APP) 및 프레세닐린 2(presenilin2, PS2)에 돌연변이가 일어났을 경우 100% 알츠하이머 병으로 발병하게 된다. 산발성 알츠하이머 병은 알츠하이머 병 환자의 대부분을 차지하며, 아포지단백질E(apolipoprotein E, ApoE)나 알파-2 마크로글로불린(α-2 macroglobulin, A2M)에 돌연변이가 일어났을 때 알츠하이머 병으로 진전할 확률이 높아지는 위험인자는 밝혀져 있으나, 현재까지 발병의 정확한 원인은 알려진 것이 없다.
알츠하이머 병의 병리학적 특징으로는 신경세포의 외부에 축적되어지는 노인반점(senile plaques), 신경세포의 세포체 내에 엉켜진 실뭉치처럼 보이는 신경섬유 덩어리(neurofibrilary tangles) 및 신경세포의 손실(neuronal loss) 등을 들 수 있다. 이러한 병리학적 특징은 유전성 알츠하이머 병 및 산발성 알츠하이머 병의 모든 경우에 다 나타나며, 이 중 노인반점의 주요 구성 요소로는 응집된 아밀로이드 베타 펩티드(amyloid β peptide, Aβ)라는 독성단백질이 밝혀져 있다. 아밀로이드 베타 펩티드는 아밀로이드 전구단백질의 비정상적인 절단으로부터 생성된 40 내지 42개의 아미노산으로 이루어진 불용성 펩티드이다. 또한, 아밀로이드 베타 펩티드의 과다 축적은 유전성 알츠하이머 병 및 산발성 알츠하이머 병의 모든 경우에 공통적 현상으로 나타난다고 보고 되어 있다. 따라서 아밀로이드 베타 펩티드는 알츠하이머 병의 주요 병원성 물질(pathogenic material)로 간주되고 있다.
알츠하이머 병의 전반적인 발병과정은 다음과 같다. 프레세닐린 1, 2 유전자 (PS 1, 2)의 돌연변이가 발생하면 베타-세크레타제(β-secretase)에 의해 아밀로이드 전구단백질이 비정상적으로 절단되고 아밀로이드 베타 펩티드가 생성된다. 생성된 아밀로이드 베타 펩티드에 의해 뇌신경세포의 괴사가 일어나며, 이로 인해 알츠하이머 병이 발병하게 된다.
상기 나타난 바와 같이, 뇌신경의 불활성화와 괴사는 아밀로이드 전구단백질의 비정상적 대사산물인 아밀로이드베타 펩티드에 의한 세포독성으로 생각되어진다. 이의 신경독성은 산화적 스트레스(oxidative stress)로 인한 뇌신경세포 파괴에서 시작된다. 알츠하이머 병에서 뇌신경세포 괴사의 원인은 아직 불분명하지만 산소 유리 라디칼(oxygen free radical)의 생성, 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)과 같은 산화적 손상(oxidative injury)이 뇌신경세포 파괴 및 병인론(pathogenesis)과 관련되어 있을 것으로 추정된다.
현재, 알츠하이머 병 환자의 뇌에서 이들 산화적 스트레스[반응성 산소종 (ROS), 지질과산화(lipidperoxidation), 단백질 변형(protein modification), 미토콘드리아 DNA 산화(mitochondrial DNA oxidation)]의 증가는 증명되고 있다. 또한, 아밀로이드 베타 펩티드는 세포내 유리 라디칼 상태(intracellular free radicalstatus)를 유발시키고 궁극적으로 세포사멸을 유도하므로, 아밀로이드 베타 펩티드와 세포 파괴는 상관성이 있을 것으로 생각된다.
아밀로이드 베타 펩티드는 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP)의 비정상적인 분리(abnormal cleavage)로부터 생성된 40-42개의 펩티드 물질이고 알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)에서 중요한 병원성 물질(pathogenetic material)로 생각되어지고 있다. 알츠하이머 병에서의 뇌신경세포 괴사의 원인은 아직 불분명하지만 산소 유리 라디칼(oxygen free radical)의 생성, 활성 산소 종(reactive oxygen species, ROS)와 같은 산화적 손상(oxidative injury)이 뇌신경세포 파괴 및 병인(pathogenesis)과 관련되어 있을 것으로 추정된다. 알츠하이머 병 환자의 뇌에서 이들 산화적 스트레스(oxidative stress (ROS, lipid peroxidation, protein modification, mitochondrial DNA oxidation))의 증가는 증명되고 있으며 이러한 생리적 대사 이상은 아밀로이드 플라그(amyloid plaques)와 신경섬유엉킴(neurofibrillary tangles, NFT)과 같은 알츠하이머 병 뇌 고유의 임상적 결과를 초래한다. 또한 아밀로이드 베타 펩티드는 세포내 유리 라디칼 상태(intra-cellular free radical status)를 유발시키고 궁극적으로 세포괴사를 유도하여 아밀로이드 베타 펩티드와 뇌신경세포 파괴는 상관성이 있는 것으로 보인다. 아밀로이드 베타 펩티드에 의한 ROS, 유리 라디칼(free radical) 등의 생성은 신경 독성을 유발하는 아밀로이드 베타 펩티드의 추정을 가능하게 하기 때문에 이들에 대한 연구는 필수적이라 할 수 있다.
최근, 알츠하이머 병의 연구는 아밀로이드 베타 펩티드에 의한 뇌세포 파괴, 이들 단백질의 구조 및 생리작용, 뇌 안에서의 축적에 의한 아세틸콜린 (acetylcholine, ACh)의 농도 감소 등을 중심으로 연구되고 있다. 알츠하이머 병의 증상으로는 기억력, 인지능력 및 학습능력의 상실이 서서히 진행되어 나타나며, 이어서 감정 장애와 이상행동을 가져온다. 따라서, 알츠하이머 병의 치료는 주로 환자의 증상을 가볍게 하고, 병의 진행속도를 지연시키는데 주안을 두는 간접 치료가 유일한 치료법이 되어 왔다.
현재까지 보고된 항치매 활성화 성분은 주로 식물기원성 저분자로 특히 노인성 치매 환자들에게 인지적 증상을 호전시키는 약물로서 ChEIs(cholinesterase inhibitors)를 많이 사용되고 있다. 제1세대 ChEIs로서 최초로 항치매 작용에 있어 적용 승인을 받은 타크린은 작용지속 기간이 짧아 하루 4번 투여해야 하며, 간 독성이 있어 모니터링(monitoring)의 번거로움이 있다. 요즈음 주목받고 있는 제2세대 ChEIs(cholinesterase inhibitors)들로는 일본 에자이사에서 개발되어 96년 말 미국 FDA 승인을 받고 97년부터 세계 30여국에서 판매되고 있는 도네페질(donepezil)로 하루 한번 복용할 수 있고, 선택적인 저해로 말초 부작용을 줄였다. 리버스티그민(Rivastigmine)은 미국 노바티스사에서 개발한 약물로, 스위스에서 1997년 12월에 승인 받아 EU와 남아메리카 국가들에서 사용되고 있고, 미국, 캐나다에서도 승인 준비 중이며, 우리나라에는 97년 9월 도입되었다. 리버스티그 민(Rivastigmine)은 하루 2번 복용이 가능하고 중추신경계에 특이성이 높아 말초 부작용을 크게 감소시켰고 신장에서 대사되므로 간 독성이 거의 없는 것으로 보고되고 있다. 메트리포네이트(Metrifonate)가 치매환자에 3상 임상실험이 진행 중이며, 비가역적인 아세틸콜린에스트라제 억제제(acetyl cholinesterase inhibitor, AChEIs)로서 작용기간이 길다.
상기한 바와 같이, 현재 사용되고 있는 치매 치료제는 대부분 아세틸콜린에스터라제 저해제이다. 한편, 아밀로이드 베타 펩티드가 적어도 알츠하이머 병의 원인 중 하나라고 생각되기 때문에, 아밀로이드 베타 펩티드에 의해 유도되는 산화적 스트레스에 의한 뇌신경세포에 대한 손상을 저해시키는 물질을 개발하면 알츠하이머 병의 예방 또는 치료에 효과적일 것이라 생각된다. 따라서, 아밀로이드 베타 펩티드 생성과 아밀로이드 베타 펩티드에 의해 유도된 세포독성을 저해 또는 봉쇄(blocking)하는 유전적 접근에 대한 연구가 국내 연구진에서 비교적 활발히 이루어지고 있다. 그러나, 이를 이용한 알츠하이머 병의 예방 또는 치료제로서의 약물 개발로는 아직까지 미흡한 상태이다.
이에, 본 발명자들은 알츠하이머 병 등과 같은 신경계 질환에 유용한 치료제에 관하여 예의 연구하였으며, 그 결과 아밀로이드 베타 펩티드에 의해 유도되는 산화적 스트레스에 의한 뇌신경세포에 대한 손상을 저해할 수 있는 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)를 석류 추출물로부터 분리, 정제하였으며 이들의 뇌신경 예방 및 치료 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 석류 추출물을 포함하는 뇌 신경계 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)을 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌 신경계 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 석류 추출물에서 유효성분인 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)을 분리 또는 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 석류 추출물 또는 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)을 포함하는 뇌 신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품용 조성물을 제공하는 것이다.
이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 석류 추출물 또는 그의 유효성분인 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)- phenol)을 포함하는 뇌 신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 석류 추출물 또는 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)을 포함하는 뇌 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
석류(Pomegranate, Punica granatum L.)는 석류나무과(Punicaceae)에 속하는 석류나무의 열매로서, 과육에는 당질(포도당과당), 시트르산 등의 유기산 및 소량의 수용성 비타민(B1ㆍB2ㆍ나이아신) 등이 포함되어 있고, 과피에는 다량의 탄닌이 포함되어 있으며, 씨에는 식물성 에스트로겐(phytoestrogen) 등의 성분이 포함되어 있다고 알려져 있다. 전기 성분들의 효능에 관련하여서, 수용성 비타민 B₁은 운동신경과 시신경에 효과가 있고, 비타민 B₂는 지능저하와 기억력 감퇴, 알츠하이머 등을 예방할 수 있으며, 나이아신은 체내의 에너지대사에 꼭 필요하며 구강염과 구내염에 효과적이고, 탄닌은 소화액의 분비를 자극시켜 입맛을 돋우고 인체의 에너지대사를 도와 피로를 빠르게 회복시키며, 식물성 에스트로겐은 여성의 갱년기 장애에 좋다고 알려져 있다.
본 발명에서 용어 "뇌 신경계 질환"이란, 신경 특히, 뇌신경과 관련된 여러 가지 질병을 총칭하는 용어를 의미하며 바람직하게는 퇴행성 신경계 질환을 의미한다. 상기 퇴행성 신경계 질환은 아밀로이드 베타 펩티드-유도 산화적 스트레스에 의한 뇌 신경 세포 손상이 유발되는 질환을 일컬으며, 구체적으로는 알츠하이머 병, 치매, 근위축측상경화증(amyotrophic laternal sclerosis), 파킨슨씨병(Parkinson's disease), 심근경색증(myocardial infacrtion) 또는 헌팅턴병일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 알츠하이머 병이다.
구체적으로, 알츠하이머 병 모델의 신경세포의 미토콘드리아에 아밀로이드 베타가 축적됨이 발견되었고, 미토콘드리아에서 활성 산소의 생성이 증가되면서 산화에 의한 손상(oxidative damage)이 유발됨이 보고되었으며, 이러한 산화에 의한 손상이 알츠하이머 병의 발병과 관련이 있는 것으로 보고되어 있다(Manczak et al., Hum Mol Genet. 15(9): 1437-49); Reddy, J Neurochem. 96(1): 1-13(2006)).
본 발명의 조성물에 포함되는 석류 추출물은 석류로부터 공지의 방법을 적절히 채택하여 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 따라서 추출시간, 용매 및 온도 등의 조건은 당업자가 적절히 조절할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 사용하여 추출한다.
이와 같은 본 발명에 따른 조성물에 포함되는 석류 추출물은 아밀로이드 베타 펩티드-유도 산화적 스트레스에 의한 신경 세포 손상에 대한 보호활성을 갖는다. In vitro 상에서, 석류 에탄올 추출물을 극성에 따라 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순으로 각각 분획한 후 산화적 스트레스 유발정도 및 MTT 환원 어세이를 통해 세포 활성(viability)을 측정한 결과 에틸아세테이트의 분획이 가장 우수 한 신경세포 보호활성을 보임을 확인하였다.
또한 in vivo 상에서, 마우스에 아밀로이드 베타를 주사하여 치매모델을 확립한 후 석류 추출물을 400 mg/kg 및 800 mg/kg로 투약한 군의 경우 대안행동(alternative behavior) 및 스텝 쓰루 레턴시(step through latency) 수동회피검사에서 치매군보다 우수한 효과를 확인하였다.
상기 석류 추출물에 함유되는 아밀로이드 베타 펩티드-유도 산화적 스트레스에 의한 신경 세포 손상에 대한 보호활성을 갖는 유효성분은, 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)이며 이 또한 본 발명에 따른 조성물에 포함될 수 있다.
상기 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)은 (C14H22O, CAS No: 96-76-4) 하기 화학식 1을 가지며 분자량은 206.32이다.
상기 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)은 이에 제한되는 것은 아니나, 하기와 같은 방법으로 추출 분리하여 제조된다.
먼저 석류(punica granatum)를 마쇄하여 얻은 석류 조말에 에탄올을 가하여 얻은 석류 에탄올 추출물에 극성이 다른 유기용매인 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 분획하는 단계; 상기 획득한 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 분획물을 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(open silica gel column chromatography)를 사용하여 뇌손상 저해 활성 물질을 CHCl3 : EtOH = 80:20 (v/v)으로 용출분획하여 수득하는 단계; 상기 전 단계에서의 획분을 TLC로 분리한 결과 가장 활성이 좋은 5th 밴드(Rf value = 0.47)를 수득하는 단계; 상기 전 단계에서의 활성 분획을 HPLC로 분리하여 분자량 206.32 m/z를 갖는 활성물질을 수득하는 단계를 포함하여 아밀로이드 베타 펩티드-유도 산화적 스트레스에 의한 뇌 신경 독성 저해 활성을 갖는 석류 에탄올 추출물 제조 방법에 의한다.
상기 추출물로서 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알콜 또는 부탄올 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올이다. 또한 극성이 다른 유기용매로 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트를 사용한다.
한편, 본 발명에 따른 퇴행성 신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 석류 추출물 또는 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 더 나아가 본 발명의 조성물은 석류 추출물 또는 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)과 함께 신경 세포 보호 및 신경독성 억제 또는 예방의 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있으며, 이들 약제학적으로 허용되는 담체, 약제학적 조성물의 제제, 이들 제제를 제조하는 방법의 실례는 공지된 방법에 의한다.
이들 약학적 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 신경 퇴행 및/또는 이와 연관된 증상을 비롯한 다양한 질환을 치료하기 위하여 본 발명의 석류 추출물을 개체에 투여하는데 유용하다. 석류 추출물은 이런 약제학적 조성물이 투여되는 개체에서 퇴행성 신경질환을 치료하는데 유효한 양으로 제공되며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기한 바와 같이, 당업자는 적절한 양을 편의하게 결정할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내, 근육 내, 혈관 내 또는 피하투여) 할 수 있으며, 바람직하게는 경구 또는 정맥 내 투여이다.
경구투여를 위해서, 석류 추출물 제제는 캡슐, 정제, 분말, 과립 또는 현탁 액으로 제공될 수 있다. 이들 제제는 락토오스, 만니톨, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 통상적인 첨가제를 함유할 수 있다. 이들 제제에는 또한 결합제 예를 들면, 결정성 셀룰로오스, 셀룰로오스 유사체, 아카시아, 옥수수 전분 또는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스가 제공될 수도 있다. 이들 제제에는 또한 이염기성 인산칼슘 또는 무수성 나트륨 전분 글리콜레이트가 제공될 수도 있다. 최종적으로 이들 제제에는 윤활제, 예를 들면 활석 또는 스테아르산 마그네슘이 제공될 수 있다.
비경구 투여를 위하여, 석류 추출물 제제는 무균 수용액, 바람직하게는 개체의 혈액과 등장성인 무균 수용액과 혼합될 수 있다. 이들 제제는 생리적합성 물질, 예를 들면, 염화나트륨, 글리신 등을 함유하고 생리 조건에 적합한 완충된 pH를 보유하는 물에 고체 활성성분을 용해시켜 수용액을 생산하고 상기 용액이 무균이 되도록 함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 퇴행성 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 퇴행성 신경계 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품의 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 석류 추출물로 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 석류 추출물 또는 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 검류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 석류 추출물은 주변에서 손쉽게 구할 수 있을 뿐만 아니라 독성, 부작용 등의 우려가 거의 없는 천연산물이며, 특히 산화적 스트레스에 의한 신경 세포 손상에의 보호물질을 포함하고 있다는 사실이 본 발명을 통해 새로이 밝혀졌다. 따라서 본 발명에 따른 석류 추출물 또는 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)을 포함하는 조성물은 신경 퇴행성 질환, 바람직하게는 알츠하이머 병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
상술한 바와 같이 본 발명의 석류 추출물은 퇴행성 신경 질환과 상관관계가 있는 것으로 알려진 산화적 스트레스를 감소시키고 세포활성을 증대시킬 뿐만 아니라 치매 모델에서 기억 학습 능력을 유지시키며 인체에 부작용을 발생시키지 않으므로 이를 포함하는 조성물은 상기 질병의 예방 및 개선을 위한 약학적 또는 건강 기능식품용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
산화적 스트레스(oxidative stress)는 DCF-DA(2',7'-dichlorofluorescin diacetate) 어세이를 이용하여 형광분광광도계(spectrofluorometer)를 통해서 측정하여 석류 추출물의 저해활성을 확인하였으며, 세포활성(Cell viability)는 MTT 환원 어세이를 통해 측정하였다.
<실시예 1> 석류 에탄올 추출물 제조 및 뇌 신경세포 보호물질 분리
1. 석류 에탄올 추출물의 제조
선정된 석류(Punica granatum)를 믹서로 곱게 마쇄한 후 마쇄된 2.7 kg의 석류 조말을 에탄올 5배 부피로 24시간 동안 흔들어서(shaking) 5회 추출한 후 감압 농축하여 석류 에탄올 추출물을 조제한다.
2. 석류 분획물의 제조
상기 추출물로부터 에탄올을 완전히 제거한 후 극성에 따라 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 각각 3배 부피로 환류 추출하여 1차적인 물질 분리를 실시하였다. 추출된 원액 그대로의 에탄올 추출물(crude ethanolic extract)은 극성도에 따라 용매 분획(solvent partitioning)을 실시하여 산화적 스트레스 저해 활성 및 세포 활성을 확인하였다.
3. 석류 에틸 아세테이트 분획물로부터 활성물질의 분리
저해 활성이 높게 나온 에틸 아세테이트(ethyl acetate (E1-E3))부분을 가지고 열린 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(open silica gel column chromatography)를 시행하여 33개의 소분획 (CHCl3 : EtOH = 100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90, 0:100 순으로 각각 3회)으로 분획 하였다.
열린 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(open silica gel column chromatography)의 획분 중 저해활성이 좋은 CHCl3 : EtOH = 80:20 (v/v) 두 번째 획분을 TLC로 분리한 결과 가장 활성이 좋은 5th 밴드 (Rf value = 0.47)를 얻었다.
4. HPLC를 통한 활성물질 확인
가장 높은 활성을 나타낸 5th 밴드(Rf value 0.19) 부분의 활성성분(active compound)을 분리 해내기 위하여 HPLC 어세이를 실시하였다. 이때 HLPC 사용 조건은 다음과 같다.
Data detection: PDA, 200-800 nm, Column: C18μ bondapakTM(reverse phase column, size: 3.9 x 300 mm), Mobile phase: gradient of 0-100% ethanol in water (total 90 min), Flow rate: 0.5 ml/min, Injection volume: 10 ㎕ (30 mg/ml)
이 활성 밴드를 HPLC로 분리하여 확인한 결과, 분리된 물질은 분자량 206.32 m/z를 갖는 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)을 확인하였다(도 5).
<실시예 2> 석류 에탄올 추출물의 뇌 신경세포 보호 활성
석류 에탄올 추출물의 산화적 스트레스에 의한 뇌신경 독성으로부터 뇌 신경세포 보호 활성을 확인하기 위해, 신경세포 괴사 저해능을 석류 에탄올 추출물의 농도별로 측정하였다. PC12 세포를 항진균제/항생제를 함유한 RPMI-1640 배지에서 배양하여 세포수가 104-106 cell/ml가 되었을 때 100 μM의 H2O2를 처리하여 산화적 스트레스(oxidative stress)를 유도하였다.
C군은 탈이온수(deionized water)처리군, H군은 H2O2 100μM 처리군, V는 H2O2 처리 전 48시간동안 Vit. C 100 μM으로 사전 배양(pre-incubated)한 군이며, 다른 군들은 H2O2처리 전 48시간동안 각기 다른 농도(0.5~2.0 mg/ml)로 사전 배양한 군이다. 산화적 손상(oxidative injury) 유발 정도는 DCF-DA 어세이를 이용하여 형광분광광도계(spectrofluorometer)를 통해서 측정하여 석류 추출물의 저해활성을 확인하였다(도 2a). 세포 활성(cell viability)은 MTT 환원 어세이를 통해 측정하였다.
MTT 환원 어세이는 다음과 같이 실시하였다.
PC12 cell을 이용하여 cell 수가 104-106 일 때 96 well에 100 ㎕ 씩 접종(seeding) 한 후 overnight 후에 식용식물자원 추출물을 탈이온수(distilled water)로 녹여 1 ㎎/㎖로 30 ㎕씩 전처리한다. 48시간 후, 세포에 상해를 줄 수 있는 아밀로이드 베타 펩티드(amyloid beta peptide, Aβ) 또는 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)를 처리하고 2시간 후 (Aβ는 24시간) MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]용액을 2.5 ㎎/㎖로 제조하여 세포에 처리해주어 어두운 조건하에 인큐베이터(incubator)에서 3시간 배양한 후에 DMSO를 처 리한 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader) (파장: measurement 570 nm, reference 630nm)를 이용하여 흡광도를 측정한다.
H2O2에 의한 산화적 스트레스 유발정도는 석류 에탄올 추출물의 농도에 비례하여 감소됨을 확인하였으며(도 2a), 또한 세포활성(cell viability)은 비타민 C 전 처리군에 비해 석류 에탄올 추출물 처리군이 좋은 활성을 보임을 확인하였다(도 2b).
<실시예 3> 동물을 이용한 활성 효과 확인
In vivo 상에서 석류 추출물의 활성을 측정하기 위하여 마우스(mice)에 아밀로이드 베타 펩티드를 주사하여 치매 모델을 확립하였다. 기억력 및 학습능력 활동량을 측정하기 위한 대안행동(alternative behavior) Y-미로 실험(Y-maze test)의 실험 및 기억력 및 학습능력의 변화를 확인하기 위한 스텝 쓰루 레턴시(step through latency) 수동회피검사를 실시하였다(도 6).
In vivo 실험은 In vivo 행동 평가(behavioral test)를 위해 ICR-수컷 마우스(ICR-male mouse)에 시료의 추출물을 대조군(control)과 음성 대조군(negative control)을 제외한 각 그룹(group)당 400, 800 ㎎/㎏ 제공하였다. ICR-수컷 마우스(ICR-male mouse)는 20-24℃, 30-70%의 상대습도를 갖는 12-광주기 챔버(12- photoperiod chamber)에서 사육하였다.
Y-미로 실험(Y-maze test)을 위하여 ICR-수컷 마우스(ICR-male mice)는 샘플을 섞은 물을 약 3주간 ad lib (무제한 임의식이법) 상태로 공급하였다. 치매 유발성 물질로 아밀로이드 베타 펩티드(amyloid beta peptide, Aβ)를 뇌실 내로(intracerebroventricular, ICV) 투여하여 각각 ⓐ, ⓑ, ⓒ 세 개의 arms를 갖는 Y-maze에서 행동실험을 실시하였다. Y-maze는 길이 32.5 cm, 높이 15 cm 그리고 넓이 4 cm로써 각각의 arm을 A, B, C로 정한 다음 들어간 arms를 기록하였다. 마우스를 미로(maze)에 넣고 아무런 자극 없이 8 분 동안 자유롭게 움직이도록 두고, 꼬리를 제외하고 arm에 두 뒷발이 들어간 것을 측정하여 그 수치를 계산하였다.
수동 회피 검사(Passive avoidance test)를 위하여 상기 조건처럼 ICR-수컷 마우스(ICR-male mice)는 음식(food)과 선정시료를 약 3주간 ad lib(무제한 임의식이법)의 상태로 공급하였다. 치매 유발성 물질로는 아밀로이드 베타 펩티드(Aβ)를 각각 시험 전에 ICV 투여하여 기억력 실험을 실시하였다. 이 실험은 실제 실험에 들어가기 전날에 기억상자와 같은 장소에서 트레이닝(training)을 시킨 다음 행동실험을 실시하였다. 모든 마우스를 실험 전날 실험 상자에서 적응 훈련(명(明)실-명(明)실, 쇼크 없음-명(明)실, 쇼크 있음)을 실시한 후에 24시간 뒤에 쇼크는 없고 빛은 있는 상태에서 1 마리당 300 sec 동안 실험하였다.
대안행동(alternative behavior)과 마우스의 스텝 쓰루 레턴시(step through latency) 수동회피검사에서 석류 추출물 800(PG800) 섭취군이 섭취하지 않은 군보다 보다 높은 수치가 나왔다(도 7a, 7b). Y-maze 결과, 대조군보다 치매 유발군 (A)에서 기억력 감소가 확인되었고 샘플이 공급된 그룹에서는 치매 유발 물질을 주사했음에도 기억력이 감소가 일어나지 않았음을 알 수 있었다(도 7a).
수동회피검사(Passive avoidance test) 결과, 치매를 유발시키지 않은 대조군(control group)은 아밀로이드 베타 펩티드(Aβ) 군에 비해서 안정된 기억학습능력을 나타내었고, 400, 800 ㎎/㎏ 군에서는 대조군의 학습능력 활성과 비교할 때 거의 같거나 상회하는 인지능력의 회복을 확인하였다(도 7b).
실험예 1: 석류 추출물의 H
2
O
2
에 의해 유도된 산화적 스트레스 저해 활성 및 세포 활성 측정
석류를 에탄올 추출한 후 신경세포 괴사 저해능을 농도별로 측정하였다. PC12 세포를 항진균제/항생제(antimicotics/antibiotics)를 함유한 RPMI-1640 배지에서 배양하여 세포수가 104-106 cell/ml가 되었을 때 100 μM의 H2O2를 처리하여 산화적 스트레스를 유도한다. 산화적 손상(Oxidative injury)을 DCF-DA (2',7'-dichlorofluorescin diacetate)를 이용하여 형광분광광도계(spectrofluorometer)를 통해서 측정한 결과 석류 추출물의 산화적 스트레스의 저해활성을 확인하였다. 석 류 에탄올 추출물에서 세포 활성(Cell viability)은 MTT 환원 어세이를 통해 확인하였다.
결과는 도 2a, 2b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 석류 에탄올 추출물을 처리한 PC12 세포에서 과산화수소에 의해 유도된 산화적 스트레가 감소함을 확인하였고(도 2a), 비타민 C 전 처리군에 비해 석류 에탄올 추출물 처리군이 좋은 활성을 보임을 확인하였다(도 2b).
C군은 탈이온수(deionized water)처리군, H군은 H2O2 100μM 처리군, V는 H2O2 처리 전 48시간동안 Vit. C 100 μM으로 사전 배양(pre-incubated)한 군이며, 다른 군들은 H2O2 처리 전 48시간동안 각기 다른 농도(0.5~2.0 mg/ml)로 사전 배양한 군이다.
실험예 2 : 석류 분획물에 대한 H
2
O
2
에 의해 유도된 산화적 스트레스 저해 활성 및 세포 활성 측정
1. 석류 분획물의 산화적 스트레스의 저해 활성
석류를 에탄올 추출한 후 PC12 세포수가 104-106 cell/ml가 되었을 때 상기 실시예 2,3에 의해 분리한 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 각각 전 배양하였다. 48시간 후에 100μM의 H2O2를 처리하여 산화적 스트레스를 유도한다. 산화적 손상(Oxidative injury)은 DCF-DA (2',7'-dichlorofluorescin diacetate)를 이용하여 형광분광광도계(spectrofluorometer)를 통해서 측정하였으며, 그 결과 석류 추출물의 산화적 스트레스의 저해활성을 확인하였으며, 세포 활성은 MTT 환원 어세이를 통해 확인하였다.
C군은 탈이온수(deionized water)처리군, H군은 H2O2 100 μM 처리군, V는 H2O2 처리 전 48시간동안 Vit. C 100 μM 사전 배양(pre-incubated)한 군이며, 다른군들은 H2O2 처리 전 48시간동안 각각 다른 처치(H1은 헥산을 사용해 분획한 첫번째 층; H2는 헥산을 사용해 분획한 두번째 층; H3는 헥산을 사용해 분획한 세번째 층; C1은 클로로포름을 사용해 분획한 첫번째 층; C2는 클로로포름을 사용해 분획한 두번째 층; C3는 클로로포름을 사용해 분획한 세번째 층; E1은 에틸아세테이트를 사용해 분획한 첫번째 층; E2는 에틸아세테이트를 사용해 분획한 두번째 층; 및 E3는 에틸아세테이트를 사용해 분획한 세번째 층)를 한 군들이다.
석류 분획물의 산화적 스트레스 저해 활성 결과 가장 저해 활성이 높은 에틸 아세테이트 분획물을 획득하였고(도 3a), 세포 활성 결과 에틸 아세테이트 분획물의 활성이 가장 높게 나타났다(도 3b).
실험예 3 : 용매 분획(Solvent partition)을 통해 분리된 석류 분획물인 에틸 아세테이트 분획물의 산화적 스트레스 저해 활성
실시예 2, 3에서의 석류 분획물 중 과산화수소에 의한 산화적 스트레스 저해 활성이 높은 총 33개 에틸 아세테이트 분획물 분류(fractions)의 열린 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통한 산화적 스트레스 저해 활성을 확인하였다(도 4a).
C군은 탈이온수(deionized water)처리군, H군은 H2O2 100 μM 처리군, V는 H2O2처리 전 48시간동안 Vit. C 100 μM 사전 배양(pre-incubated)군이며, 다른 군들은(총33분획) H2O2 처리 전 48시간동안 샘플 추출물로 사전 배양한 군이다.
실험예 4 : 석류 분획물인 에틸 아세테이트 분획물의 세포활성 측정
1. 석류 분획물인 에틸 아세테이트 분획물의 H2O2에 의한 산화적 스트레스에서 세포활성 측정
실험예 3 및 도 4a에 나타나 있는 결과로부터 에틸 아세테이트 분획물 33개의 분류 중 5, 7, 8, 9, 10, 25, 31, 32에 대하여 MTT 환원 어세이를 통한 세포활성을 측정하였다.
C군은 대조군, H군은 H2O2 100 μM 처리군, V는 H2O2 처리 전 48시간동안 Vit. C 100 μM 사전배양(pre-incubated)군이며, 다른 군들은 H2O2 처리 전 48시간동안 샘플 추출물로(20㎕, 1mg/ml) 사전배양한 군이다.
그 결과, 클로로포름:에탄올의 비율이 80:20의 두 번째 획분(fraction) 8에서 높은 세포 활성을 보였다(도 4b).
2. 석류 분획물인 에틸 아세테이트 분획물의 아밀로이드 베타 펩티드에 의한 산화적 스트레스에서 세포활성 측정
실험예 3 으로부터 에틸 아세테이트 분획물에 대하여 MTT 환원 어세이를 통한 세포활성을 측정하였다. 에틸 아세테이트 분획물 33개의 분류 중 5, 8, 9, 10, 32에 대하여 각각 (20 ㎕, 1 ㎎/㎖)을 처리하고, 48시간 후 아밀로이드 베타 펩티드에 의한 산화적 스트레스를 유도하였다. 이후, MTT 환원 어세이를 통한 세포활성을 측정하였다(도 4c).
C군은 대조군, A군은 Aβ25-35 30 μM 처리군, V는 Aβ25-35 처리 전 48시간동안 Vit. C 100 μM 사전배양(pre-incubated)군이며, 다른 군들은 Aβ25-35 처리 전 48시간동안 샘플 추출물로(30㎕, 1mg/ml) 사전배양한 군이다.
그 결과, 클로로포름:에탄올의 비율이 80:20의 두 번째 획분(fraction) 8에서 높은 세포 활성을 보였다(도 4c).
실험예 5 : TLC로 분리한 획분에 따른 H
2
O
2
에 의한 산화적 스트레스 유발 정도와 아밀로이드 베타 펩티드에 의한 세포활성(cell viability)
1. 클로로포름: 에탄올 80:20 두 번째 (획분 8)의 H2O2에 의한 산화적 스트레스 저해 활성
열린 컬럼 크로마토그래피(Open column chromatography)를 통해 얻은 시료의 활성을 확인한 후, 선정된 획분(fraction 8)을 예비 실리카 겔 플레이트(preparative silica-gel plate (glass, 200 × 200 mm))를 사용하여 PTLC (preparative thin layer chromatography)를 실시하였다. 선정된 획분을 감압 농축하여 얻은 1 g의 시료를 1 ㎖의 EtOH에 녹인 후, 0.5 ㎕씩 5회 스팟팅(spotting)하여 건조시킨다. 클로로포름과 에탄올 (80:20, v/v)으로 전개시킨 후 밴드를 분리하였다.
밴드로 분리된 획분을 각각 (20 ㎕, 1 ㎎/㎖)을 처리하고, 48시간 후 H2O2에 의한 산화적 스트레스를 유도하였다. H2O2에 의한 산화적 손상은 DCF-DA (2',7'-dichlorofluorescin diacetate)를 이용하여 형광분광광도계(spectrofluorometer)를 통해서 측정하였다(도 4d).
C군은 대조군, H군은 H2O2 100 μM 처리군, V는 H2O2 처리 전 48시간동안 Vit. C 100 μM 사전배양(pre-incubated)군이며, 다른 군들은 H2O2 처리 전 48시간동안 샘플 추출물로(20㎕, 1mg/ml) 사전배양한 군이다.
2. 에틸 아세테이트 획분 8번째 분류의 H2O2에 의한 세포활성 측정
열린 컬럼 크로마토그래피(Open column chromatography)를 통해 얻은 시료의 활성을 확인한 후, 선정된 획분(fraction 8)을 예비 실리카 겔 플레이트(preparative silica-gel plate (glass, 200 × 200 mm))를 사용하여 PTLC (preparative thin layer chromatography)를 실시하였다. 선정된 획분을 감압 농축하여 얻은 1 g의 시료를 1 ㎖의 EtOH에 녹인 후, 0.5 ㎕씩 5회 스팟팅(spotting)하여 건조시킨다. 클로로포름과 에탄올 (80:20, v/v)으로 전개시킨 후 밴드를 분리하였다.
밴드로 분리된 획분을 각각 (30 ㎕, 1 ㎎/㎖) 처리하고, 48시간 후 H2O2에 의한 산화적 스트레스를 유도하였다. MTT 환원 어세이를 통한 세포활성을 측정하였다(도 4e).
C군은 대조군, H군은 H2O2 100 μM 처리군, V는 Aβ25-35 처리 전 48시간동안 Vit. C 100 μM 사전배양(pre-incubated)군이며, 다른 군들은 H2O2 처리 전 48시간동안 샘플 추출물로(30㎕, 1mg/ml) 사전배양한 군이다.
3. 에틸 아세테이트 획분 8번째 분류의 아밀로이드 베타 펩티드에 의한 세포활성 측정
열린 컬럼 크로마토그래피(Open column chromatography)를 통해 얻은 시료의 활성을 확인한 후, 선정된 획분(fraction 8)을 예비 실리카 겔 플레이트(preparative silica-gel plate (glass, 200 × 200 mm))를 사용하여 PTLC (preparative thin layer chromatography)를 실시하였다. 선정된 획분을 감압 농축하여 얻은 1 g의 시료를 1 ㎖의 EtOH에 녹인 후, 0.5 ㎕씩 5회 스팟팅(spotting)하여 건조시킨다. 클로로포름과 에탄올 (80:20, v/v)으로 전개시킨 후 밴드를 분리하였다.
밴드로 분리된 획분을 각각 (30 ㎕, 1 ㎎/㎖) 처리하고, 48시간 후 아밀로이드 베타 펩티드에 의한 산화적 스트레스를 유도하였다. MTT 환원 어세이를 통한 세포활성을 측정하였다(도 4f).
C군은 대조군, A군은 Aβ25-35 30 μM 처리군, V는 Aβ25-35 처리 전 48시간동안 Vit. C 100 μM 사전배양(pre-incubated)군이며, 다른 군들은 Aβ25-35 처리 전 48시간동안 샘플 추출물로(30㎕, 1mg/ml) 사전배양한 군이다.
실험예 6: 동물을 이용한 활성 효과 확인
1. 생체 내(In vivo)에서 석류 추출물의 활성을 측정하기 위하여 마이스(mice)에 아밀로이드 베타 펩티드를 뇌에 주사하여 석류 추출물의 보호 효과 확인
실시예 3에서 석류 추출물 400(PG400)과 석류 추출물 800(PG800)을 석류(400 mg/kg, 800 mg/kg per day) 먹이를 준 후 아밀로이드 베타 펩티드 (Aβ1-42)를 주입하였다.
그 결과로 대안행동(alternative behavior)과 마우스의 스텝 쓰루 레턴시(step through latency) 수동회피검사에서 석류 추출물 800(PG800) 섭취군이 섭취하지 않은 군보다 보다 높은 수치가 나왔다(도 7a, 7b). Y-maze 결과, 대조군보다 치매 유발군 (A)에서 기억력 감소가 확인되었고 샘플이 공급된 그룹에서는 치매 유발 물질을 주사했음에도 기억력이 감소가 일어나지 않았음을 알 수 있었다(도 7a).
수동회피검사(Passive avoidance test) 결과, 치매를 유발시키지 않은 대조군(control group)은 아밀로이드 베타 펩티드(Aβ) 군에 비해서 안정된 기억학습능력을 나타내었고, 400, 800 ㎎/㎏ 군에서는 대조군의 학습능력 활성과 비교할 때 거의 같거나 상회하는 인지능력의 회복을 확인하였다. 이는 석류(Punica granatum) 샘플이 아밀로이드 베타 펩티드의 기억학습능력 저해 효과 (인지능력과 학습능력의 상실유도)를 봉쇄(blocking)하여 대조군(control group)이 보여주는 인지 능력을 나타내어줌으로써 뇌세포를 정상적으로 보호, 회복시켜줌을 확인하였다(도 7b).
본 발명에 따른 우수한 뇌신경 독성 저해 활성을 갖는 석류 추출물의 유효성분인 2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol을 포함하는 뇌 신경계 질환 예방 및 치료용 조성물 및 이의 정제 방법에 관한 것으로서, 석류 추출물에 포함된 2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol의 건강기능식품 또는 기능성 신소재로서 유용성을 확인하였다.
도 1은 아밀로이드 베타 펩티드에 의한 산화적 스트레스(oxidative stress)로부터 석류 에탄올 추출물로부터 활성물질을 정제 및 분리하는 과정을 도식화한 그림이다.
도 2a는 석류 추출물의 PC12 세포에서 H2O2에 의해 유도된 산화적 스트레스의 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 석류 추출물의 PC12 세포에서 H2O2에 의해 유도된 산화적 스트레스로부터 세포 활성 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 석류 추출물에서 극성에 따라 수득된 분획물에 H2O2에 의해 유도된 산화적 스트레스의 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3b는 석류 추출물에서 극성에 따라 수득된 분획물에 H2O2에 의해 유도된 산화적 스트레스로부터 세포 활성 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 용매 분획(Solvent partition)를 통해 분리된 에틸아세테이트(ethyl acetate) 분획을 열린 실리카겔 컬럼(open silica gel column)을 통한 저해 활성물 을 보여주는 것으로, 도 4a는 석류 열린 실리카겔 컬럼 분획물의 H2O2에 의해 유도된 산화적 스트레스 저해 활성을 나타낸 그래프이며,
도 4b는 석류 열린 실리카겔 컬럼 분획물에 H2O2에 의해 유도된 산화적 스트레스로부터 세포 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4c는 석류 열린 실리카겔 컬럼 분획물의 PC12 세포에서 아밀로이드 베타 펩티드(Aβ25-35)에 의한 산화적 스트레스에 대한 세포활성을 나타낸 그래프이다.
도 4d는 석류 분획물에서 TLC를 통해 분리된 밴드들의 H2O2에 의한 산화적 스트레스의 저해 활성을 나타낸 그래프이다 (Rf=0.47이 가장 저해시킴).
도 4e는 석류 분획물에서 TLC를 통해 분리된 밴드들의 H2O2에 의한 산화적 스트레스에 대한 세포활성을 나타낸 그래프이다.
도 4f는 석류 분획물에서 TLC를 통해 분리된 밴드들의 아밀로이드 베타 펩티드(Aβ25-35)에 의한 산화적 스트레스에 대한 세포활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 가장 높은 활성을 나타낸 5nd 밴드의 활성성분을 확인하기 위한 HLPC 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 생체 내(In vivo)에서 동물을 이용한 활성 효과를 확인을 위한 실험 디자인을 나타낸 그림이다.
도 7a는 생체 내(In vivo)에서 석류 추출물의 활성을 측정하기 위한 마우스에 아밀로이드 베타 펩티드를 주입한 후 대안행동(alternative behavior)의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 생체 내(In vivo)에서 석류 추출물의 활성을 측정하기 위한 마우스에 아밀로이드 베타 펩티드를 주입한 후 스텝쓰루 레턴시(step through latency) 수동회피검사의 결과를 나타낸 그래프이다.
Claims (11)
- 석류 추출물을 포함하는 뇌 신경계 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 뇌 신경계 질환은 아밀로이드 베타 펩티드-유도 산화적 스트레스에 의한 뇌 신경 세포 손상이 유발되는 질환인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 뇌 신경계 질환은 알츠하이머 병인 조성물.
- 제1항에 있어서, 석류 추출물은 에탄올 추출물인 조성물.
- 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)을 포함하는 뇌 신경계 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1- dimethylethyl)-phenol)은 석류 추출물에서 획득된 것인 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 뇌 신경계 질환은 아밀로이드 베타 펩티드-유도 산화적 스트레스에 의한 뇌 신경 세포 손상이 유발되는 질환인 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 뇌 신경계 질환은 알츠하이머 병인 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)은 다음 단계를 포함하는 석류 추출물에서 유효성분을 분리 또는 정제하는 것을 특징으로 하는 방법에 의해 얻어지는 것인 조성물;(a) 석류 추출물을 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 분획하는 단계;(b) 상기 획득한 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 분획물을 열린 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(open silica gel column chromatography)를 시행한 다음 CHCl3 : EtOH = 80:20 (v/v)으로 용출 분획하여 수득하는 단계;(c) 상기 (b)단계에서의 획분을 TLC로 분리한 결과 가장 활성이 좋은 5th 밴 드(Rf value = 0.47)를 수득하는 단계;(d) 상기 (c)단계에서의 활성 분획을 HPLC로 분리하여 분자량 206.32 m/z를 갖는 유효물질을 수득하는 단계;
- 석류 추출물을 포함하는 뇌 신경계 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품용 조성물.
- 2,4-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀(2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol)을 포함하는 뇌 신경계 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품용 조성물.
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