KR20100029083A - 항탄수화물 항체에 의해 유발되는 면역분석법에서의 간섭 제거 - Google Patents

항탄수화물 항체에 의해 유발되는 면역분석법에서의 간섭 제거 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 항약물 항체의 검출, 특히 약물이 탄수화물 부분을 갖는 항약물 항체의 검출을 위한 분석법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 일반적으로 약물의 검출, 특히 탄수화물 부분을 갖는 약물의 검출을 위한 분석법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 탄수화물 부분을 포함하는 약물로 치료하기 위한 적당한 피험체를 확인하는 방법에 관한 것이다.

Description

항탄수화물 항체에 의해 유발되는 면역분석법에서의 간섭 제거{ELIMINATION OF INTERFERENCE IN IMMUNOASSAYS CAUSED BY ANTI-CARBOHYDRATE ANTIBODIES}
본 발명은 일반적으로 항약물 항체의 검출, 특히 약물이 탄수화물 부분을 갖는 경우 항약물 항체의 검출을 위한 분석법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 일반적으로 약물의 검출, 특히 탄수화물 부분을 갖는 약물의 검출을 위한 분석법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 탄수화물 부분을 포함하는 약물로 치료하기에 적절한 피험체를 확인하는 방법에 관한 것이다.
당단백질은 암, 감염, 및 면역 질병의 치료 및 진단에 점점 더 사용되고 있다. 특히, 다양한 종, 및 키메라 또는 "인간화" 항체로부터의 단일클론 항체는 임상 사용이 증가하고 있는 당단백질의 한 종류이다. 피험체에 투여되는 경우, 상기 항체에 대하여 때때로 환자에 따라 면역 반응이 발생한다. 상기 반응은 주입된 항체를 이용한 사전처리 혈청 또는 혈장의 반응성과 사후처리 혈청 또는 혈장의 반응성 간의 차이에 의해 규정된다.
규제 당국은 치료된 환자에서 약물 및/또는 단백질에 대한 인간 면역 반응의 모니터링과 정량을 요구하고 있다. 하지만, 일부 경우에는, 단일클론 항체에 대한 인간 혈청 또는 혈장의 예비투여 반응성이 높아서 이것이 당단백질에 대한 특이 적 면역 반응의 모니터링 및 정량에 간섭할 수 있다. 또한, 치료제로 사용된 특정 항체에 노출되지 않은 피험체가 종종 치료 단백질과의 사전처리 혈청 반응성을 입증한다는 것을 유념한다. 이러한 반응성은 인간 혈청 또는 혈장의 항체 및 특히 투여된 당단백질의 탄수화물 부분과 반응하는 "천연 항체"의 존재에서 기인할 수 있다. (예, 문헌[Robert G. Hamilton and N. Franklin Adkinson . Naturally Occurring Carbohydrate Antibodies : Interference in Solid - Phase Immunoassays . Journal of Immunological Methods 77 (1985) 95-108.); "해밀턴" 참조). 또한, 항 탄수화물 항체가 면역분석법에 있어 간섭원으로 작용할 수 있음이 관찰되었다. 문헌[Justus Adedoyin, S.G.O. Johansson , Hans Groenlund , Marianne van Hage. Interference in immunoassays by human IgM with specificity for the carbohydrate moiety of animal proteins . Journal of Immunological Methods 310 (2006) 117-125)].
해밀턴은 인간 혈청의 면역분석법 분석에서 탄수화물에 대한 상기 천연 항체에 의해 유발된 간섭은 천연 항체와 반응성인 가용성 상 또는 고상 탄수화물과 피험체 혈청의 예비흡착에 의해 제거할 수 있음을 개시하고 있다. 또한, 미국 특허 번호 제5,856,106호는 당단백질 치료 후 개체로부터 얻은 체액 샘플을 산화된 탄수화물 부위를 갖도록 개질된 당단백질과 접촉시킴으로써 이로 치료하고자 하는 개체에서 당단백질에 대한 특이적 면역 반응성 수준을 측정하는 방법을 개시한다.
치료제로 투여되는 경우 당단백질과의 사전처리 혈청 반응성이 당단백질에 대한 실질 면역 반응을 숨기거나 증가시킬 수 있기 때문에, 잠재적 치료 당단백질 의 면역반응성을 평가하기 전에 이의 반응성을 감소시키는 것이 바람직하다.
발명의 개요
본 발명은 탄수화물 부분을 갖는 약물과 반응성인 사전처리 혈청의 존재에 관한 것으로서, 상기 탄수화물 부분은 당단백질과 직접적으로 관련되어 있지 않다. 특정 세포 유형(들)에 대해 칼리케아미신을 표적하는 단일클론 항체에 접합된 약물 칼리케아미신을 포함하는 약물-담체 접합체는 사전처리 또는 미처리 인간 및 원숭이 혈청과 반응하는 것으로 밝혀졌다. 사전처리 반응성은 약물-담체 접합체의 칼리케아미신 부위에 특이적이고, 특히 칼리케아미신의 탄수화물 부위에 집중된다. 또한, 추가의 탄수화물을 사전처리 혈청에 제공하면 칼리케아미신과 혈청의 배경 반응성이 제거된다는 것을 발견하였다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은 (i) 샘플을 (ii) 탄수화물 부분을 포함하는 약물 및 (iii) 추가의 탄수화물과 배합시키는 단계; 및 샘플에서 항체와 탄수화물 부분을 포함하는 약물 사이에 특이적 결합이 발생하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 항체를 포함하는 체액 샘플에서 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 대한 항체의 존재를 검출하는 분석법으로서, 상기 탄수화물 부분을 포함하는 약물은 당단백질을 포함하지 않는 것인 분석법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (i) 샘플을 (ii) 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 특이적으로 결합하는 포획 시약 및 (iii) 추가의 탄수화물과 배합시키는 단계; 및 샘플에서 탄수화물 부분을 포함하는 약물과 포획 시약 사이에 특이적 결합이 발생하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 항체를 포함하는 체액 샘플에서 탄수화물 부분을 포함하는 약물의 존재를 검출하는 분석법으로서, 상기 탄수화물 부분을 포함하는 약물은 당단백질을 포함하지 않는 것인 분석법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 a) (i) 체액 샘플을 (ii) 탄수화물 부분을 포함하는 약물 및 (iii) 추가의 탄수화물과 배합시키는 단계; 및 b) 샘플에서 항체와 탄수화물 부분을 포함하는 약물 사이에 특이적 결합이 발생하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 항체를 포함하는 체액 샘플에서 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 대한 항체의 존재를 검출하는 분석법으로서, 샘플에서 항체와 탄수화물 부분을 포함하는 약물 사이에 특이적 결합이 발생하기 전 상기 추가 탄수화물을 체액 샘플과 미리 흡착시키지 않는 것인 분석법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (i) 샘플을 (ii) 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 특이적으로 결합하는 포획 시약 및 (iii) 추가의 탄수화물과 배합시키는 단계; 및 샘플에서 탄수화물 부분을 포함하는 약물과 포획 시약 사이에 특이적 결합이 발생하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 항체를 포함하는 체액 샘플에서 탄수화물 부분을 포함하는 약물의 존재를 검출하는 분석법으로서, 포획 시약과 탄수화물 부분을 포함하는 약물 사이에 특이적 결합이 발생하는지 여부를 검출하기 전 추가의 탄수화물을 체액 샘플로 미리 흡착시키지 않는 것인 분석법을 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 분석법으로서, 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 피험체를 노출시킨 후 피험체로부터의 체액 샘플 상에서 수행하는 분석법을 제공한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 분석법으로서, 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 피험체를 노출시키기 전(즉, 미처리 피험체) 체액 샘플 상에서 수행하는 분석법을 제공한다. 상기 구체예에서, 분석법은 미처리 피험체의 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 특이적으로 결합하는 고유 예비존재 항체의 존재 또는 부재에 관한 정보를 제공한다.
일부 구체예에서, 미처리 피험체의 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 특이적으로 결합하는 고유 예비존재 항체의 존재 또는 부재에 관한 정보는 탄수화물 부분을 포함하는 약물의 치료에 더욱 반응하는 것 같은 피험체를 확인하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 미처리 피험체로부터의 체액 샘플 상에서 분석법을 수행하는 경우, 상기 분석법은 피험체를 약물에 노출시키기 전 피험체로부터의 샘플과 피험체를 약물에 노출시킨 후 피험체로부터의 샘플의 비교 분석을 추가로 포함할 수 있고, 노출 후 샘플에서 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 대한 항체의 양은 약물에 대한 면역 반응을 가리킨다.
일부 구체예에서, 미처리 피험체로부터의 체액 샘플 상에서 분석법을 수행하는 경우, 추가의 탄수화물을 미처리 피험체 혈청에 존재하는 고유 사전처리 항 탄수화물 항체의 결과인 탄수화물 부분을 포함하는 약물과의 임의의 반응성을 제거한 최종 농축물에 첨가한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 분석법을 제공하고, 여기서 피험체로부터의 체액 샘플은 전혈; 혈청; 점액, 타액, 초유 및 혈장 중 하나 이상을 포함한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 분석법을 제공하고, 여기서 검출 단계는 샌드위치 분석법, 가교 분석법 및 경쟁적 결합 분석법 중 하나 이상을 포함한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 분석법을 제공하고, 여기서 검출 단계는 샘플과 접촉한 고체 광학 표면에서 굴절률의 변화를 검출 또는 측정하는 단계; 발광의 변화를 검출 또는 측정하는 단계; 색조의 변화를 검출 또는 측정하는 단계; 방사능의 변화를 검출 또는 측정하는 단계; 생물학적 층 간섭분석계를 이용한 검출 또는 측정하는 단계; 캔틸레버 검출을 이용한 검출 또는 측정하는 단계; 무표지 고유 화상(label-free intrinsic imaging)을 이용한 검출 또는 측정하는 단계; 및 음향 검출을 이용한 검출 또는 측정하는 단계 중 하나 이상을 포함한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 분석법을 제공하고, 여기서 검출 단계는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA); 전기화학발광 분석법(ECL); 방사면역분석법(RIA); 고상 방사면역분석법(SPRIA); 면역블롯팅; 면역침전법; 형광활성세포분리법(FACS): 및 면역염색법으로 이루어진 군에서 선택된 분석법을 포함한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 분석법을 제공하고, 여기서 추가의 탄수화물은 박테리아 지질다당류(LPS), 덱스트란, 레반, 폐렴구균 다당류, 아가로스, 셀룰로스, 카라지난, 및 메틸글리코시드 또는 상기 탄수화물 중 어느 하나의 기능적 단편 중 하나 이상이다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 분석법을 제공하고, 여기서 추가의 탄수화물은 약 10 ng/㎖∼약 1 mg/㎖의 농도로 배합물 내에 존재한다. 또다른 구체예에서, 추가의 탄수화물은 약 10 ng/㎖∼약 0.5 mg/㎖의 농도로 배합물 내에 존재한다. 또다른 구체예에서, 추가의 탄수화물은 약 100 ng/㎖∼약 0.5 mg/㎖의 농도로 배합물 내에 존재한다. 또다른 구체예에서, 추가의 탄수화물은 약 100 ng/㎖∼약 0.75 mg/㎖의 농도로 배합물 내에 존재한다. 또다른 구체예에서, 단편을 포함한 추가의 탄수화물은 약 100 ng/㎖∼약 0.25 mg/㎖의 농도 및 임의의 범위 사이에서 배합물 내에 존재한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 분석법을 제공하고, 여기서 탄수화물 부분을 포함하는 약물은 약물과 접합된 담체를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 담체는 단일클론 및 다클론 항체 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 이의 항원 인식 단편 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 소형 모듈 면역의약품(SMIP: small modular immunopharmaceuticlas) 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 나노바디 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 가용성 수용체 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 성장 인자 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 압타머(aptamer); 리포좀; 비글리코실화 단백질; 및 나노입자로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 담체는 암 세포 상에 발현되거나 암 세포 내에 발현된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 암 세포 상에 발현되거나 암 세포 내에 발현된 항원은 5T4; CD19; CD20; CD22; CD33; 루이스 Y; HER-2; 면역글로불린 G의 I형 Fc 수용체(Fc 감마 R1); CD52; 표피세포 성장 인자 수용체(EGFR); 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF); DNA/히스톤 복합체; 태아성 암 항원(CEA); CD47; VEGFR2(혈관 내피세포 성장 인자 수용체 2 또는 키나아제 인서트 도메인 함유 수용체, KDR); 상피 세포 부착 분자(Ep-CAM); 섬유아세포 활성화 단백질(FAP); 트레일 수용체-1(DR4); 프로게스테론 수용체; 종양태아성 항원 CA 19.9; 및 섬유소로 이루어진 군에서 선택된다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 분석법을 제공하고, 여기서 담체는 단일클론 항체이다. 일부 구체예에서, 단일클론 항체는 항-CD22 단일클론 항체; 항-5T4 단일클론 항체; 항-CD33 항체; 및 항 루이스 Y 단일클론 항체로 이루어진 군에서 선택된다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 분석법을 제공하고, 여기서 탄수화물 부분을 포함하는 약물은 세포독성제; 방사선요법제; 면역조절제; 항신생혈관형성제; 증식방지제; 세포사멸촉진제(pro-apoptotic agent); 화학요법제; 치료적 핵산; 튜불린 중합 억제제; DNA에 결합하거나 이를 파괴시키는 알킬화제; 단백질 합성의 억제제; 및 티로신 키나아제 억제제로 이루어진 군에서 선택된다. 본원에 기술된 분석법은 하나 이상의 탄수화물 부분을 포함하는 약물을 포함하거나 이에 노출된 체액 샘플 상에서 수행될 수 있다. 본원에 기술된 분석법은 탄수화물 부분을 포함하는 약물의 부위 또는 기능적 단편을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 분석법을 제공하고, 여기서 탄수화물 부분을 포함하는 약물은 칼리케아미신, 티오테파, 탁산, 빈크리스틴, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 타목시펜, 이다루비신, 돌라스타틴/아우리스타틴, 헤미아스테린, 및 마이탄시노이드로부터 선택된 세포독성제이다. 일부 바람직한 구체예에서, 세포독성제은 칼리케아미신이고 일부 구체예에서는 N-아세틸 감마 디메틸 히드라진 칼리케아미신일 수 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 기술된 분석법을 제공하고, 여기서 탄수화물 부분을 갖는 약물 또는 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 대한 항체는 포획제에 결합함으로써 검출된다.
일부 구체예에서, 항약물 항체에 특이적으로 결합하는 포획제는 탄수화물 부분을 갖는 약물 또는 탄수화물 부분을 포함하는 약물의 부위 또는 기능적 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, 항약물 항체에 특이적으로 결합하는 포획제는 탄수화물 부부분을 포함하는 약물의 탄수화물 부위 또는 탄수화물 부분을 포함하는 약물의 기능적 단편 또는 부위이다.
일부 구체예에서, 탄수화물 부분을 포함하는 약물 및 포획 시약은 S-[(2R,4S,6S)-6-({[(2R,4S,5R)-5-({(2S,4S,5S)-5-[아세틸(에틸)아미노]-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일}옥시)-4-히드록시-6-메톡시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]4-{[(2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]옥시}-3-요오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤젠카르보티오에이트이다.
일부 구체예에서, 탄수화물 부분을 갖는 약물에 특이적으로 결합하는 포획제는 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 대한 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 탄수화물 부분을 포함하는 약물이 담체-약물 접합체를 포함하는 경우, 탄수화물 부분을 갖는 약물에 특이적으로 결합하는 포획제는 담체-약물 접합체의 담체 부위에 특이적으로 결합하는 표적을 포함한다.
일부 구체예에서, 탄수화물 부분을 포함하는 약물이 담체-약물 접합체를 포함하는 경우, 탄수화물 부분을 갖는 약물에 특이적으로 결합하는 포획제는 5T4; CD19; CD20; CD22; CD33; 루이스 Y; HER-2; 면역글로불린 G의 I형 Fc 수용체(Fc 감마 R1); CD52; 표피세포 성장 인자 수용체(EGFR); 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF); DNA/히스톤 복합체; 태아성 암 항원(CEA); CD47; VEGFR2(혈관 내피세포 성장 인자 수용체 2 또는 키나아제 인서트 도메인 함유 수용체, KDR); 상피 세포 부착 분자(Ep-CAM); 섬유아세포 활성화 단백질(FAP); 트레일 수용체-1(DR4); 프로게스테론 수용체; 종양태아성 항원 CA 19.9; 및 섬유소의 부위 이상을 포함하고, 상기 부위는 담체-약물 접합체의 담체 부위에 특이적으로 결합한다.
또다른 구체예에서, 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 결합된 항체는 항체와 표지된 화합물의 결합에 의해 검출된다. 일부 바람직한 구체예에서, 표지된 화합물은 검출가능한 표지를 추가로 포함하는 포획 시약; 또는 검출가능한 표지를 추가로 포함하는 제2 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 제2 항체는 결합된 항체에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 검출가능한 표지는 하나 이상의 효소 표지, 발광 표지 및 방사성동위원소 표지를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 실시예 1 내지 8 중 어느 하나 이상의 실시예에서 본원에 기술된 분석법을 제공한다.
일부 구체예에서, 포획 시약에 결합하는 탄수화물 부분을 포함하는 약물의 존재는 또한 약물에 특이적으로 결합하는 표지된 화합물로 검출된다. 일부 구체예에서, 표지된 화합물은 검출가능한 표지를 추가로 포함하는 포획 시약; 및 검출가능한 표지를 추가로 포함하는 항체로 이루어진 군에서 선택되고, 항체는 약물에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 검출가능한 표지는 효소 표지; 발광 표지; 및 방사성동위원소 표지로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 표지를 포함한다.
일부 구체예에서, 항체를 포함하는 체액 샘플에서 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 대한 항체의 존재 또는 탄수화물 부분을 포함하는 약물의 존재를 검출하는 분석법은 샘플과 접촉하는 고체 광학 표면에서 굴절률의 변화 측정; 발광에서의 변화 측정; 색조에서의 변화 측정; 및 방사능에서의 변화 측정 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체를 포함하는 체액 샘플에서 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 대한 항체의 존재 또는 탄수화물 부분을 포함하는 약물의 존재를 검출하는 분석법은 ELISA; ECL; RIA; SPRIA; 면역블롯팅; 면역침전법; 및 면역염색법으로 이루어진 군에서 선택된 분석법을 포함한다.
발명의 상세한 설명
전신 약물요법을 위해 개발된 약물 접합체는 표적 특이적 세포독성제이다. 그 개념은 규정된 표적 세포 집단에 대한 특이성을 갖는 담체 분자를 치료제에 연결시키는 것과 연관된다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 약물 접합체는 또한 "담체-약물 접합체"로도 언급된다.
항원에 대한 친화성이 높은 항체는 표적 부분 또는 담체-약물 접합체의 "담체" 부위로서 자연 선택적이다. 높은 친화성 단일클론 항체의 이용가능성과 함께, 항체 표적 치료제에 대한 전망은 유망하게 되고 있다. 단일클론 항체와 접합된 독성 물질은 독소, 저분자량 세포독성 약물, 생물학적 반응 변형제, 및 방사성핵종을 포함한다. 항체-독소 접합체는 종종 면역독소로 언급되는 반면, 항체 및 저분자량 약물, 예컨대 메토트렉세이트 및 아드리아마이신으로 이루어진 면역접합체는 화학면역접합체로 지칭된다. 면역조절제는 림포카인, 성장 인자, 및 보체 활성 코브라 베넘 인자(CVF)와 같은 조절 기능을 갖는 것으로 공지된 생물학적 반응 변형제를 포함한다. 방사면역접합체는 방사선으로 세포사시키는 요법으로 사용되거나 화상화하는데 사용될 수 있는 방사성 동위원소로 이루어진다. 종양 세포에 대한 세포독성 약물의 항체 매개된 특이적 전달은 항 종양 효능을 증가시킬 뿐 아니라, 정상 조직에 의한 비표적 흡수를 막아서, 치료 지수를 증가시킬 것으로 예상된다.
암 및 류마티스 관절염을 포함한 각종 질병을 치료하기 위한 다수의 항체를 기초로 한 요법은 임상 사용에 승인되었거나 비호지킨 림프종과 같은 B 세포 종양을 포함하는 각종 종양에 대한 임상 실험 중에 있다. 상기 항체를 기초로 한 하나의 요법은 B 세포 상에 발현되는 세포 표면 항원 CD20에 특이적인 비표지된 키메라 인간 γ1(+mγ1V 영역) 항체인 리툭시맙(Rituxan.TM.)이다. 상기 항체를 기초로 한 요법은 보체 매개성 세포독성(CDCC) 또는 B 세포에 대한 항체 의존성 세포독성(ADCC)에 의존하거나, 방사성핵종, 예컨대 131I 또는 90Y의 사용에 의존하고, 이는 임상의와 환자를 위한 조제 및 사용 문제와 관련되어 있다. 결과적으로는, 현재 항체를 기초로 한 요법의 결점을 극복하여 비호지킨 림프종(NHL)과 같은 조혈 종양을 포함한 각종 종양을 치료할 수 있고, 용이하고 효율적으로 제조할 수 있으며, 면역 반응을 유도하지 않으면서 반복하여 사용할 수 있는 면역접합체의 생성이 필요하다.
칼리케아미신 또는 LL-E33288 복합체(미국 특허 번호 제4,970,198호(1990) 참조)로 총괄하여 공지된 항세균제 및 항종양제의 강력한 패밀리의 구성원을 포함하는 면역접합체가 골수종의 치료에 사용하기 위해 개발되었다. 가장 강력한 칼리케아미신 중 하나는 감마로서 본원에 간단히 언급되는 γ1로 고안되어 있다. 이러한 화합물은 적당한 티올과 반응하여 디설피드를 형성하고, 동시에 작용기, 예컨대 히드라지드 또는 칼리케아미신 유도체를 결합시키는데 유용한 다른 작용기를 담체에 도입시킬 수 있는 할 수 있는 메틸트리설피드를 포함한다. (미국 특허 번호 제5,053,394호 참조).
탄수화물 부분을 포함하는 약물의 탄수화물 부위 또는 접합체의 약물 부위가 탄수화물 부분을 포함하는 담체 약물 접합체에 특이적으로 결합하는 미처리 혈청 내 항체의 존재는 (i) 담체 약물 접합체에 반응하여 발생하는 항체 또는 (ii) 탄수화물을 갖는 약물 또는 담체 약물 접합체를 검출하기 위한 면역분석법에 간섭할 수 있다. 이러한 간섭은 현재 담체 약물 접합체의 당단백질 또는 당단백질 부위와 관련되지 않은 탄수화물에 특이적으로 결합하는 고유 항체를 포함하는 것으로 측정되고 있다.
예로서, 약물에 특이적인 항체를 포획하기 위한 표적으로 약물이 사용되는 경우, 고유 항 탄수화물 부분 항체가 포획제에 결합하였을 때 긍정 오류 반응 (또는 양의 증가)이 있을 수 있다. 또한, 혈청에서 약물을 검출하기 위해 표지된 화합물과 함께 약물용 포획 시약을 사용하는 분석법에서, 결합된 항체가 표지된 화합물의 결합을 간섭하는 경우, 약물에 대한 표지된 화합물의 특이적 결합을 막거나 감소시키는 약물에 결합하는 항 탄수화물 항체로 인한 부정 오류 (또는 양의 감소)가 있을 수 있다.
항체를 포함하는 체액 샘플 내에서 항 담체-약물 접합체 항체와 담체-약물 접합체 사이의 특이적 결합을 검출하는 분석법에서 추가의 탄수화물의 존재는 담체-약물 접합체에 피험체를 노출시키는 것에 반응하여 발생하는 항 담체-약물 접합체 항체의 특이적으로 검출할 수 있을 것임을 본원에 보고하였다. 추가의 탄수화물은 항 담체-약물 접합체 항체와 담체-약물 접합체 사이의 특이적 결합을 검출하기 전에 체액 샘플과 미리 흡착시킬 필요는 없다. 분석법에 첨가된 추가의 탄수화물이 약물에 노출되기 전 존재할 수 있는 임의의 활성을 제거하기 때문에 특이적 검출이 가능하다.
유사하게, 항체를 포함하는 체액 샘플 내에서 포획 시약과 담체-약물 접합체 사이의 특이적 결합을 검출하기 위한 분석법에서 추가의 탄수화물의 존재는 담체-약물 접합체 항체를 특이적으로 검출할 수 있을 것이다. 추가의 탄수화물은 포획 시약과 담체-약물 접합체 사이의 특이적 결합을 검출하기 전에 체액 샘플과 미리 흡착시킬 필요는 없다. 분석법에 첨가된 추가의 탄수화물이 샘플에 존재하는 예비존재하는 항 약물 항체의 임의의 차폐 활성을 제거할 것이기 때문에 특이적 검출이 가능하다.
추가의 탄수화물은 혈청 내 고유 항체와 탄수화물 부분을 포함하는 약물의 결합 효과를 없애기 위해 혈청에 첨가된다. 추가의 탄수화물 양은 미처리 혈청으로 적정하여 최적의 양을 측정함으로써 배경이 감소되도록 모색하는 경우에 첨가할 수 있다. 탄수화물 부분을 포함하는 약물의 분석 및 검출이 탄수화물 부분에 결합하지 않는 포획 시약에 의존하는 경우, 추가의 탄수화물을 과량으로 첨가할 수 있다.
특이적 결합 분석법 기법의 개발은 초저농도에서 다양한 액체 또는 고체 (예, 조직) 샘플에 나타나는 각종 진단적, 의학적, 환경적 및 공업적 물질의 중요성을 측정하기 위해 상당히 유용한 분석 방법을 제공하였다. 특이적 결합 분석법은 측정 하에 결합가능한 피분석물 및 이의 결합 파트너, 즉 피분석물-특이적 부분 사이의 특이적 상호작용을 기초로 한다. 피분석물-특이적 부분의 결합과 임의의 추가 시약의 상호작용은, 필요한 경우, 결합 및 비결합 표지된 피분석물의 기계적 분리를 일으키거나 검출가능한 신호를 조절하는 방식으로 표지에 영향을 미친다. 전자의 상황은 통상 이종성으로 언급되고 후자는 동종성으로 언급되는데, 즉 후자는 분리 단계가 필요하지 않다.
CMA-676 또는 CMA로도 언급되는 MYLOTARG®(Sievers, E. L. et al (1999) Blood: 93, 3678-3684)는 담체로서 단일클론 항체에 결합하는 칼리케아미신을 포함하는 시중에서 구입가능한 약물이다. MYLOTARG®(젬투주맙 오조가미신)는 현재 고령의 환자에서 급성 골수성 백혈병을 치료하도록 승인되어 있다. 약물은 산 가수분해성 링커에 의해 칼리케아미신에 결합되는 CD33에 대한 항체로 이루어져 있다. 반합성의 N-아세틸 감마 칼리케아미신의 디설피드 유사체는 접합에 사용되었다(미국 특허 번호 제5,606,040호 및 제5,770,710호).
통상적인 표지 접합체 특이적 결합성 분석법 기술에서, 분석법하고자 하는 액체 배지의 샘플을 각종 시약 조성물과 배합한다. 상기 조성물은 표지가 도입된 결합성 성분을 포함하는 표지 접합체를 포함한다. 접합체 내 결합성 성분은, 접합체의 2개의 종 또는 형태, 예컨대 결합된 종(접합체 복합체) 및 프리 종을 생성하는 결합성 반응 시스템을 형성하는 분석법 하에 배지 내 시약 조성물 및 리간드 중 시약 조성물의 다른 구성성분이 있는 경우 이에 관여한다. 결합된 종에 있어서, 접합체의 결합성 성분은 상응한 결합성 파트너에 의해 결합되는 반면, 프리 종의 경우에는 결합성 성분은 그렇게 결합되지 않는다. 프리 종과 비교하였을 때 결합된 종을 초래하는 접합체의 양 또는 비율은 테스트 샘플에서 검출하고자 하는 피분석물의 존재 (또는 양)의 기능이다.
특이적 결합 분석법에 대한 대안적인 체재는 "샌드위치" 분석법 프로토콜이고, 여기서 표적 피분석물은 직접 또는 연결 기를 통해 고체 매트릭스에 고정되는 제1 특이적 결합 파트너와 신호 발생 또는 표지 시스템에 결합되는 제2 특이적 결합 파트너 사이에 결합된다.
추가의 면역분석법 체재 및 프로토콜은 또한 당업계에 공지되어 있고 본 발명의 사용에 적용될 수 있다. 표지된 시약의 결합 형태 및 프리 형태의 바람직한 분리를 실현하기 위해, 결합 분석법 반응에서 결합성 참여자 중 하나, 예컨대 고정된 항원 또는 항체의 직접 고정화를 위해 고정되거나 고정화가능한 재료를 사용한 각종 결합 분석법이 제안되었다. 특히, 그러한 다수의 결합 분석법은 검출하고자 하는 항원에 대한 항체가 테스트 튜브의 내부벽 또는 플라스틱 또는 자성 비드와 같은 고정 재료에 결합한다는 것이 기술되어 있다.
미국 특허 번호 제4,243,749호는 경쟁적 결합 분석법을 개시하고 있고, 여기서 반응은 테스트 튜브의 내부벽 상에 불용성화되거나 고정된 측정 하에 합텐에 대해 특이적 항체를 갖는 테스트 튜브 내에서 수행된다. 반응은 표지된 합텐 접합체를 포함하고, 여기서 테스트 튜브벽에 결합되는 표지된 합텐 접합체의 양은 측정 하에 합텐의 양에 반비례한다.
상기 결합 분석법 중 또다른 것은 미국 특허 번호 제4,230,683호에 기술되어 있고, 이는 항원 또는 항체가 결합된 6 mm 폴리스티렌 비드를 사용하는 방법을 개시하고 있고, 상기 항원 또는 항체는 항원 또는 항체에 대한 합텐 접합된 항체와 반응한다. 결합된 합텐 접합된 항체를 표지된 항 합텐 항체와 추가로 반응시켜 테스트 샘플 내 항원 또는 항체의 양을 측정한다.
상기 결합 분석법 중 또다른 것은 미국 특허 번호 제4,228,237호에 기술되어 있고, 이는 특이적 결합 방법에서 효소 표지된 아비딘 및 바이오틴 표지된 시약을 사용하는 액체 배지에서 리간드의 검출 및 측정 방법을 개시한다. 상기 방법에서, 검출하고자 하는 리간드를 리간드에 대해 특이적 결합 물질을 포함하는 불용성 상과 접촉시킨다.
지금까지 기술된 직접 고정화 기술 이외에, 제1 결합 물질로 고정화시키고자 하는 결합 분석법 반응 참여자를 표시하거나 표지한 후, 고정된 제2 결합 물질을 첨가함으로써 간접적 고정화가 제안되었다.
예를 들어, 미국 특허 번호 제4,298,685호는 효소 면역분석법을 개시하고 있고, 여기서 측정 하에 생물학적 물질을 포함하는 샘플을 분석법 하에 바이오틴 및 효소 표지된 형태로 태깅된 생물학적 물질에 대한 항체와 혼합시킨다. 이후 아비딘의 고정된 형태를 첨가하고 여기서 아비딘은 바이오틴 태깅된 항체에 결합되어 효소 표지된 시약의 항체 결합된 분획을 고정시킨다. 유사하게, 영국 특허 출원 번호 GB 2,084,317A는 고체 재료 및 바이오틴 표지된 항원에 결합한 아비딘을 사용하는 항원 연결된 경쟁 효소 면역분석법을 개시한다. 방사선표지되고 효소 태깅된 면역분석법은 분리 단계의 일부 유형을 필요로 한다. 최근 들어, 상이한 접근법은 분리 단계가 필요하지 않고 이에 따라 분리가 필수적인 불균일한 시스템과 대조적으로 균일한 시스템으로 지칭되는 것으로 개시되었다. 미국 특허 번호 제3,817,837호는 검출하고자 하는 리간드와 공유 결합하는 표지 물질로서 효소로 이루어진 가용성 복합체 및 리간드에 대한 가용성 수용체, 통상 항체와 분석법하고자 하는 액체를 배합시키는 단계; 및 복합체에서 효소의 효소적 활성에 대해 분석법하고자 하는 액체의 효과를 분석하는 단계를 수반하는 경쟁적 결합 분석법 방법을 개시한다.
또한 추가로, 표지된 시약은 다른 통상적인 검출가능한 화학 기를 포함할 수 있다. 상기 검출가능한 화학 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 성질을 갖는 임의의 재료일 수 있다. 상기 재료는 면역분석법 분야에서 잘 개발되어 왔고 일반적으로 상기 방법에 유용한 임의의 표지는 본 발명에 적용할 수 있다. 특히 유용한 것은 효소 활성 기, 예컨대 효소(문헌[Clin. Chem. (1976)22:1243] 참조), 효소 기질(미국 특허 번호 제4,492,751호 참조), 보결기 또는 조효소(미국 특허 번호 제4,230,797호 및 제4,238,565호 참조), 및 효소 억제제(미국 특허 번호 제4,134,792호 참조); 회전 표지; 형광 물질(Clin. Chem. (1979)25:353); 발색단; 발광 물질, 예컨대 화학발광 물질 및 생물발광 물질(미국 특허 번호 제4,380,580호 참조); 특이적 결합가능한 리간드(예, 바이오틴 및 합텐); 전기활성 종; 및 방사성동위원소, 예컨대 3H, 35S, 32P, 125I, 및 14C이다. 상기 표지 및 표지 쌍은 이의 자체의 물리적 성질(예, 형광 물질, 발색단 및 방사성동위원소) 또는 이의 반응 성질 또는 결합 성질(예, 효소, 기질, 조효소 및 억제제)을 기초로 검출된다.
정의
명세서 및 첨부된 청구 범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태의 단어는 달리 문맥상 명백하게 언급되지 않는 한 복수 의미를 포함한다. 따라서, 예를 들어 "항체(antibody)"에 대한 언급은 상기 조성물의 복수 형태, 즉 "항체(antibodies)"를 포함한다.
용어 "약"은 언급된 측정 또는 농도의 20%, 더욱 바람직하게는 10%, 더욱 바람직하게는 5% 내를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "추가의 탄수화물"은 혈청에서 고유 항체에 결합하는 탄수화물과 경쟁할 수 있는 탄수화물을 지칭한다. 면역분석법에서 박테리아 지질다당류(LPS), 메틸글리코시드, 덱스트란, 레반, 폐렴구균 다당류, 아가로스, 셀룰로스, 또는 카라지난을 사용하면 탄수화물과 통상 결합하는 항체의 결합을 차단할 수 있다. 상기 임의의 탄수화물을 첨가하면 분석법에서 다른 시약에 특이적으로 결합함으로써 N-아세틸 감마 디메틸 히드라지드 단독 또는 담체-약물 접합체의 일부로서의 비탄수화물 영역에 결합할 수 있어서, 혈청 내 항 탄수화물 항체에서 발생된 비특이적 배경 신호를 감소시킬 것이다. 또한, 적절한 탄수화물의 선택은 약물-담체 접합체에 특이적으로 결합하는 탄수화물과 관련될 수 있다.
문맥상 특별하게 제시하지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "항체"는 단일클론 및 다클론 항체 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 이의 항원 인식 단편 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 및 이의 항원 인식 단편을 포함하는 합성 분자 중 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "추가의 탄수화물"은 또한 탄수화물 부분을 포함하는 약물 또는 이의 단편, 및 특이적으로 탄수화물 부분을 포함하는 약물의 탄수화물 부위를 모방한 다른 탄수화물 또는 이의 단편에 결합하는 동일한 탄수화물을 포함하는 것을 의미한다. 탄수화물 부분을 포함하는 약물의 탄수화물 부위를 특이적으로 모방하기 위해, 탄수화물 또는 이의 단편은 약물의 탄수화물 부분에 결합하는 동일한 표적 및 수용체 화합물에 특이적으로 결합할 것이다.
"가교 분석법"은 면역분석법을 지칭하며, 여기서 포획 시스템은 용액에서 형성된 후 고상과 면역복합체를 연결하는 가교 성분에 의해 포획되는 샘플 피분석물을 포함하는 면역복합체이다. 가교 성분에 결합하는 성분에 공유 연결되는 검출가능한 표지는 결합 사건의 검출에 사용된다.
본원에 사용된 용어 "포획 시약"은 해당 표적에 특이적으로 결합하는 임의의 조성물을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 탄수화물 부분을 포함하는 약물인 해당 표적을 위한 포획 시약은, 비제한적 예로서, 탄수화물 부분을 포함하는 약물 및 탄수화물 부분을 포함하는 약물을 위한 임의의 특이적 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 예를 들어, 탄수화물 부분을 포함하는 약물이 약물에 접합된 항체를 추가로 포함하는 경우, 항체의 항원 결합 도메인의 표적은 또한 탄수화물 부분을 포함하는 약물을 위한 포획 시약이다. 또한, 탄수화물 부분을 포함하는 약물이 해당 수용체 결합 파트너를 갖는 경우, 또는 해당 결합 파트너를 갖는 수용체의 가용 형태를 포함하는 경우, 수용체 및 수용체 결합 파트너는 서로에 대해 포획 시약이다.
용어 "경쟁 분석법"은 불균일한 샘플 내 비표지된 피분석물이 검출가능한 표지와 공유 결합하는 성분, 주로 항체 또는 항원와 경쟁하는 능력에 의해 측정되는 분석법을 지칭한다. 비표지된 피분석물 및 표지된 분자는 고상 위에 고정된 포획 시약에 결합하기 위해 서로 경쟁할 것이다. 비표지된 피분석물은 포획 시약 상의 결합 위치를 이미 차지하고 있기 때문에 결합하기 위한 표지된 분자의 능력을 차단한다. 따라서, 경쟁 면역분석법에서, 분석법에서 측정된 표지가 적을수록 비표지된 피분석물이 더 많이 존재한다는 것을 의미한다. 불균일한 샘플에서 항원의 양은 측정된 표지 양과 관련하여 반비례한다.
용어 "세포독소" 또는 "세포독성제"는 일반적으로 세포의 기능을 억제하거나 막고/막거나 세포의 파괴를 초래하는 제제를 지칭한다. 대표적인 세포독소는 항생제, 튜불린 중합 억제제, 티로신 키나아제 억제제, DNA에 결합하여 파괴하는 알킬화제, 및 단백질 합성 또는 주요 세포 단백질의 기능을 파괴하는 제제, 예컨대 단백질 키나아제, 인산분해효소, 위상이성질화효소, 효소, 및 사이클린을 포함한다. 대표적인 세포독소는, 비제한적 예로서, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 아클라루비신, 조루비신, 미톡산트론, 에피루비신, 카루비신, 노갈라마이신, 메노가릴, 피타루비신, 발루비신, 시타라빈, 젬시타빈, 트리플루리딘, 안시타빈, 에노시타빈, 아자시티딘, 독시플루리딘, 펜토스타틴, 브록수리딘, 카페시타빈, 클라드리빈, 데시타빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 고우게로틴, 푸로마이신, 테가푸어, 티아조푸린, 아드리아마이신, 시스플라틴, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 다카르바진, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 미톡산트론, 블레오마이신, 메클로레타민, 프레드니손, 프로카르바진, 메토트렉세이트, 플루로우라실, 에토포시드, 탁솔, 탁솔 유사체, 플라틴, 예컨대 시스 플라틴 및 카프보 플라틴, 미토마이신, 티오테파, 탁산, 빈크리스틴, 다우노루비신, 에피루비신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 타목시펜, 이다루비신, 돌라스타틴/아우리스타틴, 헤미아스테를린, 에스퍼라미신 및 마이탄시노이드를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "담체 또는 담체 분자"는, 비제한적 예로서, 단일클론 및 다클론 항체 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 이의 항원 인식 단편 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 소형 모듈 면역의약품(SMIP) 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 나노바디 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 가용성 수용체 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 성장 인자 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 압타머; 리포좀; 비글리코실화된 단백질; 및 나노입자; 압타머; 리포좀; 비글리코실화 단백질; 및 나노입자를 포함한다.
"검출가능한 표지"는 검출가능한 신호의 발생에 직간접적으로 연관된 임의의 물질 또는 물질 군을 지칭하며 본 발명의 면역분석법 중 어느 하나에 사용된 항원 또는 임의의 항체와 공유결합할 수 있다. 통상적으로 사용되는 검출가능한 표지는, 예를 들어 효소, 방사능활성, 형광, 화학발광 또는 인광성 표지이다. 바람직한 표지는 효소 표지이고, 더욱 바람직한 것은 HRP의 경우에, 과산화수소 및 3,3',5,5'-테트라메틸빈지딘-2 HCl(TMB) 용액인 효소 기질의 첨가 하에 측색 분석법을 초래하는 겨자무 페록시다제(HRP)이다. HRP는 이미 결합된 포획 피분석물에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원에 공유결합하는 경우 직접적 방식으로 사용될 수 있다. HRP는 또한 2차 시약으로서 첨가되는 경우 간접 방식으로 면역분석법에 첨가될 수 있는데, 예를 들어 항체 또는 항원이 바이오틴으로 표지되는 경우 아비딘-HRP가 이어서 첨가된다.
본원에 사용된 용어 "탄수화물 부분을 포함하는 약물"은 생물학적 또는 검출가능한 활성을 갖는 임의의 물질, 예컨대 요법제, 검출가능한 표지, 결합제 등, 및 생체내 활성제로 신진대사시키는 프로드러그를 지칭한다. 용어 탄수화물 부분을 포함하는 약물은 또한 약물 유도체를 포함하고, 상기 탄수화물 부분을 포함하는 약물은 항체 또는 또다른 담체 분자와 접합되도록 작용기화되었다. 일반적으로, 상기 접합체 유형은 면역접합체로도 언급된다. 또한, 용어는 약물의 일부 또는 담체-약물 접합체인 경우 탄수화물 부분에 특이적으로 결합하는 항체에 결합할 수 있는 탄수화물 부분을 포함하는 약물의 부위 또는 기능적 단편을 지칭하는 것을 의미한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 탄수화물 부분을 포함하는 약물은 담체-약물 접합체(예, 칼리케아미신에 결합한 단일클론 담체)의 약물 부위와, 약물의 칼리케아미신 부위 또는 칼리케아미신의 메틸글리코시드 부위(즉, S-[(2R,4S,6S)-6-({[(2R,4S,5R)-5-({(2S,4S,5S)-5-[아세틸(에틸)아미노]-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일}옥시)-4-히드록시-6-메톡시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]4-{[(2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]옥시}-3-요오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤젠카르보티오에이트)에 적용할 수 있다.
본원에 사용된 항체와 접합할 수 있도록 작용기화된 탄수화물 부분을 포함하는 약물은 또한 "담체-약물 접합체"의 "약물" 부위를 포함하는 것을 의미한다. 담체-약물 접합체의 일부로서, 항체의 예는 CD22, 5T4, CD33 및 루이스-Y 항원에 특이적이다. 상기 항체는 암 세포 상에 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 수용체에 특이적이다. "당단백질을 포함하지 않는" 탄수화물 부분을 포함하는 약물을 언급하는 경우, 이는 담체-약물 접합체의 담체 부위가 당단백질을 포함할 수 있는 상황을 포함하는 것을 의미한다.
담체-약물 접합체의 일부로 유용한 치료 약물의 비제한적인 대표적 예는 세포독소, 방사성동위원소, 화학요법제, 면역조절제, 항신생혈관형성제, 증식방지제, 세포사멸촉진제, 및 세포증식억제성 효소와 세포용해성 효소(예, RNAses)를 포함한다. 약물은 또한 치료적 핵산, 예컨대 면역조절제, 항신생혈관형성제, 증식방지제, 또는 세포사멸촉진제를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 약물 기술자(descriptor)는 서로 배제되지 않아서, 상기 언급된 용어 중 하나 이상을 사용하여 치료제를 기술할 수 있다. 예를 들어, 선택된 방사성동위원소는 또한 세포독소이다. 요법제는 상기 중 임의의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 약물로서 방사성동위원소를 갖는 접합체는 방사면역접합체로 지칭되고 약물로서 화학요법제를 갖는 것은 화학면역접합체로 지칭된다. 면역접합체로 사용하기에 적당한 약물의 예는 탁산, 마이탄신, CC-1065 및 듀오카르마이신, 칼리케아미신 및 기타 엔디인, 및 아우리스타틴을 포함한다. 기타 예는 항엽산제, 빈카 알칼로이드, 및 안트라사이클린을 포함한다. 식물 독소, 다른 생물학적활성 단백질, 효소(즉, ADEPT), 방사성동위원소, 감광자(즉, 광역동요법)는 또한 면역접합체로 사용될 수 있다. 또한, 접합체는 세포독성제로서 2차 담체, 예컨대 리포좀 또는 중합체 등을 사용하여 제조할 수 있다.
"면역 반응"은 체액성 면역 반응(예, 항원 특이적 항체의 생성) 및 세포 매개 면역 반응(예, 림프구 증식)을 포함한 척추동물 피험체의 면역 시스템에 의해 항원 또는 항원 결정자에 대한 임의의 반응을 지칭하는 것을 의미한다. 대표적인 면역조절제는 사이토카인, 크산틴, 인터루킨, 인터페론, 및 성장 인자(예, TNF, CSF, GM-CSF 및 G-CSF), 및 호르몬, 예컨대 에스트로겐(디에틸스틸베스트롤, 에스트라디올), 안드로겐(테스토스테론, HALOTESTIN®(플루옥시메스테론)), 프로게스틴(MEGACE®(메게스트롤 아세테이트), PROVERA®(메드록시프로게스테론 아세테이트)), 및 코르티코스테로이드(프레드니손, 덱사메타손, 히드로코르티손)를 포함한다.
"발광성" 표지는 인광, 화학발광 및 형광을 비롯한 표지를 포함한다. "형광성" 표지는 단백질(또는 기타 화합물)에 공유 결합하였을 때, 단파장에 여기되는 경우, 형광체 사이에서 최적의 에너지 전달을 보여주고 특이적 파장, 주로 자외선에서 판독될 수 있는 형광체를 지칭한다. 가장 흔한 형광성 표지는 각각 플루오레세인 및 로호다민, FITC 및 TRITC의 유도체이다. 상기 형광체는 항체 또는 항원과 공유 결합하고 특이적 결합 사건의 검출에 사용된다. 화학발광 표지는 자연 붕괴하는 여기된 상태의 분자 형성을 유발하여 검출가능한 광을 발광시키는 현상 시약에 의해 광을 발광하도록 유도하는 것이다. 가장 흔하게 사용되는 화학발광 표지는 아크로디늄, 루미놀 및 디옥세탄이다. 아크로디늄 및 루미놀은 퍼옥시다제 효소 반응에 의해 여기되고 HRP 표지를 사용하는 면역분석법에 사용될 수 있다. 인광성 표지는 방사선에 노출되고 여기성 방사선이 제거된 후 글로우로서 지속되는 물질로부터 광이 방출되는 것이다. 인광성 검출가능한 표지의 예는 p-이소티오시아나토페닐 Pt(II)-코프로포르피린 I 및 Pd(II)-코프로포르피린 I의 유도체이다.
방사성 표지는, 단백질에 공유 결합하였을 때, 이후 발광한 방사선의 검출에 의해 측정된 결합 사건의 존재를 자연 붕괴하는 방사선핵종이다. 검출가능한 표지로 흔하게 사용되는 방사성핵종은 3H, 125I 및 35S이다. 상기 나열된 표지는 각 표지의 성질에 특이적인 검출 시스템을 사용하여 검출된다.
본원에 사용된 용어 "부위 또는 이의 기능적 단편"은, 포획 시약, 항체, 또는 탄수화물 부분을 포함하는 약물을 확인하는데 사용되는 경우, 모 분자와 동일하거나 유사한 방식으로 표적 파트너에 특이적으로 결합할 수 있는 해당 화합물의 임의의 부위를 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "미리 혼합하는" 또는 "미리 혼합된"이란 분석법을 시작하기 전 분석법의 둘 이상의 성분들을 혼합하는 것을 말한다. 예를 들어, 본원에 기술된 분석법에 사용되는 혈청 및 추가의 탄수화물"의 "예비흡착(또는 "혈청 및 추가의 탄수화물의 예비흡착")은 혈청 또는 추가의 탄수화물과 탄수화물 부분을 포함하는 약물을 혼합시키기 전에 혈청 및 추가의 탄수화물을 사전혼합시키거나 미리항온처리하는 것이다.
용어 "샌드위치 분석법"은 높은 수준의 감도 및 특이성을 제공하는 비경쟁적 분석법 체재를 지칭한다. 상기 체재는 상이한 항체 및 항원의 불균일 샘플을 포함한 피분석물이 2개의 높은 특이성 시약 사이에 결합된 (샌드위치된) 사실로 인해 샌드위치로 지칭된다. 제1 특이적 시약은 플레이트 웰의 바닥에 일반적으로 부착된 고상에 결합하는 정제된 항체 또는 항원인 포획 시약이다. 불균일한 피분석물은 포획 시약에 노출되고 포획 시약에 친화력을 갖는 피분석물의 임의의 구성 성분은 이에 특이적으로 결합할 것이다. 두번째로 높은 특이적 결합 성분을 첨가한다. 결합 성분은 공유 결합된 검출가능한 표지를 갖는다. 이후 복합체, 통상 항체-항원이 검출될 수 있다. 비경쟁적 샌드위치 분석법에서, 표지된 결합 사건의 측정은 샘플에 존재하는 항원의 양과 직접적으로 비례한다.
용어 "특이적으로 결합하는"은 두 분자 사이의 친화력을 지칭하는데, 예를 들어 분자와 이의 결합 파트너 사이의 특이적 결합은 분자와 이의 결합 파트너 및 하나 이상의 상이한 분자를 포함하는 불균일한 샘플에서 우선적인 결합을 초래한다. IgG 항체에서의 결합은, 예를 들어 일반적으로 적어도 약 10-7 M 또는 그 이상, 예컨대 적어도 약 10-8 M 또는 그 이상, 또는 적어도 약 10-9 M 또는 그 이상, 또는 적어도 약 10-10 또는 그 이상, 또는 적어도 약 10-11 M 또는 그 이상, 또는 적어도 약 10-12 M 또는 그 이상의 친화력을 특징으로 한다. IgM 분자는 일부 예에서 10-4 정도 낮은 친화력을 갖는 것으로 공지되어 있다.
대표적인 항신생혈관형성제는 혈관 형성 억제제, 예컨대 파르네실전이효소 억제제, COX-2 억제제, VEGF 억제제, bFGF 억제제, 스테로이드 설파타제 억제제(예, 2-메톡시오에스시오에스 비스-설파메이트(2-MeOE2bisMATE)), 인터루킨-24, 트롬보스폰딘, 메탈로스폰딘 단백질, I형 인터페론, 인터루킨 12, 프로타민, 안지오스타틴, 라미닌, 엔도스타틴, 및 프로락틴 단편을 포함한다.
증식방지제 및 세포사멸촉진제는 PPAR-감마의 활성화제(예, 시클로펜테논 프로스타글란딘(cyPGs)), 레티노이드, 트리터피노이드(예, 시클로아르탄, 루판, 우르산, 올레아난, 프리에델란, 담마란, 쿠쿠르비타신, 및 리모노이드 트리테르페노이드), EGF 수용체의 억제제(예, HER4), 람파마이신, CALCITRIOL.RTM.(1,25-디히드록시콜레칼시페롤(비타민 D)), 아로마타제 억제제(FEMARA.RTM. (레트로존)), 텔로머라제 억제제, 철 킬레이터(예, 3-아미노피리딘-2-카르복스알데히드 티오세미카르바존(트리아핀)), 아폽틴(치킨 아네아미아 바이러스 유래의 바이러스 단백질 3--VP3), Bcl-2 및 Bcl-X(L)의 억제제, TNF-알파, FAS 리간드, TNF 관련 세포사멸 유도 리간드(트레일/Apo2L), TNF-알파/FAS 리간드/TNF 관련 세포사멸 유도 리간드(트레일/Apo2L) 신호전달의 활성화제, 및 PI3K-Akt 생존 경로 신호전달의 억제제(예, UCN-01 및 겔다나마이신)를 포함한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 탄수화물 부분을 갖는 세포독성 약물은 항생제, 예컨대 칼리케아미신이고, 또한 LL-E33288 복합체, 예컨대 감마-칼리케아미신γ1로 지칭된다. 미국 특허 번호 제4,970,198호 참조. 감마 칼리케아미신 히드라지드 유도체의 항체 접합체에 관한 초기 연구는 시험관내 항원을 기초로 하는 세포독성도 및 이종이식 실험에서의 활성도를 보여주었다. 디메틸 치환기를 첨가하여 모든 칼리케아미신 접합체 내 존재하는 디설피드 결합을 안정화시킴으로써 추가로 개선되었다. 본 발명의 항체/약물 접합체를 제조하는데 사용하기에 적당한 칼리케아미신의 추가의 예는 미국 특허 번호 제4,671,958호; 제5,053,394호; 제5,037,651호; 제5,079,233호; 및 제5,108,912호(이의 전문은 본원에 참고 인용됨)에 개시된다. 상기 화합물은 적당한 티올과 반응하여 디설피드를 형성할 수 있고, 동시에 칼리케아미신을 접합시키기에 유용한 작용기, 예컨대 히드라지드 또는 다른 작용기를 항체에 도입시키는 메틸트리설피드를 포함한다. 디메틸 치환기를 첨가하여 모든 칼리케아미신 접합체에 존재하는 디설피드 결합을 안정화시킴으로써 추가로 개선되었다. 이는 접합에 최적화된 유도체 중 하나로서 N-아세틸 감마 칼리케아미신 디메틸 히드라지드, 또는 NAc-감마 DMH의 선택을 초래한다. 또한 칼리케아미신의 디설피드 유사체, 예를 들어 미국 특허 번호 제5,606,040호 및 제5,770,710호(이의 전문은 본원에 참고 인용되었음)에 기술된 유사체를 사용할 수도 있다.
항체/약물 접합체를 제조하는 대표적인 방법은 미국 특허 출원 공개 번호 제2004-0082764A1호 및 미국 특허 출원 공개 번호 제2004-0192900호(이의 전문은 본원에 참고 인용되었음)에서 CMC-544의 제법에 대해 기술된 것을 포함한다. 접합은 다음의 조건을 사용하여 수행될 수 있다: 10 mg/㎖ 항체, 8.5% (w/w) 칼리케아미신 유도체, 37.5 mM 나트륨 데카노에이트, 9% (v/v) 에탄올, 50 mM HEPBS (N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산)), pH 8.5, 32℃, 1시간. 부틸 세파로스 FF 수지, 0.65 M 인산칼륨 로딩용 완충액, 0.49 M 인산칼륨 세척용 완충액, 및 4 mM 인산칼륨 용출 완충액을 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 수행할 수 있다. 크기별 배재 크로마토그래피, 한외여과/정용여과, 또는 기타 적당한 수단에 의해 완충액 교환을 실현할 수 있다.
상기 언급된 담체-약물 접합체의 일부로서, N-아세틸 감마 디메틸 히드라지드는 모두 암 세포 상에 발현되는 CD22 수용체, 5T4 수용체 및 루이스-Y 항원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체와 접합되었다. 상기 담체-약물 접합체는, N-아세틸 감마 디메틸 히드라지드 분자의 일부로서, 메틸글리코시드(즉, S-[(2R,4S,6S)-6-({[(2R,4S,5R)-5-({(2S,4S,5S)-5-[아세틸(에틸)아미노]-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일}옥시)-4-히드록시-6-메톡시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]4-{[(2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]옥시}-3-요오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤젠카르보티오에이트) 탄수화물 부분을 갖는다. 상기 탄수화물은, 다른 탄수화물과 함께, 일반적인 탄수화물 부분에 대해 작용하는 혈청에서 고유 항체와 상호작용할 수 있다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 기타 문헌은 그 전문이 본원에 참고 인용된다.
본 발명은 다음의 실시예에 의해 추가로 예시되고 지지된다. 하지만, 하기 실시예는 결코 본 발명의 범위를 추가로 한정하는 것으로 고려될 수 없다. 그럼에도 불구하고, 당업자라면 본 발명의 취지 및/또는 첨부된 청구 범위의 범위에서 벗어나지 않으면서 본 발명의 기타 구체예, 변형, 및 동등물이 있는 것으로 쉽게 이해할 것이다.
도 1은 칼리케아미신에 대해 결합 특이성을 갖는 미처리 혈청에서 간섭 인자 존재의 도표의 대표도이다.
도 2는 항체와 접합하는 칼리케아미신의 개략적 대표도를 도시한다.
도 3은 해독된 LPS의 다양한 농도로 적정된 혈청에서 특이적으로 결합하는 칼리케아미신의 감소 도표의 대표도이다.
도 4는 칼리케아미신, 메틸 글리코시드의 탄수화물 부분의 다양한 농도로 적정된 혈청에서 특이적으로 결합하는 칼리케아미신의 감소 도표의 대표도이다.
도 5는 해독된 LPS의 다양한 농도로 적정된 혈청에서 특이적으로 결합하는 칼리케아미신의 감소를 입증하는 도표의 대표도이다.
도 6은 칼리케아미신 특이적 혈청 결합 IgM 유래의 칼리케아미신 특이적 IgM의 도표의 대표도를 도시한다.
도 7은 칼리케아미신에 결합하는 칼리케아미신 특이적 혈청 유래의 IgM의 도표의 대표도를 도시한다.
도 8은 미처리 인간 혈청에서 칼리케아미신 특이적 결합 인자의 존재의 도표의 대표도를 도시한다.
도 9는 S-[(2R,4S,6S)-6-({[(2R,4S,5R)-5-({(2S,4S,5S)-5-[아세틸(에틸)아미노]-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일}옥시)-4-히드록시-6-메톡시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]4-{[(2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]옥시}-3-요오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤젠카르보티오에이트)의 화학적 구조를 도시한다.
실시예 1
미처리 혈청에서 신호 간섭
항칼리케아미신 접합체 항체 분석법의 개발 동안, 미처리된 인간 또는 원숭이 혈청 상에서 초기 연구가 시작되었다. 마이크로역가 분석법 플레이트의 웰에 고정된 포획 시약으로서 칼리케아미신을 사용하여 ELISA를 수행하고 이를 4% NFDM/PBST 완충액(무지방 건조 우유/인산완충용액 Tween; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH7.2)으로 블로킹하였다. 인간 또는 원숭이 혈청을 1% NFDM/PBST 중에 희석시키고, ELISA 웰에 첨가한 후, 항온처리하였다. THST(50 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 1 mM 글리신 및 0.05% (v/v) Tween 20, pH 8)로 웰을 세척하고 항 종-HRP 접합체와 함께 항온처리하였다. THST로 플레이트를 세척한 후 TMB(테트라메틸벤지딘) 시약을 첨가함으로써 색조 반응을 현상하였다.
이러한 초기 분석법 동안의 데이타에 반응을 현상한 후 관찰되는 높은 간섭 배경 신호가 나타났다. 후속 분석법에서 웰에 첨가된 혈청 상에서 최대 1:160의 상당한 희석액을 제조하였다. 분석법의 감도에서와 같이, 상기 분석법에서의 배경이 감소하였다. 데이타는 분석법 웰에서 특이적 신호의 간섭의 원인이 되는 혈청 내에 성분이 존재함을 시사하고 있었다. 이러한 높은 배경이 테스트된 인간 혈청 대략 1/3 및 원숭이 혈청 1/3에서 관찰되었다.
칼리케아미신 접합체의 어느 부위가 간섭성 혈청 성분과 상호작용하였는지 측정하기 위해, 가교형 ELISA를 수행하였다. 칼리케아미신 접합체, CMC-544, CMD-193 및 CME-548 및 이들의 비접합된 모 항체, 항-CD22 인간화 단일클론 항체 G544, 항 루이스-Y 인간화 단일클론 G193 및 항-5T4 인간화 단일클론 항체 huH8은 각각 100 ng/㎖의 농도에서 플레이트 상에 고정되었고, 4% NFDM/PBST로 블로킹되었다.
CMD-544는 미국 특허 출원 US2004082764에 기술된 칼리케아미신-단일클론 항체 약물 접합체이다. 상기 담체 약물 접합체의 단일클론 항체 부위는 인간 CD22 항원에 대한 표적 특이성을 갖고, 모 항체는 "G-544"로서 본원에 고안되었다.
CMD-193은 미국 특허 출원 공개 번호 US20060002942에 기술된 칼리케아미신-단일클론 항체 약물 접합체이다. 상기 담체 약물 접합체의 단일클론 항체 부위는 루이스 Y 항원에 대한 표적 특이성을 갖고, 모 항체는 "G-193"으로서 본원에 고안되었다.
CME-548은 미국 특허 출원 공개 번호 US2006008522에 기술된 칼리케아미신-단일클론 항체 약물 접합체이다. 상기 담체 약물 접합체의 단일클론 항체 부위는 인간 5T4 수용체 항원에 대한 표적 특이성을 갖고, 모 항체는 "huH8"로서 본원에 고안되었다.
풀링된 시노몰구스 원숭이 혈청을 1% NFDM/PBST 중에 1:20로 희석시키고 웰에서 항온처리하였다. 대조군으로서 혈청 없이 다른 웰들을 완충액으로 항온처리하였다. THST로 세척 후, PBST 중의 1:2000으로 희석된 칼리케아미신-HRP 접합체와 함께 분석법 플레이트를 항온처리하였다. THST로 상기 웰을 세척 후 TMB 시약으로 현상하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 칼리케아미신 접합체를 포함하고 모 항체를 포함하지 않는 웰에서만 높은 배경이 관찰되었는데, 이는 혈청 성분이 접합체에만 특이 적으로 결합하고, 이의 모 항체에는 결합하지 않고, 칼리케아미신-HRP로 이들을 "가교"시킨다는 것을 가리킨다. 상기 데이타는 혈청 내 간섭 성분이 칼리케아미신 부분에 결합하고 미접합된 모 항체에는 결합하지 않는다는 것을 시사하였다. 추가적으로, 2개의 상이한 칼리케아미신 부분, 칼리케아미신 접합된 항체 및 칼리케아미신-HRP를 가교시키는 혈청 성분의 능력은 간섭하는 혈청 성분으로서 다가 분자, 즉 면역글로불린을 시사하였다.
실시예 2
추가의 탄수화물을 사용함으로써 간섭 감소
혈청 내 간섭 성분과 칼리케아미신 사이에서의 상호작용의 성질을 측정하기 위해, 가교형 ELISA를 수행하였다. 칼리케아미신은, 분자의 일부로서, 일부 혈청 샘플에서 예비존재 항 탄수화물 항체에 의해 결합될 수 있는 탄수화물 부분을 갖는다. CMC-544를 포획 시약으로 사용하고, 분석법 웰 중에 고정시킨 후 4% NFDM/PBST 완충액으로 블로킹시켰다. 이전에 기술된 분석법(미처리)에 사용된 혈청을 1% NFDM/PBST 중에 희석시키고 웰에 첨가하였다. 칼리케아미신 탄수화물과 임의의 상호작용을 경쟁시키려는 시도에 있어서, 해독된 지질다당류(LPS)를 1 ng/㎖∼100 ng/㎖ 범위 농도의 혈청으로 정정하였다. 대조군 웰은 LPS를 포함하지 않았다. 이후 진탕하면서 1시간 동안 분석법을 항온처리하였다(본원의 모든 예에 달리 제시하지 않는 한 표준임). THST로 상기 웰을 세척한 후 이를 PBST 중 1:2000의 희석률로 칼리케아미신-HRP 접합체와 함께 항온처리하였다. 이후 TMB 시약을 첨가함으로써 색조 반응을 위해 분석법을 현상하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, CMC-544 웰에 첨가된 LPS의 양이 증가하는 것은 배경 신호를 감소시키게 된다. LPS 없이 CMC-544를 포함하는 대조군 웰에는 모든 샘플에서 높은 배경이 관찰되었다.
유사한 테스트는 2차 ELISA, 이때 CMC-544 단일클론 항체로 실시하였다. 항체를 분석법 웰에 고정시킨 후 4% NFDM/PBST 완충액으로 블로킹하였다. 이전에 기술된 분석법(미처리)에 사용된 혈청을 1% NFDM/PBST 중에 희석시키고 웰에 첨가하였다. LPS의 해독된 부위 또는 LPS의 간섭 양을 반응물에 첨가하였다. 플레이트 상에서 CMC-544에 결합된 CMC-544(바이오틴)를 혈청에서 항체를 통해 가교시켰다. CMC-544 바이오틴을 HRP 검출기에 결합된 스트렙라비딘으로 검출하였다. LPS 및 해독된 LPS의 증가된 양은 이러한 특이적 결합으로 간섭되었다. 결과를 하기 도 5에 도시하였다.
이러한 데이타는 혈청 내 간섭 성분이 칼리케아미신 상의 탄수화물 부분과 상호작용하지만 접합체의 항체 부위와는 상호작용하지 않는다는 것을 시사하고 있다. LPS를 첨가하는 것은 LPS를 갖는 혈청의 예비흡착의 필요 없이 간섭 혈청 성분에 대해 칼리케아미신 상의 탄수화물과 경쟁시킬 수 있었다.
칼리케아미신 탄수화물 부분을 위한 혈청 성분의 특이성을 입증하기 위해 추가의 연구가 수행되었다. 외인성으로 첨가된 메틸 글리코시드S-[(2R,4S,6S)-6-({[(2R,4S,5R)-5-({(2S,4S,5S)-5-[아세틸(에틸)아미노]-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일}옥시)-4-히드록시-6-메톡시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]4-{[(2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]옥시}-3-요오도-5,6-디메톡시- 2-메틸벤젠카르보티오에이트)에서 칼리케아미신 상의 메틸글리코시드 부분과 임의의 상호작용을 특이적으로 경쟁시키는 능력을 테스트하여 혈청 성분과의 상호작용을 억제시켰다. LPS를 첨가하는 것에 관하여 상기 기술된 바와 같이, CMD-193, CME-548 및 CMC-544를 포함하는 개별 웰에서 동일한 분석법을 수행하였다. 미접합된 모 항체를 대조군으로 사용하였다. 2∼2000 ng/㎖ 범위의 각종 최종 농도로 LPS에 대한 이러한 분석법에서 상기 메틸글리코시드를 대체하였다. 도 4에 도시한 바와 같이, 상기 제시된 메틸 글리코시드는 30∼70 nM 범위의 IC50을 갖는 테스트된 혈청 내 간섭 성분의 유효한 억제제가 되는 것으로 입증되었다. 이러한 데이타는 혈청 내 간섭 성분이 칼리케아미신 상에 존재하는 탄수화물 메틸글리코시드 S-[(2R,4S,6S)-6-({[(2R,4S,5R)-5-({(2S,4S,5S)-5-[아세틸(에틸)아미노]-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일}옥시)-4-히드록시-6-메톡시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]4-{[(2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]옥시}-3-요오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤젠카르보티오에이트)에 특이적으로 결합한다는 것을 시사하고 있다.
실시예 3
간섭 인자가 아닌 혈청 IgG
상기 언급된 바와 같이, 인자의 가교 능력은 면역글로불린을 가리킨다. IgG 및 IgM 둘다는 가능성으로 초기에 조사되었다. IgG의 경우, 단백질 A 수지는 간섭 인자를 포함하는 것으로 공지된 원숭이 혈청 유래의 IgG 분획을 정제하는데 사용되 었다. SDS-PAGE는 IgG의 성공적인 단리를 제시하였다(미제시됨; L38054-17). 뱃치 결합성 크로마토그래피 공정 동안 샘플의 필연적인 희석을 유발하는 농도를 조절한 후 가교 능력에 대해 혈청의 IgG 농축된 분획 및 IgG 감소된 분획 둘다를 테스트하였다.
상기 결과는, 정제된 IgG 분획이 완충액 단독 배경 하에서 가교적 활성이 없음을 보여주었고, IgG 감소된 분획은 미처리된 혈청으로서 동일한 수준의 LPS 민감성 가교 활성을 제시함으로써 입증되었다. 따라서, IgG는 활성에 대한 원인이 되는 것으로 보이지 않는다.
실시예 4
IgM 으로서 혈청 인자의 확인
이전에 기술된 분석법에 관찰된 간섭의 원인이 될 수 있는 칼리케아미신의 탄수화물 부분에 결합하는 혈청에서 간섭 분자의 성질을 측정하기 위해, 가교형 ELISA를 수행하였다. 포획 시약(CMC-544, 이의 비접합된 모 항체 G544, 또는 긍정 대조군으로서의 원숭이 IgM)으로 분석법 웰을 코팅하였다. 음성 대조군으로 우유를 사용하였다. 이후 4% NFDM/PBST 완충액으로 웰을 블로킹하였다. 1% NFDM/PBST 중에 혈청을 희석시키고 웰에 첨가하였다. 250 ㎍/㎖ 농도에서 혈청에 LPS를 첨가하고 항온처리하였다. THST로 웰을 세척하고 이를 항 IgM-HRP와 항온처리하여 플레이트에 결합된 임의의 IgM을 검출하였다. TMB 시약을 첨가하여 색조 반응을 위해 분석법을 현상하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, CMC-544는 혈청 유래의 대량의 IgM을 포획하고, 지질다당류의 존재 하에서 유의적으로 약한 신호가 얻어졌다. 극히 적은 IgM이 미접합된 모 항체 G544에 결합하였다.
추가의 분석법에서, 항 원숭이 IgM으로 웰을 코팅하였다. 항 마우스 IgG를 음성 대조군으로 사용하였다. .001∼10% 범위의 PBST 중에 제조된 혈청의 희석액을 제조하고 웰에 첨가하였다. 항온처리 후, 칼리케아미신-HRP를 첨가하였다. 플레이트를 세척하고 TMB 시약으로 현상하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 플레이트 상에 포획된 혈청 IgM은 용량 의존적 방식으로 칼리케아미신-HRP에 결합하였다. 항 마우스 IgG를 포함하는 웰은 그렇지 않았다.
이러한 데이타는 일부 혈청 내에 존재하는 IgM이 칼리케아미신 분자의 탄수화물 부위에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다는 것을 입증한다. 이러한 결합은 칼리케아미신 접합체에 대한 항체를 검출하거나 칼리케아미신 자체를 검출하는데 사용되는 분석법에서 높은 배경 신호를 발생시킬 수 있다. 외인성으로 첨가된 탄수화물을 분석법에 첨가하는 것은 혈청 내 간섭성 IgM의 존재에 의해 발생된 신호의 폐기를 도울 것이다.
실시예 5
항 탄수화물 IgM 을 포함하는 미처리 혈청
미처리 인간 혈청의 무작위 패널에서 항 탄수화물 항체의 만연도를 측정하기 위해, 가교형 ELISA를 수행하였다. CMC-544를 포획 시약으로 사용하고 분석법 웰에 고정시켰다. 4% NFDM/PBST 완충액으로 웰을 블로킹하였다. 1% NFDM/PBST 중에 미처리 혈청 샘플을 희석시키고, 웰에 첨가한 후, 항온처리하였다. THST로 웰을 세척한 후 칼리케아미신-HRP와 함께 항온처리하였다. TMB 시약을 첨가하여 색조 반응을 위 해 분석법을 현상시켰다. 조사된 혈청 샘플의 백분율이 칼리케아미신 상의 탄수화물 부분에 결합할 수 있는 간섭성 IgM을 얼마나 포함하는지 측정하는 이 분석법에는 탄수화물을 첨가하지 않았다. 도 8에 도시된 바와 같이, 테스트된 혈청 샘플의 대략 30%는 간섭을 나타내었다. 유사한 관찰이 미처리 원숭이 혈청에서 언급되었는데, 여기서 20마리의 원숭이 중 2마리는 높은 수준의 항 탄수화물 항체를 나타내고 20마리 중 8마리는 유의적 수준의 항 탄수화물 항체를 나타내었다.
실시예 6
혈청 내 항- 칼리케아미신 접합체 항체의 검출
칼리케아미신 접합된 단일클론 항체, 예컨대 CMC-544에 노출에 반응하여 특이적으로 생성된 혈청 내 항체의 존재를 검출하기 위해, 칼리케아미신 상에 존재하는 최적 농도의 메틸 글리코시드 S-[(2R,4S,6S)-6-({[(2R,4S,5R)-5-({(2S,4S,5S)-5-[아세틸(에틸)아미노]-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일}옥시)-4-히드록시-6-메톡시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]4-{[(2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]옥시}-3-요오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤젠카르보티오에이트)를 측정한 후 가교형 ELISA를 수행하였다.
미처리 혈청은, 약물에 노출시킨 후 항약물 항체의 생성에 대해 테스크하고자 하는 피험체로부터 미처리 혈청으로부터의 고유 항 탄수화물 배경 노이즈를 제거하는 탄수화물의 최소 (및 이에 따라 최적의) 농도를 측정하기 위해 상기와 같이 적정되었다.
실험 피험체에 CMC-544를 주사하거나 그렇지 않으면 이를 노출시키고 혈청을 수집하였다. CMC-544, 및 비접합된 모 항체 G544를 포획 시약으로 사용하고 100 ng/㎖의 농도에서 개별 웰에 고정시켰다. 4% NFDM/PBST 완충액으로 상기 웰을 블로킹하였다. 노출된 피험체로부터 혈청을 수집하고, 이를 1% NFDM/PBST와 혼합시키고, 웰에 첨가한 후, 항온처리하였다. THST로 상기 웰을 세척하고 칼리케아미신-HRP 접합체 및 최적 농도의 추가의 탄수화물 메틸 글리코시드(칼리케아미신 상에 존재하는 S-[(2R,4S,6S)-6-({[(2R,4S,5R)-5-({(2S,4S,5S)-5-[아세틸(에틸)아미노]-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일}옥시)-4-히드록시-6-메톡시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]4-{[(2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]옥시}-3-요오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤젠카르보티오에이트)와 항온처리하였다. 대안적으로, 추가의 탄수화물을 포획 시약과 함께 초기 항온처리된 혈청을 갖는 웰 및 대조군 웰에 직접 첨가할 수 있다. 세척시킨 후, TMB 시약을 첨가하여 색조 반응을 위해 플레이트를 현상하였다. 현상 후 색조 반응이 존재하는 것은 고유 항 탄수화물 항체에 대한 결과가 아니고 대신에 담체-약물 접합체에 반응하여 면역 반응을 생성하는 결과인 혈청 내 칼리케아미신 접합체에 대한 항체의 존재를 가리키는 것이다.
항체 반응이 칼리케아미신의 탄수화물 부위에 대해 발생하는 경우를 측정하기 위해, 노출된 피험체 유래의 혈청을 칼리케아미신 특이적 메틸 글리코시드로 적정하여 항체 반응이 배경 수준으로 돌아가는 경우를 측정하였다. 항체 반응이 배경 수준으로 전환되어 적정되는 경우, 담체-약물 접합체에 반응하여 발생된 항체 반응은 칼리케아미신의 탄수화물 부분으로 인한 것이다.
실시예 7
약물이 탄수화물 부분을 갖는 담체 약물 접합체에 대해 항체 존재에 대한 미처리 혈청의 테스트
칼리케아미신 접합체를 처리하는 후보자 피험체 유래의 혈청 내 예비존재 간섭성 IgM의 존재를 측정하기 위해, 가교형 ELISA를 수행하였다. 칼리케아미신을 포획 시약으로 사용하고 이를 분석법 웰에 고정시켰다. 4% NFDM/PBST 완충액으로 웰을 블로킹하였다. 약물 미처리 피험체로부터 수집된 혈청을 1% NFDM/PBST 중에 희석시키고, 분석법에 첨가하고 항온처리하였다. 최적 농도의 메틸 글리코시드를 상기 기술된 바와 같이 측정하였다. 탄수화물의 적정은 또한 각 혈청 샘플에 대해 탄수화물 대조군 테스트를 포함하지 않을 수 있다. THST로 상기 웰을 세척하고 칼리케아미신-HRP 접합체 및 최적 농도의 추가의 메틸 글리코시드 (칼리케아미신 상에 존재하는 S-[(2R,4S,6S)-6-({[(2R,4S,5R)-5-({(2S,4S,5S)-5-[아세틸(에틸)아미노]-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일}옥시)-4-히드록시-6-메톡시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]4-{[(2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]옥시}-3-요오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤젠카르보티오에이트))와 함께 항온처리하였다. 세척 후, TMB 시약을 첨가하여 색조 반응을 위해 플레이트를 현상하였다. 색조 반응은 Ig가 웰에 결합된 칼리케아미신에 결합하고 또한 후속 첨가된 칼리케아미신 HRP에 결합한다는 것을 가리키고 있다.
대안적으로, 미처리 혈청의 초기 스크리닝은 첨가된 추가의 탄수화물을 포함하지 않는다. 이후 혈청은 탄수화물의 적정을 실시하여 탄수화물이 혈청 반응성의 표적인 것을 확인하였다.
실시예 8
약물로서 칼리케아미신을 이용한 담체-약물 접합체의 테스트
상기 약물을 투여한 피험체 유래의 혈청에서 칼리케아미신 접합체, 예컨대 CMC-544를 검출하기 위해, ELISA를 수행하였다. 피험체에 CMC-544를 주사하거나 그렇지 않으면 이를 노출시키고 혈청을 수집하였다. 모 항체 G544에 의해 특이적으로 결합되는 항원인 CD22를 분석법 웰에 고정시키고 포획 시약으로 사용하였다. 이후 4% NFDM/PBST 완충액으로 웰을 블로킹하였다. 1% NFDM/PBST 중에 혈청을 희석시키고 웰에 첨가한 후 항온처리하였다. 추가의 탄수화물이 CD22 특이적 결합에 의해 CMC-544의 포획에 간섭하지 말아야 하기 때문에, 상당한 과량의 탄수화물을 여기에 첨가하여 CMC-544에 결합할 수 있는 혈청 내 존재하는 항체를 블로킹할 수 있다. (THST로 플레이트를 세척하고 이를 항-칼리케아미신-HRP 접합체와 항온처리한 후 TMB 시약을 첨가하여 색조 반응을 위해 플레이트를 현상하였음.) 색조 반응은 혈청 내 칼리케아미신 접합체의 존재를 나타낸다.

Claims (68)

  1. (a) (i) 체액 샘플을
    (ii) 탄수화물 부분을 포함하는 약물 및
    (iii) 추가의 탄수화물
    과 배합시키는 단계; 및
    b) 샘플 내 항체와 탄수화물 부분을 포함하는 약물 사이에 특이적 결합이 발생하는지 여부를 검출하는 단계
    를 포함하는, 피험체로부터의 항체를 포함하는 체액 샘플 내에 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 대한 항체의 존재를 검출하기 위한 분석법으로서,
    샘플 내 항체와 탄수화물 부분을 포함하는 약물 사이에 특이적 결합이 발생하는지 여부를 검출하기 전에 상기 추가의 탄수화물을 체액 샘플과 미리 혼합시키지 않는 것인 분석법.
  2. (a) (i) 체액 샘플을
    (ii) 탄수화물 부분을 포함하는 약물 및
    (iii) 추가의 탄수화물
    과 배합시키는 단계; 및
    (b) 샘플 내 항체와 탄수화물 부분을 포함하는 약물 사이에 특이적 결합이 발생하는지 여부를 검출하는 단계
    를 포함하는, 피험체로부터의 항체를 포함하는 체액 샘플 내에 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 대한 항체의 존재를 검출하기 위한 분석법으로서,
    상기 탄수화물 부분을 포함하는 약물은 당단백질을 포함하지 않는 것인 분석법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 피험체를 노출시킨 후에 수행하는 분석법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 피험체를 노출시키기 전에 수행하는 분석법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 추가의 탄수화물은, 샘플과 탄수화물 부분을 포함하는 약물을 배합시킨 후 첨가하는 분석법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피험체로부터의 체액 샘플은 전혈; 혈청; 점액, 타액, 초유 및 혈장 중 하나 이상을 포함하는 분석법.
  7. 제6항에 있어서, 검출 단계는 샌드위치 분석법, 가교 분석법 및 경쟁적 결합 분석법 중 하나 이상을 포함하는 분석법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 검출 단계는 샘플과 접촉하는 고체 광학 표면에서 굴절률의 변화를 검출하는 것; 발광의 변화를 검출하는 것; 색조의 변화를 측정하는 것; 방사능의 변화를 검출하는 것; 생물학적 층 간섭분석계를 사용하여 측정하는 것; 캔틸레버 검출을 사용하여 측정하는 것; 무표지 고유 화상(label-free intrinsic imaging)을 사용하여 측정하는 것; 및 음향 검출을 사용하여 측정하는 것 중 하나 이상을 포함하는 분석법.
  9. 제8항에 있어서, 검출 단계는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA); 전기화학발광 분석법(ECL); 방사면역분석법(RIA); 고상 방사면역분석법(SPRIA); 면역블롯팅; 면역침전법; 형광활성세포분리법(FACS)으로 이루어진 군에서 선택된 분석법을 포함하는 분석법.
  10. 제9항에 있어서, 검출 단계는 가교 분석법을 포함하는 분석법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 검출 단계는 ELISA를 포함하는 분석법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 추가의 탄수화물은 박테리아 지질다당류(LPS) 또는 이의 단편, 덱스트란 또는 이의 단편, 레반 또는 이의 단편, 폐렴구균 다당류 또는 이의 단편, 아가로스 또는 이의 단편, 셀룰로스 또는 이 의 단편, 카라지난 또는 이의 단편, 및 메틸글리코시드 또는 이의 단편인 분석법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 추가의 탄수화물은 약 10 ng/㎖∼약 1 mg/㎖의 농도로 단계 a)의 배합물에 존재하는 분석법
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 탄수화물 부분을 포함하는 약물은 약물에 접합된 담체를 추가로 포함하는 분석법.
  15. 제14항에 있어서, 담체는 단일클론 및 다클론 항체 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 이의 항원 인식 단편 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 소형 모듈 면역의약품(SMIP: small modular immunopharmaceuticlas) 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 나노바디 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 가용성 수용체 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 성장 인자 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 압타머; 리포좀; 비글리코실화 단백질; 및 나노입자로 이루어진 군에서 선택되는 분석법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 담체는 암 세포의 표면 상에 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 분석법.
  17. 제16항에 있어서, 암 세포 상에 발현된 항원은 5T4; CD19; CD20; CD22; CD33; 루이스 Y; HER-2; 면역글로불린 G의 I형 Fc 수용체(Fc 감마 R1); CD52; 표피세포 성장 인자 수용체(EGFR); 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF); DNA/히스톤 복합체; 태아성 암 항원(CEA); CD47; VEGFR2(혈관 내피세포 성장 인자 수용체 2 또는 키나아제 인서트 도메인 함유 수용체, KDR); 상피 세포 부착 분자(Ep-CAM); 섬유아세포 활성화 단백질(FAP); 트레일 수용체-1(DR4); 프로게스테론 수용체; 종양태아성 항원 CA 19.9; 및 섬유소로 이루어진 군에서 선택되는 분석법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 담체는 단일클론 항체인 분석법.
  19. 제18항에 있어서, 단일클론 항체는 항-CD22 단일클론 항체; 항-5T4 단일클론 항체; 항 루이스 Y 단일클론 항체: 및 항-CD33 단일클론 항체로 이루어진 군에서 선택되는 분석법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 탄수화물 부분을 포함하는 약물은 세포독성제; 방사능요법제; 면역조절제; 항신생혈관형성제; 증식방지제; 세포사멸촉진제(pro-apoptotic agent); 화학요법제; 및 치료적 핵산으로 이루어진 군에서 선택되는 분석법.
  21. 제20항에 있어서, 탄수화물 부분을 포함하는 약물은 세포독성제인 분석법.
  22. 제21항에 있어서, 세포독성제는 튜불린 중합 억제제; DNA에 결합하여 이를 파괴하는 알킬화제; 단백질 합성의 억제제; 또는 티로신 키나아제 억제제인 분석법.
  23. 제21항에 있어서, 세포독성제는 칼리케아미신, 티오테파, 탁산, 빈크리스틴, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 타목시펜, 이다루비신, 돌라스타틴/아우리스타틴, 헤미아스테를린, 및 마이탄시노이드에서 선택되는 분석법.
  24. 제23항에 있어서, 세포독성제는 칼리케아미신인 분석법.
  25. 제24항에 있어서, 칼리케아미신은 N-아세틸 감마 디메틸 히드라지드 칼리케아미신인 분석법.
  26. 제25항에 있어서, N-아세틸 감마 디메틸 히드라지드 칼리케아미신은 담체 단일클론 항체에 접합되고 단일클론 항체는 5T4; CD19; CD20; CD22; CD33; 루이스 Y; HER-2; 면역글로불린 G의 I형 Fc 수용체 (Fc 감마 R1); CD52; 표피세포 성장 인자 수용체(EGFR); 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF); DNA/히스톤 복합체; 태아성 암 항원(CEA); CD47; VEGFR2(혈관 내피세포 성장 인자 수용체 2 또는 키나아제 인서트 도메인 함유 수용체, KDR); 상피 세포 부착 분자(Ep-CAM); 섬유아세포 활성화 단백질(FAP); 트레일 수용체-1(DR4); 프로게스테론 수용체; 종양태아성 항원 CA 19.9; 및 섬유소로 이루어진 군에서 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 분석법.
  27. 제22항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 추가의 탄수화물은 S-[(2R,4S,6S)-6-({[(2R,4S,5R)-5-({(2S,4S,5S)-5-[아세틸(에틸)아미노]-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일}옥시)-4-히드록시-6-메톡시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]4-{[(2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]옥시}-3-요오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤젠카르보티오에이트)인 분석법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 검출 단계는 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 특이적으로 결합하는 샘플 내 항체와 포획 시약의 특이적 결합을 추가로 포함하는 분석법.
  29. 제28항에 있어서, 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 특이적으로 결합하는 항체의 존재는 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 특이적으로 결합하는 항체와 화합물의 특이적 결합에 의해 검출되는 분석법.
  30. 제29항에 있어서, 화합물은 검출가능한 표지를 추가로 포함하는 포획 시약; 및 검출가능한 표지를 추가로 포함하는 제2 항체로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 제2 항체는 결합된 항체에 특이적으로 결합하는 분석법.
  31. 제30항에 있어서, 검출가능한 표지는 효소 표지; 발광 표지; 단백질 표지; 비타민 표지; 방사성동위원소 표지로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 표지를 포함하는 분석법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 포획 시약은 칼리케아미신을 포함하는 분석법.
  33. 제32항에 있어서, 포획 시약은 칼리케아미신의 탄수화물 부분 또는 이의 기능적 단편인 분석법.
  34. 제33항에 있어서, 칼리케아미신의 탄수화물 부분은 칼리케아미신 상에 존재하는 S-[(2R,4S,6S)-6-({[(2R,4S,5R)-5-({(2S,4S,5S)-5-[아세틸(에틸)아미노]-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일}옥시)-4-히드록시-6-메톡시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]4-{[(2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]옥시}-3-요오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤젠카르보티오에이트)인 분석법
  35. 제1항에 기술되어 있고, 실시예 5, 6 또는 7 중 어느 하나에 추가로 기술된 바와 같은 분석법.
  36. (a) (i) 체액 샘플을
    (ii) 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 특이적으로 결합하는 포획 시약 및
    (iii) 추가의 탄수화물
    과 배합시키는 단계; 및
    b) 샘플 내 탄수화물 부분을 포함하는 약물과 포획 시약 사이에 특이적 결합이 발생하는지 여부를 검출하는 단계
    를 포함하는, 항체를 포함하는 체액 샘플 내에 탄수화물 부분을 포함하는 약물의 존재를 검출하기 위한 분석법으로서,
    포획 시약과 탄수화물 부분을 포함하는 약물 사이에 특이적 결합이 발생하는지 여부를 검출하기 전에 상기 추가의 탄수화물을 체액 샘플과 미리 혼합시키지 않는 분석법.
  37. (a) (i) 체액 샘플을
    (ii) 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 특이적으로 결합하는 포획 시약 및
    (iii) 추가의 탄수화물
    과 배합시키는 단계; 및
    b) 샘플 내 탄수화물 부분을 포함하는 약물과 포획 시약 사이에 특이적 결합이 발생하는지 여부를 검출하는 단계
    를 포함하는, 항체를 포함하는 체액 샘플 내에 탄수화물 부분을 포함하는 약물의 존재를 검출하기 위한 분석법으로서,
    상기 탄수화물 부분을 포함하는 약물은 당단백질을 포함하지 않는 분석법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 포획 시약에 결합된 약물의 존재는 또한 약물에 특이적으로 결합하는 화합물로 검출되는 분석법.
  39. 제38항에 있어서, 포획 시약은 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편 및 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 특이적으로 결합하는 표적 분자 중 하나 이상인 분석법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 약물에 또한 특이적으로 결합하는 화합물은 표지되고, 검출가능한 표지를 추가로 포함하는 포획 시약; 및 검출가능한 표지를 추가로 포함하는 항체로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 항체는 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 특이적으로 결합하는 분석법.
  41. 제38항 또는 제39항에 있어서, 약물에 또한 특이적으로 결합하는 화합물은 하나 이상의 순차적 중간체 화합물과의 결합에 의해 검출되고, 상기 순차적 중간체 화합물 중 하나 이상은 검출가능한 표지를 포함하는 분석법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 검출가능한 표지는 효소 표지; 발광 표지; 단백질 표지; 비타민 표지; 및 방사성동위원소 표지로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 표지를 포함하는 분석법.
  43. 제36항 내지 제42항 중 어느 하나의 항에 있어서, 체액 샘플은 전혈; 혈청; 점액, 타액; 초유 및 혈장 중 하나 이상을 포함하는 분석법.
  44. 제36항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 있어서, 검출 단계는 샌드위치 분석법; 가교 분석법; 및 경쟁적 결합 분석법으로 이루어진 군에서 선택된 분석법을 포함하는 분석법.
  45. 제44항에 있어서, 검출 단계는 샘플과 접촉하는 고체 광학 표면에서 굴절률의 변화를 측정하는 것; 발광의 변화를 측정하는 것; 색조의 변화를 측정하는 것; 및 방사능의 변화를 측정하는 것; 생물학적 층 간섭분석계를 사용하여 측정하는 것; 캔틸레버 검출을 사용하여 측정하는 것; 무표지 고유 화상을 사용하여 측정하는 것; 및 음향 검출을 사용하여 측정하는 것 중 하나 이상을 포함하는 분석법.
  46. 제45항에 있어서, 검출 단계는 ELISA; ECL; RIA; SPRIA; 면역블롯팅; 면역침전법; 및 면역염색법으로 이루어진 군에서 선택된 분석법을 포함하는 분석법.
  47. 제46항에 있어서, 검출 단계는 가교 분석법을 포함하는 분석법.
  48. 제47항에 있어서, 검출 단계는 ELISA를 포함하는 분석법.
  49. 제36항 내지 제48항 중 어느 하나의 항에 있어서, 추가의 탄수화물은 약 10 ng/㎖∼약 1 mg/㎖의 농도로 샘플 내에 존재하는 분석법.
  50. 제49항에 있어서, 샘플에 첨가된 탄수화물은 박테리아 지질다당류(LPS), 덱스트란, 레반, 폐렴구균 다당류, 아가로스, 셀룰로스, 카라지난 또는 메틸글리코시드인 분석법.
  51. 제36항 내지 제50항 중 어느 하나의 항에 있어서, 탄수화물 부분을 포함하는 약물은 약물에 접합된 담체를 추가로 포함하는 분석법.
  52. 제51항에 있어서, 담체는 단일클론 및 다클론 항체 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 이의 항원 인식 단편 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 소형 모듈 면역의약품(SMIP) 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 나노바디 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 가용성 수용체 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 성장 인자 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 대응부; 압타머; 리포좀; 비글리코실화 단백질; 및 나노입자로 이루어진 군에서 선택되는 분석법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 담체는 암 세포의 표면 상에 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 분석법.
  54. 제53항에 있어서, 암 세포 상에 발현된 항원은 5T4; CD19; CD20; CD22; CD33; 루이스 Y; HER-2; 면역글로불린 G의 I형 Fc 수용체(Fc 감마 R1); CD52; 표피세포 성장 인자 수용체(EGFR); 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF); DNA/히스톤 복합체; 태아성 암 항원(CEA); CD47; VEGFR2(혈관 내피세포 성장 인자 수용체 2 또는 키나아제 인서트 도메인 함유 수용체, KDR); 상피 세포 부착 분자(Ep-CAM); 섬유아세포 활성화 단백질(FAP); 트레일 수용체-1(DR4); 프로게스테론 수용체; 종양태아성 항원 CA 19.9; 및 섬유소로 이루어진 군에서 선택되는 분석법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 담체는 단일클론 항체인 분석법.
  56. 제55항에 있어서, 단일클론 항체는 5T4; CD19; CD20; CD22; CD33; 루이스 Y; HER-2; 면역글로불린 G의 I형 Fc 수용체(Fc 감마 R1); CD52; 표피세포 성장 인자 수용체(EGFR); 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF); DNA/히스톤 복합체; 태아성 암 항원(CEA); CD47; VEGFR2(혈관 내피세포 성장 인자 수용체 2 또는 키나아제 인서트 도메인 함유 수용체, KDR); 상피 세포 부착 분자(Ep-CAM); 섬유아세포 활성화 단백질(FAP); 트레일 수용체-1(DR4); 프로게스테론 수용체; 종양태아성 항원 CA 19.9; 및 섬유소로 이루어진 군에서 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 분석법.
  57. 제36항 내지 제56항 중 어느 하나의 항에 있어서, 탄수화물 부분을 포함하는 약물은 세포독성제; 방사능요법제; 면역조절제; 항신생혈관형성제; 증식방지제; 세포사멸촉진제; 화학요법제; 및 치료적 핵산으로 이루어진 군에서 선택되는 분석법.
  58. 제57항에 있어서, 탄수화물 부분을 포함하는 약물은 세포독성제인 분석법.
  59. 제58항에 있어서, 세포독성제는 튜불린 중합 억제제; DNA에 결합하여 이를 파괴하는 알킬화제; 단백질 합성의 억제제; 또는 티로신 키나아제 억제제인 분석법.
  60. 제59항에 있어서, 세포독성제는 칼리케아미신, 티오테파, 탁산, 빈크리스틴, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 타목시펜, 이다루비신, 돌라스타틴/아우리스타틴, 헤미아스테를린, 및 마이탄시노이드에서 선택되는 분석법.
  61. 제57항에 있어서, 세포독성제는 칼리케아미신인 분석법.
  62. 제61항에 있어서, 칼리케아미신은 N-아세틸 감마 디메틸 히드라지드 칼리케아미신인 분석법.
  63. 제62항에 있어서, N-아세틸 감마 디메틸 히드라지드 칼리케아미신은 담체 단일클론 항체에 접합되고 담체-약물 접합체는 CMC-544; CME-548; CMD-193; 및 젬투주맙 오조가미신으로 이루어진 조성물의 군에서 선택되는 분석법.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 하나의 항에 있어서, 추가의 탄수화물은 메틸글리코시드인 분석법.
  65. 제36항 내지 제64항 중 어느 하나의 항에 있어서, 포획 시약은 5T4; CD19; CD20; CD22; CD33; 루이스 Y; HER-2; 면역글로불린 G의 I형 Fc 수용체(Fc 감마 R1); CD52; 표피세포 성장 인자 수용체(EGFR); 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF); DNA/히스톤 복합체; 태아성 암 항원(CEA); CD47; VEGFR2(혈관 내피세포 성장 인자 수용체 2 또는 키나아제 인서트 도메인 함유 수용체, KDR); 상피 세포 부착 분자(Ep-CAM); 섬유아세포 활성화 단백질(FAP); 트레일 수용체-1(DR4); 프로게스테론 수용체; 종양태아성 항원 CA 19.9; 및 섬유소로 이루어진 군에서 선택되는 분석법.
  66. 제36항 내지 제64항 중 어느 하나의 항에 있어서, 포획 시약은 항-칼리케아미신 항체인 분석법.
  67. 제36항 내지 제66항 중 어느 하나의 항에 기술되어 있고, 실시예 7에 추가로 기술된 바와 같은 분석법.
  68. 제29항 또는 제30항에 있어서, 탄수화물 부분을 포함하는 약물에 특이적으로 결합하는 항체에 결합하는 화합물은 하나 이상의 순차적 중간체 화합물과의 결합에 의해 검출되고, 상기 순차적 중간체 화합물 중 하나 이상은 검출가능한 표지를 포함하는 분석법.
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