KR20100038967A - 지방세포 분화용 배지 조성물 - Google Patents

지방세포 분화용 배지 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20100038967A
KR20100038967A KR1020080098149A KR20080098149A KR20100038967A KR 20100038967 A KR20100038967 A KR 20100038967A KR 1020080098149 A KR1020080098149 A KR 1020080098149A KR 20080098149 A KR20080098149 A KR 20080098149A KR 20100038967 A KR20100038967 A KR 20100038967A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
adipocytes
present
composition
histamine
medium
Prior art date
Application number
KR1020080098149A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101019877B1 (ko
Inventor
조대호
방사익
송석빈
천소영
정민경
박유림
Original Assignee
숙명여자대학교산학협력단
사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 숙명여자대학교산학협력단, 사회복지법인 삼성생명공익재단 filed Critical 숙명여자대학교산학협력단
Priority to KR1020080098149A priority Critical patent/KR101019877B1/ko
Priority to PCT/KR2009/005714 priority patent/WO2010041863A2/ko
Publication of KR20100038967A publication Critical patent/KR20100038967A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101019877B1 publication Critical patent/KR101019877B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/80—Neurotransmitters; Neurohormones
    • C12N2501/82—Histamine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 지방세포 분화용 배지 조성물에 있어서, 인슐린(insulin), DHEA(dehydroepiandrosterone) 및 히스타민(histamine)을 함유하는 것을 특징으로 하는 지방세포 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용하여 지방전구세포(preadipocyte)를 지방세포(adipocyte)로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 지방세포 분화용 배지 조성물은 통상적으로 사용되는 지방세포 분화용 배지 조성물에 비해 분화된 지방세포의 분포가 고르고 분화된 지방세포가 안정적으로 고정될 수 있도록 하여 생존율을 극대화할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명의 지방세포 분화용 배지 조성물에 사용되는 DHEA(dehydroepiandrosterone) 및 히스타민(histamine)은 종래 사용되던 덱사메타손(dexamethasone) 및 아이소부틸메틸젠틴(isobutylmethylxanthine)에 비하여 가격이 저렴하므로 경제적인 장점이 있다.
지방세포, 분화, 배지, 조성물

Description

지방세포 분화용 배지 조성물{Composition of medium for differentiation of adipocyte}
본 발명은 지방세포 분화용 배지 조성물에 있어서, 인슐린(insulin), DHEA(dehydroepiandrosterone) 및 히스타민(histamine)을 함유하는 것을 특징으로 하는 지방세포 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용하여 지방전구세포(preadipocyte)를 지방세포(adipocyte)로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
현재 성체줄기세포(adult stem cell)를 특정세포로 분화시켜 활용하고자 하는 움직임이 전 세계적으로 활발히 이루어지고 있다. 이는 상기 성체줄기세포가 의학적으로 이용하기에 안전하기 때문이며, 구체적으로 상기 성체줄기세포는 장기 재생을 위해 체내에 이식해도 문제가 없으며, 주변 조직의 특성에 자신을 맞추어 분화하는 조직 특이적 분화능력이 있다. 또한 신체조직에 어떤 손상이 발생하면 다른 장기에 있던 줄기세포가 몰려와서 손상된 조직으로 변하는 분화의 유연성이 있으며, 주입된 체내에서 자가 재생산을 할 수 있는 특징이 있다. 또한 성인의 체내에 있기 때문에 자기 자신의 세포를 자가 이식할 수 있다는 점에서 면역거부반응이 발생하지 않을 수 있다. 이러한 점에서 성체줄기세포는 거의 모든 종류의 난치병 해 결에 도움이 될 것으로 보고 있다.
상기 성체줄기세포 중 하나인 지방전구세포 또한 상기와 같은 이점을 가지고 있으며 분화유도에 따라 지방세포, 연골세포, 골육세포, 신경세포, 상피세포로 분화되는 것으로 알려져 있다. 특히 지방전구세포(Preadipocyte)를 이용하여 지방세포(adipocyte)로 분화시키는 방법은 분화된 지방세포를 성형 재료로 이용할 수 있다는 장점이 있다. 특히 상기 방법은 종래 지방만을 분리하여 주입하는 성형방법에 비하여 생착 기간과 생착율이 높은 장점을 가지고 있다. 따라서 지방전구세포로부터 지방세포를 효과적으로 분화시키는 방법에 대한 연구가 절실한 실정이다.
종래 지방전구세포로부터 지방세포를 분화시키기 위해, 주로 인슐린(insulin), 덱사메타손(dexamethasone), 아이소부틸메틸젠틴(isobutylmethylxanthine)등을 함유하는 지방세포 분화용 배지 조성물을 주로 사용하였다(The Journal of Biological chemistry, 2001, 276(30),28430-28435; 한국특허공개번호:2004-0082068). 그러나 상기 성분들은 비교적 고가(高價)이고(Methods Mol. Biol., 2001(155);239-47), 지방세포의 형태를 급격하게 변화시키며, 이 뿐만 아니라 생장정지(growth arrest) 현상, 클론 확장(clonal expansion) 현상, 분화 관련 유전자 변화 및 지질의 저장량 변화를 초래하는 것으로 알려져 있다(Exp. Biol. Med., (Maywood). 2001.12;226(11):997-1002). 또한 분화된 지용성의 지방세포가 수용성인 배지 속에서 자라면서 세포내 지방 축척율이 증대되게 되고 그로 인해 지방세포가 배지 위로 부유함으로써 지방세포가 안정성을 잃어 손상 되기 때문인 것으로 알려져 있다(J. Lipid Res., 1995 Apr;36(4):868-75.)
이에 본 발명자들은 지방세포 분화용 배지 조성물에 있어서, 인슐린(insulin), DHEA(dehydroepiandrosterone) 및 히스타민(histamine)을 함유하는 것을 특징으로 하는 지방세포 분화용 배지 조성물을 제조하고, 이를 이용하는 경우 지방전구세포에서 지방세포로의 분화가 촉진되고 분화된 지방세포의 분포가 고르고 분화된 지방세포가 안정적으로 고정되어 있어 생존율이 월등히 높아짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 지방세포 분화용 배지 조성물에 있어서, 인슐린(insulin), DHEA(dehydroepiandrosterone) 및 히스타민(histamine)을 함유하는 것을 특징으로 하는 지방세포 분화용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 배지 조성물을 이용하여 지방전구세포(preadipocyte)를 지방세포(adipocyte)로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지방세포 분화용 배지 조성물에 있어서, 인슐린(insulin), DHEA(dehydroepiandrosterone) 및 히스타민(histamine)을 함유하는 것을 특징으로 하는 지방세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 배지 조성물을 이용하여 지방전구세포(preadipocyte)를 지방세포(adipocyte)로 분화시키는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 지방세포 분화용 배지 조성물은 지방세포 분화용 배지 조성물에 있어서, 인슐린(insulin), DHEA(dehydroepiandrosterone) 및 히스타민(histamine)을 함유하는 것을 특징으로 한다.
상기 지방세포 분화용 배지 조성물은 지방전구세포(preadipocyte)를 지방을 함유하고 있는 성숙한 지방세포(adipocyte)로 분화하는데 사용되는 배지 조성물을 말한다.
본 발명의 지방세포 분화용 배지 조성물은 인슐린(insulin), DHEA(dehydroepiandrosterone) 및 히스타민(histamine)을 함유하는 것을 특징으로 한다.
상기 DHEA(dehydroepiandrosterone) 및 히스타민(histamine)은 지방세포 분화용 배지 조성물로 전혀 사용된 적이 없는 물질로써, 상기 DHEA(dehydroepiandrosterone)는 부신에서 생성되는 스테로이드계 호르몬의 한 종류로 콜레스테롤로부터 만들어지는 것으로 알려져 있다. 또한 상기 히스타민(histamine)은 체내에서 히스티딘 탈탄산효소가 아미노산인 히스티딘에 작용해 히스타민이 생성되는 것으로 알려져 있다. 또한 히스타민은 주로 비만세포 내에 커다란 과립형태로 저장되며 이물질에 의한 상처나 이들의 침입에 대한 신체의 방어반응에 중요한 역할을 하는 것으로도 알려져 있다. 그러나 상기 DHEA(dehydroepiandrosterone) 및 히스타민(histamine)이 지방세포 분화에 구체적으로 어떠한 역할을 하는지는 전혀 알려진 바가 없다.
특히 종래 지방세포 분화용 배지 조성물은 주로 인슐린(insulin), 덱사메타손(dexamethasone), 아이소부틸메틸젠틴(isobutylmethylxanthine)을 혼합하여 사용하였으나 본 발명의 지방세포 분화용 배지 조성물은 인슐린(insulin), DHEA(dehydroepiandrosterone) 및 히스타민(histamine)을 혼합하여 사용한다는 점에서 차이가 있다.
또한 본 발명의 지방세포 분화용 배지 조성물은 상기 인슐린(insulin), DHEA(dehydroepiandrosterone) 및 히스타민(histamine)에 인도메타신(indomethacin), 바이오틴(biotin) 및 펜토시네이트(panthothenate)를 추가적으로 함유할 수 있다. 또한 필요한 경우 당업자에게 공지된 배지 조성 성분을 추가적으로 함유할 수 있다.
상기 본 발명의 지방세포 분화용 배지 조성물이 인슐린(insulin), DHEA(dehydroepiandrosterone), 히스타민(histamine), 인도메타신(indomethacin), 바이오틴(biotin) 및 펜토시네이트(panthothenate)를 함유하는 것은, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 인슐린(insulin)이 0.1~10ug/㎖, DHEA(dehydroepiandrosterone)가 0.01~10uM, 히스타민(histamine)이 1~10uM, 인도메타신(indomethacin)이 0.1~10mM, 바이오틴(biotin)이 20~40uM 및 펜토시네이트(panthothenate)가 10~30uM로 함유하는 것을 말한다. 가장 바람직하게는 인슐린(insulin)이 1ug/㎖, DHEA(dehydroepiandrosterone)가 1uM, 히스타민(histamine) 이 7uM, 인도메타신(indomethacin)이 0.2mM, 바이오틴(biotin)이 33uM 및 펜토시네이트(panthothenate)가 17uM로 함유할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 지방세포 분화용 배지 조성물이 인슐린(insulin)이 1ug/㎖, DHEA(dehydroepiandrosterone)가 1uM, 히스타민(histamine)이 7uM, 인도메타신(indomethacin)이 0.2mM, 바이오틴(biotin)이 33uM 및 펜토시네이트(panthothenate)가 17uM로 함유하도록 제조하였다. 한편 대조군으로 통상적으로 사용되는 지방세포 분화용 배지 조성물을 인슐린(insulin)이 1ug/ml, 덱사메타손(dexamethasone)이 1uM, 아이소부틸메틸젠틴(isobutylmethylxanthine)이 0.5mM, 인도메타신(indomethacin)이 0.2mM, 바이오틴(biotin)이 33uM, 펜토시네이트(panthothenate)가 17uM이 함유하도록 제조하였다(<실시예 1> 참조).
상기와 같이 제조된 본 발명의 지방세포 분화용 배지 조성물을 이용하여 <참조예 1>에서 배양된 지방전구세포를 지방세포로 분화하도록 유도하였다.
상기 본 발명의 지방세포 분화용 배지 조성물을 이용하여 분화된 지방세포의 형태를 관찰한 결과, 상기 대조군보다 분화된 지방세포의 분포가 고르고 안정적으로 고정되어 있음을 알 수 있었다(<실험예 1-1> 참조). 또한 본 발명의 배지 조성물에서 분화된 지방세포의 생존율이 모든 측정 기간 동안 대조군에 비하여 월등히 높음을 알 수 있었다(<실험예 1-2> 참조). 한편 본 발명의 배지 조성물에서 글루코오스 흡수량이 대조군에 비하여 월등히 높음을 알 수 있었는데, 이는 지방세포가 글루코오스를 흡수하여 지방으로 전환하는 기능을 하므로 글루코오스의 흡수량이 클수록 그만큼 많은 지방세포가 분화되었음을 알 수 있었다(<실험예 1-3> 참조). 또한 본 발명의 배지 조성물에서 지방 생성량이 대조군에 비하여 높았으며 특히 초기 생성량이 월등히 높아 지방세포 분화가 잘 유도됨을 알 수 있었다(<실험예 1-4> 참조).
따라서 본 발명의 지방세포 분화용 배지 조성물은 통상적으로 사용되는 지방세포 분화용 배지 조성물에 비해 분화된 지방세포의 분포가 고르고 분화된 지방세포가 안정적으로 고정될 수 있도록 하여 생존율을 극대화할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명의 지방세포 분화용 배지 조성물에 사용되는 DHEA(dehydroepiandrosterone) 및 히스타민(histamine)은 종래 사용되던 덱사메타손(dexamethasone) 및 아이소부틸메틸젠틴(isobutylmethylxanthine)에 비하여 가격이 저렴하므로 경제적인 장점이 있다.
한편 본 발명의 지방전구세포(preadipocyte)를 지방세포(adipocyte)로 분화시키는 방법은 상기 본 발명의 배지 조성물을 이용하는 것을 특징으로 한다.
상기 지방전구세포는 공지된 방법에 따라 성체줄기세포로부터 분리하여 사용할 수 있으나 시판되는 제품을 구입하여 사용할 수 있다. 또한 필요한 경우 상기 지방전구세포를 통상적인 배양방법에 따라 배양하여 사용할 수 있으며 이에 한정되지 않지만 지방전구세포를 배양 배지에 접종하고 30~45°C, CO2 1~10% 에서 배양하여 사용할 수 있다. 상기 지방전구세포를 배양하기 위한 배지로는 이에 한정되지 않지만 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), MEM(Minimum Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), α-MEM, RPMI 1640 배지 등을 사용할 수 있으며 이에 첨가하는 혈청의 종류는 우아혈청(BCS, Bovine calf serum) 또는 우태아혈청(FBS, Fetal bovine serum) 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 지방전구세포를 10%의 우아혈청(BCS: bovine calf serum)이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 37°C, CO2 5%에서 배양하여 사용하였다(<참조예 1> 참조).
상기 배양된 지방전구세포(preadipocyte)를 지방세포(adipocyte)로 분화시키는 것은 상기 지방전구세포를 본 발명의 지방세포 분화용 배지 조성물이 함유된 배지에 접종하고 당업자에게 공지된 방법에 따라 분화시키는 것을 말한다. 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 지방전구세포를 본 발명의 배지 조성물에 직접 접종하거나 지방전구세포가 배양된 배지에 본 발명의 배지 조성물을 첨가하여 30~45°C, CO2 1~10%에서 배양함으로써 분화를 유도할 수 있다. 또한 상기 분화를 유도한 다음, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 인슐린(insulin), 바이오틴(Biotin), 인도메타신(Indomethacin) 및 펜토시네이트(Panthothenate)로 구성된 조성물을 추가적으로 첨가할 수 있고 또한 세포 분화 또는 증식에 이용되는 우아혈청(BCS, Bovine calf serum) 또는 우태아혈청(FBS, Fetal bovine serum)을 선택하거나 조합하여 추가적으로 첨가할 수도 있으며, 가장 바람직하게는 우아혈청(BCS, Bovine calf serum)을 먼저 첨가한 다음 우태아혈청(FBS, Fetal bovine serum)을 추가적으로 첨가할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 배지 면적대비 지방전구세포의 분포도가 95%이상일 때 분화가 유도되기 시작하였으며 이때 37℃에서 이산화탄소 농도가 5.0± 0.5 %가 되도록 유지하고, 상기 분화를 유도한지 2일이 지난 후 이틀에 한번 1㎍/㎖의 인슐린(insulin), 바이오틴(Biotin), 인도메타신(Indomethacin) 및 펜토시네이트(Panthothenate)만을 함유한 배지를 추가적으로 공급하였다.
본 발명의 지방세포 분화용 배지 조성물은 통상적으로 사용되는 지방세포 분화용 배지 조성물에 비해 분화된 지방세포의 분포가 고르고 분화된 지방세포가 안정적으로 고정될 수 있도록 하여 생존율을 극대화할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명의 지방세포 분화용 배지 조성물에 사용되는 DHEA(dehydroepiandrosterone) 및 히스타민(histamine)은 종래 사용되던 덱사메타손(dexamethasone) 및 아이소부틸메틸젠틴(isobutylmethylxanthine)에 비하여 가격이 저렴하므로 경제적인 장점이 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<참조예 1>
세포 배양
마우스 배아 섬유아세포로(mouse embryo fibroblast)써 지방전구세포(3T3-L1)를 ATCC사(catalog no: CL-173)에서 구입하였다. 상기 세포를 10%의 우아혈청(BCS: bovine calf serum)이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 37°C, CO2 5%하에서 배양하였으며 3일마다 계대 배양을 실시하였다.
<실시예 1>
본 발명의 배지 조성물을 이용한 지방전구세포의 지방세포로의 분화 유도
먼저 지방전구세포를 지방세포로 분화시키기 위해, 하기 표 1과 같이 본 발명의 배지 조성물을 제조하였다.
본 발명의 배지 조성물의 조성
조성물 함유량
인슐린(Insulin) 1㎍/㎖
DHEA(dehydroepiandrosterone) 1uM
히스타민(Histamine) 7uM
인도메타신(Indomethacin) 0.2mM
바이오틴(Biotin) 33uM
펜토시네이트(Panthothenate) 17uM
상기와 같이 제조된 본 발명의 배지 조성물을 이용하여 상기 <참조예 1>에서 배양된 지방전구세포를 지방세포로의 분화를 유도하였다. 즉 배지 면적대비 지방전구세의 분포도가 95%이상일 때 분화가 유도되기 시작하였으며 이때 37℃에서 이산화탄소 농도가 5.0± 0.5 %가 되도록 유지하였다. 상기 분화를 유도한지 2일이 지난 후 이틀에 한번 1㎍/㎖의 인슐린(insulin), 바이오틴(Biotin), 인도메타신(Indomethacin) 및 펜토시네이트(Panthothenate)만을 함유한 배지를 추가적으로 공급하였다.
한편 대조군으로 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 유도하기 위하여, 통상적으로 사용되는 배지 조성물(The Journal of Biological chemistry 2001, 276(30);28430-28435)을 하기 표 2와 같이 제조하였다.
대조군의 조성
조성물 함유량
인슐린(Insulin) 1ug/ml
덱사메타손(Dexamethasone) 1uM
아이소부틸메틸젠틴(isobutylmethylxanthine) 0.5mM
인도메타신(Indomethacin) 0.2mM
바이오틴(Biotin) 33uM
펜토시네이트(Panthothenate) 17uM
상기와 같이 제조된 대조군을 이용하여 상기 <참조예 1>에서 배양된 지방전구세포를 상기와 동일한 조건에서 지방세포로의 분화를 유도하였다. 상기 분화를 유도한지 2일이 지난 후 이틀에 한번 1㎍/㎖의 인슐린(insulin), 바이오틴(Biotin), 인도메타신(Indomethacin) 및 펜토시네이트(Panthothenate)만을 함유한 배지를 추가적으로 공급하였다.
<실험예 1>
본 발명의 배지 조성물이 지방세포 분화에 미치는 효과
<1-1> 지방세포 분화 형태 관찰
본 발명의 배지 조성물에서 분화된 지방세포의 형태를 관찰하기 위하여, <실시예 1>의 분화된 지방세포가 함유된 디쉬(Dish)에서 배양액을 제거한 후, PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하고 10% 포름알데히드(formaldehyde) 용액을 투여하여 1시간 동안 고정시킨 다음, 용액을 제거하고 오일 레드 오 용액(100% 이소프로파놀에 오일 레드 오 시약 5㎎/㎖ 및 증류수가 3:2로 혼합된 용액)을 사용하여 약 10분여간 염색하였다. 상기 염색 후, 물로 세척하고 현미경을 이용하여 지방세포 분화 형태를 대조군과 비교하여 관찰하고 그 결과를 도 1에 기재하였다.
상기 도 1에 기재된 바와 같이, 본 발명의 배지 조성물에서 대조군에 비해 지방전구세포에서 지방세포로의 분화가 높게 나타났으며 분화된 지방세포의 분포가 고르고 안정적으로 고정되어 있음을 알 수 있었다.
<1-2> 지방세포 생존율 측정
본 발명의 배지 조성물에서 분화된 지방세포의 생존율을 측정하기 위하여, <실시예 1>의 분화된 지방세포가 함유된 배지 100ul 당 알라마 블루 용액(alamar blue solution) 40ul을 투여하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 형광측정기기(excitation 544 nm, emission 590nm)를 이용하여 형광값을 측정하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.
상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 배지 조성물에서 분화된 지방세포의 생존율이 모든 측정 기간 동안 대조군에 비하여 월등히 높음을 알 수 있었다.
<1-3> 글루코오스 흡수량 측정
지방세포가 글루코오스를 흡수하여 지방으로 전환하는 기능을 하므로 글루코오스의 흡수량이 클수록 그만큼 많은 지방세포가 분화되었음을 알 수 있다.
먼저 지방세포내로 직접 흡수된 글루코오스의 양을 알아보기 위해, 0.1mM의 2-NBDG(2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose) 시료를 <실시예 1>의 분화된 지방세포가 함유된 배지에 처리하고 37℃에서 1 시간동안 둔 후, 트립신(trypsin)을 처리하여 세포를 분리하고 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter)를 사용하여 형광값을 측정하고 그 결과를 대조군과 비교하여 도 3에 기재하였다.
한편, 배지에 남아있는 글루코오스의 양을 측정하여, 간접적으로 지방세포의 글루코오스의 흡수량을 측정하였다. 구체적으로 <실시예 1>의 분화된 지방세포가 함유된 배지를 1/20로 희석하여 96-웰 플레이트에 분주하고, 글루코오스 옥시다제/퍼옥시다제(Glucose oxidase/peroxidase) 용액을 사용하여 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 540nm에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 대조군과 비교하여 도 4에 기재하였다.
상기 도 3 및 도 4에 기재된 바와 같이, 본 발명의 배지 조성물에서 글루코오스 흡수량이 대조군에 비하여 월등히 높아 그만큼 많은 지방세포가 분화되었음을 알 수 있었다.
<1-4> 지방 생성량 측정
지방세포가 글루코오스를 흡수하여 지방으로 전환하는 기능을 하므로 지방 생성량을 측정함으로써 지방세포가 분화된 정도를 알 수 있다.
지방 생성량을 측정하기 위하여, 상기 <실험예 1-1>에서 염색된 지방세포를 100% 이소프로파놀을 사용하여 녹이고 490 nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 대조군과 비교하여 도 5에 기재하였다.
상기 도 5에 기재된 바와 같이, 본 발명의 배지 조성물에서 지방 생성량이 대조군에 비하여 높았으며 특히 초기 생성량이 월등히 높았다. 따라서 본 발명의 배지 조성물에서 대조군에 비해 지방세포 분화가 잘 유도됨을 알 수 있었다.
본 발명의 지방세포 분화용 배지 조성물은 통상적으로 사용되는 지방세포 분화용 배지 조성물에 비해 분화된 지방세포의 분포가 고르고 분화된 지방세포가 안정적으로 고정될 수 있도록 하여 생존율을 극대화할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명의 지방세포 분화용 배지 조성물에 사용되는 DHEA(dehydroepiandrosterone) 및 히스타민(histamine)은 종래 사용되던 덱사메타손(dexamethasone) 및 아이소부틸메틸젠틴(isobutylmethylxanthine)에 비하여 가격이 저렴하므로 경제적인 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 배지 조성물에서 분화된 지방세포의 형태를 오일 레드 오 염색을 통해 현미경으로 관찰하여 나타낸 사진이다(DIM: 대조군에서 분화된 경우, DIH: 본 발명의 배지 조성물에서 분화된 경우).
도 2는 본 발명의 배지 조성물에서 분화된 지방세포의 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다(FBS:　우태혈청, DIM: 대조군에서 분화된 경우, DIH: 본 발명의 배지 조성물에서 분화된 경우).
도 3은 본 발명의 배지 조성물에서 지방세포가 직접 흡수한 글루코오스 양을 측정하여 나타낸 그래프이다(DIM: 대조군에서 분화된 경우, DIH: 본 발명의 배지 조성물에서 분화된 경우).
도 4는 본 발명의 배지 조성물에서 배지에 남아있는 글루코오스의 양을 측정하여, 간접적으로 지방세포의 글루코오스의 흡수량을 측정하여 나타낸 그래프이다(FBS:　우태혈청, DIM: 대조군에서 분화된 경우, DIH: 본 발명의 배지 조성물에서 분화된 경우).
도 5는 본 발명의 배지 조성물에서 지방 생성량을 흡광도를 측정하여 나타낸 그래프이다(FBS:　우태혈청, DIM: 대조군에서 분화된 경우, DIH: 본 발명의 배지 조성물에서 분화된 경우).

Claims (4)

  1. 지방세포 분화용 배지 조성물에 있어서, 인슐린(insulin), DHEA(dehydroepiandrosterone) 및 히스타민(histamine)을 함유하는 것을 특징으로 하는 지방세포 분화용 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물에 인도메타신(indomethacin), 바이오틴(biotin) 및 펜토시네이트(panthothenate)를 추가적으로 함유하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 인슐린(insulin)이 0.1~10ug/㎖, DHEA(dehydroepiandrosterone)가 0.01~10uM, 히스타민(histamine)이 1~10uM, 인도메타신(indomethacin)이 0.1~10mM, 바이오틴(biotin)이 20~40uM 및 펜토시네이트(panthothenate)가 10~30uM로 함유하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  4. 제1항의 배지 조성물을 이용하여 지방전구세포(preadipocyte)를 지방세포(adipocyte)로 분화시키는 방법.
KR1020080098149A 2008-10-07 2008-10-07 지방세포 분화용 배지 조성물 KR101019877B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080098149A KR101019877B1 (ko) 2008-10-07 2008-10-07 지방세포 분화용 배지 조성물
PCT/KR2009/005714 WO2010041863A2 (ko) 2008-10-07 2009-10-07 지방세포 분화용 배지 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080098149A KR101019877B1 (ko) 2008-10-07 2008-10-07 지방세포 분화용 배지 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100038967A true KR20100038967A (ko) 2010-04-15
KR101019877B1 KR101019877B1 (ko) 2011-03-04

Family

ID=42101078

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020080098149A KR101019877B1 (ko) 2008-10-07 2008-10-07 지방세포 분화용 배지 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101019877B1 (ko)
WO (1) WO2010041863A2 (ko)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100865884B1 (ko) * 2003-03-18 2008-10-31 (주)안트로젠 동종 이식에 사용하기 위한 분화된 지방 세포
US7893315B2 (en) * 2004-11-04 2011-02-22 Advanced Cell Technology, Inc. Derivation of embryonic stem cells and embryo-derived cells
JP2009539378A (ja) 2006-06-09 2009-11-19 アントフロゲネシス コーポレーション 胎盤環境及び幹細胞を培養するためのその使用
KR100883565B1 (ko) * 2007-02-14 2009-02-13 (주)프로스테믹스 지방 줄기세포의 조직 재생 능력을 최적화한 조건 배지를 함유한 조직 재생용 주사제 첨가제

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010041863A9 (ko) 2010-06-10
KR101019877B1 (ko) 2011-03-04
WO2010041863A2 (ko) 2010-04-15
WO2010041863A8 (ko) 2010-07-29
WO2010041863A3 (ko) 2010-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7932084B2 (en) Methods and compositions for growing adipose stem cells
US9321995B2 (en) Stem cell culture medium and its applications as well as a stem cell culture method
US8741646B2 (en) Amnion-derived cell compositions, methods of making and uses thereof
Alonso-Goulart et al. Mesenchymal stem cells from human adipose tissue and bone repair: a literature review
US9051547B2 (en) Use of PEDF-derived polypeptides for promoting stem cells proliferation and wound healing
EP2460875A1 (en) Amnion-derived cell compositions, methods of making and uses thereof
KR101655780B1 (ko) 클로날 중간엽 줄기세포를 포함하는, 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US20080213235A1 (en) Adipose Tissue Stem Cells, Perivascular Cells and Pericytes
Wan et al. Nonadherent cell population of human marrow culture is a complementary source of mesenchymal stem cells (MSCs)
CN106459913B (zh) 改良的干细胞组合物
WO2008155659A2 (en) Compositions for preventing or treating skin defects and methods of use thereof
KR101588394B1 (ko) 줄기세포의 재생능 향상을 위한 배지 조성물 및 이를 이용한 줄기세포의 배양방법
JP7287948B2 (ja) 多分化能性幹細胞分化促進剤
US20140271616A1 (en) Compositions And Methods For Mesenchymal And/Or Chondrogenic Differentiation Of Stem Cells
Katuchova et al. Impact of different pancreatic microenvironments on improvement in hyperglycemia and insulin deficiency in diabetic rats after transplantation of allogeneic mesenchymal stromal cells
US20240124843A1 (en) Functional feline pancreatic cells from adipose tissue
KR101019877B1 (ko) 지방세포 분화용 배지 조성물
CN109749981B (zh) 人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞及其制备方法和应用
KR102280199B1 (ko) 중간엽 줄기세포의 면역조절 활성 증진용 조성물
US20210130789A1 (en) Methods of stromal cell expansion, uses and materials related thereto
Nishio et al. Chondrocyte differentiation of human buccal fat pad-derived dedifferentiated fat cells and adipose stem cells using an atelocollagen sponge
Morales et al. WJSC
US20160160179A1 (en) Method for obtaining a population of isolated brite adipocytes
Pang et al. In vitro and in vivo analysis of human fibroblast reprogramming and multipotency
Ma et al. In Vitro Culture and Multipotency Evaluation of Broiler Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140122

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150112

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160203

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170223

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180226

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190218

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200218

Year of fee payment: 10