KR20100052711A

KR20100052711A - 엔도톡신의 검출방법 및 이를 수행하기 위한 엔도톡신 검출기

Info

Publication number: KR20100052711A
Application number: KR1020080111541A
Authority: KR
Inventors: 오현직; 박혜민; 박종성; 윤태중
Original assignee: 주식회사 서린바이오사이언스
Priority date: 2008-11-11
Filing date: 2008-11-11
Publication date: 2010-05-20
Also published as: KR101088503B1

Abstract

본 발명은 시료의 저항값을 측정하여 짧은 시간내에 정확하게 엔도톡신을 정량분석할 수 있는 엔도톡신의 검출방법 및 이를 수행하기 위한 엔도톡신 검출기에 관한 것이다.

이를 통해 전기적 변화량의 측정을 통해 농도의 산출이 가능하므로 비색법이나 비탁법에 비하여 매우 적은양의 시료만으로 엔도톡신의 농도를 민감하게 검출해 낼 수 있고, 간단한 저항측정기만 구비하면 족하므로 고가의 측정장비가 필요없으므로 매우 작은 크기의 마이크로 칩 내지 랩온어필름칩에 충분히 적용될 수 있다.

따라서, 종래의 실험실 단계를 벗어나 부피가 작으면서 대량생산이 용이한 마이크로 필름칩에 적용이 가능하다.

엔도톡신, 검출, 검출기, 전압, 저항

Description

엔도톡신의 검출방법 및 이를 수행하기 위한 엔도톡신 검출기{DETECTING METHOD OF ENDOTOXIN AND ENDOTOXIN DETECTOR TO EXECUTE METHOD THEREOF}

본 발명은 엔도톡신의 검출방법 및 이를 수행하기 위한 엔도톡신 검출기에 관한 것으로, 보다 상세하게는 시료의 저항값을 측정하여 짧은 시간내에 정확하게 엔도톡신을 정량분석할 수 있는 엔도톡신의 검출방법 및 이를 수행하기 위한 엔도톡신 검출기에 관한 것이다.

엔도톡신(ET)은 단백질 및 인지질과 함께 그램-음성 박테리아의 외부세포막을 형성하는 리포다당체과를 가리킨다. 엔도톡신은 오직 이 박테리아군에서만 발생하며 외부세포막의 조직, 안정성 및 장벽 기능에 있어서 중요한 역할을 한다. 다수 박테리오파지는 그들의 숙주 박테리아를 찾는 특이방법으로서 엔도톡신이나 일반적인 리포다당체를 사용한다.

모든 엔도톡신 변이체는 지질 A와 공유결합적으로 결합되는 이종다당체로 구성된다(Holst, O., 리포다당체의 코아영역에서의 화학적 구조. In: 건강과 질병에 서의 엔도톡신(Brade, H., Morrison, D.C., Opal, S., Vogel, S. eds.), Marcel Dekker Inc. New York). 지질 A는 외부 박테리아 세포막에 엔도톡신을 고정시킨다. 상기 이종다당체는 코아 올리고당과 O 항원으로 구성되며, 주변용액에서 나타나 박테리아의 혈청학적 특성을 결정한다. 상기 O 항원은 반복되는 올리고당 단위로 구성되며, 이는 특이한 균주의 성분이다(상기 Holst 등의 논문을 참조). 상기 코아 올리고당의 기본 단위체는 2-케토-3-디옥시옥토네이트(KDO) 및 L-글리세로-D-만노헵토스(Hep)이다.

엔도톡신은 2분자로서 별도의 예방수단없이 거의 모든 수용성 용액에서 발견될 수 있다. 사람과 동물에 있어서의 엔도톡신은 패혈증을 일으켜 면역계통의 강력한 오반응을 야기한다. 따라서, 예를 들어 파마프로틴을 생산하는 경우에 있어서 엔도톡신에의 오염은 정밀하게 검출되어야하고, 이후 완전하게 제거되어야 한다. 엔도톡신은 사람이나 동물에 주입되는(예를 들어, 가축치료 또는 동물실험) 유전적으로 처리된 의약이나 유전자 치료 또는 물질에의 문제를 나타낸다. 그런데, 포유류 세포의 이입실험과 같은 의약 및 연구의 용도에 있어서 엔도톡신에 의한 이입효율의 억제 또는 저하가 관측될 수 있다.

현재, 생물학적 용액에 있어서 엔도톡신 검출을 위한 세 가지 방법을 아래와 같이 기술하나, 이 중에서 처음 두 가지방법만이 FDA에 의해 허가되고 있다.

1. "토끼 발열원 테스트": 살아있는 토끼에 엔도톡신 용액을 주입하여 면역반응을 유발시키는 방법이다. 이러한 엔도톡신-유도 면역응답은 열의 발현으로써 검출된다.

2. "LAL(Limulus Amoebocyte Lysate) 테스트": 현재 가장 많이 사용되고 있으며(Bio Whittacker, Inc.,Charles-River, Inc., Associates of Cape Cod, Inc., all USA), 매우 향상된 방법으로 표준화될 수 있다. 이 방법으로, 엔도톡신 접촉 후 투구게(리물루스 폴리페무스)의 혈액응집이 측정된다.

3. 또한, 특별한 세포배양시스템을 사용하는 방법이 있으며(Sterogene Inc., USA), 이는 단핵세포의 활성화를 특정 사이토카인의 발현을 통하여 추적한다.

이 중, 상술한 1, 3의 검출방법은 검출비용의 과다 및 민감성에 문제가 있어 실제로는 2 방법(LAL(Limulus Amoebocyte Lysate) 테스트)이 가장 많이 활용되고 있다.

상기 LAL 테스트는 구체적으로 엔도톡신이 아메리카 대륙의 대서양 연안에 분포하는 투구게(Limulus polyphemus)의 순환혈액세포 추출물인 LAL(Limulus Amebocyte Lysate)과 결합하여 겔을 형성하며, 이와 같이 엔도톡신이 LAL을 활성화시켜 겔화를 일으키는 반응에 기초해 엔도톡신을 검출 또는 정량하는 방법이다. LAL 시약은 키트의 형태로 판매되는데, 구체적으로 LAL 시약, 마그네슘 이온, 나트륨 이온 및 pH버퍼로 구성되어 있다.

상기 LAL의 시험법으로는 겔화법(gel clot), 비탁법(kinetic turbidimetric assay: KTA), 또는 비색법(kinetic chromogenic assay: KCA)이 있으며, 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 겔화법은 LAL 중에 존재하는 엔도톡신 감소성의 각종 응고인자에 의해 순차 활성화되고, 최종적으로 활성화된 응고효소에 의해 코아글로겐(coagulogen)이 코아글린(coagulin)으로 변환되어 겔이 형성되는 반응 (a)을 이용한 것이며, 비탁법은 상기 코아글로겐이 코아글린으로 겔화하는 반응 (a)에서 발생하는 탁도 변화를 340nm에서 광학분석장치에 의해 측정하는 방법이며, 비색법은 코아글로겐 대신 합성 크로모게닉 펩타이드(chromogenic peptide)를 사용하고, 소정 시간 인큐베이션(incubation) 후 발색 정도를 405nm에서 측정하는 방법으로서, 효소 반응 활성의 결과는 발생 기질의 방출과 노란색의 형성으로 확인할 수 있고(반응 b), 발색의 정도는 엔도톡신의 양에 비례한다. 하기 반응식 1에서 pNA 기질(substrate)은 Boc-Leu-Gly-Arg-CONH-파라-니트로아닐린을 나타낸다.

한편, 생체분자 및 특정한 화학물질을 효율적으로 검출하고 투입된 시료의 미세입자 관찰분석을 용이하게 관찰하기 위하여 미세 패턴이 구현된 필름이 다층 구조로 이루어져 단일개의 칩으로 구현 가능한 다층 필름 구조의 마이크로 필름칩 특히 랩온어칩이 개발되었다.

그러나, 엔도톡신의 검출은 종래의 비색법이나 비탁법은 일정부분 이상의 시 료의 양 및 일정부피 이상의 반응챔버 등이 반드시 요구되며, 이에 미달할 경우 정확한 측정이 곤란한 문제가 있었다.

그러므로 엔도톡신의 검출은 여전히 고가의 장비가 구비된 실험실 상에서 수행되었으며, 이를 억지로 랩온어칩에서 구현하는 경우 민감도가 떨어지는 치명적인 문제가 있었다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 엔도톡신과 LAL 시약의 반응시 단위시간당 저항값의 변화량을 측정하여 매우 적은 양의 시료를 사용하면서도 짧은 시간내에 엔도톡신의 정확히 정량할 수 있는 엔도톡신의 검출방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 엔도톡신의 검출방법을 효과적으로 구현할 수 있고 대량생산이 용이한 엔도톡신 검출기를 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 엔도톡신의 검출방법은, 엔도톡신을 정량적으로 검출하는 방법에 있어서, 1) 엔도톡신이 포함된 시료의 저항값을 측정하는 단계; 2) 상기 시료와 LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 시약을 반응시키는 단 계; 및 3) 반응 후의 상기 엔도톡신이 포함된 시료의 저항값을 측정하는 단계;를 포함한다.

상기 1) 단계 이전에 바람직하게는 알려진 농도의 엔도톡신을 포함하고 있는 대조 표준 엔도톡신 시료와 LAL 시약을 반응시켜 상기 대조 표준 엔도톡신 시료의 저항값의 단위시간당 저항값의 변화량의 관계를 통해 표준곡선을 작성하는 과정을 더 포함할 수 있다.

상기 3)단계 이후 바람직하게는 단위시간당 저항값의 변화량을 통해 엔도톡신을 정량적으로 산출하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 이 경우 상기 단위시간당 저항값의 변화량을 상기 작성된 표준곡선에 대입하여 엔도톡신의 함량을 산출할 수 있다.

상기 대조표준 엔도톡신 시료 및 3)단계의 저항값의 측정은 20 ~ 30분동안 매 5 ~ 15초 간격으로 측정될 수 있다.

상기 1)단계 및 3)단계의 저항값은 전압을 인가하여 측정하며, 이 경우 상기 저항값은 바람직하게는 전기계측기 또는 휘트스톤 브릿지를 이용하여 측정하는 것도 가능하다.

상술한 엔도톡신의 검출은 바람직하게는 마이크로 칩상에서 수행되며, 보다 바람직하게는 랩온어 필름칩(Lap on a film chip)상에서 수행될 수 있다.

상술한 엔도톡신의 검출방법을 수행하기 위한 바람직한 엔도톡신 검출기는 엔도톡신을 검출하기 위한 하나 이상의 미세전극이 증착된 하부필름; 및상기 플라스틱 필름 상에 위치하며, 엔도톡신이 포함된 시료가 흐를 수 있도록 유로가 형성된 유로필름을 포함하되, 상기 유로가 상기 미세전극에 대응하는 위치상에 형성된다.

이 경우 바람직하게는 상기 하부필름은 폴리이미드 필름을 사용할 수 있다.

상기 하나 이상의 미세전극은 양극 및 상기 양극과 이격된 음극으로 구성되며 상기 양극과 음극은 마주보는 위치에 형성된다.

상기 양극과 음극은 바람직하게는 10 ~ 30 ㎛의 이격거리를 가지며, 상기 미세전극의 두께는 0.1 ~ 1 ㎛이다.

상기 유로는 바람직하게는 말단에 형성된 시료주입부, 상기 시료주입부와 연통되고 LAL 시약과 반응이 일어나는 반응챔버, 상기 반응챔버와 연통되고 주입된 시료의 저항값의 변화량을 측정하는 미세전극이 구비된 검출챔버, 상기 검출챔버와 연통되고 시료가 배출되는 시료배출부 및 상기 검출챔버와 연통되고 시료가 배출되는 시료배출부를 포함한다.

이 경우 상기 반응챔버와 검출챔버는 동일한 챔버일 수 있다.

상기 미세전극은 바람직하게는 외부전원의 탐침과 연결된 전극패드에 연결되되, 상기 전극패드는 상기 시료주입부의 반대면에 형성되며, 상기 탐침은 저항측정기에 연결된다.

상기 미세전극은 상기 시료와의 접촉면적을 최대화하기 위하여 바람직하게는 방사형으로 형성될 수 있으며, 상기 유로는 복수개가 형성될 수 있다.

상기 엔도톡신 검출기는 바람직하게는 마이크로 칩 형태일 수 있으며, 상기 마이크로 칩은 랩온어 필름칩(Lap on a film chip)일 수 있다.

본 발명의 엔도톡신의 검출방법은 엔도톡신을 포함하는 시료가 LAL 시약과 반응하는 경우 시료에 포함된 엔도톡신의 농도에 따라 단위시간당 저항값의 변화량이 달라진다는 점을 착안한 것으로서, 전기적 변화량의 측정을 통해 농도의 산출이 가능하므로 비색법이나 비탁법에 비하여 매우 적은양의 시료만으로 엔도톡신의 농도를 민감하게 검출해 낼 수 있고, 간단한 저항측정기만 구비하면 족하므로 고가의 측정장비가 필요없어 매우 작은 크기의 마이크로 칩 내지 랩온어필름칩에 충분히 적용될 수 있다. 나아가, 마이크로 칩에 적용가능하므로 휴대성이 용이한 장점이 있다.

이하 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 엔도톡신의 검출에 있어서 종래의 비색법이나 비탁법을 사용하는 경우 일정부분 이상의 시료의 양 및 일정부피 이상의 반응챔버 등이 반드시 요구되며, 이에 미달할 경우 정확한 측정이 곤란한 문제가 있었다.

이에 본 발명의 엔도톡신의 검출방법은, 엔도톡신이 포함된 시료와 LAL 시약이 반응하는 경우 용액속에 존재하는 마그네슘 이온 및 나트륨 이온의 이온농도의 변화와 겔화반응 등에 의하여 시료의 전기적 저항값이 변화하게 되며 바람직하게는 일정한 전압을 인가하는 경우 저항값이 큰 폭으로 떨어지게 되며 반응이 진행하는 동안 점차 증가하여 일정한 값으로 수렴하게 된다. 이 경우 최초 엔도톡신이 포함된 시료의 농도에 따라 최초시료의 저항값, LAL 시약과 반응후 최종적으로 도달하는 저항값 및 단위시간당 저항값의 변화량이 달라지게 된다.

그러므로, 알려진 농도의 엔도톡신을 포함하고 있는 대조 표준 엔도톡신 시료(control standard endotoxin: CSE)와 LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 시험용 시약을 반응시켜 표준곡선을 작성하고(바람직하게는 일정범위의 농도별로 표준곡선을 다수 작성하고) 엔도톡신의 함량을 측정하고자 하는 시료와 LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 시험용 시약에 일정한 전압을 인가하여 일정 시간동안 바람직하게는 매 10초단위로 측정하고 전체 25분간 반응하는 저항 값을 측정한 다음 이에 적합한 표준 곡선에 대입함으로서 시료 내의 엔도톡신 함량을 정량할 수 있다.

바람직하게는 본 발명에서는 표준곡선에서의 표준엔도톡신 농도 범위는 4.5 EU/mL, 1.5 EU/mL, 0.5 EU/mL로서 3가지이고, 각 농도에 대해 일정 시간동안 (매 10s, 전체 25min) 반응한 저항 값을 표시하여 표준곡선을 산출할 수 있으나 상기 농도범위는 상황에 따라 적절하게 변화시키는 것도 가능하다. 시료 테스트 시 나온 각 저항 값을 표준 저항값에 비례 대입하여 시료 내의 엔도톡신 값을 결정하게 된다. (엔도톡신 농도 단위는 EU로 표시; Endotoxin unit)

한편, 본 발명에서 모든 기준은 시간이며 일정 시간(바람직하게는 25분)동안 측정된 시료의 저항값을 표준 시료의 저항 값과 (표준곡선) 비교하여 산출하게 된다. 구체적으로 측정된 단위시간당 저항 값의 변화량을 표준 저항 값에 대입하여 각 시간별 저항 값의 표준편차를 구하여 그 오차범위가 10% 이하일 경우 표준 저항값의 엔도톡신 농도를 그 시료의 엔도톡신 농도로 결정한다. 보다 구체적으로 매 분에 따른 표준 농도의 저항값 - 측정하고자 하는 샘플의 저항값을 각각 비교하여 각각의 표준편차를 산출한다. 각각의 표준편차에 따른 평균 (표준편차평균)이 10 % 내외일 경우 측정하고자 하는 샘플의 엔도톡신 농도는 표준 농도 값을 수렴하게 된다

상술한 원리를 적용한 본 발명의 엔도톡신의 검출방법은, 1) 엔도톡신이 포함된 시료의 저항값을 측정하는 단계 2) 상기 엔도톡신과 LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 시약을 반응시키는 단계 및 3) 반응 후의 상기 엔도톡신이 포함된 시료의 저항값을 측정하는 단계를 포함한다.

먼저, 상기 1) 단계 이전에 바람직하게는 알려진 농도의 엔도톡신을 포함하고 있는 대조 표준 엔도톡신 시료와 LAL 시약을 반응시켜 상기 대조 표준 엔도톡신 시료의 저항값의 단위시간당 저항값의 변화량의 관계를 통해 표준곡선을 작성하는 과정을 더 포함할 수 있다.

구체적으로 표준곡선이 미리 작성된 경우라면 별도의 표준곡선의 산출과정을 거치지 않고 작업을 수행할 수 있지만, 표준곡선이 작성되지 않은 경우라면 대조 표준 엔도톡신 시료의 표준곡선을 작성하며, 바람직하게는 각각의 농도별로 대조 표준 엔도톡신 시료의 표준곡선을 다수개를 작성하는 것이 유리하며, 바람직하게는 최소유효측정값은 0.5 EU/mL이며 표준곡선 산출은 민감도 증가의 3배수의 3개를 (0.5 EU/mL; 1.5 EU/mL; 4.5 EU/mL) 기준으로 삼을 수 있다.

다음, 1) 단계로서 엔도톡신이 포함된 시료의 저항값을 측정한다. 엔도톡신의 경우 그 자체로서 저항값이 매우 높은데 엔도톡신 자체의 저항 값은 전기가 거의 통하지 않을 정도로 높으며, 엔도톡신과 LAL 시약이 반응할 경우 엔도톡신의 저항값을 측정할 수 있게 된다. 이 때 엔도톡신의 농도에 따라서 저항 값의 변화가 발생하게 된다. 상기 저항값의 측정은 일정한 전압을 인가한 후 측정할 수 있는데 이 때 인가되는 전압은 직류 1 ~ 3V를 인가할 수 있으며, 상기 저항값은 통상의 저항측정기를 통해 측정이 가능하나, 바람직하게는 전기계측기 또는 휘트스톤 브릿지를 이용하여 측정할 수 있다.

한편 본 발명의 엔도톡신이 포함된 시료는 바람직하게는 10 ~ 50㎕을 투입하므로 극소량의 시료만으로 엔도톡신의 농도를 검출할 수 있다.

다음, 2) 단계로서 상기 엔도톡신이 포함된 시료와 LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 시약을 반응시켜 겔화반응을 유도한다. 본 발명에 사용되는 LAL 시약은 통상의 엔도톡신을 검출하는데 사용되는 것으로서, 바람직하게는 LAL 시약외에도 마그네슘 이온, 나트륨 이온 및 pH버퍼를 포함하는 LAL 시약키트를 사용하는 것이 저항값의 변화량을 정확하게 계량화하는데 유리하다. 한편 LAL 시약은 바람직하게는 10 ~ 50㎕로서 투입되는 시료양과 동일한 양을 사용할 수 있다.

다음, 3)단계로서 반응 후의 상기 엔도톡신이 포함된 시료의 저항값을 측정한다. 상기 엔도톡신이 포함된 시료와 LAL 시약을 반응시키면 겔화반응이 발생하고 LAL 시약에 포함된 나트륨 및 마그네슘 이온들의 농도변화를 일으켜 최초 시료의 저항값에 비하여 저항값이 매우 낮아지게 된다. 이 때 소정의 저항값에 도달하는 시간 및 저항값의 변화량을 통해 엔도톡신을 정량적으로 산출하고 측정된 시간 및 저항값의 변화량을 이미 작성된 표준곡선에 대입하여 엔도톡신의 함량을 최종적으로 산출할 수 있는 것이다.

측정시간은 엔도톡신의 반응시간이 대략 25분이 소요되는 것을 고려하여 바람직하게는 매 5 ~ 15초씩 총 20 ~ 30분간 측정할 수 있으며, 가장 바람직하게는 매 10초씩 총 25분간 측정할 수 있다.

결국, 본 발명의 엔도톡신의 검출방법은 엔도톡신을 포함하는 시료가 LAL 시약과 반응하는 경우 시료의 농도에 따라 단위시간당 저항값의 변화량이 달라진다는 점을 착안한 것으로서, 전기적 변화량의 측정을 통해 농도의 산출이 가능하므로 색법이나 비탁법에 비하여 매우 적은양의 시료만으로 엔도톡신의 농도를 민감하게 검출해 낼 수 있고 간단한 저항측정기만 구비하면 족하므로 고가의 측정장비가 필요없어 매우 작은 크기의 마이크로 칩 내지 랩온어필름칩에 충분히 적용될 수 있다.

상술한 엔도톡신의 검출방법을 수행하기 위한 바람직한 엔도톡신 검출기를 첨부된 도 1을 중심으로 설명하면 다음과 같다. 먼저 도 1은 본 발명의 바람직한 엔도톡신 검출기의 분해사시도로서, 구체적으로 엔도톡신을 검출하기 위한 하나 이상의 미세전극(11)이 증착된 하부필름(10) 및 상기 하부필름 상에 위치하며, 엔도톡신이 포함된 시료가 흐를 수 있도록 유로가 형성된 유로필름(20)을 포함하되, 상기 유로필름의 유로가 상기 미세전극에 대응하는 위치상에 형성된다. 또한 상기 하부필름(10) 및 유로필름(20)을 덮기 위하여 상부필름(30)이 더 구비될 수 있으며, 상기 엔도톡신 검출기는 바람직하게는 마이크로 칩 형태일 수 있으며, 상기 마이크로 칩은 랩온어 필름칩(Lap on a film chip)인 것이 대량생산 및 검출의 편의를 위해 유리하다.

먼저 하부필름(10)에 대하여 설명한다.

하부필름(10)은 미세전극(11)이 증착되고 절연성이 우수한 플라스틱 재질로 구성되며 사용될 수 있는 플라스틱은 통상의 마이크로 필름 칩에 사용될 수 있는 것이면 종류의 제한이 없으나, 바람직하게는 COC(cyclo olefin copolymer), PMMA(polymethylmethacrylate), PC(polycarbonate), COP(cyclo olefin polymer), LCP (liquid Crystalline Polymers), PDMS(polydimethylsiloxane), PA(polyamide), PE(polyethylene), PI(polyimide), PP(polypropylene), PPE(polyphenylene ether), PS(polystyrene), POM(polyoxymethylene), PEEK(polyetheretherketone), PES(polyethylenephthalate), PET(polyethylenephthalate), PTFE(polytetrafluoroethylene), PVC(polyvinylchloride), PVDF(polyvinylidene

fluoride), PBT(polybutyleneterephthalate), FEP(fluorinated ethylenepropylene) 및 PFA(perfluoralkoxyalkane) 중 적어도 하나의 물질을 포함한 다양한 폴리머 등으로 형성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 고온 및 내화학성에 우수한 PI를 사용한다.

또한, 이러한 플라스틱 필름은 사출성형(Injection Molding), 압출 성형(Etrusion molding), 핫엠보싱(Hot Embossing), 캐스팅(Casting), 광성형(Stereolithography), 레이저 어블레이션(Laser Ablation), 쾌속조형(Rapid Prototyping), 실크스크린뿐만 아니라, NC(Numerical Control) 머시닝과 같은 전통적인 기계가공법을 이용하여 제작될 수 있다.

하부필름(10)은 통상의 랩온어필름에서 사용되는 하부필름과 동일한 정도의 두께를 가지면 족하며, 바람직하게는 50~400um의 두께를 가진다.

한편, 하부필름(10)에는 엔도톡신의 전기적 변화를 측정할 수 있는 센서부분에 해당하는 미세전극(11)이 적어도 하나 이상 증착되며 상기 미세전극은 통상의 센서에 사용되는 물질이면 사용가능하며 바람직하게는 Ti-Au 전극 또는 카본전극을 사용할 수 있다. 미세전극(11)은 후술하는 유로필름(20)의 유로에 대응하는 위치 바람직하게는 유로 중 검출챔버에 대응하는 위치에 형성되며 후술하는 유로필름(20) 부분에서 보다 상세히 설명한다.

상부필름(30)은 유로필름(20)의 상부에 위치하여 덮개 역할을 수행하며 그 재질은 테프론, 폴리이미드 등과 같은 폴리머 계열을 사용할 수 있으며, 그 두께는 바람직하게는 300 ~ 500 ㎛이다. 한편, 모세관 현상에 의해 시료가 주입되고 흐를 수 있도록 상기 상부필름(30)공기 배출구(미도시)가 포함될 수 있다.

다음, 본 유로필름(20)을 설명한다.

도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 엔도톡신 검출기의 평면도를 유로필름을 중심으로 도시한 것이다. 도 2는 도시한 바와 같이, 시료가 흐를 수 있도록 하나의 긴 유로가 형성되어 있으며, 상기 유로는 말단에 형성된 시료가 주입되는 시료주입부(41), 상기 시료주입부(41)와 연통되고 LAL 시약과 반응이 일어나는 반응챔버(42), 상기 반응챔버(42)와 연통되고 주입된 시료의 저항값의 변화량을 측정하는 미세전극(46, 47)이 구비된 검출챔버(43), 상기 검출챔버(43)와 연통되고 시료가 배출되는 시료배출부(45)를 포함한다.

먼저, 시료주입부(41)는 엔도톡신을 포함한 시료가 주입되는 부분으로서 시료의 주입을 용이하게 하기 위하여 시료주입튜브(미도시)가 더 장착될 수 있다.

상기 시료주입부(41)는 반응챔버(42)와 연통되는데, 상기 반응챔버(42)에는 LAL 시약을 구비하여 주입된 시료와의 반응이 유도된다.

반응챔버(42) 내에서 주입된 시료와 LAL 시약의 겔화반응이 반응이 일어난 후 상기 시료는 상기 반응챔버(42)와 연통된 검출챔버(43)로 이동하며 검출챔버(43)내에 구비된 미세전극(46, 47)을 통해 저항값의 변화가 측정된다. 상기 미세전극(46, 47)은 바람직하게는 하나 이상이 형성되며, 상기 하나 이상의 미세전극(46, 47)은 바람직하게는 양극(46) 및 상기 양극(46)과 이격된 음극(47)으로 구성되며 상기 양극과 음극은 마주보는 위치에 형성된다.

이 때, 상기 미세전극(46, 47)은 도 2에 도시된 바와 같이 상기 검출챔버(43) 내에서 일렬로 배열될 수 있으며, 상기 도 2의 확대도에서 볼 수 있듯이, 양극(46)과 음극(47)을 요철형으로 형성하여 시료와의 접촉면적을 증대시켜 민감도를 향상시킬 수 있다.

상기 미세전극(46, 57)은 외부의 전원과 연결되는 전극패드(45)에 양극 및 음극별로 연결되며 상기 미세전극(46, 57) 및 전극패드(45)는 하부필름에 증착되어 있다.

한편, 유로는 하나 이상이 형성되며 바람직하게는 복수개가 형성될 수 있다. 이 경우 대조군(이미 농도를 알고 있는 엔도톡신으로서 표준곡선 작성)과 실험군(알고자 하는 엔도톡신의 농도)을 동시에 수행할 수 있고, 실험군 또는 대조군의 수를 원하는 대로 조절하여 동시에 검출반응을 수행할 수 있는 장점이 있다.

상기 유로필름의 재질은 통상의 유로가 형성된 마이크로 필름의 재질과 동일하며 바람직하게는 드라이 필름 레지스트로서 감광성 계열의 필름을 사용 할 수 있으며, 그 두께는 바람직하게는 0.01 ~ 0.35 ㎛이다.

형성되는 유로의 구조는 용도에 따라 변형이 가능한 바, 본 발명에 따른 검출기의 유로 폭 및 높이는 각각 바람직하게는 0.1mm ~ 10mm와 0.01mm ~ 0.35mm의 범위에서, 유로의 길이는 10mm ~ 100mm의 범위 내에서 용도에 따라 유로의 폭 및 길이를 변화시킬 수 있다.

한편, 유로를 형성하는 방법은 통상의 유로필름에서 유로를 형성하는 공정을 통해 제조될 수 있으며, 바람직하게는 천공기를 통해 유로 부분을 절삭하거나 스탬퍼를 이용하는 방법이 있고, 스탬퍼 방법의 경우 핫 엠보싱 방법과 UV 엠보싱 방법을 사용할 수 있다.

도 3은 본 발명의 다른 실시예에 의한 엔도톡신 검출기의 평면도로서, 도 2와 다른 부분을 중심으로 설명하면 별도의 반응챔버가 존재하지 않고 검출챔버(52)에서 반응이 수행된다. 즉 시료투입부(51)를 통해 투입된 엔도톡신이 포함된 시료는 이와 연통된 검출챔버(52)로 이동하며, 상기 검출챔버(52)에는 LAL 시약이 구비되어 투입된 시료와 반응이 일어난다. 한편, 별도의 반응챔버가 구비되지 않으므로 미세전극(55)은 시료와의 접촉면을 확대시켜 민감성을 향상시키기 위하여 도 3의 확대도에 도시된 바와 같이 양극과 음극이 방사형으로 형성될 수 있다.

도 4는 상기 도 2의 확대도의 A-A' 부분에 대한 단면도로서 양극(62)과 음극(61)이 적절하게 이격되어 있다. 상기 양극과 음극은 바람직하게는 10 ~ 30 ㎛의 이격거리를 가지며, 상기 미세전극의 두께는 바람직하게는 0.1 ~ 1 ㎛이다.

상술한 하부필름, 유로필름 및 상부필름은 통상의 마이크로 칩의 제조하는 일반적인 반도체 공정(포토리소그래피) 등을 통해 제작될 수 있으며, 이들의 필름간의 접착 역시 통상의 초음파접착, 열접착 또는 접착수단을 통한 접착을 통해 일체화시킬 수 있다. 하부 및 상부 구조체(400)의 접합에 있어서 반드시 고려해야 할 사항 중 하나가 주입된 용액이 외부로 빠져나오거나 또는 이미 형성된 유로(microchannel)를 통하지 않은 채 미세한 틈새나 공극을 통해 다른 곳으로 흘러들어가지 않도록 유로와 반응 챔버 주위로의 완벽하게 밀봉하는 접합이 이루어져야 한다는 것이다.

접합 방법은 위에서 예시한 것 외에, 하부 및 상부 구조체를 클립형태의 부가적인 구조물을 이용하여 강제적으로 체결하거나 하부 및 상부 구조체 중 하나에 양각 모양의 홈을 만들고 나머지 하나에 음각 모양의 홈을 만들어 끼우는 방법으로 두 기판을 접합할 수 있다. 위와 같이 클립 또는 홈을 이용한 접합의 경우에는 미세한 틈새가 발생하지 않도록 접촉면에 탄성을 가진 폴리머 층을 덧댈 수도 있다.

도 5는 본 발명의 엔도톡신 검출기의 사용상태도이다.

구체적으로 전원(80)과 전극패드(72)가 탐침(81)에 의해 연결되고, 상기 전원(80)에서 일정한 전압이 인가된 후, 시료주입튜브(71)을 통해 엔도톡신 검출기(70)에 시료를 주입하면 상술한 반응을 거쳐 저항값의 변화가 발생하며 이를 전극패드(72)와 연결된 저항측정기(90)를 통해 단위시간당 저항값의 변화를 측정한다. 그 뒤 컴퓨터(100) 등을 통해 표준곡선에 상기 단위시간당 저항값의 변화값을 대입하여 최종적인 엔도톡신의 농도를 산출해 낼 수 있다.

본 발명은 또한 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체에 컴퓨터가 읽을 수 있는 코드로서 구현하는 것이 가능하다. 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록매체는 컴퓨터 시스템에 의하여 읽혀질 수 있는 데이터가 저장되는 모든 종류의 기록장치를 포함한다. 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록매체의 예로는 ROM, RAM, CD ROM, 자기테이프, 플로피디스크 및 광데이터 저장장치 등이 있으며, 또한 캐리어 웨이브(예를 들어 인터넷을 통한 전송)의 형태로 구현되는 것도 포함한다. 또한, 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록매체는 네트워크로 연결된 컴퓨터 시스템에 분산되어, 분산방식으로 컴퓨터가 읽을 수 있는 코드로 저장되고 실행될 수 있다.

한편, 엔도톡신을 시료투입부에 넣은 후 시료배출구까지 모세관 원리로 (capilliary fore)흘러가며 반응 챔버와 검출 챔버에서 시료의 속도를 줄여서 원할한 반응과 검출이 이루어지도록 설계되나 이에 한정되지 않고 시료투입부와 시료배출구 사이에 경사를 두어 시료가 자연스럽게 흘러갈 수 있도록 설계하는 것도 가능하다.

본 발명에 따라 엔도톡신 검출기를 제작하고 이를 통해 엔도톡신을 검출하는 경우 통상의 검출방법에 비하여 매우 적은양의 시료를 가지고 매우 짧은 시간안에 농도를 정밀하게 산출해낼 수 있다.

또한, 비색법을 마이크로 칩에 적용한 경우에는 부피도 크고 고가인 엘리사 측정장치가 반드시 필요하여 측정장소에 제약이 있지만, 본 발명은 간단한 저항측정기 및 컴퓨터만 있으면 작업을 수행할 수 있으므로 검출비용이 매우 저렴할 뿐 아니라 휴대성이 극대화되는 장점이 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하나, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 엔도톡신 검출기의 제작

통상의 랩온어칩의 제조공정을 통해 도 2에서 도시한 LSL 시약이 포함된 엔도톡신 검출기를 제조하였다. 상기 검출기는 길이는 11,08mm, 폭은 1mm, 유로의 폭은 0.2~1mm, 길이는 11.01mm, 깊이는 0.01~0.35mm이다.

실시예 2 : 표준농도곡선의 산출

엔도톡신 농도가 4.5EU/ml, 1.5EU/ml, 0.5EU/ml가 각각 포함된 표준시료(용매 : )를 30 ㎕준비하고 이를 실시예 1에서 제작한 엔도톡신 검출기에 각각 투입하였다. 그 뒤 2V의 전압을 인가한 후 각각의 표준시료에 대하여 매 10초간 전체 25 분 동안 5회 저항값을 측정하여 그 평균값을 구하여 표준농도곡선을 산출하여 이를 도 6a ~ 6c에 도시하였다.

실시예 3 : 농도를 알고자 하는 시료의 엔도톡신의 저항값 측정

농도를 알고자 하는 엔도톡신이 포함된 시료를 30 ㎕를 준비하고 이를 실시예 1에서 제작한 엔도톡신 검출기에 각각 투입하였다. 그 뒤 2V의 전압을 인가한 후 각각의 표준시료에 대하여 매 10초간 전체 25분동안 저항값을 대입하여 시간에 따른 저항값의 변화량의 그래프로 산출하여 도 7에 도시하였다.

실시예 4 : 엔도톡신의 농도산출

상기 실시예 3에서 산출된 시간에 따른 저항값의 변화량을 실시예 2에서 작성된 표준곡선에 대입하여 엔도톡신의 농도를 측정하며, 구체적으로 측정된 단위시간당 저항 값의 변화량을 표준 저항 값에 대입하여 각 시간별 저항 값의 표준편차를 구하여 그 오차범위가 10% 이하일 경우 표준 저항값의 엔도톡신 농도를 그 시료의 엔도톡신 농도로 결정한다.

보다 구체적으로 매 분에 따른 표준 농도의 저항값 - 측정하고자 하는 샘플의 저항값을 각각 비교하여 각각의 표준편차를 산출한다. 각각의 표준편차에 따른 평균 (표준편차평균)이 10 % 내외일 경우 측정하고자 하는 샘플의 엔도톡신 농도는 표준 농도 값을 수렴하게 된다

한편, 하기 표 1은 상기 실시예 3의 시료의 단위시간당 저항값 및 표준편차 로서 이를 통해 시료의 엔도톡신의 농도가 0.5EU/ml과 근접함을 확인할 수 있다. 따라서, 실시예 3의 엔도톡신의 농도는 0.5EU/ml로 결정할 수 있다.

[표 1]

Time (min)	0.5 EU/mL 저항값 (kohm)	실시예 3의 시료 저항값 (kohm)	표준편차 (STDEV)
1	1322	1330	5.65
2	1326	1335	6.36
3	1337	1345	5.65
4	1335	1347	8.48
5	1338	1348	7.07
6	1340	1351	7.77
7	1349	1358	6.36
8	1364	1371	4.94
9	1399	1405	4.24
10	1472	1481	6.36
11	1811	1821	7.07
12	1837	1850	9.19
13	1846	1855	6.36
14	1852	1859	4.94
15	1859	1868	6.36
16	1860	1871	7.77
17	1867	1879	8.48
18	1868	1883	10.6
19	1868	1883	10.6
20	1868	1882	9.89
21	1869	1881	8.48
22	1870	1883	9.19
23	1868	1884	11.3
24	1868	1883	10.6
25	1868	1883	10.6
표준편차 평균값			7.77

실시예 5 : 산출된 농도 검증

산출된 농도를 검증하기 위하여 표준시약 0.5 EU/mL (도 8b의 열1)과 실시예 3의 시료(도 8b의 열2)를 FLUOStar OPTIMA 마이크로스펙트로포토메타(BMG사)를 통해 종말점 비색법으로 측정하였으며 구체적인 실험방법은 charles river laboratories 사에서 구매한 endpoint chromogenic 제품 내 실험방법(미국약전 및 대한약전을 따름)을 따랐다. 한편 도 8a, 8b는 서로 밀접한 관련이 있는 그래프로 서 구체적으로 도 8a 그래프는 엔도톡신 측정에 사용되는 표준시약의 정확도를 나타내는 표준곡선 그래프입니다. (0.15, 0.3, 0.6) 농도를 측정하여 표준시약의 농도편차를 알아보는 것이고 이 중 도 8b의 Calculated concentration B,C,D 행이 그 측정값이다. 한편 Calculated concentration F 행이 상기 표준농도시약 (0.5EU/mL)과 실시예 3의 시료샘플 두 개를 측정한 결과이다.

그 결과 0.5 EU/mL은 도 8b의 1열에서 나타난 바와 같이 실제 엔도톡신의 농도는 0.566 EU/mL이었고, 실시예 3의 시료는 0.641 EU/mL이었다. 결국 두 샘플의 측정값의 차이가 오차범위 10% 미만으로서 모두 0.5 EU/mL에 수렴한다. 따라서 본 발명의 엔도톡신 검출방법 및 검출장치는 시료의 양을 줄이고 검출시간은 단축시키면서도 정확성은 매우 우수함을 확인할 수 있다.

본 발명의 엔도토신 검출방법 및 이를 위한 검출기는 극소량의 시료에 대하여 측정이 가능하여 마이크로 필름칩에 적용할 수 있으므로 엔도톡신 테스트가 많이 요구되는 제약산업에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 엔도톡신 검출기의 분해사시도이다.

도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 엔도톡신 검출기의 평면도이다.

도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따른 엔도톡신 검출기의 분해사시도이다.

도 4는 도 2의 A-A' 부분에 대한 검출기의 단면도이다.

도 5는 본 발명의 바람직한 엔도톡신 검출기의 사용상태도이다.

도 6a 내지 6c는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 엔도톡신의 농도가 4.5EU/ml, 1.5EU/ml, 0.5EU/ml에 전압을 인가하여 저항값의 변화량을 측정한 그래프이다.

도 7은 농도를 알고자 하는 시료에 전압을 인가하여 저항값의 변화량을 측정한 그래프이다.

도 8a는 엔도톡신 측정에 사용되는 표준시약의 정확도를 나타내는 표준곡선 그래프이고, 도 8b는 표준농도 0.5EU/ml 및 농도를 알고자 하는 시료의 실제 농도를 측정한 측정값이다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

10 : 하부필름 11 : 미세전극

20 : 유로필름 30 : 상부필름

Claims

엔도톡신을 정량적으로 검출하는 방법에 있어서,

1) 엔도톡신이 포함된 시료의 저항값을 측정하는 단계;

2) 상기 시료와 LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 시약을 반응시키는 단계; 및

3) 반응 후의 상기 엔도톡신이 포함된 시료의 저항값을 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 엔도톡신의 검출방법.
제1항에 있어서,

상기 1) 단계 이전에 알려진 농도의 엔도톡신을 포함하고 있는 대조 표준 엔도톡신 시료와 LAL 시약을 반응시켜 상기 대조 표준 엔도톡신 시료의 저항값이 소정 저항값에 도달하는 시간 및 저항값의 변화량의 관계를 통해 표준곡선을 작성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 엔도톡신의 검출방법.
제1항에 있어서,

상기 3)단계 이후 단위시간당 저항값의 변화량을 통해 엔도톡신을 정량적으로 산출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 엔도톡신의 검출방법.
제3항에 있어서,

상기 단위시간당 저항값의 변화량을 상기 제2항의 표준곡선에 대입하여 엔도 톡신의 함량을 산출하는 것을 특징으로 하는 엔도톡신의 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 1)단계 및 3)단계의 저항값은 일정한 전압을 인가하여 측정하는 것을 특징으로 하는 엔도톡신의 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 저항값은 전기계측기 또는 휘트스톤 브릿지를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 엔도톡신의 검출방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 엔도톡신의 검출은 마이크로 칩상에서 수행되는 것을 특징으로 하는 엔도톡신의 검출방법.
제7항에 있어서,

상기 마이크로 칩은 랩온어 필름칩(Lap on a film chip)인 것을 특징으로 하는 엔도톡신의 검출방법.
제1항에 있어서,

상기 3)단계의 저항값의 측정은 20 ~ 30분동안 매 5 ~ 15초 간격으로 측정하는 것을 특징으로 하는 엔도톡신의 검출방법.
엔도톡신을 검출하기 위한 장치에 있어서,

엔도톡신을 검출하기 위한 하나 이상의 미세전극이 증착된 하부필름; 및

상기 하부필름 상에 위치하며, 엔도톡신이 포함된 시료가 흐를 수 있도록 유로가 형성된 유로필름을 포함하되, 상기 유로가 상기 미세전극에 대응하는 위치상에 형성되는 것을 특징으로 하는 엔도톡신 검출기.
제10항에 있어서,

상기 하부필름은 폴리이미드 필름인 것을 특징으로 하는 엔도톡신 검출기.
제10항에 있어서,

상기 하나 이상의 미세전극은 양극 및 상기 양극과 이격된 음극으로 구성되는 것을 특징으로 하는 엔도톡신 검출기.
제12항에 있어서,

상기 양극과 음극은 10 ~ 30 ㎛의 이격거리를 갖는 것을 특징으로 하는 엔도톡신 검출기.
제11항에 있어서,

상기 미세전극의 두께는 0.1 ~ 1 ㎛인 것을 특징으로 하는 엔도톡신 검출기.
제10항에 있어서,

상기 미세전극은 상기 유로를 따라 일렬로 형성된 것을 특징으로 하는 엔도톡신 검출기.
제15항에 있어서,

상기 미세전극은 양극과 음극으로 나뉘어지고 상기 양극과 음극은 마주보는 위치에 형성되는 것을 특징으로 하는 엔도톡신 검출기.
제10항에 있어서,

상기 유로는 말단에 형성된 시료주입부, 상기 시료주입부와 연통되고 LAL 시약과 반응이 일어나는 반응챔버 및 상기 반응챔버와 연통되고 주입된 시료의 단위시간당 저항값의 변화량을 측정하는 미세전극이 구비된 검출챔버를 포함하는 것을 특징으로 하는 엔도톡신 검출기.
제17항에 있어서, 상기 반응챔버와 검출챔버는 동일한 챔버인 것을 특징으로 하는 엔도톡신 검출기.
제17항에 있어서,

상기 미세전극은 외부전원의 탐침과 연결된 전극패드에 연결되되, 상기 전극패드는 상기 시료주입부의 반대면에 형성되는 것을 특징으로 하는 엔도톡신 검출 기.
제19항에 있어서, 상기 탐침은 저항측정기에 연결된 것을 특징으로 하는 엔도톡신 검출기.
제10항에 있어서,

상기 미세전극은 상기 시료와의 접촉면적을 최대화하기 위하여 방사형으로 형성되는 것을 특징으로 하는 엔도톡신 검출기.
제10항에 있어서,

상기 유로는 복수개가 형성되는 것을 특징으로 하는 엔도톡신 검출기.
제10항에 있어서, 상기 유로필름의 상부에 상부필름이 형성되는 것을 특징으로 하는 엔도톡신 검출기.
제10항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 엔도톡신 검출기는 마이크로 칩 형태인 것을 특징으로 하는 엔도톡신 검출기.
제22항에 있어서,

상기 마이크로 칩은 랩온어 필름칩(Lap on a film chip)인 것을 특징으로 하는 엔도톡신 검출기.