KR20100025435A - 알레르기성 염증 억제 조성물 - Google Patents

Abstract

광물성 미네랄은 한방이나 민간요법에서 오랜 기간 질병치료 목적으로 사용되어 오고 있다. 비염, 천식, 아토피성 피부염과 같은 알레르기성 염증에 대한 광물성 미네랄 혼합물의 효과를 리폭시게나제 활성, 히스타민과 β-hexosaminidase 방출, 염증성 cytokine 및 혈청 IgE 농도를 중심으로 분석하였다. 그 결과 ovalbumin으로 염증을 유도한 쥐에 광물성 미네랄 혼합물을 경구투여한 혈청의 IgE 농도가 감소함을 확인할 수 있었다. 또한 기관지 폐포 세척액과 폐 조직의 IL-4와 TNF-a의 mRNA 발현도 크게 감소하였다.

H&E 염색에 의해 폐 조직 내의 염증세포를 관찰한 결과 염증반응을 유도한 폐 조직에서는 염증관련 세포가 증가했으나 광물성 미네랄 복합물을 처리한 쥐의 폐 조직에서는 염증관련 세포가 현저히 줄어들었으며 PBS를 처리한 정상군과 비슷한 경향을 보였다. 쥐의 호염기성 백혈병 세포인 RBL-2H3 세포에 anti-DNP-IgE 감작 후 광물성 미네랄 혼합물을 처리하고 히스타민과 β-hexosaminidase 방출양을 측정한 결과 미네랄 농도 증가에 의존적으로 히스타민과 β-hexosaminidase 방출양이 크게 감소하였다.

광물성 미네랄 혼합물은 염증과 알레르기성 반응에 관여하는 리폭시게나제 활성도 감소시켰다. 이러한 결과는 종합적으로 광물성 미네랄 혼합물이 알레르기 염증을 억제하는 효과가 있음을 보여준다.

알레르기, 염증, 광물성 미네랄, 히스타민, 리폭시게나제

Description

알레르기성 염증 억제 조성물{Inhibitory effect of ore mineral mixtrue on the allergic inflammation}

알레르기성 염증 억제 조성물을 개시한다.

알레르기 (Allergy)란 알레르겐과 같은 비자기 (non-self) 물질에 대해 면역학적 기전에 의해 야기되는 병적인 과민반응을 말하며, 항체 또는 세포에 의해서 매개된다. 알레르기 반응은 Th2 (T-helper type 2) 세포반응으로 대표되는데 이에는 IL-4, IL-5, IL-13과 종양괴사인자 (TNF)-a와 같은 사이토카인이 관여하고 RANTES (regulated upon activation, normal T-cell expressed & secreted), eotaxin과 macrophage chemoattractant protein-3 (MCP-3)같은 케모카인이 알레르기 염증반응에 중요한 역할을 한다(도 1). 또한 자기 (self) 물질에 대해서 병적인 과민반응을 보이는 자가면역질환 (autoimmunity)도 포함된다.

한편, 과민 반응 (Hypersensitivity reaction)은 어떤 특정한 자극에 노출되면 재발 가능한 증상이나 증후가 일어나는 것으로 면역학적 또는 다른 기전에 의해 일어날 수 있는 여러 증폭된 증상 및 반응을 말한다(도 2). 과민 반응은 Coombs and Gell에 의하여 I, II, III와 IV로 분류할 수 있고 Janeway 등은 이 중 II형 과 민 반응과 IV형 과민 반응을 세분화하여 분류하였다.

과민 반응 중 I형은 IgE (Immunoglobulin E)가 매개하며 알레르겐이 비만세포 표면의 IgE에 접촉하여 세포내 비만세포 또는 호염기구에서 여러 물질을 생산, 분비하여 일어나는 세포내 신호전달 반응이다. 과민 반응형에 의해 일어나는 임상적 증상은 알레르기성 비염, 천식, 아토피, 아나필락시스, 두드러기 등이 있다.

II형과 III형 과민 반응은 특이 IgG에 의해 매개된다. II형 과민 반응의 경우 주로 IgG가 세포 표면에 드러나 있는 항원과 결합하여 세포 독성을 초래하고 일부는 IgG가 세포 용해 또는 사멸 등 세포의 기능을 변화시키게 된다. Janeway 등은 이를 세분화하여 전자의 경우를 IIa형 과민 반응, 후자의 경우를 IIb형 과민 반응으로 세분화하였다. III 형 과민 반응은 IgG가 용해성 항원과 결합하여 면역 복합체를 형성하고 이로 인하여 조직 손상이 일어난다.

IV형 과민 반응은 T 세포에 의해 일어나는 과민 반응으로 IVa1형, IVa2형 , IVb형 과민 반응으로 분류할 수 있고, IVa1형 과민 반응은 Th1 세포에 의해 대식 세포가 활성화되어 조직 손상이 오는 경우이다. IVa2형 과민 반응은 Th2 세포에 의해 호산구 등이 주로 작용하여 조직 손상이 오는 경우를 말하며 IVb형 과민 반응은 T 세포에 의한 세포독성으로 직접적인 조직 손상이 초래되는 경우이다.

알레르기성 비염, 천식, 아토피성 피부염, 그리고 음식 알레르기와 같은 알레르기성 질병으로 인해 전 인구의 20%가 알레르기 질환을 겪고 있으며 이는 계속 증가하고 있다. 최근에는 환경과 음식 알레르기원으로 인한 알레르기 환자의 수가 빠르게 증가하고 있다. 알레르기성 비염은 주로 IgE로 매개되는 질병으로 알레르겐 에 의해 비만세포가 활성화되면 호산구, 호중구와 Th2 임파구를 포함하는 염증 세포의 활성화가 유도되어 주로 히스타민, 류코트리엔과 사이토카인을 방출한다. 이 염증반응은 가려움, 재채기, 비루 그리고 폐색을 포함하는 대표적인 코 증상을 일으킨다.

천식은 많은 요소에 의해 유발되는 질병으로, 폐의 만성 염증이 특징적이다. 이 병은 림프구, 호산구와 비만세포가 기관지 점막 조직에 광범위하게 침투하여 혈청 내 IgE의 농도를 증가시킨다. 폐 상피가 벗겨지고 goblet 세포가 과형성되면 점막층이 얇아지며, 세기관지 내에 점액이 생성되어 숨쉬기와 기도 민감성이 방해된다. 천식과 같은 만성 폐 염증 질환이 일어나면 CD4⁺ Th2 세포에서 분비되는 IL-5와 같은 proinflammatory 사이토카인의 매개로 분열 및 분화 조절로 호산구의 활성을 증대시켜 IL-4와 IL-13을 증가시킨다. 반면 CD4⁺ Th2 세포 분화가 억제됨으로 CD4⁺ Th1 세포로부터 interferon- (IFN-)가 분비된다.

사람의 천식 반응은 전기와 후기 반응으로 나눌 수 있다. 전기는 알레르겐에 노출된 후 즉시 나타나며 후기 반응은 기도의 염증과 기도 과민성으로, 알레르겐에 노출된 후 8-24 시간 내에 나타나고 이 반응은 기도 내 호산구의 침입이 동반된다.

아토피(atopy)는 “알 수 없는”, “이상한”이란 뜻의 그리스어 a-topos로부터 유래되었으며, IgE를 쉽게 생성시켜 알레르기 반응을 일으킴으로써 천식, 알레르기성 비염, 아토피 피부염 등을 일으키는 유전적 경향을 말한다. 아토피의 발병원인은 유전적 요인과 면역학적 요인 이외에 환경적, 정신적 요인이 알려져 있으 나 아직 원인과 치료법이 확실하게 규명되지 않았다.

현재까지 아토피성 피부염의 발병기전으로는 Th2 세포가 활성화되어 IL-4, IL-5, IL-10와 IL-13등이 과량 분비되며, 주로 IL-4가 IgE의 증가에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한 호산구 과립단백질이 아토피 피부염의 병변에 침착되어 염증 정도가 조절되고 세포부착분자인 E-selectin이 CLA(cutaneous lymphocyte associated antigen)와 상호작용으로 기억 T 세포를 내피세포에 부착시켜 염증부위로의 침윤을 증가시킨다는 보고도 있다. 이러한 면역세포의 신호전달과정에서 아토피 증세는 단순한 피부 건조증 뿐만 아니라 염증성 병변을 수반하게 된다.

비만세포는 모든 기관과 조직을 구성하며, 알레르기와 과민증과 같은 염증성 반응의 중요한 매개체이다. 비만세포는 IgE-의존적 그리고 IgE-비의존적 자극 모두에서 활성화되어 플라즈마 막과 세포질 미립 막의 용해되어 탈과립이 일어난다. 비만세포 또는 호염구의 특이적 IgE에 여러 항원이 결합되면 IgE 수용체 (FceRI)와 강하게 결합하여 히스타민 생산과 더불어 에코사노이드, 프로테오글리칸, 프로테아제, 그리고 다수의 proinflammatory 사이토카인 그리고 TNF-a, IL-4, IL-6, IL-13와 TGF-β 등의 화학주성 사이토카인이 생산된다(표 1). 이 중 히스타민은 가장 많은 특성을 갖고 있는 강력한 혈관 작용 매개체로서 즉시형 과민증에 가장 많은 영향을 준다. 비만세포에서 TNF-a와 IL-6는 백혈구 이동과 염증을 활성화시킨다. 또한, 염증성 사이토카인은 숙주 방어에 좋은 효과를 나타내지만 과발현시에는 병리학적 알레르기 증상을 자극할 수 있다. 이에따라 비만세포에서 TNF-a과 IL-6는 염 증성 알레르기 증상의 지표로 쓰인다.

β-hexosaminidase는 히스타민을 저장하는 비만세포의 과립에 존재하고, 비만세포가 면역학적 활성을 나타내면 히스타민과 함께 방출된다. 따라서 β-hexosaminidase은 탈과립의 지표물질로 탈과립 정도를 결정하고 항 알러지 활성의 평가에 활용된다.

Rat basophilic leukemia cell line인 RBL-2H3세포는 점막 비만 세포 타입으로 IgE-매개체 탈과립 연구에 중요하다. 이 세포는 FcεRI을 발현하고, heterotetrameric 수용체로 하나의 IgE-결합 α서브유닛, 하나의 β서브유닌, 그리고 두 개의 disulfied-bonded 서브유닛으로 구성되어 있다. IgE와 함께 RBL-2H3세포의 IgE수용체를 자극하면 항원과 결합된 것 같은 효과를 나타낼 수 있으며, 탈과립, 지질 매개체의 방출, 사이토카인 분비, 알레르기 반응의 일련적 단계 반응이 일어난다.

Ca^{2 +}는 세포가 활성화하는 동안 second messenger로 작용한다. 세포내 Ca^{2 +}의 증가는 비만세포 활성화에 있어 중요한 자극제로 작용한다. TNF-a와 IL-6 는 비만세포에서 발생되고, 염증 면역반응을 가능하게 함으로써 다른 염증 매개체로 유도된다. 비만세포의 IgE 자극과 호염구는 TNF-a, IL-6, 과립성백혈구-대식세포 CSF, IL-8, IL-13 그리고 proinflammatory 사이토카인과 함께 백혈구 억제 인자, NF-kB 활성을 통한 면역 조절제 특성을 포함하는 사이토카인의 합성과 분비를 유도한다. 그러나 아직 염증 반응 내 사이토카인 생산의 메카니즘은 아직 밝혀지지 않았다.

알레르기와 같은 염증질환에 관여하는 주요 염증세포인 호염구와 비만세포들의 자극원으로는 일부 음식물 성분이 작용하는 것으로 알려졌으며, 대표적으로 난황의 지질단백질, 우유의 단백질, 땅콩 등이 있다. 이와 같은 물질들은 림프구의 면역글로불린의 생성을 증가시킬 수 있으며, 식품성분인 불포화지방산을 세포 내의 leukotriene, 혈소판 활성인자, IgE의 생성을 감소시킬 수 있다고 보고되었다.

Corticosteroid는 일반적으로 강력한 항 염증성 스테로이드로서 천식과 같은 만성 염증 폐 질환의 치료제로 사용된다. 세포 수준에서 corticosteroid는 호산구, 림프구, 대식세포 그리고 그 외의 세포 타입에 축적되어 활성을 감소시킨다. Corticosteroid는 항원을 처리한 동물이나 천식에 걸린 사람에게서 기도 내 민감성과 점액 분비를 방지함으로써 염증 진행을 멈추게 한다. Glucocorticoids는 알레르기 염증 질환의 치료를 위한 가장 효과적인 약물 중 하나로 glucocorticoids는 염증과정에 관련된 세포에 존재하는 염증 사이토카인 수용체와 결합하여 이로 인한 염증세포에서 분비되는 염증매개물질들을 차단함으로써 항염증활성을 나타낸다.

Corticosteroids나 glucocorticoids 외에도 epinephrine, histamine antagonists, leukotriene 합성저해제와 같은 몇몇의 물질들은 알레르기 염증 반응을 방해한다.

Kim 등은 Gallic acid가 화합물 48/80이나 IgE-유도 히스타민 방출을 감소시키고, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)와 더불어 칼슘 이온 투과 매개체로 작용하여 proinflammatory 사이토카인을 발현한다고 보고하였다. Nedocromil sodium은 항알레르기 약물로 비만세포에서 매개체의 방출의 기능을 갖는 염화물 통로를 차단하는 역할을 한다. 또한 유사 기전에 의해 IgE로 유도된 피부의 과민증과 TNF-a 발현을 Acanthophanax senticosus 뿌리 추출물이 억제한다는 보고가 있다.

이 외에도 차에 존재하는 폴리페놀은 비만세포에서 분비되는 화학매개물질을 억제하고, 항염증활성을 가지고 있다고 보고되었다. Besra 등은 Litchi chinensis Gaertn. 잎의 에테르 추출물이 항염증효과가 있음을 밝혔고, 쌀 추출물과 한약제 추출물들이 알레르기 천식의 기도염증을 억제한다고 보고되었으며, 포도씨에 존재하는 중합체성 procyanidins는 RBL-2H3 세포에서 히스타민 등 염증유발물질을 억제한다고 알려졌다.

본 발명의 일실시예의 목적은 알레르기성 염증 억제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 알레르기성 염증 억제 조성물은 광물성 미네랄 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 조성물은, 알레르기성 염증을 억제하는 효과가 있다.

동양의학에서 미네랄과 광물은 오래전부터 질병 치료제 등으로 사용되어 왔다. 본 연구에서는 광물성 미네랄을 사용하여 알레르기성 염증 억제 반응을 살펴보았다.

본 연구에서는 ovalbumin에 의하여 유도된 알레르기성 염증반응과 항-DNP IgE에 의하여 유도된 과민반응에 대한 광물성 미네랄 혼합물의 효과를 조사하기 위하여 알레르기성 염증의 개시와 유도에서 IgE와 사이토카인의 변화를 관찰하였으며, 비만세포 탈과립과 사이토카인 분비에 대한 광물성 미네랄 혼합물의 효과를 RNA수준에서 살펴보았다.

	Mediator	Actions
Preformed in granules	Histamine	Vascular permeability, vasodilation, mucus production, bronchoconstriction, activation of nociceptive neurons
	Proteases (tryptase, chymotryptase, carboxypeptidases, kininogenase)	Degradation of tissue, activation of protein precursors, mucus production, generation of bradykinin
Synthesized de novo on allergen exposure	Arachidonic acid derivatives
	Leukotrienes (B4, C4, D4)	Vascular permeability, mucus production, bronchoconstriction, neutrophil/eosinophil chemoattractant (B4), leukocyte adhesion molecule expression (B4)
	PGD2	Vascular permeability, bronchoconstriction (transient airway hyperresponsivity)
	Thromboxane A2	Bronchoconstriction
	Cytokines
	IL-3	Hematopoietic growth factor, chemoattractant for basophils
	IL-4	IgE antibody formation by B lymphocytes, differentiation of TH2 from TH0 thymocytes
	IL-5	Eosinophil proliferation and differentiation, chemoattractant for eosinophils and basophils
	TNF-a	Potent stimulator of inflammator cascade, up-regulation of leukocyte adhesion molecules on endothelium
	GM-CSF	Proliferation of granulocytes
	Platelet-activation factor	Eosinophil/neutrophil chemoattractant, vascular permeability

알레르기 질환 중 type I 알레르기는 음식 뿐만 아니라 환경 알레르겐에 의해 주로 일어난다. Type I 알레르기 반응에서는 비만세포 및 호염구의 표면에 존재하는 IgE 수용체에 알레르겐과 IgE 복합체가 결합하면, 히스타민의 분비뿐만 아니라, 염증 사이토카인인 TNF-a와 IL-6의 생성을 증가시켜 생체내의 염증반응을 유도한다. 염증관련 사이토카인에는 TNF-a, IL-1β, IL-6 등이 있다. IL-1β와 TNF-a는 세포의 상해를 유도하고, 염증반응의 주요 초기인자로 알려져 있다. 이에 비해 IL-6는 염증반응과정의 강력한 중재자로서 정상상태에서는 저농도로 존재하다가 감염, 천식 및 각종 스트레스에 의해 발현이 유도된다. 이 사이토카인들은 보통 비만세포에서 분비되며 다른 염증매개물질을 통하여 염증반응을 유발할 수 있다.

비만세포는 알레르기 반응 중에 일어나는 다양한 생리학적, 면역학적, 병리학적 과정 즉, 창상치유, 혈관생성, 기생충과 신생물에 대한 숙주의 반응, 급·만성 염증 및 IgE 매개 즉발성 과민 반응에 관여한다. 이러한 비만세포는 다양한 사이토카인의 근원으로 이에 대한 연구를 함으로써 비만세포의 기능과 관련된 생리학적, 병리학적 기전을 알 수 있다.

비만세포 분비를 억제시키는 방법으로 일반적인 단계에는 두 가지 단계로 나눌 수 있는데 첫째, IgE와 알레르겐이 FceRI-항 IgE 항체에 부착하는 것을 억제함에 의한 것이며, 둘째는 부착 후 FceRI의 신호전달계를 억제함에 의한 방법이 있다.

임파구 생성과 더불어 임파구 생존, 활성과 분화를 조절하는 사이토카인과 염증 전구 물질의 메카니즘 작동자는 염증 반응을 야기한다. 특히 알레르기성 염증은 Th2 사이토카인 (IL-4, IL-5, IL-9과 IL-13)의 임파구 생성을 증가시키고, Th2 사이토카인의 발현을 야기할 수 있다. Th2 사이토카인인 IL-4와 IL13은 알레르기성 염증에서 유도와 작동기로 주요한 역할을 수행한다.

본 실험에서 ovalbumin으로 알레르기성 염증을 유도 후 광물성 미네랄 혼합물을 처리하여 염증을 억제한 결과 IgE의 농도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 비만세포의 사이토카인 분비에 대한 광물성 미네랄 혼합물의 효과는 ovalbumin 감작 후 광물성 미네랄 혼합물 처리 시 IL-4와 TNF-a의 농도가 감소하였으며, 폐 조직을 이용하여 IL-4와 TNF-a의 발현이 억제되는 것을 볼 수 있었다. 알레르기성 염증 반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 리폭시게나제 효소의 활성 억제를 확인한 결과에서도 알 수 있듯이 광물성 미네랄 혼합물은 염증 억제에 관련이 있는 것으로 보인다.

RBL-2H3 세포의 염증 유도 반응에서 광물성 미네랄 복합물의 처리시 β-hexosaminidase와 히스타민 분비가 감소되는 것을 확인함으로써 광물성 미네랄 복합물이 알레르기 염증 반응을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다. 따라서 동의보감의 석부에 근거하여 개발된 본 광물성 미네랄 혼합물은 새로운 개념의 알레르기성 염증 개선제로 사용할 수 있을 것으로 보인다.

이하, 바람직한 실험예 등을 통해 본 발명을 더욱 상술하지만, 하기 실험예 등은 본 발명의 효과를 예시적으로 확인하기 위한 것이며, 본 발명의 범주가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

1. 실험 재료

1. 1. 동물 재료

본 실험에 사용한 광물성 미네랄 복합물은 기 출원된 내용과 동일하며 실험 동물은 중앙실험 동물 사육장으로부터 공급받아 실험에 사용하였다.

2. 1. 동물 배양

6 주령 수컷 BALB/c mouse는 중앙실험 동물 사육장으로부터 공급받아 실험에 사용하였다. 실험동물은 무작위로 8 마리씩 3 개의 그룹으로 나누었으며, 사육 조건은 온도 21~23, 습도 40~60%, 조명 12 시간 명암으로 유지시켰으며, 실험동물은 분양 받은 다음날 사용하였다.

2. 2. 알레르기성 염증반응의 유도

BALB/c mouse에 제 0 일과 14 일에 500 ug/ml의 ovalbumin과 100 mg/ml의 aluminum hydroxide를 PBS (Phosphate buffer saline)에 넣고 섞은 후 200 ul씩 복강주사하였다. 정상군은 PBS (Phosphate buffer saline) 200 ul을 복강주사하였다. 21 일과 22 일, 23 일째에는 광물성 미네랄 혼합물 분말 20 mg/ml을 PBS에 녹여 500 ul씩 경구투여하였고, 30 분이 지난 후 1.5 mg/ml의 ovalbumin을 PBS에 녹인 후 100 ul씩 코에 넣어주었다. 24 일째 경추이탈시켜 희생시켰다.

2. 3. ELISA 를 이용한 IgE 의 측정

BALB/c mouse의 혈액은 경추이탈시켜 희생시킨 뒤 하대정맥에서 얻었다. 혈액은 13,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상등액인 혈청만 분리하였다. 이렇게 얻은 혈청은 분주하여 -70℃에서 보관하면서 ELISA법을 사용하여 IgE 정량을 실시하였다. 1 차 항체와 0.1 M sodium carbonate, pH 9.5 용액을 1:250으로 희석하여 96 well plate에서 4, 16 시간 이상 코팅한 후 혈청과 assay diluent를 1:250 으로 희석하여 2 시간 동안 반응시키고 biotin이 부착된 2 차 항체를 결합시킨 후 horseradish peroxidase (HRP)와 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)를 이용하여 발색시켜 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

2. 4. ELISA 를 이용한 기관지 폐포 세척액 내의 사이토카인 측정

혈액 샘플을 얻은 다음, 기관지가 있는 목 부분을 조심스럽게 열고 기관지에 1 ml의 PBS로 4 번 세척하여 폐포 세척액을 수거하였다. 폐포 세척액은 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상등액만 얻은 다음 -70에서 보관해두었다. 기관지 폐포 세척액의 상등액을 이용한 사이토카인 IL-4, TNF-a의 정량은 ELISA키트 (BD Pharmingen, USA)의 사용 설명서에 따라 검사하였다.

IL-4는 1 차 항체를 0.1 M sodium carbonate, pH 9.5 용액을 1:250으로 희석하여 96 well plate에서 4, 16 시간이상 코팅하고, TNF-a는 0.2 M sodium phosphate, pH 6.5 용액을 1:250 으로 희석하여 동일한 방법으로 코팅하였다. 그 후 assay diluent로 비특이적 반응을 차단하였다. 기관지폐포 세척액 원액을 2 시간동안 반응시키고 biotin이 부착된 2 차 항체를 부착시킨 후 horseradish peroxidase (HRP)와 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)를 이용하여 발색시킨 후 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

2. 5. 폐 조직에서 총 RNA 의 분리

폐 조직에 TRI Reagent^® 500 ul를 첨가하고 ultrasonicator를 사용하여 파쇄한 후 TRI Reagent^® 500 ul를 첨가하여 실온에서 5 분간 반응시켰다. Chloroform 500 ul를 첨가하여 심하게 혼합하고 실온에서 3 분간 반응시킨 후 4℃, 12,000xg에서 15 분간 원심분리 하였다. 상층액을 취해 위의 과정을 1회 반복하여 RNA를 추출하였다. 정제된 RNA가 녹아있는 상층액을 위하여 isopropanol 500 ul를 첨가하고 가볍게 혼합한 후 실온에서 10 분간 반응시킨 다음 4℃, 12,000xg에서 15 분간 원심분리하여 모은 침전물을 75% ethanol로 세척하였다. 다시 원심분리하여 침전물을 모은 다음 5 분간 건조하고, TE 완충용액 (10 mM trizma base, 1 mM EDTA, pH 8.8)에 녹인 후 흡광도 (A₂₆₀/A₂₈₀)를 측정하여 RNA 양과 순도를 결정하였다. 분리된 total RNA는 실험에 사용하기 전까지 -70℃의 극저온 냉동기에 보관하였다.

2. 6. RT - PCR ( Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction )

2. 6. 1. cDNA 의 합성

폐 조직으로부터 분리한 총 RNA를 주형으로 사용하여 (주)Genotech의 Oligo dT 20 primer와 총 RNA 2 ug을 혼합하여 70에서 5 분간 반응시킨 후 얼음위에서 식혔다. 이 혼합물에 (주)Bioneer의 AccuPower^® RT PreMix kit를 섞고 DEPC-DW로 최종 부피 50 ul로 맞춘 후 섞어 주었다. 42에서 60 분간 반응시켜 cDNA를 합성하고 94, 5 분간 반응시켜 reverse transcriptase를 불활성화시켰다. 합성된 cDNA는 실험에 사용되기 전까지는 -20℃ 냉동기에 보관하였다.

2. 6. 2. Primer 제작

폐 조직으로부터 항상 발현되어 대조군으로 사용할 수 있는 β-actin 유전자를 증폭하기 위하여 forward primer와 reverse primer를 제작하였고, IL-4와 TNF-a 유전자를 증폭해 낼 수 있는 forward primer와 reverse primer를 제작하였다. 모든 primer들은 (주)Genotech에 의뢰하여 주문제작하였다.

Primer name	Forward primer sequence (F)	Fragment size ( bp )
	Reverse primer sequence (R)
β-actin	F 5'-TGGAATCCTGTGGCATCCAT-3' R 5'-CGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'	350
IL-4	F 5'-GGAGATGGATGTGCCAAACG-3' R 5'-GTTAAAGCATGGTGGCTCAG-3'	350
TNF-a	F 5'-CATCTCTCTGTGCATCCGAC-3' R 5'-CATCTCTCTGTGCATCCGAC-3'	350

2. 6. 3. PCR ( Polymerase Chain Reaction )

합성한 cDNA를 주형으로 하여 해당하는 primer 조합과 (주)Genotech사의 PCR PreMix를 사용하여 20 ul의 반응액에서 PCR 반응을 수행하였다. Techne사의 PROGENE을 이용하여 다음 조건의 반응을 수행하였다. 94에서 3 분간 변성 후, 94, 55와 72에서 각각 1 분간의 반응을 30 회 반복하였고, 72℃에서 3 분간 연장 반응시켰다. 반응이 끝난 산물은 다음 실험에 사용하기 전까지 -20℃의 냉동기에 보관하였다.

2. 6. 4. 정량적인 RT-PCR

최초 cDNA 합성시 주형 RNA (total RNA)의 양을 5 ug/ul의 농도로 정량하여 cDNA를 합성하였고, 정량적인 PCR을 위해 합성된 cDNA를 연속적으로 희석하여 사용하였다. 연속적인 cDNA 희석의 범위는 1/2~1/16까지로 정하였다. 정량 분석을 위하여 대조군과 광물성 미네랄 복합물 처리군에서 internal standard로 사용된 대조군 유전자 β-actin과 동일한 양으로 증폭된 희석 조건에서 IL-4와 TNF-a 유전자의 증폭양을 비교하였다.

2. 7. 폐 조직의 형태학적 분석

폐포 세척액을 얻은 후 왼쪽 폐 안으로 2 ml의 PBS를 관류시켰다. 폐 속에 있던 혈액을 제거하고 4% paraformaldehyde에 넣어 20 시간 이상 고정시킨 후 파라핀 포매 절편을 제작한다. 조직학적 검색을 위하여 초박절편기 (Reichert-Jung, 820-II)를 이용하여 파라핀 포매 조직을 4 um 두께로 박절한 후 gelatine으로 피복된 유리슬라이드 위에 부착시킨 후 xylene과 알코올로 탈 파라핀과 함수과정을 거친 후 hematoxylin과 eosin Y로 염색하였다.

2. 8. Lipoxygenase 효소활성 억제 측정

광물성 미네랄 혼합물의 lipoxygenase 활성 억제를 측정하기 위하여 0.1 M borate 완충액 (pH 9.0)에 lipoxygenase (Sigma) 110 Units을 첨가하고 광물성 미네랄 혼합물 분말은 충분히 녹인 후 상등액을 100 ul 첨가하였다. 30에서 10 분간 pre-incubation한 뒤 500 uM linoleic acid를 첨가하고 234 nm에서 흡광도 변화를 측정하였다.

2. 9. 세포주 및 세포주의 배양

본 연구에 사용한 basophilic leukemia cell line인 RBL-2H3 세포는 ATCC (American Type Culture Collection)로부터 분양받아 실험에 사용하였다. RBL-2H3 세포는 10% heat inactivated fetal bovine serum (FBS) (Hyclone)과 1% antibiotics (penicillin-streptomycin) (Hyclone)이 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) (Hyclone)배지를 사용하여 5% CO₂, 95% air가 공급되는 37℃의 CO₂ 배양기에서 배양하였다.

2. 10. 동결보존 세포의 해동

액체 질소에 보관되어 있는 동결세포를 37 수조에서 녹인 후 배지 내의 DMSO를 제거하기 위하여 7 ml의 배지와 혼합하여 4, 1,000 rpm에서 3 분간 원심분리 후 상등액을 제거하고 5 ml의 배지에 잘 현탁하여 T25 cm² 세포 배양 플라스크에 넣어주고 5% CO₂, 95% air가 공급되는 CO₂ 배양기에서 배양하였다.

2. 11. 계대배양

실험에 사용한 RBL-2H3 세포의 계대배양에 사용한 배지는 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM 배지를 사용하였다. RBL-2H3 세포와 같은 부착성 세포의 경우 배양액을 흡인 제거한 후 1X PBS buffer로 수세한 후, 2.5 ml의 trypsin-EDTA 용액을 사용하여 약 3 분간 반응시켜 세포를 떼어주었다. 새 배지 3 ml을 첨가하여 trypsin-EDTA 용액에 의한 반응을 멈춘 뒤, 부유된 세포들을 1,200 rpm에서 5 분간 원심분리한 후 상등액을 다시 제거하고 새로운 배지에 수확된 세포를 현탁하여 세포 배양 플라스크에 분주하고 5% CO₂, 95% air가 공급되는 CO₂ 배양기에서 배양하였다.

2. 12. 세포수의 측정

세포수의 측정은 hemocytometer와 trypan-blue 염색법을 이용하였다. Trypsin-EDTA 용액을 처리한 뒤, 분리한 세포 배양액 10 ul와 trypan-blue solution (0.4% (w/v) trypan-blue, 0.8% (w/v) NaCl, 0.06% (w/v) KH₂PO₄, 0.05% (w/v) methylene--hydroxybenzonate, pH 7.2) 10 ul를 잘 혼합한 후 혼합액 10 ul를 hemocytometer에 취해 역상 현미경을 이용해 세포수를 측정하였다. Hemocytometer의 0.1 mm³의 4 구간을 정해 청색으로 염색되지 않고 살아있는 세포수를 측정한다.

2. 13. 세포증식 측정

MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-ly)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)용액은 1X PBS buffer에 5 mg/ml의 MTT를 용해 후 살균된 여과지로 여과하여 불용성 물질을 제거한 후 사용하였다. 세포수를 3x10⁶ 개/ml로 희석하여 96 well plate에 100 ul씩 분주한 뒤 5% CO₂, 95% air가 공급되는 CO₂ 배양기에서 24 시간 배양하였다. 그 후 광물성 미네랄 혼합물 분말을 녹인 용액을 농도별로 첨가하여 24 시간 더 배양하고 조제한 MTT solution을 50 ul/well씩 첨가하여 37에서 2 시간 동안 반응시켜 살아있는 세포가 보라색의 불용성 formazan을 형성하게 되면 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 100 ul/well씩 가하고 잘 교반하여 침전물을 완전히 용해하였다. 용해된 formazan 산물이 들어있는 각 well의 흡광도는 ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 측정하였다. 결과는 대조군의 살아있는 세포를 100%로 하였을 때의 상대적인 비율로 나타내었다.

2. 14. β- hexosaminidase 정량

Rat의 basophilic leukemia cell line인 RBL-2H3 세포는 10% FBS, 100 unit/ml의 penicillin과 streptomycin을 포함하는 DMEM 배지와 37℃의 5% CO₂를 포함하는 조건에서 24 시간 배양하였다. 이 때 세포의 수는 2x10⁴ cell/well로 96 well plate에서 배양한 후, 상등액을 제거한 다음 2% FBS, anti-DNP IgE (1:1,000)이 포함된 DMEM을 각 well에 100 ul씩 첨가한 후 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 배양 후 HEPES buffer (pH 7.4)를 각 well당 200 ul씩 첨가하여 3 회 세척하고 세포독성이 없는 조건의 광물성 미네랄 혼합물 분말을 HEPES buffer (pH 7.4)로 미리 희석하여 100 ul씩 첨가하고 37에서 10 분간 반응하였다. 4 ug/200 ul의 DNP-BSA를 첨가하고 37℃에서 35 분간 재차 반응시켰다. 4℃에서 반응을 종결시킨 후 상등액을 새 plate에 50 ul씩 넣은 후 1 mM p-nitrophenyl-β-acetyl-glucosamide를 50 ul씩 넣고 37℃에서 1 시간 동안 반응시킨 다음 200 ul의 0.2 M glycine buffer (pH 10.7)로 반응을 종결시켰다. 그리고 ELISA reader를 사용하여 407nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

2. 15. 히스타민 정량

Rat의 basophilic leukemia cell line인 RBL-2H3 세포는 10% FBS, 100 unit/ml의 penicillin과 streptomycin을 포함하는 DMEM 배지와 37℃의 5% CO₂를 포함하는 조건에서 24 시간 배양하였다. 이 때 세포의 수는 1x10⁵ cell/well로 조절하고 24 well plate에서 배양한 후, 상등액을 제거한 다음 2% FBS, anti-DNP IgE (1:1,000)이 포함된 DMEM을 각 well에 1 ml씩 첨가한 후 37에서 2 시간 동안 배양하였다. 배양 후 HEPES buffer (pH 7.4)를 각 well당 200 ul씩 첨가하여 3 회 세척하고 세포독성이 없는 조건의 광물성 미네랄 혼합물 분말을 HEPES buffer (pH 7.4)로 미리 희석하여 500 ul씩 첨가하고 37℃에서 10 분간 반응하였다. DNP-BSA (20 ug/well)를 1 ml첨가하고 37℃에서 35 분간 재차 반응시켰다. 4℃에서 반응을 종결시킨 후 회수한 상등액 1 ml을 새 24 well plate에 옮겨서 0.2 ml의 1 N NaOH, 0.1 ml의 1% o-phthalaldehyde (OPT)를 첨가하고 실온에서 5 분간 방치하였다. 반응을 종결시키기 위해서 1 N HCl을 0.2 ml 첨가하고 fluorometer를 사용하여 360 nm의 excitation 파장과 450 nm의 emission 파장에서 흡광도를 측정하였다.

2.16. 통계학적 분석

결과는 독립된 3 번의 실험을 통해 Mean ± SEM으로 나타내었으며, 통계는 SPSS for Windows 12.0 프로그램을 이용하였다. 두 집단간의 유의성은 대응표본 t-test인 paired t-test로 분석하고, 세 집단 이상의 유의성은 ANOVA를 사용하여 분석했으며 Duncan’s multiple-range test에 따른 사후 검정을 실시하였다. 모든 실험에서 유의한 p값은 0.05 이하로 분석하였다.

3. 결과

3. 1. OVA 감작된 쥐 모델의 IgE 에 대한 광물성 미네랄 혼합물의 효과

항원 특이적 Th2 반응은 항원 특이적 IgE 항체를 유도하는 것으로 알려져 있다. 도 3에서 광물성 미네랄 혼합물이 알레르기성 염증 반응을 유도한 쥐의 혈중 IgE 농도에 미치는 영향을 살펴보기 위해 쥐 희생 후 48 시간 이내에 ELISA법을 사용하여 IgE 농도를 측정하였다.

Ovalbumin으로 염증반응을 유도한 대조군 (7250.75 ± 376.32 ng/ml)의 IgE는 PBS로 처리한 정상군 (1817.19 ± 296.45 ng/ml)의 IgE 농도에 비해 약 4 배 증가하였으나, 증가된 대조군의 IgE 농도는 광물성 미네랄 혼합물을 처리에 의해 현저히 감소되었다 (4255.77 ± 514.69 ng/ml). 광물성 미네랄 혼합물은 증가된 IgE 농도를 약 59% 감소시켰다.

3. 2. OVA 감작 쥐 모델의 사이토카인에 대한 광물성 미네랄 혼합물의 효과

알레르기성 염증 반응과 기도 리모델링은 IL-4, IL-13, 그리고 종양 괴사 인자 (TNF)-a와 같은 Th2 사이토카인의 연속적인 분비를 유도한다. 도 2에서는 알레르기성 염증반응을 유도한 쥐 기관지 폐포 세척액의 IL-4, TNF-a의 농도 변화를 측정하였다.

Ovalbumin으로 염증반응을 유도한 대조군의 IL-4 농도는 110.7 ± 8.11 pg/ml로서 PBS 처리된 정상군 IL-4 농도 (51.9 ± 7.05 pg/ml)에 비해 2 배 증가하였고, 증가된 대조군의 IL-4 농도는 광물성 미네랄 혼합물을 처리한 실험군에서 50.38 ± 4.01 pg/ml로 감소되었다 (도 4).

TNF-a는 ovalbumin으로 염증반응을 유도한 대조군에서 129.52 ± 23.08 pg/ml로서 PBS 처리된 정상군의 75.01 ± 4.16 pg/ml에 비해 약 1.7 배 증가하였다. 증가된 대조군의 TNF-a 농도는 광물성 미네랄 혼합물을 처리한 실험군에서 58.79 ± 5.92 pg/ml로 대조군보다 약 50% 감소되었다 (도 5)

3. 3. OVA 감작된 쥐 모델의 폐 조직 내 사이토카인에 대한 광물성 미네랄 혼합물의 효과

알레르기성 염증반응을 유도한 쥐 모델에서 광물성 미네랄 혼합물 처리에 의한 사이토카인 발현 변화를 보고자 정상군, ovalbumin 처리된 대조군, 미네랄 혼합물 처리된 실험군의 폐 조직을 이용해 총 RNA를 분리하여 각각 cDNA를 합성하였다. 정상군 cDNA, 대조군 cDNA와 실험군 cDNA를 각각 단계적으로 희석하여 IL-4와 TNF-a 유전자를 증폭시켰다. 이 때 internal standard로 사용된 housekeeping 유전자는 β-actin 유전자였다. RT-PCR 결과 모두 동일한 양의 β-actin 유전자가 증폭되었다. 따라서 이와 동일한 조건일 때, IL-4와 TNF-a transcript 유전자의 증폭양을 비교해 본 결과, IL-4의 경우 정상군과 실험군은 대조군에 비해 감소하였다 (도 6). TNF-a도 정상군과 실험군이 대조군에 비해 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (도 7). 이러한 결과는 RT-PCR을 통하여 알레르기성 염증반응을 유도와 광물성 미네랄 혼합물 처리에 따른 IL-4와 TNF-a 유전자의 발현을 보여준다. 또한 기관지폐포 세척액을 이용하여 사이토카인을 측정한 결과와 거의 일치하고 있음을 보여준다.

3. 4. OVA 감작된 쥐 모델의 폐 조직 염증세포에 대한 광물성 미네랄 혼합물의 효과

알레르기성 염증반응에 의한 폐 조직의 형태학적 변화를 관찰하기 위해 H&E 염색을 실시하였다. 폐 조직 내 기관지 주위과 혈관주위의 염증 침윤을 중심으로 하여 정상군, 대조군, 실험군의 폐 사진을 비교하였다(도 8).

Ovalbumin 감작 모델의 폐 조직에서는 세기관지 내로 점액이 다량 유입되어있고 주위에 림프구 및 호산구를 비롯한 염증세포가 산재해있으나, 광물성 미네랄 혼합물을 처리한 그룹에서는 세기관지 내의 점액이 유의하게 감소하였고, 주위의 염증 세포들도 다량 감소한 것을 확인하였다.

3. 5. 광물성 미네랄 혼합물에 의한 리폭시게나제 활성 억제

리폭시게나제는 류코트리엔으로 알려진 생물학적 지질 활성화에 관련된 효소로써 염증과 알레르기성 반응에 중요한 역할을 한다. 류코트리엔은 비만세포, 호산구, 호염구에서 유리되는 화학매개체로 알레르기 반응의 염증세포에 대한 화학주성과 활성화에 관여한다.

도 9에서는 광물성 미네랄 혼합물의 농도에 따른 리폭시게나제의 활성 억제 양상을 보여준다. 광물성 미네랄 혼합물의 농도가 증가 할수록 리폭시게나제의 활성 억제율이 증가되는 것을 알 수 있었다.

3. 6. 광물성 미네랄 혼합물이 RBL -2 H3 세포의 증식에 미치는 영향

광물성 미네랄 혼합물이 RBL-2H3 세포의 증식에 미치는 영향을 살펴보았다. 도 10에서는 RBL-2H3 세포에 광물성 미네랄 혼합물 분말을 녹인 용액을 농도별로 첨가하여 24 시간 동안 처리한 후 MTT 방법을 이용하여 세포 증식정도를 측정하였다. 살아있는 세포의 미토콘드리아에 존재하는 lactate dehydrogenase (LDH)의 생산물인 NADH 혹은 NADPH는 MTT를 환원시켜서 보라색의 formazan을 형성하므로 이것을 DMSO로 녹인 후 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 각 측정값은 동일한 조건의 세포를 3 번 반복 실험하여 나온 결과의 평균값이며 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.

그 결과 0.5% 광물성 미네랄 혼합물 처리에 의해 세포증식이 약 30% 정도 억제되었고 0.25% 광물성 미네랄 혼합물에 의해서 약 10% 정도 세포증식이 억제되었다.

3. 7. RBL -2 H3 세포의 β- hexosaminidase 분비와 히스타민 분비에 대한 광물성 미네랄 혼합물의 효과

RBL-2H3 세포는 표면에 IgE 항체의 수용체를 가지고 있고 이 수용체는 항원에 의한 자극으로 서로 복합체를 이루게 되면 RBL-2H3 세포 내의 입자들이 분비되면서 입자 내에 포함된 히스타민과 β-hexosaminidase효소를 분비하게 되는데 이 효소의 분비가 급격히 증가하면 알레르기 반응이 발생하고 이로 인해 칼슘 이온의 유입이 증가하는데 이는 비만세포 자극제로 작용하여 TNF-a, IL-1과 같은 염증 매개 물질 방출을 유도한다.

RBL-2H3 세포에서 anti-DNP IgE 매개 β-hexosaminidase 분비에 대한 광물성 미네랄 혼합물의 효과는 10 분간 처리 후 관찰하였으며 그 결과는 도 11과 같다. 광물성 미네랄 복합물 0.25%를 처리한 경우 β-hexosaminidase 분비는 대조군에 비해 약 30% 감소하였고, 0.125% 처리시 분비율은 약 20% 감소하는 것으로 나타났다. 광물성 미네랄 혼합물을 RBL-2H3 세포에 미네랄을 0.25%, 0.125%의 농도로 10 분간 처리한 결과 (도 12) 광물성 미네랄 혼합물의 농도가 증가할수록 히스타민 분비량은 감소하였다. 0.125% 광물성 미네랄 혼합물 처리에 의해 약 50% 정도 감소되었고, 0.25% 광물성 미네랄 혼합물을 처리하였을 때 히스타민 분비는 대조군에 비해 80% 이상 감소되었다.

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도 1은 알레르기 염증반응에 대한 개략도이다;

도 2는 과증증에 대한 의학적 분류도를 나타낸 것이다;

도 3은 마우스 림프액에 있어서 전체 IgE에 대한 경구형 미네랄 처리의 효과를 나타낸 그래프이다;

도 4는 IF-4에서 경구형 미네랄 처리의 효과를 나타낸 그래프이다;

도 5는 TNF-α에 있어서 경구형 미네랄 처리의 효과를 나타낸 그래프이다;

도 6은 IF-4 mRNA 표현에 있어서 경구형 미네랄 혼합물의 효과를 나타낸 것이다;

도 7은 TNF-α에 있어서 경구형 미네랄 혼합물의 효과를 나타낸 것이다;

도 8은 폐 조직의 조직학적 변화에 통해 경구형 미네날 혼합물의 효과를 확인한 것이다;

도 9는 경구형 미네랄 혼합물에 의한 lipoxygenase 활성의 저해를 나타낸 그래프이다;

도 10은 경구형 미네랄 혼합물로 처리된 RBL-2H3의 상대적인 셀 생존능력을 나타낸 것이다;

도 11은 RBL-2H3 셀로부터 항-DNP IgE-유래된 β-hexosaminidase 방출에 있어서 경구형 미네랄 혼합물의 효과를 나타낸 그래프이다;

도 12는 RBL-2H3 셀로부터 항-DNP IgE-유래된 histamine 방출에 있어서 경구형 미네랄 혼합물의 효과를 나타낸 그래프이다.

Claims (3)

1. 광물성 미네랄 혼합물을 포함하는 알레르기성 염증 억제 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 알레르기성 염증은 ovalbumin에 의해 유도된 것을 특징으로 하는 알레르기성 염증 억제 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 알레르기성 염증은 항-DNP IgE에 의해 유도된 과민반응에 의한 것임을 특징으로 하는 알레르기성 염증 억제 조성물.

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