KR20100056525A - 암 치료 방법 및 암 치료용 조성물 - Google Patents

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아이알엠 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 BCR-ABL 저해제와 함께 조합된, 헷지호그 신호전달 경로의 길항제의 조합물을 제공한다. 본 발명의 조합물은 예를 들어, Src, BCR-ABL 및 c-kit와 같은 단백질 티로신 키나제와 관련되어 있다고 알려져 있는 암을 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

암 치료 방법 및 암 치료용 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CANCERS}
관련 출원에 관한 상호-참조
본 출원은 2007년 8월 16일 출원된 미국 가출원 일련번호 제60/956,295호 (본원에서는 그의 전문이 참고로 인용된다)의 이점을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 종양 세포 성장을 저해하고, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
당업계에는 Hh 신호전달 경로에 관한 특징이 잘 규명되어 있다 (예로서, 문헌 ([Nybakken et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 2002, 12:503-511]; 및 [Lum et al., Science 2003, 299: 2039-2045]) 참조). 간략하면, 헷지호그(hedgehog) 리간드 부재하에서는 막횡단 수용체인 패치드(Patched) (Ptch)가 스무든드(Smoothened) (Smo)에 결합하여 Smo의 기능을 차단한다. 리간드가 존재할 경우, 상기와 같은 저해는 완화되어 Smo가 신호전달 캐스케이드를 개시할 수 있도록 함으로써 세포질 단백질인 퓨즈드(fused) (Fu) 및 퓨즈드 억제제(Suppressor of Fused) (SuFu)로부터 전사 인자인 Gli가 방출된다. 불활성 상태에서 SuFu는 Gli가 핵으로 전위되지 못하도록 막는다. 활성 상태에서는 Fu가 SuFu를 저해시켜 Gli가 방출되어 진다. Gli 단백질은 핵으로 전위되고, 표적 유전자 전사를 제어한다.
BCR-ABL 온코진은 필라델피아 염색체(Philadelphia chromosome) (Ph) 22q의 생성물이며, 이는 구성적으로 활성화된 ABL 티로신 키나제 활성을 갖는 키메라 BCR-ABL 단백질을 코딩한다 (문헌 [Lugo et al., Science 1990, 247:1079-1082]). BCR-ABL이 만성 골수성 백혈병의 근본적인 원인이 된다. 210 kDa의 BCR-ABL 단백질이 CML 환자에서 발현되는 반면, BCR 유전자 중 교대 브레이크포인트(alternative breakpoint)로부터 형성된 190 kDa의 BCR-ABL 단백질은 Ph 양성 (Ph+) 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 환자에서 발현된다. (문헌 ([Bartram et al., Nature 1983, 306:277-280]; [Chan et al., Nature 1987, 325:635-637])).
BCR-ABL은 수임 골수성 또는 림프성 선조체 또는 3T3 섬유모세포에서의 다양한 기전을 통해 증식과 항-아포프토시스를 유도하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 ([Pendergast et al., Cell 1993, 75:175-85]; [Ilaria et al., J. Biol. Chem. 1996, 271:31704-10]; [Chai et al., J. Immunol. 1997, 159:4720-8]; 및 [Skorski et al., EMBO J. 1997, 16:6151-61])). 그러나, BCR-ABL이 조혈 줄기 세포 (HSC) 군집에 미치는 효과에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 발생 경로, 예로서, Wnt 신호전달 경로, 또는 폴리콤(Polycomb) 유전자 BMI1이 백혈병 줄기 세포의 조절 및 확장에 관여할 수 있다는 것이 최근 공개 문헌을 통해 제안되었다 (문헌 ([Mohty et al., Blood, 2007]; [Hosen et al., Stem Cells, 2007])). BMI1 및 베타-카테닌 둘 모두 CML 급성기에 상향 조절되며, 그의 발현은 질환의 진행 과정과 밀접한 연관성이 있다. β-카테닌 발현을 획득한 BCR-ABL 양성 과립구-대식세포 선조체가 급성기 CML에서 후보 백혈병 줄기 세포가 된다. 악성 클론의 초기 확장으로 이어지는, 만성기 동안의 BCR-ABL 양성 백혈병 줄기 세포의 확장에 관여하는 자기 재생 경로에 관해서는 현재 잘 다루어져 있지 않다.
본 발명의 개시 내용
본 발명은 종양 세포 성장을 저해하고, 각종 암을 치료하는데 있어서 유용할 수 있는, 조성물 및 그의 제약 조성물을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 헷지호그 신호전달 경로를 저해하는 제1 제제, 및 BCR-ABL을 저해하는 제2 제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 치료학적 유효량의, 헷지호그 신호전달 경로를 저해하는 제1 제제, BCR-ABL을 저해하는 제2 제제, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 시스템에 또는 대상체에게 치료학적 유효량의, 헷지호그 신호전달 경로를 저해하는 제1 제제 및 BCR-ABL을 저해하는 제2 제제, 또는 제약상 허용되는 염을 포함하는 조성물 또는 그의 제약 조성물을 투여하여 BCR-ABL 양성 백혈병을 치료하는 단계를 포함하는, 암, 특히, BCR-ABL 양성 백혈병을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 만성 골수성 백혈병 또는 급성 림프구성 백혈병을 치료하는데 사용될 수 있다.
추가로, 본 발명은 세포 증식성 질병, 특히, BCR-ABL 양성 백혈병 치료용 약제의 제조에 있어서, 치료학적 유효량의, 헷지호그 신호전달 경로를 저해하는 제1 제제 및 BCR-ABL을 저해하는 제2 제제, 또는 제약상 허용되는 염을 포함하는 조성물 또는 그의 제약 조성물의 용도를 제공한다.
상기의 본 발명의 조성물 및 상기 조성물의 사용 방법에 있어서, 본 발명의 조성물 중 제1 제제는 Smo에 결합할 수 있다. 특정 일례로, 제1 제제는 사이클로파민 또는 포르스콜린이다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 조성물 중 제2 제제는 ABL 저해제, ABL/Scr 저해제, 오로라(Aurora) 키나제 저해제, 또는 BCR-ABL의 비-ATP 경쟁적 저해제이다. 예를 들어, 제2 제제는
Figure pct00001
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기의 본 발명의 조성물 및 상기 조성물의 사용 방법에 있어서, 본 조성물은 세포 또는 조직을 포함하는 시스템에 투여될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 인간 또는 동물 대상체에게 투여될 수 있다.
도 1a는 건강한 환자, 및 만성기 또는 급성기의 CML 환자로부터 유래된 정제된 CD34+ 세포 중 Gli1 및 Ptch1의 전사체 수준 (CD34+ 세포로 정규화된 값)을 나타낸다. 도 1b는 BCR-ABL 양성 대 음성 전 골수 또는 줄기 세포 중 Gli1 및 Ptch1의 전사체 발현 수준을 나타낸다.
도 2a는 혼합형 골수 배양물을 72시간 동안 사이클로파민으로 처리한 후의 BCR-ABL (GFP) 양성 골수성 선조체 (Lin-, Kit+, Sca-) 및 HSC (Lin-, Kit+, Sca+)의 비율을 나타내는 것이다. 도 2b는 백혈병 마우스의 골수를 사이클로파민으로 처리한 후의 Gli1 발현을 나타내는 것이다. 도 2c는 사이클로파민으로 처리한 혼합형 골수 배양물을 플레이팅 후 10일째에 계수된 콜로니의 총 갯수를 나타낸다.
도 3a는 PepC-Ly5.1 마우스로의 이식 후 말초 혈액 중 Ly5.2 (배아) 양성 세포의 갯수를 나타낸다. 도 3b는 이식 후 10주째의 말초 혈액 중 Ly5.2 양성 세포에서의 세포 유형 분포를 나타낸다. 도 3c는 5-FU 처리 (150 mg/kg) 후 말초 혈액 중 Ly5.2 양성 세포의 재생을 나타낸다. 도 3d는 60주간의 기간 동안의, 10％ GFP 양성 세포, 10％ Smo GFP 양성 세포 또는 10％ SMOW535E GFP 양성 세포를 함유하는 골수를 이식 받은 마우스의 말초 혈액 중 GFP 양성 세포의 비율을 나타낸다. 도 3e는 pMSCV 대조군 벡터 또는 Smo GFP 또는 SMOW535E GFP 벡터로 감염된 골수의 상대적인 Gli1 전사체 수준을 나타낸다.
도 4a는 이식 (Tx) 후 20일째 이식받은 마우스의 말초 혈액 중 BCR-ABL 양성 세포의 갯수를 나타낸다. 도 4b는 Tx 후 28일째 이식받은 마우스의 비장의 중량을 나타낸다. 도 4c는 BCR-ABL로 감염된 태아 간 세포를 이식받은 마우스의 생존을 나타낸다. 도 4d는 2*10E5 BCR-ABL (GFP) 양성 골수 세포를 재이식받은 마우스의 생존을 나타낸다.
도 5a는 AMN107로, 또는 AMN107과 사이클로파민의 조합물로 처리된 BCR-ABL+ 마우스의 대퇴골 하나로부터 유래된 GFP 양성 골수 콜로니의 상대적인 양을 나타낸다. 도 5b는 처리 종료 후 8일째 비장 및 간 중량을 나타낸다. 도 5c는 오직 AMN107로만, 또는 AMN107과 사이클로파민의 조합물로 처리한 경우, 각 처리 종료 후의 생존일수를 나타낸다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련인이 통상적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 하기 문헌들은 본 발명에서 사용된 다수의 용어들의 일반적인 정의를 당업자에게 제공한다: 문헌 ([Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (eds.), Oxford University Press (revised ed., 2000)]; [Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (eds.), John Wiley & Sons (3rd ed., 2002)]; 및 [A Dictionary of Biology ( Oxford Paperback Reference ), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4th ed., 2000)]). 추가로, 하기 정의는 본 발명의 실행시 독자의 이해를 돕기 위해 제공된다.
"제제" 또는 "시험 제제"라는 용어는 임의의 물질, 분자, 원소, 화합물, 실체, 또는 그의 조합을 포함한다. 이는 예로서, 단백질, 폴리펩티드, 유기 소분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이는 천연 생성물, 합성 화합물, 화학적 화합물, 또는 2개 이상의 물질이 조합된 조합물일 수 있다. 달리 구체적으로 명시하지 않는 한, "제제," "물질," 및 "화합물"이라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 "유사체"라는 용어는 기준 분자의 특정 치환체가 대체 치환체로 대체됨으로써, 구조적으로 기준 분자와 유사하지만, 표적화되고 조절된 방식으로 변형된 분자를 의미한다. 당업자는, 유사체가 기준 분자와 비교하여 동일하거나, 유사하거나, 개선된 유용성을 보일 수 있다고 예측할 것이다. (예를 들어, 표적 분자에 대한 결합 친화성이 더 높은 것과 같은) 개선된 특성을 갖는 공지 화합물의 변이체를 확인하기 위해 유사체를 합성하고 스크리닝하는 것은 제약 화학 분야에 잘 알려져 있는 접근법이다.
본원에서 사용되는 바, "접촉"은 그의 통상적인 의미를 가지며, 2개 이상의 분자 (예로서, 소분자 유기 화합물과 폴리펩티드)를 조합하거나, 분자와 세포 (예로서, 화합물과 세포)를 조합하는 것을 의미한다. 접촉은 시험관내에서, 예로서, 시험관 또는 기타 다른 용기 중에서 2개 이상의 제제를 조합하거나, 화합물과 세포 또는 세포 용해물을 조합함으로써 수행할 수 있다. 또한, 접촉은 세포 또는 계내에서, 예로서, 2개의 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 세포에서의 동시발현에 의해 세포내에서, 또는 세포 용해물에서 2개의 폴리펩티드를 접촉시킴으로써 수행할 수 있다.
용어 "헷지호그"는 총칭적으로 소닉(sonic), 인디안(indian), 데저트(desert) 및 티기 윙클(tiggy winkle)을 비롯한 헷지호그 계열 중 임의의 구성원을 의미하는 것으로 사용된다. 상기 용어는 단백질 또는 유전자를 가리키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 상기 용어는 상이한 동물 종에서의 호모로그/오솔로그 서열을 기술하기 위해서도 사용된다.
용어 "헷지호그 (Hh) 신호전달 경로" 및 "헷지호그 (Hh) 신호전달"은 상호교환적으로 사용되며, 보통은 예로서, 헷지호그, 패치드 (Ptch), 스무든드 (Smo), 및 Gli와 같은 신호전달 캐스케이드의 다양한 구성원들에 의해 매개되는 일련의 이벤트를 의미한다. 헷지호그 경로는 하류 성분을 활성화시킴으로써 헷지호그 단백질의 부재하에서 조차 활성화될 수 있다. 예를 들어, Smo의 과다발현은 헷지호그 부재하에서도 상기 경로를 활성화시킬 것이다.
Hh 신호전달 성분 또는 Hh 신호전달 경로의 구성원은 Hh 신호전달 경로에 참여하는 유전자 생성물을 의미한다. Hh 신호전달 성분은 빈번하게 세포/조직에서의 Hh 신호 전달에 영향을 주어, 전형적으로는 하류 유전자 발현 수준 정도 및/또는 표현형에 변화를 일으킨다. 하류 유전자 활성화/발현의 최종 결과에 대한 Hh 신호전달 성분의 생물학적 기능 및 효과에 따라, Hh 신호전달 성분은 양성 및 음성 조절 인자로 나뉠 수 있다. 양성 조절 인자는 Hh 신호의 전달에 양성적으로 영향을 주는, 즉, Hh가 존재하는 경우 하류의 생물학적 이벤트를 자극하는 Hh 신호전달 성분이다. 그의 예로는 헷지호그, Smo, 및 Gli를 포함한다. 음성 조절 인자는 Hh 신호의 전달에 음성적으로 영향을 주는, 즉, Hh가 존재하는 경우 하류 생물학적 이벤트를 저해하는 Hh 신호전달 성분이다. 그의 예로는 Ptch 및 SuFu를 포함된다 (그러나, 이에 한정되지 않는다).
헷지호그 신호전달 길항제, Hh 신호전달 길항제 또는 Hh 신호전달 경로 저해제는 양성 Hh 신호전달 성분 (예를 들면, 헷지호그, Ptch, 또는 Gli)의 생체 활성을 저해하거나, Hh 신호전달 성분의 발현을 하향조절하는 제제를 의미한다. 이는 또한 Hh 신호전달 성분의 음성 조절 인자를 상향조절하는 제제를 포함한다. 헷지호그 신호전달 길항제는 소닉, 인디안 또는 데저트 헷지호그, 스무든드, ptch-1, ptch-2, gli-1, gli-2, gli-3 등을 비롯한 (그러나, 이에 한정되지 않는다), 헷지호그 경로에 있는 임의의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 길항제일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "이종성 서열" 또는 "이종성 핵산"은 특정 숙주 세포에 대해 외래성인 공급원에서 비롯되거나, 동일한 공급원에서 비롯되는 경우에 대해서도 그 원래의 형태로부터 변형된 것이다. 따라서, 숙주 세포내 이종성 유전자는 특정 숙주 세포에 대해 내인성이지만, 변형된 것인 유전자를 포함한다. 이종성 서열의 변형은 예로서, DNA를 제한 효소로 처리하여 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는 DNA 단편을 생성시킴으로써 일어날 수 있다. 부위-지정 돌연변이유발법과 같은 기법 또한 이종성 핵산을 변형시키는데 유용하다.
단백질 및/또는 단백질 서열에 대해 지칭할 때 "상동성"이라는 용어는 공통 선조 단백질 또는 단백질 서열로부터 천연적으로 또는 인위적으로 유래된 것임을 가리킨다. 유사하게, 핵산 및/또는 핵산 서열은 공통 선조 핵산 또는 핵산 서열로부터 천연적으로 또는 인위적으로 유래될 때 상동성이다. 상동성은 일반적으로 2개 이상의 핵산 또는 단백질 (또는 그의 서열) 사이의 서열 유사성으로부터 유추된다. 상동성 확립에 유용한 서열 간의 정확한 유사성(％)은 쟁점이 되는 핵산 및 단백질에 따라 달라지지만, 상동성 확립에는 25％ 정도의 낮은 서열 유사성이 통상 이용된다. 상동성 확립을 위해서는 보다 높은 수준의 서열 유사성, 예로서, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 99％ 이상의 서열 유사성이 또한 사용될 수 있다.
"숙주 세포"는 그 안으로 이종성 폴리뉴클레오티드가 도입될 수 있는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 임의 수단, 예로서, 전기천공법, 인산칼슘 침전법, 미량주사법, 형질전환법, 바이러스 감염법 등에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.
종양 성장 또는 종양 세포 성장과 관련하여 "저해하는" 또는 "저해"라는 용어는 원발성 또는 속발성 종양의 출현을 지연시키거나, 원발성 또는 속발성 종양 발생 속도를 저속화시키거나, 원발성 또는 속발성 종양의 발생을 감소시키거나, 질환의 2차적 영향의 중증 속도를 저속화 또는 감소시키거나, 또는 종양 성장을 저지하고, 종양을 퇴행시키는 것을 의미한다. "예방하다" 또는 "예방"이라는 용어는 원발성 또는 속발성 종양의 발생 또는 질환의 임의의 2차적 영향을 완전히 저해시키는 것을 의미한다. 효소 활성 조절과 관련하여, 저해는 경쟁적, 비경쟁적, 및 무경쟁적 저해를 비롯한 효소 활성의 가역적 억제 또는 저하를 의미한다. 이는 효소의 반응 동력학에 대한 저해제의 효과에 의해 실험적으로 구별될 수 있으며, 상기 효과는 기본적인 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 속도식에 의해 분석될 수 있다. 경쟁적 저해는 저해제가 활성 부위에서의 결합에 대해 정상 기질과 경쟁하는 방식으로 유리 효소와 조합될 수 있을 때 발생한다. 경쟁적 저해제는 효소와 가역적으로 반응하여 효소-기질 복합체와 유사한 효소-저해제 복합체 [EI]를 형성한다.
두 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 관련하여 "서열 동일성"이란 용어는 지정된 비교창에서 최대로 상응하도록 정렬되었을 때 동일한 두 서열 내의 잔기를 지칭한다. "비교창"은 서열과 기준 서열, 이 두 서열이 최적으로 정렬된 후에 서열이 동일한 갯수의 인접 위치의 기준 서열과 비교될 수 있는, 적어도 약 20개의 인접 위치, 일반적으로 약 50 내지 약 200개, 더욱 일반적으로는 약 100 내지 약 150개의 인접 위치의 세그먼트를 지칭한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 예로서, 스미쓰와 워터만(Smith and Waterman)의 국소적인 상동성 알고리즘 (문헌 [Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 1981, 2:482])에 의해, 니들만과 운쉬(Needleman and Wunsch)의 상동성 정렬 알고리즘 (문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 1970, 48:443])에 의해; 피어슨과 리프만(Pearson and Lipman)의 유사성 검색법 (문헌 [Pearson and Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 1988, 85:2444])에 의해; 또는 이러한 알고리즘들(인텔리전틱스(Intelligentics) (미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)에 의한 PC/Gene 프로그램에서의 CLUSTAL; 및 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지, 제네틱스 컴퓨터 그룹 (GCG)(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG))(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재)의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 또는 TFASTA를 포함하나, 이에 한정되지 않음)의 컴퓨터화된 실행에 의해 수행될 수 있다. CLUSTAL 프로그램은 문헌 ([Higgins and Sharp, Gene 1988, 73:237-244]; [Higgins and Sharp, CABIOS 1989, 5:151-153]; [Corpet et al., Nucleic Acids Res. 1988, 16:10881-10890]; [Huang et al, Computer Applications in the Biosciences 1992, 8:155-165]; 및 [Pearson et al., Methods in Molecular Biology 1994, 24:307-331])에 잘 기재되어 있다. 정렬은 또한 검사 및 수동 정렬에 의해 수행될 수 있다. 실시태양의 한 부류에서, 폴리펩티드는 (예로서, BLASTP 또는 CLUSTAL에 의해, 또는 디폴트 파라미터를 사용하는 임의의 기타 다른 이용가능한 정렬 소프트웨어에 의해 측정되는 바) 기준 폴리펩티드 (예로서, 헷지호그 분자)와 적어도 70％, 일반적으로는 적어도 75％, 임의로는 적어도 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 99％ 이상 동일하다. 유사하게, 핵산은 또한 출발 핵산을 참고로 하여 기술될 수 있는데, 예를 들면, 핵산은 (예로서, BLASTN 또는 CLUSTAL에 의해, 또는 디폴트 파라미터를 사용하는 임의의 기타 다른 이용가능한 정렬 소프트웨어에 의해 측정되는 바) 기준 핵산과 50％, 60％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 99％ 이상 동일할 수 있다.
"실질적으로 동일한" 핵산 또는 아미노산 서열은 표준 파라미터를 사용하는 상기 기술된 프로그램 (바람직하게, BLAST)을 이용하여 기준 서열과 적어도 90％의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산 또는 아미노산 서열을 의미한다. 서열 동일성은 적어도 95％, 더욱 특히, 적어도 98％일 수 있고, 몇몇 일례로는 적어도 99％이다. 예를 들어, (뉴클레오티드 서열의 경우) BLASTN 프로그램은 디폴트로서 워드 길이 (W) = 11, 기대치 (E) = 10, M=5, N=-4, 및 두 가닥 모두의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드 길이 (W) = 3, 기대치 (E) = 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 사용한다 (문헌 [Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 89:10915] 참조). 서열 동일성(％)은 비교창 상에서 최적으로 정렬된 두 서열을 비교하여 측정하는데, 여기서, 비교창 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부분은 두 서열이 최적으로 정렬될 수 있도록 하기 위하여 기준 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않는 서열)과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수도 있다. 상기 서열 동일성(％)은 양 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 갯수를 측정하여 매치되는 위치의 갯수를 산출하고, 매치되는 위치의 갯수를 비교창내 존재하는 위치의 총 갯수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 계산한다. 실질적인 동일성은 길이가 적어도 약 50개 잔기인 서열 부위, 더욱 특히, 적어도 약 100개 잔기인 부위에 걸쳐 나타날 수 있다. 몇몇 일례로, 서열은 적어도 약 150개 잔기에 걸쳐 실질적으로 동일하거나, 서열은 전장의 코딩 부위에 걸쳐 실질적으로 동일할 수 있다.
기준 단백질 (예를 들어 헷지호그 경로 구성원) 또는 그의 단편의 생물학적 활성과 관련된 용어 "조절"은 단백질의 발현 수준 또는 기타 다른 생물학적 활성의 변화를 의미한다. 예를 들어, 조절은 기준 단백질의 발현 수준, 단백질의 효소적 변형 (예로서, 인산화), 결합 특성 (예로서, 또다른 분자에의 결합), 또는 기준 단백질의 임의의 기타 다른 생물학적 (예로서, 효소적), 기능적 또는 면역학적 특성을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 활성의 변화는 예를 들어, 기준 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현의 증가 또는 감소, 단백질을 코딩하는 mRNA의 안정성, 번역 효율, 또는 기준 단백질의 기타 다른 생물학적 활성의 변화에서 비롯될 수 있다. 변화는 또한 기준 단백질을 조절하는 또다른 분자 (예로서, 기준 단백질을 인산화시키는 키나제)의 활성에 기인하는 것일 수 있다.
기준 단백질의 조절은 상향조절 (즉, 활성화 또는 자극), 또는 하향조절 (즉, 저해 또는 억제)일 수 있다. 기준 단백질의 조절 인자의 작용 방식은 예로서, 단백질 또는 단백질을 코딩하는 유전자에의 결합을 통한 직접적인 방식이거나, 기준 단백질을 다른 방식으로 조절하는 또다른 분자에 결합하고/거나 그 분자를 (예로서, 효소적으로) 변형시키는 간접적인 방식일 수 있다.
용어 "대상체"는 포유동물, 특히, 인간을 포함한다. 이는 또한 기타 다른 인간 이외의 동물, 예를 들면, 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 원숭이도 포함한다.
"치료하다" 및 "치료"라는 용어는 종양 성장을 저지하고, 종양을 부분적으로 또는 완전하게 퇴행시키는 것을 의미한다. "치료하는"이라는 용어는 화합물 또는 제제를 투여하여 증상, 합병증, 또는 질환 (예로서, 백혈병)의 생화학적 징후의 발병을 저해 또는 지연시키거나, 증상을 완화시키거나, 또는 질환, 병태, 질병이 추가로 발전되는 것을 저지 또는 저해하는 것을 포함한다. 치료는 예방적 (질환의 발병을 저해 또는 지연시키는 것, 또는 그의 임상 또는 임상전 증상의 소견을 저해하는 것)일 수도 있고, 질환 소견 후 증상의 치료적 억제 또는 완화일 수도 있다.
기준 분자의 "변이체"란 전체 기준 분자와 구조 및 생물학적 활성에 있어 실질적으로 유사한 분자, 또는 그의 단편을 의미한다. 따라서, 두 분자가 유사한 활성을 갖는다면, 비록 분자 중 한 분자의 조성 또는 2차, 3차, 또는 4차 구조가 나머지 한 분자에서 관찰되는 것과 동일하지 않을지라도, 또는 아미노산 잔기 서열이 동일하지 않을지라도 상기 용어가 사용되는 바와 같이 변이체인 것으로 간주된다.
본 발명의 수행 모드
본 발명은 종양 세포 성장을 저해하고, 각종 암을 치료하는데 있어서 유용할 수 있는, 조성물 및 그의 제약 조성물을 제공한다.
더욱 특히, 본 발명은 헷지호그 신호전달 경로를 저해하는 제1 제제, 및 BCR-ABL을 저해하는 제2 제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 림프성 및 골수성 조혈 종양의 성장 및 증식을 저해하는데, 그리고, 예를 들어, Src, BCR-ABL 및 c-kit와 같은 단백질 티로신 키나제와 관련되어 있다고 알려져 있는 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 조성물은 BCR-ABL-양성 만성 골수성 백혈병 (CML) 및 급성 림프구성 백혈병 (ALL)을 치료하는데 사용될 수 있다.
만성 골수성 백혈병은 필라델피아 전위를 수반하는 백혈병 줄기 세포 클론의 확장으로 비-악성 조혈 줄기 세포의 증식이 이루어지는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 부분적으로는, BCR-ABL이 Smo의 상향조절을 통해 헷지호그 신호전달 경로를 활성화시킴으로써 조혈 줄기 및 선조체 세포의 자기 재생을 직접 증진시킨다는 발견된 사실에 입각한 것이다. BCR-ABL이 마우스 및 인간 HSC에서 Smo 발현을 상향조절하고, 헷지호그 신호전달 경로를 활성화시킨다.
BCR-ABL 양성 골수 배양물 중 Smo의 활성을 약리학적으로 저해시키면 시험관내에서 BCR-ABL 양성 자기 재생 세포의 콜로니 형성능은 저해된다. AMN107 (Abl 저해제)와 사이클로파민 (Smo 저해제)을 사용한 조합 치료법으로 백혈병에 걸린 마우스를 치료하였을 때에는 AMN107 단독으로 치료받은 마우스에 비해 생체내에서 BCR-ABL 양성 자기 재생 세포가 감소하였고, 재발 시간이 3배 초과로 향상되었다. 따라서, BCR-ABL은 Smo의 상향조절에 의한 헷지호그 신호전달의 내인성 활성화를 통해 백혈병 줄기 세포의 자기 재생을 증진시킨다. 그러므로, Hh 경로를 단독으로, 또는 Abl 저해제와 함께 조합하여 저해시키는 것이 BCR-ABL 양성 백혈병에서 악성 줄기 세포 풀을 감소시키는 효과적인 치료학적 전략법 역할을 할 수 있다.
본 발명의 치료 방법은 암 세포, 특히, 혈액 및 림프계의 암, 예를 들면, 백혈병 및 골수종의 성장 및 증식을 저해하기 위하여 헷지호그 신호전달 경로를 저해하는 제제를, BCR-ABL을 저해하는 제제와 함께 조합하여 사용한다. 이러한 방법은 (시험관내에서 또는 생체내에서) 상기 종양 세포를 Hh 신호전달 경로 저해제 및 BCR-ABL의 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
A. 헷지호그 신호전달 경로를 저해하는 제제
당업계에 공지되어 있는, 헷지호그 신호전달 경로를 저해하는 각종 제제가 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 이는 헷지호그 신호전달 경로의 구성원이 갖는 생물학적 활성 (예로서, 효소 활성)을 직접 또는 간접적으로 조절하는 제제를 포함한다. 이는 또한 헷지호그 신호전달 경로의 구성원을 코딩하는 유전자 또는 mRNA를 특이적으로 표적하는 제제를 포함한다. 헷지호그 신호전달 경로의 구성원 (예로서, 막횡단 수용체)를 표적하는 항체 또는 다른 결합 제제를 비롯한, 헷지호그 신호전달 경로의 기타 다른 길항제 또한 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다.
Hh 신호전달 경로는 태아 및 성체의 조혈 줄기 세포 (HSC)에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀진 발생학적 경로이다 (문헌 [Trowbridge et al., Proc Natl Acad Sci USA 2006, 103:14134-9]). 기질 세포에 의해 생산된 헷지호그 리간드 (Shh, Ihh 및 Dhh)는 7번 막을 횡단하는 막횡단 수용체 Ptch에 결합한다. Ptch에 결합한 리간드는, 7번 막을 횡단하는 제2의 막횡단 수용체인 Smo에 결합한 Ptch를 유리시킨다. 이로써 Smo의 입체형태상에 변화가 일어난 후, 하류 신호전달 경로가 활성화되고, Gli 전사 인자 (Gli1, Gli2, Gli3)가 유도되고, Gli1, Ptch1, 사이클린 D1 및 Bcl2와 같은 표적 유전자의 전사가 이루어진다 (문헌 [Duman-Scheel et al., Nature 2002, 417:299-304]). 초기 배아 발생 과정 동안 이루어진 내장 내배엽에 의한 인디안 헷지호그 분비는 뮤린 배아의 난황낭에서 원시 조혈 세포의 형성을 유도한다. Smo에 결핍 돌연변이를 갖거나, Hh 신호전달 저해제인 사이클로파민으로 처리된 제브라피쉬 배아는 성체 HSC 형성에 있어서 결핍을 보인다 (문헌 [Gering et al., Dev. Cell. 2005, 8:389-400]). 성체 HSC의 세포 주기 조절에 있어서 헷지호그 신호전달의 역할이 최근 공개문헌을 통해 제시된 바 있다 (문헌 [Trowbridge et al., 상기 문헌 동일]).
본 발명의 치료 방법을 실시하기 위해 다수의 Hh 신호전달 경로 성분이 조절될 수 있다. 이는 길항 작용을 받을 수 있는 Hh 신호전달의 양성 조절 인자와, 효현 작용을 받을 수 있는 Hh 신호전달의 음성 조절 인자를 포함한다. 헷지호그 (Hh) (예로서, Ihh, Shh, 및 Dhh 포함), 스무든드 (Smo), 및 Gli는 양성 조절 인자의 일례이고, 패치드 (Ptch) 및 퓨즈드 억제제 (Fu)는 음성 조절 인자이다. 다양한 종의 모든 Hh 신호전달 경로 유전자는 예를 들면, GenBank, EMBL, 또는 FlyBase와 같은 공용 및 전용 데이타베이스로부터 쉽게 이용할 수 있는 서열에 기초하여 쉽게 클로닝될 수 있다.
다수의 헷지호그 신호전달 경로 저해제가 당업계에 공지되어 있고, 이는 헷지호그 신호전달 경로를 실시하는데 쉽게 사용될 수 있다. 몇몇 Hh 신호전달 길항제는 Hh 경로의 중요한 구성원, 예를 들면, Smo를 표적하는 소분자 화합물로서, 예를 들면, 사이클로파민, SANT1 및 Cur61414가 있다 (문헌 ([Katoh et al., Maycer Biol Ther.2005, 4:1050-4]; 및 [Williams et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2003, 100:4616-21])). 예를 들어, 사이클로파민은 Smo에 직접 결합함으로써 헷지호그 신호전달 경로를 저해시킨다. 기타 다른 Hh 신호전달 길항제는 또다른 분자에 작용하여 결국에는 Hh 신호전달에 영향을 줌으로써 Hh 경로를 간접적으로 저해시킨다. 예를 들어, 포르스콜린은 단백질 키나제 A를 활성화시켜 결국에는 Smo 하류의 Hh 신호전달을 차단한다 (예로서, 문헌 [Yao et al., Dev Biol. 2002, 246:356-65] 참조). Hh 신호전달을 저해하는 추가의 유기 화합물 저해제는 예로서, US 미국 출원 US20060063779 (Gunzner et al., 2006), US20050222087 (Beachy, 2005) 및 US 20010034337 (Dudek et al., 2001)에 기재되어 있다. 본 발명의 치료 방법을 수행하는데 상기 Hh 신호전달 길항제 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 상기 화합물 중 일부는 상업적으로 구입할 수 있다 (예로서, 사이클로파민 또는 SANT-1). 나머지는 유기 화합물 분야에서 통상적으로 실시되는 방법을 사용함으로써 쉽게 합성될 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 사용되는 Hh 신호전달 길항제는 Hh 신호전달 경로의 활성화를 특이적으로 저해시키는 결합 제제이다. 예를 들어, 막횡단 수용체 Ptch는 그의 리간드와 결합하지 않은 상태에서는 Smo에 결합하여 그의 기능을 차단시킨다. 따라서, 헷지호그가 Ptch에 결합하는 것을 저해시키거나 차단할 수 있는 결합 제제가 Hh 신호전달을 길항시키는데 사용될 수 있다. 헷지호그에 대한 길항제 항체 또는 항체 상동체 뿐만 아니라, 기타 다른 분자, 예를 들면, 가용성 형태의 천연 결합 단백질이 유용하다. 예를 들어, 모노클로날 항체, 예로서, 항-헷지호그 또는 항-패치드 항체 상동체가 본 발명의 방법을 실시하는데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 헷지호그가 Ptch에 결합하는 것을 차단하면서, Hh 신호전달은 활성화시키지 않아야 한다.
몇몇 방법에서는 헷지호그 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체가 사용될 수 있다. Hh 신호전달을 저해시키기 위하여 헷지호그에 대한 중화 항체를 사용하는 것이 잘 알려져 있으며, 당업계에서 통상적으로 실시되고 있다. 예로서, 문헌 ([Ahlgren et al., Curr Biol. 1999, 9:1304-14]; [Cobourne et al., J Dent Res. 2001, 80:1974-9]; [Hall et al., Dev Biol. 2003, 255:263-77]; 및 [Berman et al., Nature 2003, 425:846-51]을 참조한다. 그러한 헷지호그 중화 항체의 일례로는 모노클로날 항체 클론 5E1이 있다. 이 항체는 아이오와 대학의 디벨럽멘탈 스터디즈 하이브리도마 뱅크(Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa)로부터 입수할 수 있다.
몇몇 다른 실시태양에서, Ptch로부터 유래된 가용성 형태의 결합 제제가 사용될 수 있다. 이는 가용성 Ptch 펩티드, Ptch 융합 단백질, 또는 이작용성 Ptch/Ig 융합 단백질을 포함한다. 이들 가용성 제제 중 일부는 Ptch의 리간드 결합 부위를 포함하는 Ptch 단편의 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드 단편을 포함한다. 예를 들어, 헷지호그에 결합하는 가용성 형태의 Ptch 또는 그의 단편은 헷지호그에 결합하는 것에 대해 세포 상에 있는 Ptch와 경쟁하여 Hh 신호전달의 활성화를 차단시키는데 사용될 수 있다. 추가로, Ptch에 결합은 하지만, 헷지호그-의존성 신호전달은 유도하지 못하는 가용성 헷지호그 돌연변이체 또한 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
인간 대상체에 대해 적용되는 일부 치료 방법은 인간 기원의 Hh 경로 항체 길항제를 사용한다. 이는 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, Fab, Fab', F(ab')2 또는 F(v) 항체 단편 뿐만 아니라, 항체 중쇄 또는 경쇄의 단량체 또는 이량체, 또는 그의 혼합물을 포함한다. 키메라 항체는, 면역글로불린 경쇄, 중쇄, 또는 둘 모두의 힌지 및 불변 부위 모두 또는 그 일부가 인간 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄로부터 유래된 상응 부위로 치환된 것인 항체 상동체이다. 인간화된 항체는, 인간 불변 부위 서열을 갖는 것 이외에도 가변 부위 중에 존재하는 그의 비-CDR 아미노산 잔기 중 일부 또는 그 모두가 인간 면역글로불린으로부터 유래된 상응 아미노산으로 대체되어진 항체 상동체이다. 인간 항체는 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 아미노산 모두가 인간 공급원으로부터 유래된 것인 항체 상동체이다.
항체 상동체는 이황화 결합을 통해 연결되어 있는 면역글로불린 경쇄 및 중쇄로 구성된 온전한 항체를 포함한다. 이는 또한 하나 이상의 항원 (즉, 헷지호그 또는 패치드)에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄, 면역글로불린 중쇄 및 그의 항원-결합 단편으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 포함한다. 1 초과의 폴리펩티드로 구성된 항체 상동체의 성분 폴리펩티드는 임의로 이황화 결합에 의해 결합될 수 있거나, 다르게는 공유적으로 가교결합될 수 있다. 항체 상동체는 또한 항원-결합 특이성을 보유하는, 온전한 항체의 일부분, 예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, F(v) 단편, 중쇄 단량체 또는 이량체, 경쇄 단량체 또는 이량체, 하나의 중쇄와 하나의 경쇄로 구성된 이량체 등을 포함한다. 따라서, 항원-결합 단편 뿐만 아니라, 상기 기술된 항체로부터 유래된 전장의 이량체 또는 삼량체 폴리펩티드 또한 본 발명의 실시에 유용하다.
항-헷지호그 및 항-패치드 항체 상동체는 예로서, 문헌 ([Monoclonal Antibodies--Production, Engineering And Clinical Applications, Ritter et al., Eds., Cambridge University Press, Cambridge, UK, 1995]; 및 [Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 3rd ed., 2000])와 같이, 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용함으로써 생산될 수 있다. 헷지호그 또는 패치드에 대한 인간 모노클로날 항체 상동체는 문헌 [Boemer et al., J. Immunol. 1991, 147:86-95]에 기재되어 있는 바와 같이, 시험관내에서 초회 감작된 인간 비장세포를 사용함으로써 제조될 수 있다. 별법으로, 상기 인간 모노클로날 항체 상동체는 예로서, 문헌 ([Persson et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1991, 88: 2432-2436]; [Huang and Stollar, J. Immunol. Methods 1991, 141: 227-236]; 미국 특허 출원 시리얼 번호 제10/778,726호 (공개번호 제20050008625호); 및 미국 특허 번호 제5,798,230호 및 제5,789,650호)에 기재되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 헷지호그 또는 패치드 단백질에 결합할 수 있는 결합능을 갖는 인간화된 재조합 항체 상동체는 예로서, 문헌 ([Riechmann et al., Nature 1988, 332:323-327]; [Verhoeyen et al., Science 1988, 239: 1534-1536]; [Queen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1989, 86:10029]; 및 [Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86:3833])에 기재되어 있는 방법을 사용함으로써 생성될 수 있다.
본 발명의 치료 방법 중 몇몇은 헷지호그 신호전달 경로를 길항시키는 핵산 제제를 사용한다. 전형적으로, 이들 제제는 양성 Hh 신호전달 성분, 예를 들면, 헷지호그, Smo 또는 Gli를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현을 하향조절한다. 이는 이중-가닥 RNA, 예를 들면, 짧은 간섭 RNA (siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNAs), 마이크로RNA (miRNA), 안티센스 핵산, 및 상보적 DNA (cDNA)를 포함한다. 다양한 유기체, 예를 들면, C. 엘레강스(C. elegans) (예로서, 문헌 [Fire et al., Nature 1998, 391:806-811]에 기재); 초파리 (예로서, 문헌 [Kennerdell et al., Cell 1998, 95:1017-1026]에 기재); 및 마우스 배아 (예로서, [Wianni et al., Nat. Cell Biol. 2000, 2:70-75]에 기재)에서의 이중-가닥 RNA에 의한 내인성 유전자의 기능 및 발현 간섭이 밝혀졌다. 그러한 이중-가닥 RNA는 주형의 양방향으로부터 판독되는 단일-가닥 RNA의 시험관내 전사와 센스 및 안티센스 RNA 가닥의 시험관내 어닐링에 의해 합성될 수 있다. 이중-가닥 RNA는 또한 표적 유전자가 역방향 반복부에 의해 분리되어 반대 배향으로 클로닝되는 cDNA 벡터 작제물로부터 합성될 수 있다. 세포 형질감염 이후, RNA는 전사되고, 상보적 가닥과의 재어닐링이 이루어진다. 본 발명에서 Hh 신호전달을 길항시키기 위해 Hh 신호전달 경로의 양성 조절 인자를 표적하는 이중-가닥 RNA를 적절한 작제물의 형질감염에 의해 세포 (예로서, 림프종 세포) 내로 도입시킬 수 있다.
몇몇 실시태양에서, Hh 신호전달의 siRNA 길항제는 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. siRNA 길항제는 헷지호그 신호전달 경로 중 임의의 시점에서 헷지호그 신호전달을 조절할 수 있다. 예를 들면, siRNA 길항제는 헷지호그 그 자체를, 또는 임의의 기타 다른 양성 Hh 신호전달 성분, 예를 들면, Smo 또는 Gli를 길항시킴으로써 Hh 신호전달을 조절할 수 있다. siRNA의 길이는 전형적으로 약 19-30개의 뉴클레오티드, 및 바람직하게는, 21-23개의 뉴클레오티드이다. 이는 이중 가닥형이며, 각 말단에 짧은 오버행을 포함할 수 있다. siRNA는 당업계에 공지된 방법을 사용함으로써 화학적으로 합성될 수 있거나, 재조합적으로 제조될 수 있다. siRNA의 재조합적 제조 방법은 일반적으로 효율적으로 프로세싱되어 세포내에서 siRNA를 형성하는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)의 전사를 포함한다. 예로서, 문헌 ([Paddison et al. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99: 1443-1448]; [Paddison et al. Genes & Dev. 2002, 16:948-958]; [Sui et al. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 8:5515-5520]; [Brummelkamp et al. Science 2002, 296:550-553]; [Caplen et al., Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98:9742-9747]; 및 [Elbashir et al., EMBO J. 2001, 20:6877-88])을 참조한다.
몇몇 실시태양에서, Hh 신호전달의 핵산 길항제는 이중 가닥 헤어핀 RNA일 수 있다. 헤어핀 RNA는 외인성 방식으로 합성될 수 있거나, 생체내에서 RNA 폴리머라제 III 프로모터로부터의 전사에 의해 형성될 수 있다. 포유동물 세포에서 유전자 침묵화를 위해 상기와 같은 헤어핀 RNA를 제조하고 사용하는 것에 관한 일례는 예를 들어, 문헌 ([Paddison et al., Genes Dev. 2002, 16:948-58]; [McCaffrey et al., Nature 2002, 418:38-9]; [McManus et al., RNA 2002, 8:842-50]; 및 [Yu et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99:6047-52])에 기재되어 있다. 원하는 유전자를 연속하여 안정적으로 억제하기 위해서는 세포 또는 동물에서 상기 헤어핀 RNA를 공학처리하는 것이 바람직하다. 세포에서 헤어핀 RNA를 프로세싱함으로써 siRNA를 제조할 수 있다는 것이 당업계에 알려져 있다.
B. BCR - ABL 을 저해하는 제제
당업계에 알려져 있는 각종 BCR-ABL 저해제가 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있으며, 그러한 저해제로는 ABL 저해제, ABL 및 Src-계열 키나제, 둘 모두의 저해제, 오로라 키나제 저해제, 및 BCR-ABL의 비-ATP 경쟁적 저해제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
Src 계열의 티로신 키나제는 세포 성장, 분화, 유주 및 생존 (이중 다수는 종양형성, 종양 전이 및 혈관형성에 관여한다)에 관여하는 다수의 세포내 신호 전달 경로를 조절한다 (문헌 [Weisberg et al., Nat. Rev. Cancer 2007, 7:345-356]). Src 계열의 키나제 다수가 조혈 세포에서 발현된다 (Blk, Fgr, Fyn, Hck, Lck, Lyn, c-Src 및 Yes). 추가로, BCR-ABL은 인산화를 통해서, 그리고 단순히 Src 단백질에 결합하기만 하여도, 이 둘 모두에 의해 Src 키나제를 활성화시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 추가로, 이마티닙-내성 환자로부터 유래된 세포 용해물은 Lyn 키나제를 과다발현시키는 것으로 밝혀졌고, Lyn을 과다발현시키기도 하면서, 이마티닙에 대해 내성을 띠는 것으로서 선별된 인간 CML K562 세포의 증식은 Abl/Src 저해제인 PD180970에 의해 저해된다. Src 계열의 키나제가 BCR-ABL 신호전달 캐스케이드 하류에 있는 요소를 조절하기 때문에, 따라서, 이들 효소를 저해하는 것이 BCR-ABL 저해에 대해 시너지 효과가 있으며, 잠재적으로는, BCR-ABL 저해에도 불구하고 CML 세포가 이용할 수 있는 대체 생존 경로의 이용가능성을 상쇄시킨다. 따라서, BCR-ABL과 Src 계열의 키나제 저해제를 조합하여 사용하는 조합 요법은 또한 CML 및/또는 ALL에서 약물에 대해 내성을 띠는 BCR-ABL의 돌연변이체 형태가 갖는 발암성 잠재능을 상쇄시킬 수 있다 (문헌 [Manley et al., Biochim. Biophys. Acta 2005, 1754:3-13]). 다사티닙(BMS-354825), 보수티닙 (SKI-606), INNO-404 (NS-187) 및 AZD05030이 이중 ABL-Src 저해제의 일례가 된다.
오로라 계열의 세린/트레오닌 키나제는 유사분열 진행에 있어 중요하다. 오로라-A는 각종 인간 암에서 과다발현되는 것으로 보고된 바 있으며, 배양된 인간 및 설치류 세포에서는 그의 과다발현으로 이수배수체, 중심체 증폭 및 종양형성의 형질전환이 유도된다 (문헌 [Zhang et al., Oncogene 2004, 23:8720-30]). MK-0457 (머크(Merck); 원래는 버텍스 파마수티칼스(Vertex Pharmaceuticals)에 의해 VX-680으로서 개발된 것)은 나노몰 범위에서 효능을 나타내는, 3개의 오로라 키나제 모두와 FLT3에 대한 효능있는 저해제로서, 이는 다양한 골수증식성 질병에 대해 관련된 표적이 되는 ABL과 JAK2에 대하여 중간 내지 강한 정도의 효능을 보이는 저해제이다. MK-0457은 비록 마이크로몰 이하(submicromolar)의 농도에서 세포 증식을 저해지만, 약 5 μM의 IC50으로 형질전환된 Ba/F3 세포에서 T315I 돌연변이체 BCR-ABL의 자가인산화를 저해시키기도 한다.
ATP-경쟁적 BCR-ABL 저해에 대해 잠재적인 대체 접근법은 비-ATP 경쟁적 알로스테릭 기전에 의해서, 또는 기질의 키나제에의 결합을 방해함으로써 키나제 활성을 저해하는 분자를 사용하는 것이다. 이러한 전략법은, 결합 부위가 다르다는 이유로 이마티닙-내성 돌연변이체가 상기 저해제에 대해서 내성을 띨 가능성이 없다는 이점을 갖는다. BCR-ABL-의존성 세포 증식의 저해제에 대한 고효율 스크리닝을 통해 원형 저해제로서 3-[6-[[4-(트리플루오로메톡시)페닐]아미노]-4-피리미디닐]벤즈아미드 (GNF-2)를 확인할 수 있었는데, 이는 BCR-ABL의 미리스토일 결합 부위에 결합함으로써 ABL 티로신 키나제 활성에 알로스테릭 저해 작용을 일으킨다. GNF-2는 p210 비-돌연변이화된 BCR-ABL 뿐만 아니라, 상기 효소의 E255V 및 M351T 돌연변이체 형태로 형질감염된 Ba/F3 세포의 증식을 저해시킨다 (문헌 [Weisberg et al., Nat. Rev. Cancer 2007, 상기 문헌 동일]).
표 1은 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있는 예시적인 BCR-ABL 저해제를 제시하는 것으로서, 그러한 BCR-ABL 저해제로는 닐로티닙 (AMN107), 이마티닙 (STI571), 2,6,9-삼치환된 퓨린 유사체 (예로서, AP23464), AZD-0530, 보수티닙, CPG070603, 피리도[2,3-d]피리미딘 화합물 (예로서, 다사티닙), PD166326, PD173955, PD180970), ON012380, 3-치환된 벤즈아미드 유도체 (예로서, INNO-406), MK-0457, PHA-739358 및 GNF-2를 포함한다 (예로서, 문헌 ([Weisberg et al., Nat. Rev. Cancer 2007, 상기 문헌 동일]; [Tauchi et al., Int. J. Hematology 2006, 83:294-300]; [Manley et al., Biochim. Biophys. Acta 2005, 상기 문헌 동일]; [Ge et al., J. Med. Chem. 2006, 49:4606-4615]; [Adrian et al., Nat. Chem. Biol. 2006, 2:95-102]; [Asaki et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16:1421-1425]) (이들 각각이 본원에서 참고로 인용된다) 참조).
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C. 치료하고자 하는 질환 및 병태
각종 암 치료에 본 발명의 조합물이 사용될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 급성 림프모구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발상 세포 림프종, 조직구 림프종, 및 버킷트 림프종을 비롯한 림프 계열의 조혈 종양; 및 급성 및 만성 골수 백혈병 (CML), 골수형성 이상 증후군, 골수성 백혈병, 및 전골수구성 백혈병을 비롯한 골수 계열의 조혈 종양의 성장 및 증식을 저해시키기 위한 제제로서, BCR-ABL을 저해하는 제제와 함께 조합되는 헷지호그 신호전달 경로를 저해하는 제제를 제공된다.
본 발명의 조합물은 또한 단백질 티로신 키나제, 예를 들어, Src, BCR-ABL 및 c-kit와 관련된 것으로 알려져 있는 암을 치료하는데 유용하다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 조합물은 BCR-ABL 및 c-kit를 표적하는 화학요법제에 대해 감수성이 있고, 내성을 띠는 암을 치료하는데 유용하다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 조합물은 BCR-ABL-양성 CML 및 ALL을 치료하는데 사용될 수 있다.
만성 골수 백혈병 (CML)은 골수에서 주로 골수성 세포의 증가되고 조절되지 않은 클론 증식을 특징으로 하는 골수암이다. 골수암의 1년 발병률은 100,000명당 1-2명꼴이며, 이는 여성보다는 남성이 좀 더 걸리기가 쉽다. CML이 서양 인구 중 모든 성인 백혈병 사례의 약 15-20％를 차지하며, 미국 또는 유럽에서 매년 약 4,500 여건의 신규 사례에 해당한다 (문헌 [Faderl et al., N. Engl. J. Med. 1999, 341: 164-72]).
CML은 필라델피아 전위 t(9/22)를 포함하는 단일의 형질전환된 조혈 줄기 세포 (HSC) 또는 다능성 선조체 세포 (MPP)로부터 유발되는 클론성 질환이다. 이러한 전위의 유전자 생성물인 융합 온코진 BCR-ABL의 발현이 분자에 변화를 유도하여 백혈병 줄기 세포 (LSC) 풀 및 증식물을 비롯한, 악성 조혈작용의 확장과 비-악성 조혈작용의 억제를 일으킨다 (문헌 [Stam et al., Mol Cell Biol. 1987, 7:1955-60]). 골수성 세포 (과립구, 단핵구, 거핵세포, 적혈구) 뿐만 아니라, B- 및 T-세포가 BCR-ABL을 발현하는데, 이는 MPP 또는 HSC가 상기 질환의 출발점이 된다는 것을 시사한다 (문헌 ([Fialkow et al., J. Clin. Invest. 1978, 62:815-23]; [Takahashi et al., Blood 1998, 92:4758-63])). AML을 유발하는 온코진인 M0Z-TIF2 또는 MLL-ENL과는 달리, BCR-ABL은 수임 선조체 세포에 자기 재생 특성을 부여하지 않고, HSC 또는 MPP와 같이 현존하는 자기 재생 세포의 자기 재생 특성을 이용하고 증진시킨다. 질환이 진행되는 동안 백혈병 줄기 세포 풀은 확장되고, 최종 단계인 급성기에는 거의 모든 CD34+CD38- 세포가 필라델피아 전위를 수반한다.
이마티닙 메실레이트 (STI571, 글리벡(GLEEVEC)®)는 그의 반응율이 96％를 초과함에 따라 CML에 대한 요법의 표준이 되어가고 있으며, 이는 BCR-ABL의 활성을 저해함으로써 작용을 한다. 그러나, 초기의 성공에도 불구하고, BCR-ABL에서의 점 돌연변이 획득으로 인하여 결국 환자에서는 이마티닙 메실레이트에 대한 내성이 발생하게 된다. 이마티닙 메실레이트의 한계에 비추어 볼 때, 개선된 CML 치료 방법이 요구되고 있다.
추가로, 본 발명의 조합물은 방광 암종 (가속성 및 전이성 방광암 포함), 유방암종, 결장암종 (결장직장암 포함), 신장암종, 간암종, 폐암종 (소세포 및 비-소세포 폐암 및 폐 선암종 포함), 난소암종, 전립선암종, 정소암종, 비뇨생식관 암종, 림프계 암종, 직장암종, 후두암종, 췌장암종 (외분비계 췌장암종 포함), 식도암종, 위암종, 담낭암종, 자궁경부암종, 갑상선암종, 및 피부암종 (편평 세포 암종 포함)을 비롯한 암종; 성상세포종, 신경모세포종, 신경아교종, 및 신경집종을 비롯한, 중추 신경계 및 말초 신경계 종양; 섬유육종, 횡문근육종, 및 골육종을 비롯한 중간엽 기원의 종양; 및 흑색종, 색소성 건피증, 각질가시세포종, 정상피종, 갑상선 소포암, 및 기형암종을 비롯한 기타 다른 종양을 치료하는데 유용할 수 있다는 것에 주시한다. 또한, 본 발명의 조합물은 비만세포증, 생식 세포 종양, 소아 육종, 및 기타 다른 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것에도 주시한다.
본원에 기술된 치료 방법은 기타 다른 암 요법과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, BCR-ABL 저해제와 함께 조합하여 사용되는 Hh 길항제는 보조적으로 예를 들면, 화학요법, 방사선, 및/또는 수술과 같은 치료 기법들 중 임의의 기법과 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 이는 하나 이상의 화학요법제 또는 면역요법제와 함께 조합하여 사용될 수 있고; 기타 다른 치료 요법(들)을 종료한 후에 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 화학요법제의 예로는 안트라사이클린, 알킬화제 (예로서, 미토마이신 C), 알킬 설포네이트, 아지리딘, 에틸렌이민, 메틸메라민, 질소 머스터드, 니트로소우레아, 항생제, 항대사물질, 엽산 유사체 (예로서, 디하이드로폴레이트 리덕타제 저해제, 예를 들면, 메토트렉세이트), 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 효소, 포도필로톡신, 백금-함유 제제, 인터페론, 및 인터루킨을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 공지의 화학요법제의 특정 일례로는 부설판, 임프로설판, 피포설판, 벤조데파, 카르보쿠온, 메투레데파, 우레데파, 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드, 트리메틸로로멜라민, 클로람부실, 클로르나파진, 사이클로포스파미드, 에스트라머스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페테스테린, 프레드니머스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드, 카무스틴, 클로로조토신, 포테머스틴, 로머스틴, 니머스틴, 라니머스틴, 다카르바진, 만노머스틴, 미토브로니톨, 미토락톨, 피포브로만, 아클락시노마이신, 악티노마이신 F(1), 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카루비신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 다우노마이신, 6-디아조-5-옥소-1-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 플리카마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 플루오로우라실, 테가푸르, L-아스파라기나제, 풀모자임, 아세글라톤, 알도포스파미드 글리코시드, 아미노레불린산, 암사크린, 베스트라부실, 비산트렌, 카르보플라틴, 시스플라틴, 데포파미드, 데메콜신, 디아지쿠온, 엘포르니틴, 아세트산 엘립티늄, 에토글루시드, 에토포시드, 플루타미드, 질산갈륨, 하이드록시우레아, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 인터루킨-2, 렌티난, 로니다민, 프레드니손, 덱사메타손, 류코보린, 미토구아존, 미토산트론, 모피다몰, 니트라크린, 펜토스타틴, 페나메트, 피라루비신, 포도필린산, 2-에틸하이드라지드, 프로카르바진, 라족산, 시조피란, 스피로게르마늄, 파클리탁셀, 타목시펜, 테니포시드, 테누아존산, 트리아지쿠온, 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민, 우레탄, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 및 빈데신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 방법은 원발성, 재발성, 형질전환성, 또는 난치성 형태의 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 대개, 재발성 암을 앓는 환자는 화학요법, 방사선 요법, 골수 이식, 호르몬 요법, 수술 등을 비롯한 하나 이상의 치료를 받아 왔다. 상기 치료법에 대해 반응을 보인 환자들 중에서 재발성 암을 앓는 환자는 안정형 질환, 부분적인 반응 (즉, 종양 또는 암 마커 수준이 적어도 50％ 만큼 감소), 또는 완전한 반응 (즉, 종양 뿐만 아니라, 마커도 검출불가능하게 됨)을 나타낼 수 있다. 이들 시나리오 중 어느 경우에서든, 암은 추후에 재출현할 수 있고, 이는 암 재발의 전조가 될 수 있다.
D. 제약 조성물 및 투여
본 발명의 조성물은 단독으로 멸균 조건하에서 그를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 조성물은 제약 조성물의 활성 성분으로서 투여된다. 본 발명의 제약 조성물은 BCR-ABL을 저해하는 제제와 함께 조합하여 헷지호그 신호전달 경로를 저해하는 제제를 유효량으로 그의 하나 이상의 담체와 함께 포함할 수 있다. 본 조성물은 또한 상기 언급한 제3의 치료제, 예로서, 화학요법제 또는 기타 다른 항암제를 함유할 수 있다.
제약 담체는 조성물을 증진 또는 안정화시키거나, 조성물의 제조를 촉진시킨다. 제약상 허용되는 담체는 부분적으로는 투여되는 특정 조성물 (예로서, 핵산, 단백질, 또는 기타 다른 유형의 화합물)에 의해서, 그리고 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해서 결정된다. 이는 또한 다른 성분들과 화합성이고, 대상체에게는 해가 되지 않는다는 의미에서 제약상 그리고 생리학적으로, 두가지 모두의 형태로 허용가능하여야 한다. 담체는 예로서, 경구, 설하, 직장, 비내, 또는 비경구 투여와 같이, 투여에 바람직한 제제 형태에 따라서 매우 광범위한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 항종양 화합물은 안정성 또는 약리학적 특성을 증진시키기 위한 목적으로 그의 투여 이전에 담체 단백질, 예를 들면, 오브알부민 또는 혈청 알부민과 함께 착물을 형성할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물의 적합한 제제가 매우 광범위하게 존재한다 (예로서, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000] 참조). 제한없이, 제약상 허용되는 담체로는 특히 시럽, 물, 등장성 염수 용액, 물 중 5％ 덱스트로스 또는 완충처리된 아세트산나트륨 또는 아세트산암모늄 용액, 오일, 글리세린, 알코올, 향미제, 방부제, 착색제, 전분, 당, 희석제, 과립화제, 활택제, 및 결합제를 포함한다. 담체는 또한 지효성 방출 물질, 예를 들면, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴디스테아레이트를 단독으로, 또는 왁스와 함께 포함할 수 있다.
제약 조성물은 예를 들면, 과립제, 정제, 환제, 좌제, 캡슐제, 현탁제, 연고제, 로션 등과 같이 다양한 형태로 제조될 수 있다. 제제 중 치료학적으로 활성인 화합물의 농도는 약 0.1-100중량％로 다양할 수 있다. 치료학적 제제는 약학 분야에 잘 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조된다. 예로서, 문헌 ([Gilman et al., eds., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990]; [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000]; [Avis et al., eds., Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, published by Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1993]; [Lieberman et al., eds., Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, published by Marcel Dekker, Inc., N. Y., 1990]; 및 [Lieberman et al., eds., Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, published by Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1990])을 참조한다.
치료학적 제제는 치료를 위해 사용될 수 있는 임의의 유효한 수단에 의해 전달될 수 있다. 투여하고자 하는 특정 항종양제에 따라서 적합한 수단으로는 경구, 비내, 폐내 투여, 또는 혈류로의 비경구적 주입 (피하, 근육내, 정맥내 및 진피내 주입 포함)을 포함한다. 비경구적인 투여를 위해 본 발명의 항종양제는 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 조절 인자의 수용액은 중합체 비드, 리포좀, 나노입자 또는 당업자에게 공지되어 있는 주사용 데포 제제로 캡슐화될 수 있다. 추가로, 본 발명의 화합물은 또한 리포좀 캡슐화된 형태로 투여될 수 있다. 조성물은 그의 가용성에 성질에 따라서 수층 및 리피드 층, 이 둘 모두에 존재할 수 있거나, 일반적으로는 리포좀 현탁액이라 명명되는 것에 존재할 수 있다. 일반적으로는 전적으로 그러한 것은 아니지만, 소수성 층이 인지질, 예를 들면, 렉시틴 및 스핑고미엘린, 스테로이드, 예를 들면, 콜레스테롤, 디아세틸포스페이트, 스테아릴아민, 또는 포스파티드산과 같이 어느 정도 이온성을 띤 계면활성제, 및/또는 소수성 성질을 갖는 기타 다른 물질을 포함한다.
치료학적 제제는 편리하게 단위 제형 형태로 제공될 수 있고, 적합한 치료학적 투여량으로 투여될 수 있다. 적합한 치료학적 투여량은 잘 알려져 있는 임의 방법, 예를 들면, 최대 내성 용량을 측정하기 위해 수행된 포유동물에서의 임상 연구 및 안전 투여량를 측정하기 위해 수행된 정상적인 인간 대상체에서의 임상 연구에 의해 결정될 수 있다. 더 높은 투여량이 필요할 수 있는 특정 상황하의 경우를 제외하면, 본 발명의 항종양제의 투여량은 일반적으로 1일당 약 0.001 내지 약 1000 mg, 더욱 일반적으로는 1일당 약 0.01 내지 약 500 mg 범위에 포함되어 있다. 항종양제의 투여량과 투여 방식은 치료하는 의사가 개별적으로 검토할 수 있는 인자, 예를 들면, 치료하고자 하는 병태 또는 병태들, 투여하고자 하는 조성물 (특정 항종양제 포함)의 선택, 각 대상체의 연령, 체중, 및 반응, 대상체가 갖는 증상의 중증도, 및 선택된 투여 경로에 따라서 다른 대상체에 대해서는 달라질 수 있다. 대개, 항종양제의 투여량은 대상체의 병태를 효과적이면서도 신뢰할 수 있을 정도로 예방하거나 최소화시킬 수 있는 최소 투여량이다. 그러므로, 상기 투여량 범위는 일반적인 가이던스를 제공하고, 본원의 교시를 뒷받침하기 위한 것이며, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되는 것이지, 제한하고자 하는 것은 아니다. 모든 동물 실험은 미국 국립 보건원의 실험 동물에 대한 인도적인 배려와 사용에 대한 표준 지침(US National Institutes of Health Statement of Compliance with Standards for Humane Care and Use of Laboratory Animals)을 준수하여 실시하여야 한다.
실시예 1
일반 재료 및 방법
마우스 실험
Ptch+/- 마우스 (잭슨 실험실(Jackson Laboratory)), Smo-/- 마우스 (델타진(Deltagene)), C57BL/6 마우스 (잭슨 실험실) 및 B6-Pep3b-Ly5 .1 (Pep) 마우스를을 기술한 바와 같이 유지시키고, 그의 유전자형을 분석하였다. 골수 이식 실험을 위해 C57BL/6 수컷에 5-FU (150 mg/kg)를 복강내로 주사하고, 4일 후에 희생시켰다. 다리 뼈로부터 골수 단핵구 세포를 플러싱하고(flushed), 적혈구 세포를 염화암모늄으로 용해시키고, 골수 세포를 10％ FBS, SCF, IL-6 및 IL-3을 함유하는 DMEM 중에서 배양하였다. 세포를 pMSCV/BCR-ABL/IRES/GFP 레트로바이러스로 감염시키고, 5 x 105개의 단핵구 세포를 치사선량의 방사선이 조사된 C57BL/6 마우스 내로 이식하였다. AMN107 50 mg/kg bid (바젤 소재의 노파르티스(Novartis, Basel)) 및 사이클로파민 25 mg/kg bid (캠브릿지 소재의 노파르티스)를 사용한 치료는 이식 후 7일이 경과하였을 때 출발하여 14일 동안 유지시켰다.
Ptch 및 Smo 조혈 세포를 사용한 이식 실험을 위해서 임신 기간 중 배아 일수 14.5일째인 것을 사용하였다. 배아를 얼음 상에서 냉동시키고, 두부를 제거하였다. 배아 간을 추출하고, 세포 여과기 (BD 바이오사이언스(BD Bioscience))를 통해 여과하였다. 배아 간 세포를, 재증식 실험을 위해서 준치사선량의 방사선이 조사된 B6-Pep3b-Ly5 .1 (Pep) 마우스에 직접 이식시키거나, 자극 배지 중에서 배양한 후에 pMSCV/BCR-ABL/IRES/GFP 레트로바이러스로 감염시켰다. 감염 후 24시간이 경과하였을 때에 GFP 양성 세포의 갯수를 유세포 측정법에 의해 측정하고, BCR-ABL 양성 세포의 확장을 평가하기 위해서 감염율을 4-6％로 유지시켰다. 이어서, 태아 간 세포를 치사선량의 방사선이 조사된 수혜자 내로 이식하였다. 매주 중량을 측정하고, 2주 마다 혈액 세포를 계수하고, 말초 혈액 중 GFP 양성 세포를 검출함으로써 질환 발병에 대해 모니터하였다.
세포 배양 실험
이환된 마우스로부터 유래된 골수 세포를, 10％ FBS (기브코(Gibco)), SCF (RDI), IL-3 및 IL-6 (R&D 시스템즈(R&D systems))을 함유하는 DMEM 배지 중에서 배양하였다. 시험관내에서의 처리 실험을 위해서, 4 x 106개의 골수 또는 비장 세포를 6-웰 플레이트 중 하나의 웰에 시딩하였다. 사이클로파민-KAAD (토론토 리서치 케미칼스(Toronto Research Chemicals))로부터 입수)를 DMSO 중 x 1,000 스톡으로서 용해시켰다. 72시간 동안 처리한 후, 제조사의 설명서에 따라 줄기 세포 기법 (M3434)으로부터 얻은 SCF, IL-6, IL-3 및 인슐린을 함유하는 메틸 셀룰로스 배지 중에 세포를 플레이팅하였다. 플레이팅 후 5일째 및 10일째 콜로니를 계수하였다. 12일째 세포를 플레이트로부터 희석시키고, PBS 중에서 세척한 후, 다른 세포 유형의 분석을 위해 염색하거나, 2차 또는 3차 플레이팅 회차로 재플레이팅하였다.
면역조직화학법
마우스 조직을 적어도 24시간 동안 고정시키고, 염색 방법을 수행한 후 파라핀에 포매된 조직을 생성하였다. 제조사의 권고에 따라 Gli1에 대한 항체 (N-16, 산타 크루즈 바이오테크놀러지(Santa Cruz Biotechnology)), Smo에 대한 항체 (H-300, 산타 크루즈 바이오테크놀러지) 및 Hh에 대한 항체 (H-160, 산타 크루즈 바이오테크놀러지)를 사용하여 파라핀 절편 상에서 단색 DAB-면역퍼옥시다제 염색을 실시하였다.
RT - PCR 및 정량적 PCR
제조사의 권고에 따라 퀴아젠(Qiagen) RNA 추출 키트를 사용하여 질환의 만성기 또는 급성기에 있는 CML 환자로부터 유래된 CD34+ 세포로부터, 전 골수로부터 또는 분류된 Lin-Kit+Sca+ 양성 세포로부터 RNA를 추출한다. 택맨(Taqman) PCR에 의해 정량적 PCR을 평가한다. 프라이머와 프로브는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터 입수하였다.
세포 염색 및 분류
혈액성 세포 유형을 분석하기 위하여 BD 파르미겐(BD Pharmingen)으로부터 입수한 항체 Sca-PE, Kit-APC, Lin 마커 CD3, Gr-1, CD11b, CD19, Ter119 모두 PE-Cy7 양성, CD4-PE, CD8-APC를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 유세포 측정을 위한 염색을 실시하였다. 줄기 세포의 세포 주기 분석을 위해서, 세포를 48시간 동안 사이클로파민으로 처리한 후, Lin 마커, Kit-APC 및 Sca-PE로 염색하였다. 이어서, 염색된 골수를 2％ 포르말린에 고정시켰다. 세포를 적어도 1시간 동안 70％ 냉 에탄올에 투과시킨 후, 적어도 30분 동안 요오드화 프로피디엄 (5 mg/ml)으로 처리하였다. 쿨터(Coulter)로부터 입수한 유세포 측정기를 사용하여 세포를 분석하였다. 혼합 골수를 사이클로파민과 함께 24, 48 및 72시간 동안 인큐베이션시킨 후, 아넥신(Annexin) 염색을 실시하였다. 제조사의 설명서에 따라 세포를 아넥신-PE 항체 및 7-AAD (BD 바이오사이언스)로 염색하였다.
실시예 2
BCR - ABL 에 의한 헷지호그 신호전달 경로 활성화
본 실시예에서 나타내는 바와 같이, BCR-ABL은 Smo의 상향조절을 통해서 백혈병 줄기 세포에서의 헷지호그 신호전달 경로를 활성화시킨다. BCR-ABL 양성 LSC 대 정상 HSC에서 헷지호그 신호전달 경로의 활성화 상태를 평가하기 위해 건강한 기증자로부터 유래된 인간 CD34+ 세포 중 2개의 Hh 경로 표적 유전자 Gli1 및 Ptch1의 전사체 수준을 만성기 또는 급성기에 있는 CML 환자로부터 단리된 CD34+ 세포 중의 것과 비교하였다. 모든 CML 사례에서 Gli1 및 Ptch1의 전사체 수준은 4배 초과로 유도된 것이 관찰되었는데, 이는 질환의 단계와는 상관없이 CML 경로의 활성화가 이루어진다는 것을 시사한다 (도 1a). CML 질환의 만성기에 있는 환자에 비하여 CML 급성기에 있는 환자에서 Gli1 및 Ptch1의 전사체 수준이 상승된 것으로 나타났다.
BCR-ABL이 헷지호그 경로 활성화에 미치는 효과를 추가로 평가하기 위해 마우스에서 CML-유사 증후군을 유도하였다. pMSCV/BCR-ABL/GFP 바이러스로 감염된 골수를 방사선이 조사된 수혜자 마우스에 이식하였다. 이환된 마우스로부터 입수한 BCR-ABL 양성 LSC (Lin-Kit+Sca+GFP+)의 Gli1 및 Ptch1의 전사체 수준은 정상적인 마우스 HSC (Lin-Kit+Sca+)와 비교하였을 때 증진된 것으로 나타났다. BCR-ABL 레트로바이러스 (pMSCV)로 감염된 마우스 골수에서 헷지호그 경로의 활성화는 줄기 세포 군집으로만 제한되는 것이 아니라, BCR-ABL을 과다발현하는 모든 세포에서 일어났다 (도 1b).
동일한 마우스의 BCR-ABL 음성 군집에서는 훨씬 더 낮은 수준으로 Smo가 관찰된 것에 비하여 모든 BCR-ABL/GFP 양성 골수 세포에서는 막횡단 수용체 Smo의 상향조절이 관찰되었다. BCR-ABL 양성 군집에서의 Smo 상향조절은 유세포 측정 뿐만 아니라, 면역조직화학법에 의해 검출할 수 있었다. Smo-특이 항체를 사용하여 이환된 마우스의 비장 및 골수를 염색한 IHC 염색법을 통해 BCR-ABL 양성 군집에서 Smo 발현이 강하게 유도되었다는 것이 밝혀졌다. 또한, 인간 CML 사례에서 Smo 및 Gli1에 대해 IHC 염색법을 실시한 결과, 골수, 특히 모세포 군집의 상응하는 부위에 있는 2가지 유전자 모두 상향조절된 것으로 밝혀졌다 (도 1c). 추가로, 림프종 세포에서 Smo의 레트로바이러스 발현은 피부와 같은 비-림프성 기관에서 Eμ-Myc 양성 림프종 이식편의 성장을 촉진시키는 것으로 나타났고, 심지어 리간드 자극이 없는 상태에서도 Gli1 수준을 향상시켰다.
실시예 3
시험관내에서의 헷지호그 신호전달 저해
본 실시예는 시험관내에서의 헷지호그 신호전달 저해가 BCR-ABL 양성 세포에서 아포프토시스를 유도하고, 백혈병 줄기 세포의 갯수를 감소시킨다는 것을 보여준다. 시험관내 BCR-ABL 양성 골수 세포와 백혈병 줄기 세포에서 헷지호그 경로가 갖는 역할을 조사하기 위해 Smo를 그의 불활성인 입체형태로 잠그는 알칼로이드인 KAAD-사이클로파민을 사용하여 헷지호그 신호전달을 저해시켰다. 약 50％의 BCR-ABL GFP 양성 세포 대 50％의 정상적인 골수 세포를 함유하는 CML-유사 증후군을 앓는 마우스로부터 유래된 골수를 사용하였다. 3일 동안 혼합형 골수 배양물을 사이클로파민으로 처리하였을 때 GFP 음성 군집과 비교하여 GFP/BCR-ABL 양성 군집은 용량에 의존하는 방식으로 감소하였다. 시험관내에서 사이클로파민 (2 μM 또는 5 μM)으로 처리한 이후 GFP 양성 세포는 유세포 측정 분석법에 의해 검출할 수 있었다.
상이한 세포의 하위세트에 대해 추가로 특징을 규명한 결과, BCR-ABL 양성 골수성 선조체 세포 (Lin-Kit+Sca-)는 80％ 초과 만큼 감소하였고, Lin-Kit+Sca+ 백혈병 줄기 세포 군집은 약 70％ 만큼 감소한 것으로 나타났다 (도 2a). 아넥신 V(Annexin V) 염색에 의해 측정된 바, 사이클로파민 저해가 BCR-ABL 양성 골수 세포에 미치는 주된 효과는 24시간 이내의 아포프토시스 유도였다. 완전한 골수에서의 S기 및 G2기와 비교하여 G1기가 상대적으로 증가한 세포 주기상의 변경도 검출하였다. 백혈병 줄기 세포 군집의 세포 주기를 분석한 결과, Hh 경로 저해 후 상기 세포에서는 G2기가 완전히 손실된 것으로 나타났다. 골수에서의 Gli1 전사체 수준은 사이클로파민 처리 후 감소하였고, 이를 통해 상기 화합물에 의한 상기 세포에서의 헷지호그 신호전달 경로 저해를 확인하게 되었다 (도 2b). 도 2b에서, 골수 배양물을 6시간 동안 DMSO 단독으로 처리하거나, 다른 농도의 사이클로파민 (2 μM 또는 5 μM)으로 처리하였다. 처리된 배양물로부터 RNA를 추출하고, Gli1 전사체 수준은 택맨 PCT에 의해 측정하고, GAPDH에 대해 정규화하였다. 본 분석을 3회에 걸쳐 실시하였다.
헷지호그 경로 저해가 자기 재생 선조체 및 백혈병 줄기 세포 군집에 미치는 효과를 추가로 확인하기 위해 혼합형 골수 및 비장 배양물을 48시간 동안 농도를 달리하는 사이클로파민-KAAD (10, 5, 2.5, 1 및 0 uM)로 처리하였다. 이어서, 사이토카인을 보충하지 않는 메틸 셀룰로스 플레이트에 세포를 플레이팅하여, 오직 BCR-ABL 양성 세포만이 생존할 수 있도록 하였다. 플레이팅 후 10일째 콜로니를 계수하였다. 사이클로파민으로 전처리된 골수와 비장 배양물에서는 용량에 의존하는 방식으로 BCR-ABL 양성 콜로니가 감소하였는데, 이는 BCR-ABL 양성 세포의 콜로니 형성능이 헷지호그 경로 활성화에 의존한다는 것을 시사한다(도 2c).
실시예 4
헷지호그 경로 활성화
헷지호그 경로 활성화는 콜로니 형성능과, 조혈 선조체 및 줄기 세포의 재생능을 증진시킨다. 정상적인 조혈작용에서의 헷지호그 신호전달이 갖는 역할을 평가하기 위해 임신 기간 중 배아 일수 14.5일째 간으로부터 태아 HSC를 단리시켰다. 태아 HSC의 갯수, 분화된 조혈 세포 유형의 갯수 뿐만 아니라, 이식 실험에서의 콜로니 형성능 및 재증식능에 관하여 Smo-/-, Smo+/-, Smo+/+, Ptch+/+ 및 Ptch+/- 배아로부터 유래된 태아 간 세포를 분석하였다. 유전형이 상이한 것에 따른 태아 HSC의 갯수 차이는 관찰되지 않았다. 또한, B-세포 (B220), 골수성 세포 (CD11b) 및 적혈구 선조체 (Ter119)) 및 CD3 양성 T-세포에서도 유의적인 차이는 없었다.
사이토카인 (IL-3, IL-6, SCF)이 보충된 메틸 셀룰로스로 세포를 플레이팅하였을 때에는 플레이팅 후 10일째 유세포 측정에 의해 측정한 바, 콜로니 갯수, 콜로니 유형, 또는 상이한 세포의 비율(％)에 있어 어떤 차이도 나타나지 않았다. 1회차 플레이팅과는 대조적으로, 2회차 플레이팅에서는 콜로니 형성능에 있어 큰 차이가 관찰되었다. Ptch 및 Smo wt 조혈 세포를 재플레이팅하였을 때에는 2회차 플레이팅시에 단지 매우 제한된 콜로니 형성능을 나타내었고, Smo-/- 조혈 세포는 콜로니 형성능을 완전히 상실하였다. 대조적으로, Ptch+/- 조혈 세포는 3회차 플레이팅 넘어까지 그의 콜로니 형성능을 유지하였는데, 이는 헷지호그 경로 활성화가 Ptch+/- 조혈 군집 중의 재생 세포의 양을 증진시킨다는 것을 시사한다 (표 2).
Figure pct00003
제2 실험에서는 Smo-/-, Smo+/-, Smo+/+, Ptch+/+ 및 Ptch+/- 태아 간 세포 (Ly-5.2에 대해 양성)를 준치사선량의 방사선이 조사된 C57BL/6-Ly5.1-Pep 3b (B6 Ly-5.1) 마우스에 이식하였다. Ptch+/- 이외의 다른 것을 이식받은 태아 간 유전자형과 비교하여 Ptch+/- 태아 간 세포를 이식받은 마우스에 대해 말초 혈액에서 Ly5.2 양성 조혈작용의 재생은 현저한 이점을 나타내었다. 3개월을 초과하는 시점에서부터의 기간 동안 말초 혈액 중 Ly5.2 양성 세포의 갯수는 wt 및 Smo-/-과 비교하여 그의 약 2배 정도가 되었다 (도 3a). Smo-/- 골수의 재생은 wt와 유의적인 차이를 보이지는 않았는데, 이는 Smo-/- 대 Smo wt HSC의 재생능에 있어서는 큰 차이가 없음을 시사한다. 말초 혈액 중의 세포 유형에 관한 추가 분석을 실시한 결과, Smo-/- 태아 간 세포를 이식받은 마우스 대 Smo wt 태아 간 세포를 이식받은 마우스 사이에는 세포 분포 상에 있어 차이를 보였다. Smo-/-는 CD8 양성 T-세포가 90％ 초과 감소한 것으로 나타난 반면, CD4+ T-세포의 갯수는 단지 30％ 만큼만 감소하였다. 이러한 결과는 헷지호그 신호전달이 T-세포 발생에 중요하다는 것을 나타내고, CD8+ T-세포의 재생은 온전한 헷지호그 신호전달에 의존한다는 것을 시사한다 (도 3b).
HSC에서의 헷지호그 신호전달이 갖는 역할을 추가로 조사하기 위해, 처음에 태아 간 세포를 이식받은 마우스 골수의 재생능을, 상기 마우스에 5-플루오로우라실 (5-FU)을 주사함으로써 조사하였다. Smo 결핍 골수에서는 단기간의 재생능이 현저하게 감소하였다. 5-FU 주사 후 10일째, 처음에 Smo-/- 태아 간 세포를 이식받은 마우스에서 Ly5.2 양성 세포의 갯수는 다른 유전자형에서보다 70％ 더 낮았는데, 이는 단기간의 재증식 세포에 있어서 헷지호그 신호전달 경로의 역할을 시사한다 (도 3c). 이들 결과는 Ptch+/- 마우스가 단기간의 재증식 세포에서 더 빠른 재생능을 보이고, 현저히 증진된 줄기 세포 풀을 갖는다는 것을 나타낸다. 본 결과는 3개월을 초과하는 기간 동안 Ptch+/- 마우스에서의 Ly5.2 양성 세포의 갯수는 다른 유전자형에서보다 유의적으로 더 높게 지속되었는 바, 장기간의 재증식 세포에는 헷지호그 경로 활성화가 도움이 된다는 것을 시사한다. Ptch wt 마우스와 비교하여 2살된 Ptch+/- 마우스로부터의 혈액 세포 계수에서는 말초 혈액 세포 갯수 상의 차이가 없었고, 이는 심지어 장기간의 시간이 경과한 후에도 이들 마우스에서는 혈액 세포 재생이 유의적으로 결핍되어 있지는 않다는 것을 시사한다.
조혈작용에서 Smo의 상향조절이 갖는 역할을 추가로 확인하기 위해 5-FU로 전처리된 마우스 골수에서 GFP 대조군 벡터인 Smo wt와 활성화된 돌연변이체 SmoW535E를 과다발현시켰다. 90％ GFP 음성 골수 세포와 혼합된 10％의 GFP 양성 골수 세포를 방사선이 조사된 기증자 마우스에 이식하였다. 혈액 세포 계수와 말초 혈액 중 GFP 양성 세포에 관한 평가를 통해 조혈작용의 재생을 모니터하였다. Smo wt 또는 SmoW535E를 과다발현하는 골수 세포는 대조군 골수 세포에 비해 유의적으로 상승된 Gli1 수준을 가졌다 (도 3d). GFP 대조군 벡터를 발현하는 골수를 이식받은 마우스에서 GFP 양성 세포의 비율(％)은 10-12％로 지속되었다. 대조적으로, Smo wt 또는 SmoW535T로 감염된 골수를 이식받은 마우스에서는 GFP 양성 세포의 갯수가 1년 동안 최대 30％까지 유의적이게 증가한 것으로 나타났다. GFP 양성 세포 유형에 있어서는 유의적인 차이는 없었다 (도 3e). 이러한 데이타는 Smo의 과다발현에 의한 헷지호그 신호전달의 활성화가 줄기 세포 풀을 확장시킬 수 있으며, 시간이 경과함에 따라 재증식 세포의 갯수를 유의적으로 증진시킬 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 5
생체내에서의 Smo -/- 에 의한 BCR - ABL 양성 백혈병 줄기 세포 저해
본 실시예에서 나타내는 바와 같이, Smo-/-는 BCR-ABL 양성 백혈병 줄기 세포의 확장을 저해하고, 백혈병의 재이식가능성을 폐기시킨다. 생체내에서의 BCR-ABL 양성 백혈병 발병에 있어 헷지호그 경로의 역할을 조사하기 위해, pMSCV/BCR-ABL/IRES/GFP 레트로바이러스 벡터를 사용하여 Smo-/-, Smo+/-, Smo+/+, Ptch+/+ 및 Ptch+/- 배아 간 세포에서 BCR-ABL을 과다발현시켰다. 시험된 배아 조혈 세포 모두에서의 감염율은 3-4％ 사이였다. 감염된 세포를 방사선이 조사된 수혜자인 C57/B16 마우스에 이식하였다. 이식 후 20일째에 GFP 양성 세포 및 혈액 세포 계수를 측정하였다. Ptch+/-/BCR-ABL/GFP 태아 간 세포를 이식받은 마우스에서는 pMSCV/BCR-ABL/GFP로 감염된 Ptch wt 또는 Smo wt 골수를 이식받은 마우스보다 GFP 수준이 3배 정도 더 높게 나타났다. Smo-/-/BCR-ABL/GFP 양성 세포는 상기 기간에 확장되지 않았고, 심지어 그 갯수는 원래 감염율보다 작은 것으로 나타났다 (도 4a). 이식 후 28일째, 각 이식군으로부터 3마리의 마우스를 취하여 다른 군들과 비장 중량을 비교하였다.
Ptch+/-, Ptch wt, Smo wt 또는 Smo+/-/BCR-ABL/GFP 태아 간 세포를 이식받은 마우스 모두 비장 중량이 40％ 초과로 증가한 반면 (이는 CML 발병의 출발 징후가 된다), Smo-/- 배아 간 세포를 이식받은 마우스 모두의 비장 크기는 정상이었는데, 이는 Smo이 BCR-ABL 양성 세포의 확장에 있어 중요하다는 것을 시사하는 것이다 (도 4b). 이식 후 38일 이내에 Ptch+/- 배아 간 세포를 이식받은 마우스 모두에서 치명적인 백혈병 질환이 발병하였고, 이어서, Ptch wt, Smo wt 또는 Smo+/- 태아 간 세포를 이식받은 마우스에서 발병이 일어났다 (도 4c). Ptch+/- 태아 간 세포를 이식받은 마우스에서는 CML (20％)보다는 BCR-ABL 양성 ALL (80％)이 발병될 가능성이 더 컸던 반면, Smo+/- 태아 간 세포를 이식받은 마우스에서는 ALL보다는 CML이 발병될 가능성이 더 컸다. 이식한지 3개월을 초과하는 기간이 경과된 후 Smo-/- BCR-ABL 양성 태아 간 세포를 이식받은 마우스 중 60％에서만 치명적인 질환 (이는 비장 중량 증진을 특징으로 한다)이 발병하였지만, 어떤 마우스에서도 말초 혈액 중 백혈구 세포의 계수 증진은 일어나지 않았다. Smo-/-/BCR-ABL/GFP를 이식받은 마우스 중 40％에서는 심지어 이식한지 12개월이 경과된 후에도 질환의 어떤 징후도 보이지 않았다.
백혈병 줄기 세포 군집 상에서의 헷지호그 신호전달 경로의 활성화 상태를 추가로 조사하기 위하여 1회차 감염으로 이환된 마우스로부터 골수 및 비장 세포를 수집하고, 2E5 GFP 양성 세포를 방사선이 조사된 제2 수혜자에 이식하였다. Ptch+/-, Ptch wt, Smo wt 및 Smo+/- BCR-ABL 양성 골수를 이식받은 마우스로부터 수혜받은 제2 수혜자 모두에서 이식 후 2개월 이내에 백혈병이 발병된 반면, Smo-/- BCR-ABL wt 골수를 이식받은 마우스에서는 심지어 이식한지 4개월이 경과된 후에도 질환의 어떤 징후도 발생하지 않았다 (도 4d). 이러한 결과는 BCR-ABL 양성 백혈병 줄기 세포의 확장은 헷지호그 경로 활성화에 의존하는 것이며, Smo가 CML에서 백혈병 줄기 세포에 대한 표적일 될 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 6
생체내에서의 Abl 저해와 Smo 저해의 조합
본 실시예에서 나타내는 바와 같이, CML-유사 질환을 앓는 마우스에서 Abl 저해 (예로서, AMN107) 및 Smo 저해 (예로서, 사이클로파민)의 조합은 집락 형성 단위의 양을 감소시키고, 재발 시간을 향상시키는데, 이는 AMN107와 사이클로파민의 조합이 CML을 치료하는데 있어서 유익할 수 있다는 것을 시사한다.
BCR-ABL 양성 골수를 이식받은 마우스를 차선적 투여량의 ABL 저해제 AMN107로 처리하거나, AMN107 (50 mg/kg qd) 및 Smo 길항제 사이클로파민 (25 mg/kg bid)의 조합으로 처리하였다. 처리는 이식 후 7일째에 개시하고, 총 14일 동안 계속 진행하였다. 처리 종료시, 각 군당 3마리의 마우스를 희생시키고, 오직 BCR-ABL 양성 콜로니만을 검출하기 위해서 1개의 대퇴골로부터 유래된 골수를 사이토카인을 첨가하지 않은 메틸 셀룰로스 콜로니 분석법으로 플레이팅하였다. AMN107과 사이클로파민의 조합물로 처리된 마우스에서 검출된 콜로니의 평균 갯수는 오직 AMN107만으로 처리된 처리군에 비하여 40％ 초과로 감소하였는데, 이는 상기 조합 치료가 BCR-ABL 양성 콜로니 형성 단위의 갯수를 감소시킬 수 있다는 것을 시사한다 (도 5a). 상기 시점에서 말초 혈액 세포 계수, 비장 및 간 중량은 정상적이며, GFP 양성 세포의 갯수는 5％ 아래였다.
처리 종료 후 8일째, 각 군당 또다른 3마리의 마우스를 희생시키고, 간 및 비장 중량을 비교함으로써 재발의 징후에 대해 조사하였다. 정상의 마우스와 비교하였을 때 모든 마우스에서 간 및 비장 중량이 증진된 것이 발견되었고, 오직 AMN107만으로 처리된 마우스는 AMN107과 사이클로파민의 조합물로 처리된 마우스보다 평균 비장 크기가 2배 정도 컸고, 간 중량도 훨씬 높았다 (도 4b). 각 군당 남은 5마리의 마우스는 질환의 징후에 대해 모니터하고, 빈사 상태에 있을 때 희생시켰다. 오직 AMN107만으로 처리된 AMN107 군에서의 처리 종료 후 평균 생존 기간은 8일인 반면, AMN107과 사이클로파민의 조합물로 처리된 처리군에서는 24일이었다 (도 5c).
본원에 기술되어 있는 실시예와 실시태양은 단지 예시적인 목적으로 기술된 것이며, 그에 비추어 다양한 수정 또는 변형이 당업자에게는 제안될 수 있으며, 이는 본 출원의 정신 및 범위와, 첨부된 특허청구범위의 범주에 포함시키고자 한다는 것을 이해할 것이다.
모든 공개 문헌, 특허, 미국 출원, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열 수탁 번호 및 본원에 인용된 기타 다른 문서들은 이들 각각의 문서가 개별적으로 상기와 같이 언급된 것과 동일한 정도로 그의 전문이 모든 목적을 위해 참고로 인용된다.

Claims (8)

  1. 헷지호그(hedgehog) 신호전달 경로를 저해하는 제1 제제, 및 BCR-ABL을 저해하는 제2 제제를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 제제가 Smo에 결합하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 제제가 사이클로파민 또는 포르스콜린인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2 제제가 ABL 저해제, ABL/Scr 저해제, 오로라(Aurora) 키나제 저해제, 또는 BCR-ABL의 비-ATP 경쟁적 저해제인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제2 제제가
    Figure pct00004

    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  6. 치료학적 유효량의, 헷지호그 신호전달 경로를 저해하는 제1 제제, BCR-ABL을 저해하는 제2 제제, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  7. BCR-ABL 양성 백혈병 치료용 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  8. 제7항에 있어서, 상기 BCR-ABL 양성 백혈병이 만성 골수성 백혈병 또는 급성 림프구성 백혈병인 용도.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5518062B2 (ja) * 2008-07-24 2014-06-11 ネルビアーノ・メデイカル・サイエンシーズ・エツセ・エルレ・エルレ オーロラキナーゼ阻害剤および抗悪性腫瘍剤を含む治療用組み合わせ
US20110039850A1 (en) * 2009-08-12 2011-02-17 Mhairi Copland Leukemia Treatment
RU2012120901A (ru) * 2009-10-23 2013-12-10 Новартис Аг Способ лечения пролиферативных расстройств и других патологических состояний, опосредованных действием киназ bcr-abl, c-kit, ddr1, ddr2 или pdgf-r
WO2013187967A1 (en) 2012-06-15 2013-12-19 Institute For Cancer Research D/B/A The Research Institute Of Fox Case Cancer Center ("Fox Chase Cancer Center") Sensitization of cancer cells to dna damage by inhibiting kinases essential for dna damage checkpoint control
CN103768067A (zh) * 2012-10-23 2014-05-07 杨子娇 一类治疗房角狭窄的化合物及其用途
CN104262262B (zh) * 2014-08-29 2016-06-08 西安交通大学 一种N,6二苯基嘧啶-4-胺类Bcr-Abl抑制剂及其制备方法和应用
CN109744199A (zh) * 2017-11-08 2019-05-14 南京艾莫瑞生物科技有限公司 一种肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型、其构建方法及应用
EP3624798A1 (en) 2017-05-18 2020-03-25 Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of mast cell diseases
CN108721217B (zh) * 2018-08-21 2020-09-08 武汉轻工大学 抗肿瘤药物组合物及药物制剂和应用
US20200297725A1 (en) * 2019-03-22 2020-09-24 Yale University Allosteric bcr-abl proteolysis targeting chimeric compounds

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE19541844C1 (de) 1995-11-09 1997-07-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von menschlichen Antikörpern und deren Verwendung
US6291516B1 (en) 1999-01-13 2001-09-18 Curis, Inc. Regulators of the hedgehog pathway, compositions and uses related thereto
CA2483311A1 (en) 2002-04-22 2003-10-30 Philip A. Beachy Modulators of hedgehog signaling pathways, compositions and uses related thereto
US20050008625A1 (en) 2003-02-13 2005-01-13 Kalobios, Inc. Antibody affinity engineering by serial epitope-guided complementarity replacement
PL1789390T3 (pl) 2004-09-02 2012-04-30 Genentech Inc Pirydylowe inhibitory szlaku sygnałowego hedgehog
WO2006102611A2 (en) 2005-03-24 2006-09-28 The Ohio State University Research Foundation Therapeutic agents for the treatment of leukemia

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