KR20100022588A - 골형성단백질이 코팅된 골이식재의 제조방법 - Google Patents

골형성단백질이 코팅된 골이식재의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 골이식재의 제조방법에 관한 것으로, 단백질 추출 시약을 포함하는 제1시약과 추출 대상 골분말을 혼합하여 추출용액을 마련하는 단계와; 상기 추출용액을 교반하여 상기 추출 대상 골분말로부터 골 형성 촉진 단백질을 추출하는 단계와; 추출된 상기 골 형성 촉진 단백질을 코팅대상 골이식재에 코팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이에 의해 골형성단백질에 의한 골형성 촉진기능이 향상된 골이식재의 제조방법이 제공된다.

Description

골형성단백질이 코팅된 골이식재의 제조방법{MAKING METHOD OF BONE GRAFTING MATERIAL COATED WITH BMP}
본 발명은 골형성단백질이 코팅된 골이식재의 제조방법에 관한 것이다.
최근 골분말, 골칩, 골블록 등과 같은 골이식재를 뼈의 재생이나 수복에 이용하는 기술이 발전되고 있다.
골이식재는 정형외과, 신경외과 및 치과 등에서 사용되며, 예를 들어, 디스크 수술 시 골 결손부위에 사용되어 골 재생을 유도하며, 임플란트 시술 및 구강 악 골결손 수복에도 사용될 수 있다.
골이식재는 공간을 메워주고 가교역할을 하며, 또한 골치유에 중요한 역할을 하며 골형성을 촉진시키는 골형성단백질(bobe morphogenetic protein, BMP, 골형성촉진단백질)을 포함하고 있어 치료를 촉진시킨다.
그런데 골이식재에 존재하는 골형성단백질의 대부분은 골이식재의 내부에 위치하고 있어, 골형성을 촉진하는데 한계가 있는 문제가 있다.
한편, 골이식재 제조과정에서 탈회 과정을 거치면 골형성단백질의 결속구조가 약해져 골형성단백질의 작용효과는 증가하나, 이 방법을 통해서도 골형성단백질 의 효과는 여전히 불충분하면서도 골이식재의 공간유지 기능은 약해지는 문제도 있다.
따라서 본 발명의 목적은 골형성단백질에 의한 골형성 촉진기능이 향상된 골이식재의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적은 골이식재의 제조방법에 있어서, 단백질 추출 시약을 포함하는 제1시약과 추출 대상 골분말을 혼합하여 추출용액을 마련하는 단계와; 상기 추출용액을 교반하여 상기 추출 대상 골분말로부터 골 형성 촉진 단백질을 추출하는 단계와; 추출된 상기 골 형성 촉진 단백질을 코팅대상 골이식재에 코팅하는 단계를 포함하는 것에 의해 달성된다.
상기 제1시약은 단백질분해효소억제제를 더 포함할 수 있다.
상기 추출 후 원심분리 방법을 이용하여 상기 추출용액의 상청액을 얻는 단계를 더 포함하며, 상기 코팅은 상기 상청액을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 코팅은, 상기 상청액과 상기 코팅대상 골이식재를 투석막에 주입하고, 제2시약 내에서 투석을 실행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 투석막은 3,000달턴 내지 14,000달턴일 수 있다.
상기 제2시약은 단백질분해효소억제제를 더 포함할 수 있다.
상기 코팅은, 상기 투석 후 원심분리 방법을 이용하여 코팅된 골이식재를 분 리하는 단계와; 분리된 상기 코팅된 골이식재를 예비동결하고 냉동건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 추출대상 골분말은 원재료의 탈회, 지방제거 및 냉동 건조를 포함하는 전처리 과정을 거쳐 마련된 것일 수 있다.
상기 단백질 추출시약은 완충된 구아니디움 하이드로클로라이드 및 트로메타민 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
상기 단백질분해효소억제제는 페닐메틸설포닐플로라이드, N-에틸말레이미드, 벤자미딘 및 6-아미노헥산산 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면 골형성단백질에 의한 골형성 촉진기능이 향상된 골이식재의 제조방법이 제공된다.
본 발명에 따른 골이식재의 제조방법은 크게 1. 추출대상 골분말의 마련, 2. 추출대상 골분말로부터 골형성단백질 추출, 3. 추출된 골형성단백질을 골이식재에 코팅, 4. 코팅후 처리를 포함한다. 이들 4가지 단계를 차례로 설명하면 다음과 같다.
먼저 1. 추출대상 골분말의 마련을 설명한다. 여기서 골분말은 평균 직경 1mm이하의 분말형태의 뼈를 나타내지만, 이에 한정되지는 않으며 더 큰 직경의 분말도 포함한다.
추출대상 골분말은 원재료를 처리하여 마련한다. 원재료는 인체뼈 또는 동물 뼈일 수 있으며, 동물뼈로는 소뼈, 말뼈 또는 돼지뼈를 사용할 수 있다.
원재료는 여러 단계의 처리단계를 거쳐 추출대상 골분말로 마련되는데, 탈회 및 탈지(지방제거)과정을 거치는 것이 바람직하다. 탈회 및 탈지과정을 거치면 원재료에는 무기질과 지방이 제거되어 단백질이 존재하는 유기질만이 남아 골형성단백질 추출이 용이해진다. 또한 원재료의 처리는 냉동건조를 포함하는 것이 좋은데, 냉동건조를 하면 조직파괴 없이 수분함량을 감소시킬 수 있다.
원재료의 처리는, 예를 들어, 1. 연조직 제거, 2. 1차 분쇄, 3. 1차 세척, 4. 1차 탈수, 5. 1차 탈지, 6. 1차 건조, 7. 2차 분쇄, 8. 탈회, 9. 2차 세척, 10. 2차 탈수, 11. 2차 탈지, 12. 2차 건조, 13. 3차 분쇄 및 크기 선별, 14. 냉동건조, 15. 이물질 검사를 포함할 수 있다.
원재료 처리과정을 상세히 설명하면 다음과 같다.
1. 연조직 제거 : 원재료 주변의 연조직을 세척 및/또는 트리밍하여 제거한다.
2. 1차 분쇄 : 원재료에 포함되어 있는 혈액 및 연조직을 쉽고 효과적으로 제거하기 위하여 세척된 원재료를 분쇄기를 사용하여 분쇄한다.
3. 1차 세척 : 초음파 세척기를 사용하여 약 10분씩 수회 멸균증류수로 세척하고 약 10분씩 수회 과산화 수소로 세척한다. 이후 상층에 부유된 지방을 에테르로 씻어 낸 다음 초음파 세척기를 사용하여 약 10분씩 다시 수회 멸균증류수로 세척한다. 이때 세척액은 원재료부피의 약 5~10배정도이다.
4. 1차 탈수 : 위 세척된 원재료를 에탄올에 넣어 약 2시간 동안 교반한다. 이 때, 에탄올은 분말 부피의 약 5~10배정도일 수 있다.
5. 1차 탈지 : 탈수한 분말을 에테르에 넣어 1시간 내지 2시간 동안 교반한다.
6. 1차 건조 : 통풍이 잘 되는 조건에서 상온에서 12시간 이상 건조한다.
7. 2차 분쇄 : 원하는 크기로 분쇄하되, 분말상태가 되도록 분쇄한다.
8. 탈회 : 분말 내의 잔존 칼슘의 양이 8% 이하가 되도록 0.6N 염산을 사용하여 약 45분씩 2회 실시한다. 이 때, 염산용액은 골분말 1g당 약 5ml 사용할 수 있다.
9. 2차 세척 : 초음파 세척기를 사용하여 약 10분씩 수회 멸균증류수로 세척하고 약 10분씩 수회 과산화 수소로 세척한다. 이후 상층에 부유된 지방을 에테르로 씻어 낸 다음 초음파 세척기를 사용하여 약 10분씩 다시 수회 멸균증류수로 세척한다.
10 : 2차 탈수 : 위 세척된 원재료를 에탄올에 넣어 약 2시간 동안 교반한다. 이 때, 에탄올은 분말 부피의 약 5~10배정도일 수 있다.
11 : 2차 탈지 : 탈수한 분말을 에테르에 넣어 1시간 내지 2시간 동안 교반한다.
12. 2차 건조 : 통풍이 잘 되는 조건에서 상온에서 12시간 이상 건조한다.
13. 3차 분쇄 및 크기 선별 : 건조된 분말을 크기별로 선별한다.
14. 냉동건조 : 잔존 수분함량이 5%이하가 되도록 48시간 이상 냉동건조 한다.
15 : 이물질 검사 : 냉동건조 후 처리 과정 중에 발생할 수 있는 불순물을 수회의 검사를 통해 제거한다.
이상 설명한 추출대상 골분말의 제조과정 중 일부, 특히 수회 반복되는 건조, 탈수, 탈지, 분쇄 중 일부 과정은 생략될 수 있다.
다음으로 2. 추출대상 골분말로부터 골형성단백질을 추출하는 과정을 설명한다.
마련된 추출대상 골분말으로부터 단백질 추출 시약을 포함하는 제1시약을 이용하여 골형성 단백질을 추출한다. 제1시약은 필요에 따라 단백질분해효소억제제를 더 포함할 수 있다.
골형성 단백질은 강한 비공유결합으로 골기질(bone matrix)에 결합되어 있는데, 단백질 추출시약은 이 결합을 파괴하는 역할을 한다. 한편, 골기질에는 단백질 분해효소가 존재하고, 단백질 분해효소는 골기질에서 분리된 골형성단백질을 분해하는데, 단백질분해효소억제제는 단백질 분해효소의 작용을 억제하여 분리된 골형성 단백질을 보존하는 역할을 한다.
단백질 추출시약으로는 완충된 구아니디움 하이드로클로라이드(Guanidium hydrochloride buffered) 및/또는 트로메타민(tromethamine, 2-amino-2-hydroxymethyl-propane-1, 3-diol)을 사용할 수 있으며, 단백질분해효소억제제로는 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethyl-sulfonyl fluoride), N-에 틸말레이미드(N-ethylmaleimide), 벤자미딘(benzamidine) 및 6-아미노헥산산(6-aminohexanoic acid) 중 적어도 어느 하나를 사용할 수 있다. 제1시약은 PH가 약 6 내지 8일 수 있다.
제1시약과 골분말을 혼합하여 추출용액을 마련한 후, 추출용액을 2℃ 내지 10℃에서 12 내지 20시간 동안 교반시킨다. 제1시약은 골분말 1g당 약 20ml 내지 40ml 사용할 수 있다.
교반 후 추출용액을 원심분리를 이용하여 상청액을 분리한다. 원심분리는 25000 내지 35000G의 초원심분리기를 사용할 수 있으며, 2℃ 내지 10℃에서 수행될 수 있다.
다음으로 3. 추출된 골형성단백질을 골이식재에 코팅하는 과정을 설명한다.
분리된 상청액과 코팅하고자 하는 코팅대상 골이식재를 혼합하여 투석막에 주입한다. 골이식재는 골분말, 골블럭 또는 골칩일 수 있다. 코팅대상 골이식재 1g당 상청액은 20ml 내지 40ml 사용할 수 있다. 투석막은 3000달턴 내지 14000달턴을 사용할 수 있다.
코팅대상 골이식재는 인체뼈 또는 동물뼈일 수 있으며, 동물뼈로는 소뼈, 말뼈 또는 돼지뼈를 사용할 수 있다.
코팅대상 골이식재 중 골분말은 직경 1mm이하, 골칩은 1mm 내지 3mm의 칩형태의 골조직, 골블럭은 골칩보다 좀 더 큰 골조직을 말한다. 그러나 이 기준은 절대적이지 않으며, 필요에 따라 1mm이상의 직경을 가지는 골분말도 가능하다. 한편 코팅대상 골이식재는 골형성단백질이 다량 코팅되도록 넓은 표면적을 가지는 것이 좋으며, 이를 위해 기계 또는 화학적 처리를 통해 코팅대상 골이식재의 표면을 거칠게 만들어 사용할 수 있다.
코팅대상 골이식재는 추출대상 골분말과 유사한 전처리를 통해 마련될 수 있으며, 탈회는 거칠 수도 있으며 거치지 않을 수도 있다. 또한 탈회를 거친 것과 거치지 않은 것을 혼합하여 사용할 수도 있다. 코팅대상 골이식재가 탈회를 거칠 경우에는 골형성단백질에 의해 골유도 효과가 일부 있으며, 탈회를 거치지 않을 경우에는 공간유지 기능이 우수하다.
이후 투석을 통해 코팅대상 골이식재 표면에 골형성단백질을 코팅하는데, 이 때 투석용액(제2시약)은 단백질 분해효소 억제제를 포함할 수 있다. 단백질분해효소억제제로는 페닐메틸설포닐, N-에틸말레이미드, 벤자미딘 및 6-아미노헥산산 중 적어도 어느 하나를 사용할 수 있다. 경우에 따라서는 단백질 분해효소 억제제를 사용하지 않고 투석용액으로 증류수를 사용할 수도 있다.
투석은 2℃ 내지 6℃에서 12시간 내지 20시간동안 진행되며, 상청액 중 투석막을 통과할 수 있는 작은 분자량을 가진 물질은 투석용액으로 나가고, 빠져나가지 못한 골형성단백질은 골이식재에 코팅된다.
마지막으로 4. 코팅후 처리를 설명한다.
투석 후 원심분리는 25,000 내지 35,000G(Gravity)의 초원심분리기를 사용할 수 있으며, 2℃ 내지 10℃에서 수행될 수 있다. 원심분리를 통해 골형성 단백질이 코팅된 골이식재와 수분이 분리된다.
이후 얻어진 코팅된 골이식재를 예비동결하고 동결건조하여 수분을 추가로 제거한다. 예비동결은 약 -80℃ 내지 -60℃에서 20분 내지 1시간 수행될 수 있으며, 동결건조는 -80℃ 내지 -50℃에서 1.5×10-4 토르 내지 2×10-4 토르의 압력에서 수행될 수 있다. 동결건조에 의해 최종 골이식재의 수분은 5%이하가 되도록 한다.
이렇게 얻어진 골이식재는 표면에 많은 골형성 단백질이 존재하기 때문에, 골형성이 효과적으로 촉진된다. 또한, 탈회과정을 거치지 않은 코팅대상 골이식재를 사용하면, 공간유지기능을 효과적으로 수행하면서도 골형성 단백질 기능을 충분히 확보할 수 있다. 탈회과정을 거친 코팅대상 골이식재를 사용하면 내부에 존재하는 골형성단백질의 작용도 용이해지기 때문에, 골형성은 더욱 촉진된다.
한편, 골형성단백질 추출 과정과 코팅과정에서 제1시약과 제2시약에 단백질분해효소억제제를 사용할 경우, 골기질에서 분리된 골형성단백질의 분해가 억제되어 코팅효율이 향상된다.
<실험예>
이하 실험예를 통하여 본 발명을 설명한다. 추출대상 골분말은 위에서 설명한 방법을 사용하여 얻어지며, 구체적인 제조방법의 기재는 생략한다. 얻어진 추출대상 골분말을 이용하여 골이식재에 골형성단백질을 다음과 같은 방법으로 코팅하였다. 골이식재로는 골분말(코팅대상)을 사용하였다. 추출대상 골분말은 탈회, 탈 지 및 냉동건조 과정을 거쳤으며 코팅대상 골분말은 탈회과정을 거치지 않았다. 추출대상 골분말과 코팅대상 골분말은 사람의 뼈를 사용하였다.
먼저 추출대상 골분말을 단백질 추출 시약을 포함하는 제1시약에 넣고 교반하여 골형성 단백질을 추출하였다. 제1시약은 단백질 추출시약으로 4M 완충된 구아니디움 하이드로클로라이드 + 50mM 트로메타민을 사용하고, 단백질분해효소억제제로 0.5mM 페닐메틸설포닐 + 5mM N-에틸말레이미드, + 5mM 벤자미딘 + 0.1M 6-아미노헥산산을 포함하며, PH는 7.4이다. 교반은 4℃에서 16시간 동안 이루어졌다.
교반 후 추출용액을 30,000G의 초원심분리를 이용하여 4℃에서 1시간 동안 원심분리한 후 상청액을 분리하였다.
이후 분리된 상청액과 골분말(코팅대상)를 혼합하여 3,500달턴의 투석막에 주입하였으며, 코팅대상 골분말 1g당 상청액은 30ml 사용하였다.
이후 투석막을 투석용액에 넣어 4℃에서 16시간동안 투석하였다. 투석용액은 단백질분해효소억제제로 0.5mM 페닐메틸설포닐, 5mM N-에틸말레이미드, 5mM 벤자미딘 및 0.1M 6-아미노헥산산을 포함했다.
투석에 의해 3,500달톤 이하의 분자량을 가진 물질은 투석용액으로 나가고, 남아 있는 골형성단백질은 골분말에 코팅되었다.
다음으로 골형성단백질이 코팅된 골분말은 30,000G의 초원심분리기를 사용하여, 4℃에서 1시간 동안 원심분리하여 수분과 분리하고 수분은 제거하였다.
마지막으로 얻어진 코팅된 골분말을 -70℃에서 30분동안 예비동결시키고 이 후 -70℃, 2×10- 4토르에서 48시간 이상 동결건조하여 수분을 추가 제거하였다. 최종적으로 얻은 골분말은 수분이 5%이하이다.
얻어진 골분말로 실험한 결과, 기존 골이식재를 사용시 골재생 또는 수복에 소요되는 기간은 5 내지 6개월이 소요되었으나, 본 발명에 따라 표면에 골형성단백질이 코팅된 골분말 사용 시 그 기간은 2 내지 3개월로 감소함을 확인하였다. 이는 탈회과정을 거치지 않은 골분말이 공간유지 기능을 수행하면서, 골분말의 표면에 코팅된 골형성 단백질이 골형성을 촉진시켰기 때문이다.

Claims (10)

  1. 골이식재의 제조방법에 있어서,
    단백질 추출 시약을 포함하는 제1시약과 추출 대상 골분말을 혼합하여 추출용액을 마련하는 단계와;
    상기 추출용액을 교반하여 상기 추출 대상 골분말로부터 골 형성 촉진 단백질을 추출하는 단계와;
    추출된 상기 골 형성 촉진 단백질을 코팅대상 골이식재에 코팅하는 단계를 포함하는 골이식재의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1시약은 단백질분해효소억제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 추출 후 원심분리 방법을 이용하여 상기 추출용액의 상청액을 얻는 단계를 더 포함하며,
    상기 코팅은 상기 상청액을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 코팅은,
    상기 상청액과 상기 코팅대상 골이식재를 투석막에 주입하고, 제2시약 내에서 투석을 실행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 투석막은 3000달턴 내지 14000달턴인 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 제2시약은 단백질분해효소억제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 코팅은,
    상기 투석 후 원심분리 방법을 이용하여 코팅된 골이식재를 분리하는 단계와;
    분리된 상기 코팅된 골이식재를 예비동결하고 냉동건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 추출대상 골분말은 원재료의 탈회, 지방제거 및 냉동 건조를 포함하는 전처리 과정을 거쳐 마련된 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 추출시약은 완충된 구아니디움 하이드로클로라이드 및 트로메타민 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  10. 제2항에 있어서,
    상기 단백질분해효소억제제는 페닐메틸설포닐, N-에틸말레이미드, 벤자미딘 및 6-아미노헥산산 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
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WO2013108963A1 (ko) * 2012-01-17 2013-07-25 Cho Seong-Yong 치아 블록골 이식재 및 그 제조방법

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