KR20100019487A - 항체 리간드로서 사용하기 위한 에피토프의 지시된 연장 방법 - Google Patents

항체 리간드로서 사용하기 위한 에피토프의 지시된 연장 방법 Download PDF

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KR20100019487A
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Abstract

본 발명은 고체상 합성에 의해 합성된 에피토프 펩티드 혼합물을 이용한 치료적, 예방적, 진단적 또는 탐색 용도에 유용한 항체를 선택하고 제조하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 공지된 에피토프의 기본 또는 원시 아미노산을 대신하는 아미노산의 실체 및 발생 빈도와 관련된 한 세트의 규칙에 의해 정의된다. 생성된 항체는 공지된 에피토프에 결합되는 항체와 관련이 있으나 이와 별개이다.

Description

항체 리간드로서 사용하기 위한 에피토프의 지시된 연장 방법{METHODS FOR THE DIRECTED EXPANSION OF EPITOPES FOR USE AS ANTIBODY LIGANDS}
관련 출원
본 출원은 2007년 5월 7일 출원된 미국 가출원 60/928,225, 2007년 10월 16일 출원된 미국 가출원 60/999,283, 2007년 10월 16일 출원된 미국 가출원 60/999,284, 및 2008년 4월 17일 출원된 미국 가출원 61/124,689의 이익을 주장한다. 본 출원은 또한 2006년 4월 13일 출원된 미국 가출원 60/792,085의 이익을 주장하는 2007년 4월 13일 출원된 미국출원 11/787,229의 일부계속출원이다. 상기 나열된 출원들의 모든 기재가 그 전체로서 본원에 참조로서 포함된다.
최근 몇 년 동안, 항체는 다양한 질병 및 질환에 대한 효과적인 치료제의 부류로서 그 자리를 굳게 하였다. 현재, 세계적으로 21개의 승인된 항체-기재 약물이 존재하고, 다수가 진행중에 있다.
단일 항체는 하나의 항원에 특이적일 수 있거나, 다수의 항원을 인식할 수 있다 (Notkins, A. L. et al ., Curr . Topics Microbiol . Immunol. 252:241, 2000; De Ciechi, PA et al ., Mol . Divers. 1:79, 1995). 그러나, 관련 에피토프에 결합되는 항체는 치료적 유효성을 보장하지 못한다. 항체는 광범한 범위의 결합 친화 력으로 결합될 수 있으며, 결합 형태에서의 근소한 차이는 표적 단백질에서 구조적인 변화를 야기하거나, 항체가 다른 항체 또는 표적의 결합 파트너와 경쟁하는 정도를 조절하거나, 항원-항체 복합체를 인식하는 면역 세포로부터 변화 있는 반응을 유도할 수 있다.
자가면역 질병과 같은 질환이나 내인성 항체가 자신의 조직과 기관에 대해 잘못된 공격을 가하는 이식 거부와 같은 질환에서는, 질환의 한 단계에서 생육할 수 있는 표적인 동정된 에피토프가 그대로 남아있지 않아 이러한 사실을 더욱 복잡하게 한다. 에피토프 전개(spreading)의 이러한 현상은, 신체가 초기 에피토프에 인접한 표적 단백질의 부분들을 새로운 에피토프로서 인식하기 시작하므로, 손상적인(offending) 내인성 항체의 결합과 경쟁하거나 이를 방해하는 치료적 또는 예방적 항체의 효능을 감소시킨다 (N. Suciu-Foca et al ., Immunol . Rev. 1998, 164:241).
치료적으로 유용한 항체를 제조하는 또 다른 방해물은 낮은 면역원성 펩티드 및 에피토프에 있다. 치료적으로 유용한 항체는 강한 면역 반응을 유도하지 않는 항원 및 에피토프에 대해 용이하게 발생되거나 동정될 수 없다. 이러한 현상은 침습성 병원체나 암에 대한 면역 개선 치료, 특히 면역 회피를 실행하는 침습성 병원체에 대한 면역 개선 치료와 백신접종 분야에서 오랫동안 인식되어 왔다. 효율적인 항체 생성 또는 효율적인 백신접종 요법을 위한 면역 반응성의 개선이 하기 추가로 논의된다.
감염성 질환, 예컨대 스몰-폭스, 폴리오, 홍역, 이하선염, 루벨라, 헤모필루 스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 백일해, 파상풍 및 디프테리아를 조절하기 위해 노력중인 면역화 프로그램은 살아있는 유기체에 의해 병원성 감염 이전에 숙주에서 면역 반응을 안전하게 생성하기 위한 오래된 기술을 몇 세기 동안 이용하였다. 이러한 백신접종 프로토콜은 숙주에 실제 병원체의 비활성 형태를 도입하는 것을 필요로 하며, 그렇게 함으로써 활성 면역 반응이 생성되었다. 병원체 비활성화의 유형을 상이하게 하는 형태 및 면역원성을 개선시키기 위한 애주번트의 이용에 있어서 기술의 개선이 이루어졌으나, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 시토메갈로바이러스, 및 중증 급성 호흡 증후군 뿐만 아니라 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르헤아(Neisseria gonorrhea), 또는 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)와 같은 세균 또는 말라리아와 같은 기생충 질환이나 일반적으로 전통적인 백신 요법에 반응하지 않는 십이지장충 질병을 다룰 수 있는 백신 개발이 요구된다.
이러한 감염성 물질, 세균 및 기생충 질환은 "면역 회피"에 의해 숙주 검출을 피해가는 유기체의 능력으로 인해 비활성 병원체 백신 접근법을 이용하여 치료하기가 더욱 어렵다. HIV 또는 플루 바이러스는 이의 면역 프로필 배수(multiple) 시간을 심지어 가장 최근에 생성된 백신의 유효성을 점차 과소평가하게 하는 만 1년보다 더 짧은 기간으로 변경시키는 능력을 지닌다.
더 강력한 면역 반응을 유도함에 있어서의 진보는 애주번트 알룸(alum)과 같이 면역 활성을 부스팅(boost)하는 항원/에피토프 비특이적인 치료의 개발 (백신 애주번트의 광대한 검토를 위해서는 Vaccine Adjuvants and Delivery Systems, edited by Manmohan Singh 2007 Wiley & Sons ISBN: 978-0-471-73907-4 참조, 본원에 참조로서 포함됨) 뿐만 아니라 이러한 병원체의 유전적 토대의 이해에 기초한 면역원의 개발(GenBank, National Center for Biotechnology Information에 의해 관리되는 데이터베이스, 현재 850억개를 초과하는 염기쌍을 그 데이터베이스에 지님, 병원체에 기초한 검색이 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/로 광범하게 이용됨)이 이루어졌다. 후자는 병원체로부터 유래된 단백질의 분리된 서열을 면역화제로서 이용할 가능성을 열어놓았다. 이러한 펩티드-기재 백신은 면역 반응성을 부스팅하기 위해 항원성 결정인자-특이적이고, 면역 기능을 자극하도록 설계된 방법을 이용하여 투여된다.
치료적 항체는 고도로 특이적이고 효과적일 수 있으나, 이들을 생성하고 치료적으로 활성인 종을 동정하는 수단은 여전히 곤란하고 비용이 많이 든다.
항체의 생성은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 항체는 인식된 리간드와 상호작용하는 B 세포 수용체(BCR)에 반응하는 B 세포에 의해 합성된다. 이의 도입이 유기체에 의해 항원으로서 인식되기 이전에는 그 일부가 접종물에 결합되는 다양한 항체가 활성 면역 시스템의 배경에서 숙주에서 살아남는다. 항원이 유기체에 도입될 때, 이러한 선재하는 항체 (생식세포 항체)는 항원과 상호작용하고, B 세포 증식 사건의 캐스케이드를 개시하여 친화력 성숙화로 명명된 과정을 통해 항원에 대해 더 높은 친화력을 지니는 항체를 초래한다. 이러한 천연 기작에서, 도입된 항원에 결합되는 다양한 결합 영역 서열을 지니는 다수의 항체가 생성되고, 각 클로날 B 세포주가 특정 항체를 생성한다.
특이적 표적 항원에 대한 항체를 생성하고 제공하기 위하여, 다양한 방법이 개발되어 왔다. 당 분야는 동일한 결합 영역을 갖는 다량의 항체(모노클로날 항체)를 생성하는 이점을 발견하였다. 모노클로날 항체를 생성하는 한 널리-공지된 방법은 하이브리도마를 생성하는 것이다. 간단히 말해, 하이브리도마는 뮤린 B 세포를 뮤린 종양 세포와 융합시켜 생성된다. 생성된 조합물은 일정한 자극에 의존적이지 않은, 요망되는 항체를 생성하는 무한증식 세포주이다. 하이브리도마주의 균질화는 시스템이 임상 투여를 위해 고도로 정의된 약물 생성물을 생성하기에 매력적이도록 만든다. 그러나, 하이브리도마는 인간 면역 시스템이 마우스 항체를 외래로서 인식하여 이들을 시스템으로부터 제거하므로, 마우스-유래된 임상 환경에서 큰 단점을 지닌다.
이러한 제한을 극복하기 위해, "인간화된 항체"를 생성한다. 유전자 공학에 의해 생성된 인간화된 항체는 하이브리도마로부터의 마우스 항체의 가변 영역과 면역글로불린의 나머지 부분, 예를 들어 인간 면역글로불린으로부터 유래된 불변 영역을 소유한다.
그러나, 인간 면역 시스템은 이러한 인간화된 항체조차도 외래 단백질로서 인식하였다; 마우스로부터 유래되는 경우 항체의 항원 특이성을 제공하는 상보성 결정 영역(CDR)이 인간에서 면역 반응을 일으킨다. 항체를 추가로 개선하기 위하여, 마우스 면역 시스템과 관련해서 완전한 인간 항체를 제공하는 유전자이식 마우스를 생성하였다 (Mendez MJ et al Nature Genetics 15:146, 1997). 대안적으로 발현 파지 라이브러리 기술로부터 채택된 실모양 박테리오파지 유사 M13에 기초한 발현 시스템이 인간 항체 유전자 생성물을 제공하기 위해 생성되었다. 간단히 말해, 요망되는 항체를 동정하기 위해, 다양한 인간 항체를 발현시키는 파지를 관심있는 항원 또는 단백질과 접촉시킨다. 부적절한 항체를 발현시키는 파지는 항원에 결합되지 않고 씻겨나간다. 항체 서열을 결합된 파지로부터 회수하여, 예를 들어 항체 생성을 위해 대장균(Escherichia coli) 세포와 같은 발현 시스템으로 클로닝시킨다.
이러한 개선에도 불구하고, 항체를 다량으로 생성하는 것은 여전히 난제로서 남아있다: 요망되는 양을 어떻게 생성하는가. 추가로, 이러한 시스템은 항원의 품질에도 의존적이다. 그러나, 나이브(naive) 재료로부터 정제된 항원의 이용은 로지스틱 및 비용 장애로 인해 제한된다. 항원을 제조하는데 요구되는 노력의 양은 항체 선택 공정에 요구되는 노력과 동등하거나 이를 초과한다고 보고된 바 있다 ((Hust and Duebel, Trends in Biotechnology 22:8, 2004).
따라서, 치료적으로 유용한 적절하고 면역원성인 항원을 수득하기 위한 수단 및 비용을 개선시키는 것을 포함하여, 항체를 동정하고 제조하는 개선된 방법이 요구된다.
발명의 개요
당 분야에서 치료적 항체를 동정하기 위한 현행 방법은 원형 항체를 동정하길 기대하는 에피토프에 결합되는 항체 라이브러리의 고-출력 스크리닝 후에 대개 가변 영역 서열을 랜덤 점 돌연변이시켜 그 결합 특성이 원형과 상이하여 원형과 다른 생리적 효과를 나타낼 후보를 생성하는 것을 포함한다.
본 발명은 치료적 또는 예방적으로 유용하거나, 연구 시약, 진단 툴, 단백질 서열에 있어서의 종들간 차이를 조사하기 위한 수단 또는 단백질 서열에서 종들간 차이와 관련된 문제를 극복하기 위한 수단으로서 사용하기 유용한 항체를 제조하는 개선된 방법을 포함한다. 이 방법은 리간드와 반응하는 다양한 생성된 항체의 증가를 초래한다. 추가로, 이 방법은 낮은 면역원성을 지닌 리간드에 대한 항체를 생성하는 문제점을 극복하도록 한다. 여전히 추가로, 본 방법은 단 하나의 종에 대해 반응성을 갖는 항체를 생성하는 것과 관련된 문제를 극복할 수 있게 한다. 본 발명은 조사 연구에 사용하기 위한 항체 시약을 생성하는 방법을 포함한다. 본 발명은 진단 툴로서 사용되는 항체 시약을 생성하기 위한 방법을 포함한다. 본 발명은 질병의 치료를 위한 치료제로서 유용한 항체를 생성하는 방법을 추가로 포함한다. 동일한 원리를 이용하여, 항체를 생체내에서 제조할 수 있고, 즉 항체 생성을 자극하는 조성물을 백신으로서 이용할 수 있다. 하기 개시된 모든 대표적인 방법의 면역화 단계는 백신으로서 본 발명의 면역원의 생체내 사용을 위해 변형될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 관심있는 항원에 대한 항체 반응과 관련된 파라토프(paratope)의 증가를 포함한다. 본 발명의 방법은 결합 사건으로 이어지는 변화된 양의 영향력을 유도하는 항원 결합 특성을 지니는 신규한 기능성 항체의 생성을 추가로 포함한다.
간단히 말해, 본 방법은 관심있는 단백질을 선택하는 단계, 관련 에피토프를 단백질 내에서 결정하는 단계, 관련 에피토프를 선택하는 단계, 에피토프의 지시된 과변이(permutation)를 수행하여 이미 확대된 관계 있는 일련의 항원을 생성하는 단계, 고체상 합성을 수행하여 지시된 서열 폴리머(directed sequence polymer, DSP)를 생성하는 단계, DSP를 항체 생성 수단과 접촉하여 정위시킴에 의해 DSP를 항원의 세트로서 총괄적으로 이용하는 단계, 생성된 항체의 활성을 결정하는 단계, 요망되는 활성을 갖는 항체를 선택하는 단계, 및 항체를 단일 종 시약, 다중-종 시약, 단일 종 진단제, 다중-종 진단제, 또는 대안적으로 치료제로서 이용하는 단계를 포함한다. 항체 생성 수단은, 예를 들어 DSP로 면역된 동물 및 이러한 동물로부터의 세포 (예컨대, 모노클로날 항체 생성을 위한 마우스로부터의 비장 세포), 파지 디스플레이 라이브러리, 또는 B 세포 라이브러리이다.
본 발명의 바람직한 방법은 공지된 기능을 지니지 않거나, 공지되거나 예상된 연구적 관심을 지니거나, 공지되거나 예상된 진단적 관심을 지니거나, 질병과 연관된 단백질을 선택하는 단계, 단백질 내에 공지된 면역원성이 없음으로부터 약하게 면역원성 내지 강하게 면역원성인 범위의 면역원성을 지닐 수 있는, 단백질 내에 있는 에피토프를 선택하는 단계, 알라닌 치환에 더하여 하나 내지 세 개의 아미노산 치환의 비율을 제어하는 한 세트의 규칙에 기초하여 에피토프의 지시된 과변이를 수행하는 단계, 고체상 화학을 이용하여 DSP를 합성하는 단계, DSP를 생체내 환경에 도입시키거나 대안적으로 DSP를 시험관내 환경에 도입시키거나 여전히 대안적으로 DSP를 항체 표현형 및 유전자형간에 관계를 유지하는 시스템, 예컨대 파지 디스플레이와 접촉시킴에 의해 항체를 생성하는 단계, 항체를 관심있는 원시 분자와 접촉시켜 생성된 항체의 활성을 결정하는 단계, 요망되는 활성을 지니는 항체를 선택하는 단계 (그 활성은 보다 높은 친화력 항체 또는 대안적으로 보다 낮은 친화력 항체, 단일 종 반응성 또는 대안적으로 다중-종 반응성, 관심있는 반응성의 단일-분자 또는 대안적으로 다중-분자 반응성이다)를 포함한다. 특정 구체예에서, 요망되는 활성은 표적의 활성에 길항적이고, 특정 바람직한 구체예에서, 요망되는 활성은 표적 활성의 차단이다. 다른 구체예에서, 요망되는 활성은 표적 단백질 활성에 효능적이다. 특정 구체예에서, 요망되는 항체의 특성은 이들이 시약이나 진단제, 또는 대안적으로 치료제로서 유용하게 하는 것이다. 추가의 구체예에서, 다중 특성을 갖는 항체를 단일 시약, 진단제 또는 치료제로 합친다. 추가의 구체예에서, 상기 다중 특성은 표적 단백질에 대한 효능제, 길항제, 또는 효력이 없는 활성을 포함한다.
대안적으로, 본 발명의 방법은 불연속적인 에피토프를 지니는 것으로 공지된 관심있는 단백질을 선택하고, 에피토프를 구성하는 아미노산을 선택하고, 아미노산을 선형 펩티드에 합쳐서 지시된 과변이를 수행함으로써 DSP를 생성하고 상기 항체를 발생시키는 것을 포함한다.
또한 본 발명의 다른 구체예는 둘 이상의 에피토프가 관심있는 각 단백질로부터 유래된 하나 이상의 에피토프를 지니도록 선택된, 둘 이상의 관심있는 단백질을 선택하고, 에피토프를 선형 서열에 합쳐서 지시된 과변이를 수행함으로써 DSP를 생성하고 상기 항체를 발생시키는 것을 포함한다.
대안적으로, 본 발명은 항체를 제조하는 방법을 포함하고, 이 방법은 관심있는 단백질을 선택하고, 에피토프를 구성하는 아미노산을 선택하고, 아미노산을 선형 펩티드에 합치고, 지시된 과돌연변이를 수행하고, 고체상 화학을 이용하여 DSP를 합성하고, DSP를 약제학적으로 허용되는 염으로서 제조하고, DSP를 숙주에 도입하고, 1주 후에 숙주로부터 항체를 함유하는 일차 조직을 회수하거나 대안적으로 1주를 초과하는 시간 후에 숙주로부터 항체를 함유하는 일차 조직을 회수하고, 생성된 항체의 활성을 결정하고, 항체를 선택하여 시약, 진단제 또는 대안적으로 치료제로서 이용하는 것을 포함한다.
대안적으로, 본 발명은 항체를 제조하는 방법을 포함하고, 이 방법은 관심있는 단백질을 선택하고, 첫 번째 종을 선택하고, 추가의 종들을 선택하고, 에피토프를 구성하는 아미노산을 선택하고, 에피토프에서 종들간 차이를 결정하고, 아미노산을 선형 펩티드에 합치고, 과변이에 대한 규칙으로서 종들간 차이를 이용하여 지시된 과돌연변이를 수행하고, 고체상 화학을 이용하여 DSP를 합성하고, DSP를 약제학적으로 허용되는 염으로서 제조하고, DSP를 DSP에 대한 규칙을 구성하는 서열을 지니는 숙주 중 하나와 동일한 숙주에 도입하거나 대안적으로 DSP를 DSP에 대한 규칙을 구성하는 서열을 지니는 임의의 종과 상이한 숙주에 도입하고, 1주 후에 숙주로부터 항체를 함유하는 일차 조직을 회수하거나 대안적으로 1주를 초과하는 시간 후에 숙주로부터 항체를 함유하는 일차 조직을 회수하고, 생성된 항체의 활성을 결정하고, 항체를 선택하여 시약, 진단제 또는 대안적으로 치료제로서 이용하는 것을 포함한다.
대안적으로, 본 발명은 항체를 제조하는 방법을 포함하고, 이 방법은 관심있는 단백질을 선택하고, 첫 번째 종을 선택하고, 추가의 종들을 선택하고, 에피토프를 구성하는 아미노산을 선택하고, 에피토프에서 종들간 차이를 결정하고, 아미노산을 선형 펩티드에 합치고, 과변이에 대한 규칙으로서 종들간 차이를 이용하여 지시된 과돌연변이를 수행하고, 고체상 화학을 이용하여 DSP를 합성하고, DSP를 약제학적으로 허용되는 염으로서 제조하고, DSP를 DSP에 대한 규칙을 구성하는 서열을 지니는 숙주 중 하나와 동일한 숙주에 도입하거나 대안적으로 DSP를 DSP에 대한 규칙을 구성하는 서열을 지니는 임의의 종과 상이한 숙주에 도입하고, 1주 후에 숙주로부터 세포를 생성하는 항체를 함유하는 일차 조직을 회수하거나 대안적으로 1주를 초과하는 시간 후에 숙주로부터 세포를 생성하는 항체를 함유하는 일차 조직을 회수하고, 생성된 항체의 활성을 결정하고, 항체의 활성을 항체를 생성하는 세포 내부의 유전자와 관련시키고, 항체를 선택하여 시약, 진단제 또는 대안적으로 치료제로서 이용하는 것을 포함한다.
대안적으로, 본 발명은 항체를 제조하는 방법을 포함하고, 이 방법은 불연속적인 에피토프를 지니는 것으로 공지된 관심있는 단백질을 선택하고, 에피토프를 구성하는 아미노산을 선택하고, 아미노산을 선형 펩티드에 합치고, 지시된 과돌연변이를 수행하고, 고체상 화학을 이용하여 DSP를 합성하고, DSP를 약제학적으로 허용되는 염으로서 제조하고, DSP를 숙주에 도입하고, 1주 후에 숙주로부터 세포를 생성하는 항체를 함유하는 일차 조직을 회수하거나 대안적으로 1주를 초과하는 시간 후에 숙주로부터 세포를 생성하는 항체를 함유하는 일차 조직을 회수하고, 생성된 항체의 활성을 결정하고, 요망되는 항체를 선택하고, 항체를 시약이나 대안적으로 치료제로서 이용하는 것을 포함한다.
간단히 말해, 항체를 생성하는 수단으로서, 관심있는 항체가 당업자에게 공지된 수단, 예를 들어 파지 디스플레이 라이브러리 스크리닝 또는 B-세포 증식 스크리닝을 이용하여 동정된다. 사용된 항원은 표적 에피토프와 관련된 펩티드의 혼합물을 포함하는 신규한 조성물이다. 본 발명의 방법은 시작점으로서 공지된 펩티드 에피토프의 서열을 이용한다. 에피토프를 구성하는 아미노산은 한 세트의 규칙에 의해 정의된 상이한 관련 아미노산들의 도입을 통해 순차적으로 개질된다. 그 결과는 본원에 "지시된-서열 폴리머" 또는 "DSP"를 포함하는 조성물로서 개시된, 치료제에 유용하거나 그 자체가 치료제인 관련 펩티드의 혼합물이다. 이러한 조성물을 "DSP" 조성물로서 언급한다. DSP 조성물을 합성하는 방법은 명시된 길이의 정의된 펩티드 서열의 아미노산 잔기의 자연 그대로의 순서를 이용하고 이를 유지한다. 각 아미노산 위치는 정의된 세트의 규칙에 기초하여 변화된다. 바람직한 구체예에서, 아미노산은 문헌[Kosiol et al ., J. Theoretical Biol., 2004, 228:97-106]의 표 X에 제시된 방법에 따라 치환된다. 대안적으로, 아미노산은 문헌[PCT/US2004/032598, page 10-11]에 개시된 예시적인 치환에 따라 변화될 수 있다. 대안적으로, 아미노산은 에피토프원에서의 아미노산의 차이에 따라서 변화될 수 있다. 본 발명의 고체상 합성 절차를 위해서, 펩티드에서의 주어진 위치에 대한 아미노산의 혼합물이 서로 비율에 의해 정의된다. 합성을 개시하기 전에, 이러한 비율은 펩티드를 따라 각 위치에 대해 결정된다. 생성된 지시된 순서의 펩티드 혼합물은 관련 펩티드 서열의 다양성을 포함한다.
DSP의 길이는 원래 정의된 서열 펩티드의 길이이거나 원래 정의된 서열 펩티드 중 30개 길이일 수 있다. 조합된 서열의 길이는 25개 내지 300개의 아미노산일 수 있다.
조합된 DSP에서 다른 아미노산 모두와 비교시 알라닌의 비율은 항상 10%를 초과할 것이고, 90%를 초과하지는 않을 것이다. 바람직하게는, 알라닌 비율이 20% 내지 80%이다. 보다 바람직하게는, 알라닌 비율이 40% 내지 75%이다. 혼합물의 다양성은 5 x 102개를 초과하는 상이한 펩티드이다. 바람직하게는, 혼합물의 다양성이 1 x 1010개를 초과하는 상이한 펩티드이다. 보다 바람직하게는, 혼합물의 다양성이 1 x 1015개를 초과하는 상이한 펩티드이다.
일부 구체예에서, DSP는 암 특이적이거나 암-개선 단백질 및 에피토프로부터 유래된다. 다른 구체예에서, DSP는 자가면역-관련된 단백질 및 에피토프로부터 유래된다. 추가의 구체예에서, DSP는 감염성 질환 관련된 에피토프로부터 유래된다. DSP가 유래되는 단백질의 예로는 G-단백질 커플링된 수용체(GPCR), 염증 관련된 단백질, 알레르기 관련된 단백질, 인터루킨 및 이들의 수용체, 케모킨 및 이들의 수용체, 샤페론 및 이들의 수용체가 있다. 일부 구체예에서, DSP는 CD20, 혈관 내피 성장 인자(VEFG), CD52, 표피 성장 인자 수용체(EGFR+), CD33, HER2; 비-종양 관련 단백질, 예컨대 TNF 알파, CD25 또는 면역글로불린 E, 면역억제를 위한, CD11a, 알파4-베타1 인테그린; 감염성 질환 관련 베타 케모킨 수용체 CCR5, RSVgpP로부터 유래된다. 다른 구체예에서, DSP는 예컨대 조합 화학에 의해 생성된 라이브러리의 스크리닝을 통해, 실험적으로 유도된 펩티드 서열로부터 유래된다.
여전히 추가의 구체예에서, DSP는 베타 병풍 구조 또는 알파 헬릭스와 같은 일차, 이차, 삼차 또는 사차 구조적 속성을 지니는 도메인을 함유하는 것으로만 공지된 단백질, 세로토닌 결합과 같은 특정 활성을 지니는 도메인을 함유하는 것으로만 공지된 단백질, 공지된 기점을 지니는 것으로만 공지된 단백질, 핵 또는 세포질과 같은 특이적 세포 구획에 속하는 것으로만 공지된 단백질, 관심있는 특정 단백질을 생성하는 세포 공정과 같은 세포 기능을 지니는 것으로만 공지된 단백질, 항산화 활성이나 대사활성, 또는 생합성 활성, 또는 분해 활성, 또는 키나아제 활성, 또는 트랜스퍼라아제 활성, 또는 리아제 활성, 또는 리가아제 활성 또는, 시그널 형질도입 활성이나 결합 활성, 또는 운동 활성, 또는 막 융합 활성, 또는 세포 소통 활성, 또는 생물학적 과정 조절 활성, 자극 활성에 대한 반응, 세포 치사 관련 활성, T 세포 활성화 관련 활성, B 세포 활성화 관련 활성, APC 활성화 관련 활성, 염증 면역 반응 관련 활성, 알레르기 반응 관련 활성, 감염성 질환 반응 관련 활성, 운반체 활성, 채널 활성, 분비 활성, 병원성 활성, 및 세포골격 조직화 활성을 지니는 것으로만 공지된 단백질을 포함하는 단백질 군으로부터 선택된다.
본 발명의 대안적인 구체예는 체액 면역원성을 지니나 세포 면역원성을 지니지 않는 단백질로 항체를 생성함에 있어서 DSP 리간드를 이용하는 방법을 포함한다. 본 발명의 추가의 대안적인 구체예는 세포 면역원성을 지니나 체액 면역원성을 지니지 않는 단백질로 항체를 생성함에 있어서 DSP 리간드를 이용하는 방법을 포함한다. 본 발명의 추가의 구체예는 낮은 수준의 면역원성을 갖는 단백질에 대한 항체를 생성함에 있어서 DSP 리간드를 이용하는 것을 포함한다.
본 발명의 대안적인 구체예는 DSP 리간드를 체액 면역성을 증가시키는 인자, 대안적으로 세포 면역성을 증가시키는 인자와 조합시킴에 의해 낮은 수준의 면역원성을 갖는 단백질에 대한 항체를 생성함에 있어서 DSP 리간드를 이용하는 방법을 포함한다. 본 발명의 대안적인 구체예는 DSP 리간드를 단백질의 외래성을 변경시키는 인자, 단백질의 크기를 변경시키는 인자, 단백질의 다양성을 변경시키는 인자, 단백질의 화학적 조성을 변경시키는 인자, 및 단백질의 항원 제시를 변경시키는 인자를 포함하는 군으로부터 선택된 인자와 조합시킴에 의해 낮은 수준의 면역원성을 갖는 단백질에 대한 항체를 생성함에 있어서 DSP 리간드를 이용하는 방법을 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 지시된 서열 폴리머를 생성하는 개념상 단계에 대한 도식이다.
도 2는 지시된 서열 폴리머를 리간드로서 이용하여 항체를 제조하는 단계를 도시한다.
도 3은 에피토프 투과성의 지시된 전개를 위해 정의된 바람직한 치환 규칙을 도시한다.
도 4는 DSP 합성 치환의 구조 및 범위에 대한 일반적인 규칙을 도시한다.
도 5는 모의-펩티드원을 이용한 DSP 합성 규칙의 적용예를 도시한다.
도 6A-B는 CD20-유래된 펩티드를 펩티드원으로서 이용한 DSP 합성 규칙의 적용예를 도시한다.
도 7A-B는 Gp100 (아미노산 잔기 154-162)을 펩티드원으로서 이용한 DSP 합성 규칙의 적용예를 도시한다.
도 8A-B는 HLA-유래된 펩티드 및 HLA 모의-유래된 펩티드를 펩티드원으로서 이용한 DSP 합성 규칙의 적용예를 도시한다.
도 9A-B는 hTRT-유래된 에피토프 펩티드를 펩티드원으로서 이용하고 실험적으로 결정된 치환 규칙을 적용시킨 DSP 합성 규칙의 적용예를 도시한다.
발명의 상세한 설명
약물 발견은 선도하는 생성 및 선도하는 최적화의 두 주요 엘리먼트로 일반화될 수 있다. 조합 화학(CC)의 개발 및 이용은 매우 기본적인 수준에서 랜덤 생성에 대한 합리적인 설계의 이용을 벗어나는 것으로 나타났다. 한편으로 본 발명자들은 합리적인 분자의 설계에서 연구원들을 돕는 CC의 용도를 발견하였다. 그 중 한 예가 치료적으로 흥미로운 둘 이상의 활성 분자들간 구조/활성 상관관계(SAR)의 발견에서 보여질 수 있다. 다른 한편으로 본 발명자들은 특이적 활성에 기초하여 발견된 새로운 분자들의 설계를 정의하는데 CC를 이용하는 연구원들을 발견한다. 그 중 한 예가 선도 생성에 사용된 랜덤 라이브러리의 생성에 의해 그 전례를 뽑아내고 추가로 최적화하는 것이다.
펩티드 라이브러리의 합성에 적용된 조합 화학 분야의 상황에서 전문기술의 수준을 상승시켜 큰 다양성의 고도로 신뢰성 있고 순수한 펩티드의 혼합물을 생성한다. 이렇게 다양한 펩티드 라이브러리의 이용은 선도 생성 및 최적화에 초점을 맞추었다. 이러한 전략은 특정 활성을 입증하는 단일 또는 제한된 세트의 펩티드를 정의하기 위해 관심있는 표적에 대하여 라이브러리에서 광대한 수의 개개 펩티드 서열을 스크리닝하는 것을 필요로 한다. 그 단일 펩티드 또는 제한된 세트의 펩티드가 이후 표적에 대한 활성을 증가시키도록 개질된 후보가 된다.
당업자들의 난제는 관찰된 활성의 원인이 되는 단일 또는 제한된 세트의 펩티드를 디콘볼루션(deconvolute)하거나 정확하게 정의하는 것이었다. 디콘볼루션과 관련된 곤란성은 개개 펩티드의 분해능 뿐만 아니라 펩티드 내에 있는 개개 아미노산의 실체를 본질적으로 증가시키는 합성 방법을 만들어내기 위해 개업의들 일부에서 많은 노력을 야기하였다.
그 지식을 약제학적 용도를 위한 항체의 선택 공정에 적용시켰다. 항체 선택을 위해, 항체의 라이브러리는 파지 디스플레이 라이브러리, 인간화된 항체의 라이브러리, 또는 항체가 스크리닝된 질병에 걸린 환자로부터의 B 세포의 집단일 수 있다.
기술에 있어서의 모든 개선에도 불구하고, 조합 라이브러리로부터 특이적 항체의 동정은 강력하고 분명한 지름길(cut)일 수 있으므로, 이것은 종종 그 자체가 치료적으로 유용하지 않은 선도 항체의 동정 및 시작점으로서만 기능한다. 동정된 항체는 표적 단백질의 활성을 차단할 수 없거나, 아마도 경감시키는 것이 치료의 목적인 바로 그 질환도 악화시킬 수 있다. 이러한 항체는 곧 치료적으로 유용하지 않다. 그러나, 당업자는 이러한 항체에 기초하여 돌연변이 및 단백질 공학처리에 의해 치료적으로 유용한 작용성을 지닐 항체를 생성할 수 있다.
항체에 대한 스크리닝 방법은 일반적으로 표적 에피토프에 결합되는 항체를 동정하도록 고안된다. 표적으로서 동정된 항체의 치료적 유용성과 관련된 에피토프를 선택하는 것이 중요하다. 이러한 고려는 에피토프 전개가 나타나는 질환에서 특히 중요하다. 관련 항체의 동정 가능성을 증가시키기 위해, 표적 에피토프를 조작할 수 있다.
정의된 펩티드 또는 한 세트의 펩티드를 이용하는 것이 균일한 샘플을 조절하여 일관되게 생성하는 능력으로 인해 전 단백질을 이용하는 것에 비해 이익이다. 원시 단백질에서, 글리코실화, 단백질의 적절한 폴딩, 및 단백질의 분해 및/또는 생리적 활성의 정도, 종류 및 재현성과 같은 타고난 현상들이 고려되어야 한다. 다른 세포 재료로부터의 정제 및 단리는 때로 문제를 일으킬 수 있다.
하기 추가로 기술된 다양한 방법들에 의해 질병 또는 질환과 관련하여 결정된 에피토프는 원래 표적에 대한 약해진 결합능 (항체는 여전히 생리적으로 유효할 수 있다)과 같은 이유 때문에 원래 에피토프를 스크리닝 표적으로서 이용함에 의해 동정되지 않을 항체의 종류를 확대시키도록 변형될 수 있다. 또한, 관련이 있으나 상이한 항체들의 수집물을 동정하기 위해, 일련의 이렇게 변형된 에피토프가 유용할 수 있다.
일부 경우에, 다발성 경화증의 발생 과정에, 반응성 에피토프가 일정한 채로 있지 않음이 관찰되었다. 즉, MS의 발생과 관련된 자체 인식은 자기반응성 변화, 형성성(plasticity), 및 불안정성을 특징으로 하는 발생 과정이며, 여기서 표적 에피토프는 시간에 따라, 통상적으로 미엘린 단백지방질 단백질 상의 하나의 에피토프로부터 아미노산 잔기와 부분적으로 겹치나 원래 에피토프의 어느 한쪽으로 하나 또는 소수의 아미노산만큼 이동한 에피토프로 변화된다. 이러한 현상의 결과, 면역요법 약물이 시간에 따라 원래 에피토프에서 표적화되는 경우, 이것은 약물의 메카니즘에 대한 내성으로 인해서가 아니라 단순히 표적이 더 이상 유효하지 않기 때문에 효과가 없어진다. 문헌[J. Clin . Invest., 1997, 99:1682-1690]. 따라서, 관련 항체들의 수집물은 연속 방식으로 숙주에 의해 생성된 요망되지 않는 항체의 시리즈를 방해함에 있어서 효과적일 수 있다.
관련 펩티드의 혼합물이 단일 펩티드보다 치료적으로 더욱 효과적일 수 있음이 이미 밝혀졌다 [Lustgarten et al , J. Immunol. 2006, 176: 1796-1805; Quandt et al , Molec . Immunol. 2003, 40: 1075-1087]. 펩티드 혼합물의 유효성은 단일 펩티드에 반하여 에피토프 전개의 과정을 통해 손상성(offending) 에피토프의 확장과 상호작용할 가능성이 있다 (Immunol . Rev. 1998, 164:241). 따라서, 유효성을 증가시키고 이를 유지하기 위해, 이러한 이전의 치료 양상은 변형되어 왔다. 예를 들어, 변경된 펩티드 리간드(APL) 방법에 기초한 치료용 조성물이 소수의 아미노산 잔기를 원래 에피토프 펩티드 또는 다른 APL과 함께, 에피토프 서열 내에서 변경시킴에 의해 원래 에피토프로부터 생성된 다중 펩티드를 포함할 수 있다. 문헌[Fairchild et al , Curr . Topics Peptide & 단백질 Res. 6, 2004]. 각 APL은 정의된 서열을 지닐 것이나, 조성물은 하나를 초과하는 서열을 지닌 APL의 혼합물일 수 있다. 이러한 혼합물을 항원성 조성물로 이용함으로써, 관련 항체의 수집물이 동정될 수 있다.
관련 항체의 수집물을 동정할 수 있는 또 다른 방법은 랜덤 서열 코폴리머를 이러한 항체를 스크리닝하기 위한 에피토프로서 이용하는 것이다. 랜덤 서열 코폴리머는 정의된 아미노산 조성물을 지니나 정의된 서열을 지니지 않는 펩티드의 수집물이다. 널리 공지된 예가 Y, E, A, K의 전체적인 조성물을 특정 비율로 지니는 펩티드의 혼합물인 COP-1이나, 이 경우 이러한 아미노산 잔기의 서열은 규정되지 않는다. 치료제로서, 아미노산 함량과 아미노산의 비율을 변화시킴에 의해 COP-1을 개선하려는 다수의 접근법이 있었다; 그러나, RSP를 이용하는 단점이 여전이 남아있다. 개선된 치료용 RSP에 대해서는, 예를 들어 문헌[Strominger et al. (WO/2003/029276) and developed further by Rasmussen et al. (US 2006/0194725); WO/2005/032482; and WO/2005/074579]을 참조한다.
이러한 접근법의 단점은 이의 특성이 각 모티프에서 효과적인지 확실하지 않다는 것이고, 혼합물 중 아마도 꽤 많은 비율의 펩티드가 불활성일 수 있고, 이는 유용한 에피토프의 농도를 저하시킨다. 추가로, 이러한 화합물은 로트에서 로트로 일관되게 제조하고 수득하기가 어렵다. 따라서, 이러한 랜덤 코폴리머를 이용하여 동정된 항체의 치료적 유용성은 강하게 기대되지 않으며, 이는 이러한 스크리닝을 덜 효과적이게 만든다. 본 발명은 항체를 스크리닝하는데 유용한 펩티드를 생성하는 종래 방법들의 가장 유용한 특성들을 받아들였으나 각각의 한계들을 제거하였다.
본 발명은 치료적으로 효과적인 항체를 동정하기 위해 "지시된 서열 폴리머"(DSP)의 이용에 관한 것이다. 이 접근은 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. DSP는, 이로 제한되지 않으나 원치않는 면역 반응과 관련된 원시 에피토프일 수 있는, 기본 펩티드 서열로부터 유래된 서열을 지니는 펩티드이다. DSP는 기본 펩티드 서열과 상이한 하나 이상의 아미노산 잔기를 지니는데, 이의 치환은 교체되는 아미노산 잔기의 일정한 특성을 보존하고자 하는 정의된 규칙에 의해 결정된다.
DSP 조성물에 의해 유도된 항체는 기본 펩티드이나 이와 상이한 펩티드를 인식하는 것들과 관련될 것으로 예상된다. 이러한 차이는 용이하게 노출되지 않는 에피토프, 예를 들어 전이 형태인 에피토프 또는 원시 상태에서 절반이 불명료한 에피토프를 인식하는 항체를 동정하기 위해 바람직할 것으로 기대된다. 그럼에도 불구하고 "불투명(opaque)" 또는 "위장(camouflaged)" 또는 "차폐(masked)"된 에피토프라 불리는 이러한 에피토프에 구조적으로 상이한 항체가 접근할 수 있다. 소형 잔기인 알라닌의 높은 함량으로 인해, DSP는 이러한 잠재적인 에피토프를 모방할 기회가 더 많다.
DSP 조성물에 의해 유도된 항체는, 이러한 항체가 기본 펩티드로의 이들의 검출가능한 결합에 의해 스크리닝된 항체와 상이한 방식으로 표적을 인식하고 이에 결합되어 기본 펩티드에 대한 항체와 상이한 정도 또는 상이한 방식으로 표적의 기능을 활성화 또는 불활성화시키기 때문에, 기본 펩티드에 대한 항체보다 유용할 수 있다.
다중 DSP를 포함하는 DSP 조성물은 아미노산 변화 및 기본 펩티드 서열에 대한 서열의 임의의 주어진 위치에서의 이러한 아미노산 잔기 도입의 발생 비율을 정의하는 한 세트의 합성 규칙에 의해 합성된다. 따라서, DSP는 단일 펩티드로서 합성되지 않으나, 항상 다중 관련된 DSP를 포함하는 조성물의 일부로서 합성되고, 이의 전체적인 혼합물은 재현될 수 있고 적용된 합성 규칙에 일치한다. 기본 펩티드의 선택에서 시작하여 DSP 조성물을 생성하는 단계에 대한 도식이 도 2에 제시되어 있다.
I. 기본 펩티드 서열
의미있는 DSP 조성물을 생성하기 위해, 먼저 DSP가 초래되는 기본 펩티드 서열을 정의할 필요가 있다. 기본 펩티드 서열은 수많은 방법으로 유래될 수 있다. 이러한 목적에 유용한 펩티드 서열은 단백질의 활성을 길항시키거나 작동시키는 적절한 표적으로 공지되어 있거나 적절한 표적인 것으로 여겨지는 펩티드 서열이다. 이들 서열 중 일부는 이미 동정되었고 허가된 항체 치료용 약물에 대한 표적으로 이용되어 왔다. 예를 들어 문헌[Mascelli et al , J. Clin . Pharmacol. 2007, 47: 553-565 and Carter P. et al, AACR Education Book, AACR 96th Annual Meeting, April 16-20, 2005, 147-154]의 표 I 참조. 그러나, 이러한 항체는, 예를 들어 표적에 대한 결합 친화력을 증가시키거나 원래 치료용 항체는 전혀 반응하지 않거나 충분하지 않게 반응하는 표적의 유전자 변이를 갖는 환자에게 효과적일 변이를 마련함에 의해 여전히 개선될 수 있다.
암 관련 폴리펩티드 및 에피토프
이러한 펩티드 서열은, 예를 들어 암 특이적이거나 암-개선 단백질 및 에피토프이며, 상기 암은 백혈병, 유방암, 피부암, 뼈암, 전립선암, 간암, 폐암, 뇌암, 후두암, 담낭암, 췌장암, 직장암, 부갑상샘암, 갑상샘암, 부신암, 신경암, 두경부암, 결장암, 위암, 기관지암, 신장암, 기저세포암, 암종, 편평세포 암종, 흑색종, 전이 피부암종, 골육종, 에윙(Ewing) 육종, 베티쿨럼(veticulum) 세포 암종, 골수종, 거대세포 종양, 소세포 폐 종양, 담석, 섬세포 종양, 일차 뇌종양, 림프구성, 과립구성, 털-세포, 샘종, 과다증식증, 속질 암종, 크롬친화세포종, 난소 종양, 자궁경부 형성이상, 동일반응계내(in situ) 암종, 신경모세포종, 망막모세포종, 연조직 육종, 카포시 육종, 골형성 육종으로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 구체적으로, 이러한 단백질 및 에피토프는 예컨대 G-단백질 커플링된 수용체(GPCR), CD20 (CALMIANSC (서열번호 1), CWWEWTIGC (서열번호 2), Binder et al. Blood 2006, 108: 1975-78), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), CD52, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR+), CD33, HER2; 비-종양 관련 단백질, 에컨대 TNF 알파; CD25 ((116)ERIYHFV(122) (서열번호 4) 및 이의 구조적 유사체 CWYHYIWEC (서열번호 5), Binder et al , Cancer Res. 2007, 67(8):3518-23) 또는 면역억제를 위한 면역글로불린 E, CD11a, 알파4-베타1 인테그린; 감염성 질환 관련 베타 케모킨 수용체 CCR5 또는 RSVgpP, 및 예컨대 조합 화학에 의해 생성된 라이브러리의 스크리닝을 통해 실험적으로 유래된 펩티드 서열이다.
G 단백질 커플링된 수용체
7개의 트랜스멤브레인 단백질 (7-TM)로서도 공지된 G 단백질 커플링된 수용체(GPCR)도 세포내 시그널로 세포외 자극의 번역을 제공하는 단백질의 거대 패밀리이다. 단백질의 GPCR 패밀리는 척추동물 및 비척추동물 사이에서 고도로 보존된다. 인간 게놈에 800개를 초과하는 GPCR이 존재하는 것으로 추정된다 (Kroeze, W., J. Cell Science, 116:4867에서 검토됨). 본 발명의 방법의 일 구체예는 DSP의 기초로서 GPCR 단백질을 이용하고, 상기 GPCR(http://www.expasy.org에서 용이하게 이용할 수 있는 서열)은 하기를 포함하는 군으로부터 선택된다:
5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 3B; 5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 1A; 5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 1B; 5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 1D; 5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 1E; 5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 1F, 2A; 5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 2A; 5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 2B; 5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 2C; 5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 3A; 5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 4; 5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 5A; 5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 6; 5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 7 (아데닐레이트 시클라아제-커플링됨); 아데노신 A1 수용체; 아데노신 A2a 수용체; 아데노신 A2b 수용체; 아데노신 A3 수용체; 아데닐레이트 시클라아제 활성화 폴리펩티드 1 (뇌하수체) 수용체 타입 I; 아드레날린성 알파-1A-수용체; 아드레날린성 알파-1B-수용체; 아드레날린성 알파-1D-수용체; 아드레날린성 알파-2A-수용체; 아드레날린성 알파-2B-수용체; 아드레날린성 알파-2C-수용체; 아드레날린성 베타-1-수용체; 아드레날린성 베타-2-수용체; 아드레날린성 베타-3-수용체; 아드레노메둘린(adrenomedullin) 수용체; 안지오텐신 II 수용체 타입 1; 안지오텐신 II 수용체 타입 2; 안지오텐신 II 수용체-유사 1; 아르기닌 바소프레신 수용체 1A; 아르기닌 바소프레신 수용체 1B; 아르기닌 바소프레신 수용체 2 (콩팥 요붕증); 봄베신-유사 수용체 3; 브라디키닌 수용체 B1; 브라디키닌 수용체 B2; 뇌-특이적 혈관형성 억제제 1; 뇌-특이적 혈관형성 억제제 2; 뇌-특이적 혈관형성 억제제 3; 버키트 림프종 수용체 1 GTP 결합 단백질 (케모킨 (C-X-C 모티프) 수용체 5); 카드헤린; 칼시토닌 수용체; 칼시토닌 수용체-유사; 칼슘-감지 수용체 (저칼슘뇨 고칼슘혈 1; 카나비노이드 수용체 1 (뇌); 카나비노이드 수용체 2 (매크로파지); CD97 분자; 케모킨 (C-C 모티프) 수용체 1; 케모킨 (C-C 모티프) 수용체 2; 케모킨 (C-C 모티프) 수용체 3; 케모킨 (C-C 모티프) 수용체 4; 케모킨 (C-C 모티프) 수용체 5; 케모킨 (C-C 모티프) 수용체 6; 케모킨 (C-C 모티프) 수용체 7; 케모킨 (C-C 모티프) 수용체 8; 케모킨 (C-C 모티프) 수용체 9; 케모킨 (C-C 모티프) 수용체-유사 1; 케모킨 (C-C 모티프) 수용체-유사 2; 케모킨 (C-X3-C 모티프) 수용체 1; 케모킨 (C-X-C 모티프) 수용체 4; 케모킨 (C-X-C 모티프) 수용체 6; 케모킨 결합 단백질 2; 케모킨 희귀 수용체 1; 케모킨-유사 수용체 1; 콜레시스토키닌 A 수용체; 콜레시스토키닌 B 수용체; 콜린성 수용체 무스카린 1; 콜린성 수용체 무스카린 2; 콜린성 수용체 무스카린 3; 콜린성 수용체 무스카린 4; 콜린성 수용체 무스카린 5; 염색체 7 해독틀 9; 응고 인자 II (트롬빈) 수용체; 응고 인자 II (트롬빈) 수용체-유사 1; 응고 인자 II (트롬빈) 수용체-유사 2; 응고 인자 II (트롬빈) 수용체-유사 3; 보체(complement) 성분 3a 수용체 1; 보체 성분 5a 수용체 1; 코르티코트로핀 방출 호르몬 수용체 1; 코르티코트로핀 방출 호르몬 수용체 2; 크립토크롬 1 (포토리아제-유사); 시스테이닐 류코트리엔 수용체 1; 시스테이닐 류코트리엔 수용체 2; 도파민 수용체 D1; 도파민 수용체 D2; 도파민 수용체 D3; 도파민 수용체 D4; 도파민 수용체 D5; 더피(Duffy)혈 그룹 케모킨 수용체; EGF 라트로필린 및 7 트랜스멤브레인 도메인 함유 1; EGF LAG 7-패스(pass) G-타입 수용체 1 (플라밍고 호몰로그 드로소필라); EGF LAG 7-패스 G-타입 수용체 2 (플라밍고 호몰로그 드로소필라); EGF LAG 7-패스 G-타입 수용체 3 (플라밍고 호몰로그 드로소필라) 카드헤린; egf-유사 모듈 함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2; egf-유사 모듈 함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 3; egf-유사 모듈 함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 1; 내피 분화 리소포스파티딘산 G-단백질-커플링된 수용체 6; 내피 분화 리소포스파티딘산 G-단백질-커플링된 수용체 7; 내피 분화 스핑고리피드 G-단백질-커플링된 수용체 8; 내피 분화 리소포스파티딘산 G-단백질-커플링된 수용체 2; 내피 분화 리소포스파티딘산 G-단백질-커플링된 수용체; 내피 분화 스핑고리피드 G-단백질-커플링된 수용체 1; 내피 분화 스핑고리피드 G-단백질-커플링된 수용체 3; 내피 분화 스핑고리피드 G-단백질-커플링된 수용체 5; 엔도텔린 수용체 타입 A; 엔도텔린 수용체 타입 B 카드헤린; 엡스타인-바 바이러스 유도된 유전자 2 (림프구-특이적인 G 단백질-커플링된 수용체); 서열 유사성 62(C2 도메인 함유) 구성원 A를 지니는 패밀리; 여포 자극 호르몬 수용체; 포르밀 펩티드 수용체 1; 포르밀 펩티드 수용체-유사 1; 포르밀 펩티드 수용체-유사 2; 프리즐드(frizzled) 호몰로그 1 (드로소필라); 프리즐드 호몰로그 10 (드로소필라); 프리즐드 호몰로그 2 (드로소필라); 프리즐드 호몰로그 3 (드로소필라) (G 단백질-커플링된 수용체 68); 프리즐드 호몰로그 4 (드로소필라); 프리즐드 호몰로그 5 (드로소필라) (후각 수용체 패밀리 2 서브패밀리 H 구성원 2); 프리즐드 호몰로그 6 (드로소필라); 프리즐드 호몰로그 7 (드로소필라); 프리즐드 호몰로그 8 (드로소필라); 프리즐드 호몰로그 9 (드로소필라); G 단백질-커플링된 담즙산 수용체 1; G 단백질-커플링된 수용체 패밀리 C 그룹 5 구성원 B; G 단백질-커플링된 수용체 패밀리 C 그룹 5 구성원 C; G 단백질-커플링된 수용체 패밀리 C 그룹 5 구성원 D; G 단백질-커플링된 수용체 패밀리 C 그룹 6 구성원 A; G 단백질-커플링된 수용체 1 케모킨 (C-C 모티프) 수용체 10; G 단백질-커플링된 수용체 101;
G 단백질-커플링된 수용체 103; G 단백질-커플링된 수용체 107; G 단백질-커플링된 수용체 108; G-단백질-커플링된 수용체 109B; G 단백질-커플링된 수용체 1 10; G 단백질-커플링된 수용체 111; G 단백질-커플링된 수용체 112; G 단백질-커플링된 수용체 113; G 단백질-커플링된 수용체 114; G 단백질-커플링된 수용체 115; G 단백질-커플링된 수용체 116; G 단백질-커플링된 수용체 119; G 단백질-커플링된 수용체 12 (유로텐신 2 수용체); G 단백질-커플링된 수용체 123; G 단백질-커플링된 수용체 124; G 단백질-커플링된 수용체 125; G 단백질-커플링된 수용체 126; G 단백질-커플링된 수용체 128; G 단백질-커플링된 수용체 132; G 단백질-커플링된 수용체 133; G 단백질-커플링된 수용체 135; G 단백질-커플링된 수용체 137; G 단백질-커플링된 수용체 139; G 단백질-커플링된 수용체 143; G 단백질-커플링된 수용체 146; G 단백질-커플링된 수용체 15; G 단백질-커플링된 수용체 150; G 단백질-커플링된 수용체 151; G 단백질-커플링된 수용체 152; G 단백질-커플링된 수용체 155; G 단백질-커플링된 수용체 156; G 단백질-커플링된 수용체 157; G 단백질-커플링된 수용체 158; G 단백질-커플링된 수용체 160; G 단백질-커플링된 수용체 161; G 단백질-커플링된 수용체 162; G 단백질-커플링된 수용체 17; G 단백질-커플링된 수용체 171; G 단백질-커플링된 수용체 172A; G 단백질-커플링된 수용체 172B; G 단백질-커플링된 수용체 173; G 단백질-커플링된 수용체 174; G 단백질-커플링된 수용체 175; G 단백질-커플링된 수용체 176; G 단백질-커플링된 수용체 18; G 단백질-커플링된 수용체 19; G 단백질-커플링된 수용체 20; G 단백질-커플링된 수용체 21; G 단백질-커플링된 수용체 22; G 단백질-커플링된 수용체 23 (멜라닌-농축 호르몬 수용체 1); G 단백질-커플링된 수용체 25; G 단백질-커플링된 수용체 26; G 단백질-커플링된 수용체 27; G 단백질-커플링된 수용체 3; G 단백질-커플링된 수용체 30; G 단백질-커플링된 수용체 31; G 단백질-커플링된 수용체 32; G 단백질-커플링된 수용체 34; G 단백질-커플링된 수용체 35; G 단백질-커플링된 수용체 37 (엔도텔린 수용체 타입 B-유사 모틸린 수용체); G 단백질-커플링된 수용체 37 유사 1; G 단백질-커플링된 수용체 39 (유리 지방산 수용체 1, 유리 지방산 수용체 3); G 단백질-커플링된 수용체 4 (케모킨 (C 모티프) 수용체 1); G 단백질-커플링된 수용체 42 (유리 지방산 수용체 2); G 단백질-커플링된 수용체 44; G 단백질-커플링된 수용체 45; G 단백질-커플링된 수용체 50; G 단백질-커플링된 수용체 52; G 단백질-커플링된 수용체 55; G 단백질-커플링된 수용체 56; G 단백질-커플링된 수용체 6 (신경펩티드 B/W 수용체 1, 신경펩티드 B/W 수용체 2, 케모킨 (C-X-C 모티프) 수용체 3, 프로락틴 방출 호르몬 수용체); G 단백질-커플링된 수용체 61; G 단백질-커플링된 수용체 62; G 단백질-커플링된 수용체 63; G 단백질-커플링된 수용체 64; G 단백질-커플링된 수용체 65; G 단백질-커플링된 수용체 75; G 단백질-커플링된 수용체 77; G 단백질-커플링된 수용체 78; G 단백질-커플링된 수용체 81; G 단백질-커플링된 수용체 82; G 단백질-커플링된 수용체 83; G 단백질-커플링된 수용체 84; G 단백질-커플링된 수용체 85; G 단백질-커플링된 수용체 87; G 단백질-커플링된 수용체 88; G 단백질-커플링된 수용체 89A; G 단백질-커플링된 수용체 92; G 단백질-커플링된 수용체 97; G 단백질-커플링된 수용체 98; G 단백질-커플링된 수용체 패밀리 C 그룹 5 구성원 A; 갈라닌 수용체 1; 갈라닌 수용체 2; 갈라닌 수용체 3; 감마 형질도입 활성 폴리펩티드 1; 감마-아미노부티르산 (GABA) B 수용체 1; 감마-아미노부티르산 (GABA) B 수용체 2; 위 억제 폴리펩티드 수용체; 가스트린-방출 펩티드 수용체; GLI 발병기전-관련 1 유사 1; 글루카곤 수용체 옵신 1 (추체 색소) 중간-파-민감성 (색맹 녹색강이상자); 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체; 글루카곤-유사 펩티드 2 수용체; 글루타메이트 수용체 대사성수용기(metabotropic) 1; 글루타메이트 수용체 대사성수용기 2; 글루타메이트 수용체 대사성수용기 3; 글루타메이트 수용체 대사성수용기 4; 글루타메이트 수용체 대사성수용기 5; 글루타메이트 수용체 대사성수용기 6; 글루타메이트 수용체 대사성수용기 7; 글루타메이트 수용체 대사성수용기 8; 고나도트로핀-방출 호르몬 (타입 2) 수용체 2; 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체; 성장 호르몬 방출 호르몬 수용체; 성장 호르몬 분비촉진제 수용체; 구아닌 누클레오티드 결합 단백질 (G 단백질); HCRT; 히스타민 수용체 H1 ; 히스타민 수용체 H2; 히스타민 수용체 H3; 히스타민 수용체 H4; 히포크레틴 (오렉신) 신경펩티드 전구체; 히포크레틴 (오렉신) 수용체 1; 히포크레틴 (오렉신) 수용체 2; 인터루킨 8 수용체 알파; 인터루킨 8 수용체 베타; KISS1 수용체; LanC 랜티바이오틱 합성효소 성분 C-유사 1 (세균); 라트로필린 1; 라트로필린 2; 라트로필린 3; 류신-부화 반복-함유 G 단백질-커플링된 수용체 4; 류신-부화 반복-함유 G 단백질-커플링된 수용체 5; 류신-부화 반복-함유 G 단백질-커플링된 수용체 6; 류코트리엔 B4 수용체; 류코트리엔 B4 수용체 2; 황체형성 호르몬/융모성선자극호르몬 수용체; MAS1 종양유전자; MAS1 종양유전자-유사; MAS-관련 GPR 구성원 F; MAS-관련 GPR 구성원 X1; MAS-관련 GPR 구성원 X2; MAS-관련 GPR 구성원 X3; MAS-관련 GPR 구성원 X4; 멜라닌-농축 호르몬 수용체 2; 멜라노코르틴 1 수용체 (알파 멜라닌세포 자극 호르몬 수용체); 멜라노코르틴 2 수용체 (부신피질자극 호르몬); 멜라노코르틴 3 수용체; 멜라노코르틴 4 수용체; 멜라노코르틴 5 수용체; 멜라토닌 수용체 1A; 멜라토닌 수용체 1B; 나트륨배설촉진 펩티드 수용체 A/구아닐레이트 시클라아제 A (아트리오나트륨배설촉진 펩티드 수용체 A); 나트륨배설촉진 펩티드 수용체 B/구아닐 시클라아제 B (아트리오나트륨배설촉진 펩티드 수용체 B); 나트륨배설촉진 펩티드 수용체 C/구아닐 시클라아제 C (아트리오나트륨배설촉진 펩티드 수용체 C); 뉴로메딘 B 수용체; 뉴로메딘 U 수용체 1; 뉴로메딘 U 수용체 2; 신경펩티드 FF 수용체 1; 신경펩티드 FF 수용체 2; 신경펩티드 Y; 신경펩티드 Y 수용체 Y1; 신경펩티드 Y 수용체 Y2; 신경펩티드 Y 수용체 Y5; 뉴로텐신 수용체 1 (고 친화력); 뉴로텐신 수용체 2; 후각 수용체 패밀리 1 서브패밀리 A 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 1 서브패밀리 E 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 1 서브패밀리 E 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 1 서브패밀리 G 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 1 서브패밀리 D 구성원 4; 후각 수용체 패밀리 1 서브패밀리 J 구성원 4; 후각 수용체 패밀리 10 서브패밀리 A 구성원 4; 후각 수용체 패밀리 10 서브패밀리 A 구성원 5; 후각 수용체 패밀리 10 서브패밀리 AD 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 10 서브패밀리 H 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 10 서브패밀리 H 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 10 서브패밀리 H 구성원 3; 후각 수용체 패밀리 10 서브패밀리 J 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 11 서브패밀리 A 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 12 서브패밀리 D 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 12 서브패밀리 D 구성원 3; 후각 수용체 패밀리 2 서브패밀리 A 구성원 4; 후각 수용체 패밀리 2 서브패밀리 B 구성원 11; 후각 수용체 패밀리 2 서브패밀리 B 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 2 서브패밀리 C 구성원 3; 후각 수용체 패밀리 2 서브패밀리 D 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 2 서브패밀리 F 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 2 서브패밀리 H 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 2 서브패밀리 J 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 2 서브패밀리 L 구성원 13; 후각 수용체 패밀리 2 서브패밀리 L 구성원 3; 후각 수용체 패밀리 2 서브패밀리 M 구성원 4; 후각 수용체 패밀리 2 서브패밀리 S 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 2 서브패밀리 W 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 4 서브패밀리 C 구성원 11; 후각 수용체 패밀리 4 서브패밀리 C 구성원 3; 후각 수용체 패밀리 4 서브패밀리 C 구성원 6; 후각 수용체 패밀리 4 서브패밀리 D 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 4 서브패밀리 D 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 4 서브패밀리 N 구성원 4; 후각 수용체 패밀리 5 서브패밀리 I 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 5 서브패밀리 L 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 5 서브패밀리 P 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 5 서브패밀리 P 구성원 3; 후각 수용체 패밀리 5 서브패밀리 V 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 51 서브패밀리 B 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 51 서브패밀리 B 구성원 4; 후각 수용체 패밀리 51 서브패밀리 E 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 51 서브패밀리 E 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 52 서브패밀리 A 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 52 서브패밀리 B 구성원 4; 후각 수용체 패밀리 52 서브패밀리 H 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 56 서브패밀리 B 구성원 4; 후각 수용체 패밀리 6 서브패밀리 A 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 6 서브패밀리 B 구성원 3; 후각 수용체 패밀리 6 서브패밀리 W 구성원 1 위유전자; 후각 수용체 패밀리 7 서브패밀리 A 구성원 17; 후각 수용체 패밀리 7 서브패밀리 A 구성원 5; 후각 수용체 패밀리 7 서브패밀리 C 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 7 서브패밀리 D 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 7 서브패밀리 D 구성원 4; 후각 수용체 패밀리 7 서브패밀리 E 구성원 5 위유전자; 후각 수용체 패밀리 7 서브패밀리 E 구성원 91 위유전자; 후각 수용체 패밀리 8 서브패밀리 B 구성원 8; 후각 수용체 패밀리 8 서브패밀리 D 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 8 서브패밀리 D 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 8 서브패밀리 G 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 8 서브패밀리 G 구성원 5; 후각 수용체 패밀리 8 서브패밀리 U 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 1 서브패밀리 A 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 1 서브패밀리 D 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 1 서브패밀리 F 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 2 서브패밀리 C 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 3 서브패밀리 A 구성원 1; 후각 수용체 패밀리 3 서브패밀리 A 구성원 2; 후각 수용체 패밀리 3 서브패밀리 A 구성원 3; 후각 수용체 패밀리 6 서브패밀리 B 구성원 2; 오피에이트 수용체-유사 1; 오피오이드 수용체 델타 1; 오피오이드 수용체 카파 1; 오피오이드 수용체 mu 1; 옵신 1 (추체 색소) 장-파-민감성 (색맹 적색각이상); 옵신 1 (추체 색소) 단-파-민감성 (색맹, 청색각이상); 옵신 3 (엔세팔롭신 파놉신); 옵신 4 (멜라놉신); 옵신 5; 옥소에이코사노이드 (OXE) 수용체 1; 옥소글루타레이트 (알파-케토글루타레이트) 수용체 1; 옥시토신 수용체; 췌장 폴리펩티드 수용체 1; 부갑상샘 호르몬 수용체 1; 부갑상샘 호르몬 수용체 2; 혈소판-활성 인자 수용체; 프로게스틴 및 아디포Q 수용체 패밀리 구성원 VII; 프로게스틴 및 아디포Q 수용체 패밀리 구성원 VIII; 프로키네시틴 수용체 1; 프로키네시틴 수용체 2; 프롤린-부화 단백질 PRP2; 프로스타글란딘 D2 수용체 (DP); 프로스타글란딘 E 수용체 1 (아형 EP1) 42kDa; 프로스타글란딘 E 수용체 2 (아형 EP2) 53kDa; 프로스타글란딘 E 수용체 3 (아형 EP3); 프로스타글란딘 E 수용체 4 (아형 EP4); 프로스타글란딘 F 수용체 (FP); 프로스타글란딘 12 (프로스타시클린) 수용체 (IP); 푸린성 수용체 P2 Y G-단백질 커플링된 10; 푸린성 수용체 P2Y G-단백질 커플링된 12; 푸린성 수용체 P2Y G-단백질 커플링된 13; 푸린성 수용체 P2Y G-단백질 커플링된 14; 푸린성 수용체 P2Y G-단백질 커플링된 5; 푸린성 수용체 P2Y, G-단백질 커플링된 1; 푸린성 수용체 P2Y, G-단백질 커플링된 11; 푸린성 수용체 P2Y, G-단백질 커플링된 2; 피리미딘성 수용체 P2Y, G-단백질 커플링된 4; 피리미딘성 수용체 P2Y, G-단백질 커플링된 6; 릴랙신/인슐린-유사 패밀리 펩티드 수용체 1; 릴랙신/인슐린-유사 패밀리 펩티드 수용체 2; 릴랙신/인슐린-유사 패밀리 펩티드 수용체 3; 망막 퇴화 저하(slow) 망막 G 단백질 커플링된 수용체; 망막 외부 세그먼트 막 단백질 1; 망막 색소 상피-유래된 로돕신 호몰로그; 로돕신 (옵신 2; 로드 색소) (색소성 망막염 4 상염색체 우성); 세크레틴 수용체; 혈청 아밀로이드 A2; 중증 신생아 부갑상샘기능항진증); 시그널 서열 수용체 알파 (트랜스로콘-관련 단백질 알파); 시그널 서열 수용체 베타 (트랜스로콘-관련 단백질 베타); 스무슨드(smoothened) 호몰로그 (드로소필라); 소마토스타틴 수용체 1; 소마토스타틴 수용체 2; 소마토스타틴 수용체 3; 소마토스타틴 수용체 4; 소마토스타틴 수용체 5; 숙시네이트 수용체 1; 표면; 타치키닌 수용체 1; 타치키닌 수용체 2; 타치키닌 수용체 3; 미각 수용체 타입 1 구성원 1; 미각 수용체 타입 1 구성원 2; 미각 수용체 타입 2 구성원 1; 미각 수용체 타입 2 구성원 16; 미각 수용체 타입 2 구성원 3; 미각 수용체 타입 2 구성원 4; 미각 수용체 타입 2 구성원 9; 미각 수용체 타입 2 구성원 38; 미각 수용체 타입 2 구성원 5; 트롬복산 A2 수용체 G 단백질-커플링된 수용체 137B; 갑상샘 자극 호르몬 수용체; 티로트로핀-방출 호르몬 수용체; 트레이스(trace) 아민 관련 수용체 1; 트레이스 아민 관련 수용체 2; 트레이스 아민 관련 수용체 3; 트레이스 아민 관련 수용체 5; 트레이스 아민 관련 수용체 8; 트레이스 아민 관련 수용체 9; 트랜스멤브레인 7 슈퍼패밀리 구성원 3; 트랜스멤브레인 단백질 11; 트랜스멤브레인 단백질 86B; 혈관작용 장 펩티드 수용체 1; 혈관작용 장 펩티드 수용체 수용체 2; 보습코 1 수용체 1; 친이종 및 폴리트로픽 레트로바이러스 수용체.
감염성 질환 물질
또 다른 구체예에서, 상기 기본 펩티드 서열은 AIDS, AIDS 관련 합병증, 수두 (바리셀라), 일반 감기, 시토메갈로바이러스 감염, 콜로라도 진드기 열, 뎅기열, 에볼라 출혈열, 손, 발 및 입병, 간염, 단순 헤르페스, 대상포진, HPV, 인플루엔자(플루), 라사 열, 홍역, 마르부르그 출혈열, 감염성 단핵구증, 이하선염, 회색질척수염, 진행성 다초점 백색질뇌병증, 광견병, 루벨라, SARS, 스몰폭스(바리올라), 바이러스 뇌염, 바이러스 위소장염, 바이러스 수막염, 바이러스 폐렴, 웨스트 나일병, 및 황열병으로 구성된 군으로부터 선택된 바이러스 감염성 질환의 병리와 관련된 에피토프이다.
다른 구체예에서, 이러한 기본 펩티드 서열은 탄저병, 세균 수막염, 보툴리눔독소증, 브루셀라증, 캄필로박터증, 고양이 찰상병, 콜레라, 디프테리아, 임질, 농가진, 레지오넬라증, 나병(한센병), 렙토스피라증, 리스테리아증, 라임병, 유비저, MRSA 감염, 노카르디아증, 백일해 (백일 기침), 페스트, 폐렴구균성 폐렴, 앵무새병, Q열, 록키산 홍반열 (RMSF), 살모넬라증, 성홍열, 이질, 매독, 파상풍, 트라코마, 결핵, 야토병, 장티푸스, 발진티푸스 (유행성 발진티푸스 포함), 및 요로 감염으로 구성된 군으로부터 선택된 세균 감염성 질환의 병리와 관련된 에피토프이다.
다른 구체예에서, 이러한 기본 펩티드 서열은 아메바증, 회충증, 바베스열원충증, 챠가스병, 간흡충증, 와포자충증, 낭미충증, 긴촌충증, 메디나충증, 포충증, 요충증, 간질증, 비대흡충증, 사상충증, 자유-생활 아메바 감염, 편모충증, 악구충증, 막양조충증, 포자충증, 칼라-아자르, 리슈만편모충증, 말라리아, 메타고니무스흡충증, 구더기증, 회선사상충증, 이감염증, 요충 감염, 열원충증, 옴, 주혈흡충증, 조충증, 개회충증, 톡소포자충증, 선모충증(trichinellosis), 선모충증(trichinosis), 편충증, 트리코모나스증, 및 파동편모충증 (아프리카 트리파노소마증 포함)으로 구성된 군으로부터 선택된 기생충 감염성 질환의 병리와 관련된 에피토프이다.
항체 생성에 유용하고 백신으로서의 에피토프 서열의 일부 예를 하기 표에 나열한다:
Figure 112009075436064-PCT00001
Figure 112009075436064-PCT00002
Figure 112009075436064-PCT00003
실험적으로 유래된 기본 펩티드 서열
상기 섹션에 개시된 대로, 질병 상태나 부작용에 다소의 유의성을 갖는 펩티드 서열을 관련 에피토프의 실험적인 조사를 통해 동정할 수 있다. 이러한 서열들은 질병 또는 질환을 치료하는데 유용한 것으로 입증된 비-천연 발생 펩티드를 포함할 수 있고, 그 예가 국제특허출원 공개 WO 2006/031727, 미국특허 6,930,168 및 관련된 과학 공개문헌[Stern et al ., Proc . Nat . Acad . Sci . USA, 2005, 102:1620-25]에서 발견된다.
추가로, 에피토프는 합성 조합 펩티드 라이브러리의 위치 스캐닝 (예를 들어, D. Wilson et al., above; R. Houghten et al., above; Hernandez et al., Eur J Immunol, 2004, 34:2331-41)이나 관심있는 전체 단백질의 중복되는 펩티드 서열을 제조하고 면역 반응성에 대해 이러한 펩티드를, 에피토프를 얻고자 하는 종 및 질환에 적합한 시험관내 또는 생체내 검정 시스템에서 시험함에 의해 (예를 들어, 문헌[Current Protocols in Immunology Edited by John E Coligan, Ada M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strober NIH, John Wiley & Sons]에 개시된 대로, 이를 위해 유용한 임의의 판독 검정 이용) 후보 서열을 동정함으로써 실험적으로 결정된다. 예를 들어, 다발성 경화증 약물의 설계에 있어서, 적절한 시스템의 예는 MS를 지닌 인간 피검체로부터 유래된 세포를 이용하는 것이다.
후보 에피토프를 동정한 후에, 유력한 세트의 추가 관련 에피토프를 WO 2000/042559와 같은 용이하게 이용가능한 참조문헌에 개시된 예측 알고리즘 및 모델링을 이용하여 생성하고, 정렬시키고, 이러한 유력한 에피토프의 예측된 결합을 예를 들어 WO 2005/103679, WO 2002/073193 및 WO 99/45954에 개시된 이용가능한 예측 방법을 이용하여 분석한다. 가장 높게 예측된 활성/결합을 지니는 펩티드로부터의 선택은 예측된 서열의 40%를 채용하며 각 위치에서 임의의 주어진 아미노산의 비율을 획득한다. DSP 합성으로의 아미노산 혼입을 위한 규칙을 생성하기 위해 이러한 비율을 이용한다.
기본 펩티드 서열의 다른 공급원
상기 섹션에 개시된 방법 및 결과에 추가하여, 에피토프 서열은 면역 에피토프 데이타베이스에 포함되고 동정된 기본 펩티드 서열 (http://www.immuneepitope.org/home.do에서 이용가능함, led by Alex Sette funded by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases of the National Institute of Health, USA) 또는 믹쳐스 사이언시즈 오브 샌디에고 또는 알고노믹스 오브 전트 벨기움과 같은 상업적 실체에 의해 개시되고 수행된 방법에 의해 동정된 임의의 서열로서 이용될 수 있다.
II . 지시된 서열 폴리머의 합성 규칙
DSP를 생성하는 단계는 순차적으로 하기를 포함한다:
(a) 질병과 관련된 것으로 공지되거나 여겨지는 단백질을 동정한다.
(b) 단백질 내에서 펩티드 또는 펩티드들을 선택하는데, 각각은 질병과 연관되고 면역적으로 적절한 고정된 서열을 지닌다. 펩티드가 기술되지 않은 경우, 관심있는 질병의 치료에 유용한 펩티드를 생성한다. 한 예시적인 방법이 관심있는 단백질의 전체 길이에 총괄적으로 걸치는 펩티드의 라이브러리를 생성하는 것이다. 이것은, 예를 들어 부분적인 엔도펩티다아제 소화 또는 펩티드 합성에 의해 수행될 수 있다. 라이브러리를 표적 질환을 지닌 환자의 혈청에서 검출된 항체를 이용한 결합 친화력 결정과 같은 적합한 검출 방법을 이용하여 면역적으로 관련된 펩티드에 대해 스크리닝한다. 펩티드를 시험관내 또는 생체내 실험용 시스템에서 질환을 치료하기에 유용한 면역원성에 대해 추가로 조사할 수 있다.
(c) 아미노산 치환을 정의되거나 실험적인 두 세트의 규칙에 기초하여 결정하며 이는 하기에 개시된다;
(d) 규칙에 따라 DSP의 고체상 합성을 수행하고, 약제학적으로 허용되는 제형인 DSP를 치료제로서 전달한다.
DSP를 포함하는 조성물의 합성 규칙은 하기 개요된다. 간단히 말해, DSP를 기본 펩티드 서열의 길이와 동일한 길이 또는 그 길이의 배수인 규정된 길이를 갖는 폴리펩티드로서 구상할 수 있다. 기본 펩티드 서열의 각 잔기 위치에 대하여, 하나 이상의 치환 잔기가 정의된다. 합성 규칙은 그 위치에 대한 원래 기본 펩티드 잔기 중에서 임의의 주어진 잔기 위치를 차지하는 첫 번째 치환 잔기, 두 번째 치환 잔기, 세 번째 치환 잔기, 및 알라닌의 비율을 정의한다.
치환 잔기는 (1) 치환 잔기에 대한 원래 잔기의 관련 특성의 유사성의 합리적인 비교 및 소견이나 (2) 기본 서열로부터 약간의 변이를 갖는 실제 펩티드의 상대 활성에 대한 보고된 실험 결과의 비교에 따라 정의된다. 이러한 두 접근법 중 어느 하나에서 정의된 치환 잔기를 본원에서 "보존 치환"이라 명명한다.
유사성의 합리적인 비교 및 소견의 예가 문헌[Kosiol et al , J. Theoretical Biol, 2004, 228:97-106]에 개시된 방법이다. 아미노산을 거기에 PAM 치환 매트릭스로서 언급된 매트릭스로 함께 분류한다. 도 4는 참조문헌의 표 X에 도시된 대로 크기, 전하, 소수성 등과 같은 잔기의 특성에 기초하여 코시올(Kosiol)에 따라 아미노산 유사성을 나타내고 분류한 표이다. 도 4에서, 함께 분류된 아미노산은 상호교환될 수 있는 것으로 고려되며, 그룹에서 공통된 특성을 보유할 가능성이 높다.
기본 서열로부터 다소 변이를 지니는 펩티드의 상대 활성을 나타내는 실험적인 비교 결과도 치환 규칙을 위한 기초로서 이용할 수 있다. 관찰된 변화의 원인이 되는 펩티드 서열을 정렬하고 신규한 아미노산의 유형 및 존재%를 기입한다. 펩티드의 임의의 주어진 위치에서 하나를 초과하는 아미노산 치환이 존재하는 경우, 아미노산의 발생 빈도 및 원래 서열에 대한 활성 변화의 크기를 유력한 치환 순서를 결정하기 위해 고려한다. 관심있는 전체 단백질을 나타내는 펩티드와 중복되는 변경된 펩티드 리간드를 제조함에 의해 (Atkinson et al . , J. CHn . Invest. 94:2125-29; Meini et al , J. Clin . Invest. 92:2633-43) 또는 새롭게 (US Patents 7,058,515; 6,376,246; 6,368,861; 7,024,312; 6,376,246; 7,024,312; 6,961,664; 6,917,882) DSP 합성을 위한 규칙을 생성하는 전체 공정의 예가 라이브러리를 이용하여 획득될 수 있다 ( Molec . Immunol. 40:1047-1055; Molec . Immunol. 40:1063-74; J Autoimmunity 20:199-201; and J. Immunol 163:6424-34). 간단히 말해, 관심있는 세포 물질을 검정 시스템으로서 선택하여 조사된 펩티드의 면역반응성을 정렬시킨다. 이러한 검정 시스템은 시험관내 또는 생체내 시스템일 수 있고, 적응 또는 선천 면역 반응성을 포함할 수 있다. 검정 시스템용 판독은 단백질의 활성화 상태, 단백질의 국부화에서의 변화, 단백질을 엔코딩하는 mRNA의 발현, 단백질의 상대 농도, 특이적 세포 유형의 생성에서의 변화, 세포 표현형의 변화, 세포 활성화의 변화, 세포 수의 변화, 기관 크기 또는 기능의 변화, 동물 거동 또는 표현형의 변화에서의 상태를 상향조절하거나 하향조절할 수 있다. 일단 검정이나 검정들을 수행하면, 결과를 분석하여 임의의 특정 아미노산의 보존 치환으로서의 보급을 결정한다. 펩티드 서열 내의 주어진 위치에서 세 개를 초과하는 잔기가 면역 기능의 변화를 생성하는 것으로 동정되면, 먼저, 조사된 펩티드에서의 표시 빈도에 의해, 그리고 다음으로 변화의 크기에 의해 상위 세 개의 잔기가 유도된다. 일단 선택되면, 잔기의 상대적인 양이 정의된다. 도 5에 도시된 대로, 각 카세트 "y"는 염기 (a), 일차 변화 (b), 이차 변화 (c), 및 삼차 변화 (d)에 대해 약 0-100의 범위를 지니는 한 세트의 아미노산 비율을 서로 지니는 반면, 알라닌 (e)는 약 5-1000의 비율을 지닌다. DSP 합성 규칙은 지시된 순서로 카세트의 조합을 계속한다. 동일한 블록이 순차적으로 반복되거나 또 다른 블록에 의해 분리될 수 있다. 카세트의 한 쪽에서는 서열이 N- 및 C-말단 변형제이다. 카세트의 수는 25개 아미노산 보다 길고 300개 아미노산 보다 짧을 것이 요구되는 DSP의 말단 길이의 요건에 의해 지시된다.
도 5에 개시된 대로, 본 발명은 분리된 카세트로서 정의되고 순차적으로 합성되는 다중 에피토프를 구상한다. 동일한 DSP 내에서 카세트 비율은 상이한 비율의 아미노산을 지닐 수 있다. 추가로, 세 개 미만의 비-알라닌 아미노산 치환이 존재하는 경우, '분실(missing)' 치환의 비율이 기본 서열에 첨가된다. 추가로, 카세트는 전체 DSP 합성에서 다수 출현하며 임의의 순서로 정위될 수 있다. N- 및 C-말단 변형이 각각 전체 DSP 카세트의 앞과 뒤에 존재한다. 도 7A에 도시된 대로, 단일 기본 펩티드 서열은 본 실시예에서 분리된 카세트 y1, y2, 및 y3으로서 정의된 1을 초과하는 비율을 지닐 수 있다. 개개 카세트는 도 7B에 도시된 대로 전체 DSP 합성에서 다수 출현하며 임의의 순서로 정위될 수 있다. 도 8A 및 8B에 제시된 합성 규칙은 분리된 카세트로서 정의된 1을 초과하는 비율을 지니는 단일 기본 펩티드 서열의 부분을 갖는 본 발명의 DSP를 기술한다.
도 9는 본 발명이 어떻게 특정 위치에서 아미노산의 실험적으로 유래된 비율을 구상하는지를 입증한다. 본 실시예는 유전자이식 NOD.BCD2.5 마우스로부터 유래된 당뇨병유발 T 세포를 이용한 T 세포 활성화 검정으로부터 유래된 데이터를 이용한다 (J. Immunol. 166:908-17; J. Autoimmunity 20:199-201). 세포는 억제 활성을 갖는 다수의 상이한 펩티드를 초래하는 조합 십량체 라이브러리를 지니는 것으로 조사된다. 가장 높은 활성을 갖는 펩티드를 이용하여 각 위치에 있는 아미노산 뿐만 아니라 서로 상이한 아미노산 비율을 생성하였다.
카세트는 1회를 초과하여 반복될 수 있다. 카세트의 요망되는 배수 이후에, DSP의 요망되는 길이에 아직 도달하지 않았으면, DSP 서열을 동일한 공정을 적용시켜, 아마도 원래 잔기, 치환 잔기, 이차 치환 잔기, 및 알라민 잔기의 상이한 비율을 이용하여 추가로 규정한다.
카세트간에, 에피토프 인식을 보조하는 아미노산 서열을 추가할 수 있다. 예를 들어, 베타-시트 구조, 알파 헬릭스 또는 벤드(bend)를 형성하는 것으로 공지되어 있거나 형성할 것 같은 서열을 도입할 수 있다. 예를 들어 베타 시트 모티프에 대해서는 문헌[Mayo et al., Protein Sci., 1996, Jul;5(7): 1301-15]을 참조하고, 고리를 이룬 코일 알파 헬릭스 모티프에 대해서는 문헌[Walshaw, J. et al., Biochem Soc Symp. 2001;(68): 111-23]을 참조하며, 헬릭스 및 헤어핀 도메인에 대해서는 문헌[Karle, IL et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000 Mar 28;97(7):3034-7]을 참조한다.
N 또는 C-말단의 DSP 변형체가 합성 규칙에 첨가될 수 있다. 이러한 변형제의 목적은 이로 제한되는 것은 아니나 RDG-기재 아미노산 서열 (미국특허 5,773,412; 5,770,565)이 표적화 부분으로서 이용되거나, HLA-DR 종의 넓은 어레이에 결합되는 것으로 공지된 펩티드, 예컨대 AKAVAAWTLK AAA (미국출원 공개 2006/0018915)가 DR-표적화 부분으로서 이용되는 경우에 특이적 단백질에 대한 결합을 개선시키기 위한 것을 포함한다. 이러한 변형제는 서방성 전달 시스템을 포함하는 전달 시스템에 대한 착물화를 개선시키는 부분을 포함할 수 있다. 변형제는 재흡수될 수 있는 매트릭스 구성물/합성될 수 있는 백본, 예컨대 PLGA일 수 있다. 변형제는 D-아미노산과 같은 프로테아제 내성 부분일 수 있다.
따라서, 임의의 주어진 기본 펩티드 서열의 경우에, 재현성 있는 일관된 DSP의 혼합물을 포함하는 조성물을 수득하기 위해 한 세트의 합성 규칙이 적용된다.
III . 펩티드 합성 방법
펩티드 합성을 위해 적합한 임의의 공지된 고체상 합성을 이용하여, 예를 들어 메리필드(Merrified)에 의해 최초에 개시된 대로 (J. Am . Chem . Soc, 1963, 85:2149) DSP 및 이의 임의의 변이체를 포함하는 조성물을 합성할 수 있다. 보다 구체적으로, 합성은 Fmoc 보호된 아미노산을 이용한 고체상 펩티드 합성(SPPS) 접근법에 의해 다단계로 수행된다. SPPS는 적합한 경우 측쇄 보호기를 갖는 보호된 아미노산 유도체의 폴리머 지지체(비드)로의 연속된 첨가에 기초한다. 염기-불안정한 Fmoc 기가 N-보호에 사용된다. 보호기를 제거한 후 (피페리딘 가수분해를 통해), 다음 아미노산 혼합물을 커플링 시약(TBTU)을 이용하여 첨가한다. 최종 아미노산을 커플링시킨 후, N-말단을 아세틸화한다.
생성된 펩티드 (이의 C-말단을 통해 폴리머 지지체에 부착됨)를 TFA로 절단하여 미정제 펩티드를 수득한다. 이 절단 단계 동안, 모든 측쇄 보호기도 절단된다. 디이소프로필 에테르로 침전시킨 후, 고체를 여과하고 건조시킨다. 생성된 펩티드를 분석하고 2-8℃에 저장한다.
추가로, 펩티드 서열의 임의의 주어지 위치에서 하나를 초과하는 아미노산 종을 제어된 속도로 혼입시키는 합성을 가능하게 하는 임의의 펩티드 합성 방법이 본 발명에 사용하기 적합하다. 추가로, 하기 개시된 대로, DSP는 펩티도미메틱이거나 비천연 또는 변형된 아미노산을 포함할 수 있는데, 이는 그러한 화학적 종을 합성된 폴리머의 그 지점까지 첨가시킬 수 있는 개작을 필요로 한다.
합성은 비천연 아미노산, 또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, DSP는 천연 발생 및 합성 유도체, 예를 드어 셀레노시스테인을 포함한다. 아미노산은 추가로 아미노산 유사체를 포함한다. 아미노산 "유사체"는 상이한 형태를 지니는 아미노산의 화학적으로 관련된 형태이고, 예를 들어 이성질체, 또는 L-형태라기보다 D-형태, 또는 아미노산의 대략의 크기 및 형상을 갖는 유기 분자, 또는 펩티드 결합에 수반된 원자에 변형을 지녀 폴리펩티드에서 중합될 때 프로테아제 내성인 아미노산이다.
본 발명에 사용되는 DSP는 L- 또는 D-아미노산 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 당업자에게 공지된 대로, L-아미노산은 대부분 천연 단백질로 생긴다. 그러나, D-아미노산은 시판되며, 본 발명의 DSP를 제조하기 위해 이용된 아미노산의 일부 또는 전부를 대신할 수 있다. 본 발명은 D- 및 L-아미노산 둘 모두를 함유하는 DSP 뿐만 아니라 L- 또는 D-아미노산 중 어느 하나를 본질적으로 포함하는 DSP를 고려한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 DSP는 상이한 화학적 부분을 치환시키거나 추가함에 의해 추가로 변형된 그러한 선형 DSP를 포함한다. 일 구체예에서, 그러한 변형은 피검체의 DSP의 단백분해 퇴화를 억제하기에 충분한 양으로 잔기 위치에 있다. 예를 들어, 아미노산 변형은 서열 중 하나 이상의 프롤린 잔기의 존재일 있다; 잔기는 카르복시- 및 아미노 말단 중 하나 이상에 존재한다; 추가로, 프롤린은 카르복시- 및 아미노-말단 중 하나 이상에서의 네 개의 잔기 내에 존재할 수 있다. 추가로, 아미노산 변형은 D-아미노산의 존재일 수 있다.
특정 구체예에서, 당해 DSP는 펩티도미메틱이다. 펩티도미메틱은 펩티드 및 단백질에 기초하거나 이로부터 유래된 화합물이다. 본 발명의 DSP 펩티도미메틱은 통상적으로 하나 이상의 원시 아미노산 잔기의 구조적 변형에 의해, 예컨대 하나 이상의 비천연 아미노산, 형태적 억제, 등량 교체 등을 이용하여 수득될 수 있다. 당해 펩티도미메틱은 펩티드 및 비펩티드 합성 구조들간 구조적 공간의 연속체를 구성한다.
이러한 펩티도미메틱은 가수분해될 수 없어서 이러한 속성을 지닐 수 있고 천연 발생 에피토프 펩티드를 이용하여 용이하게 동정되는 것들과 관련이 있으나 이들과는 상이한 항체를 동정하기 위해 유사하나 별개인 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 펩티도미메틱은 천연 발생 에피토프 펩티드가 펩티드로서 얻어질 수 없으나, 전체 단백질의 일부로서 적절하거나 과도적인 형태일 수 있는 형태를 보유할 수 있다. 예시를 목적으로, 본 발명의 펩티드 유사체는 예를 들어 벤조디아제핀 (예컨대, Freidinger et al. in "Peptides: Chemistry and Biology," G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988 참조), 치환된 감마 락탐 고리 (Garvey et al. in "Peptides: Chemistry and Biology," G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988, pl23), C-7 모사체 (Huffman et al. in "Peptides: Chemistry and Biology," G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988, p. 105), 케토-메틸렌 슈도펩티드 (Ewenson et al . J. Med . Chem., 1986, 29:295; and Ewenson et al. in "Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium)," Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), β-회전 디펩티드 코어 (Nagai et al., Tetrahedron Lett., 1985 26:647; and Sato et al . J. Chem . Soc . Perkin Trans., 1986,1 :1231), β-아미노알코올 (Gordon et al . Biochem . Biophys . Res . Commun., 1985, 126:419; and Dann et al . Biochem . Biophys . Res . Commun., 1986, 134:71), 디아미노케톤 (Natarajan et al . Biochem . Biophys . Res . Commun., 1984, 124:141), 및 메틸렌아미노-변형됨 (Roark et al. in "Peptides: Chemistry and Biology," G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988, p134)을 이용하여 생성될 수 있다. 또한, 일반적으로 문헌[Session III: Analytic and synthetic methods, in "Peptides: Chemistry and Biology," G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988]를 참조한다.
DSP 조성물의 분자량은 폴리펩티드 합성 동안이나 DSP가 합성된 후에 조정될 수 있다. 폴리펩티드 합성 동안 분자량을 조정하기 위해, 아미노산의 합성 조건 또는 양을, 폴리펩티드가 요망되는 대략의 길이에 도달할 때 합성을 중단시키도록 조정한다. 합성 후에, 요망되는 분자량을 갖는 폴리펩티드를, 분자량 사이징 컬럼 또는 겔 상에서 폴리펩티드의 크로마토그래피와 같은 임의의 이용가능한 크기 선택 절차, 및 요망되는 분자량 범위의 수집에 의해 수득할 수 있다. 본 폴리펩티드는 또한 부분적으로 가수분해되어, 예를 들어 산 또는 효소적 가수분해에 의해 고분자량 종을 제거한 다음, 산 또는 효소를 제거하도록 정제될 수 있다.
일 구체예에서, 보호된 폴리펩티드를 브롬화수소산과 반응시켜 요망되는 분자량 프로필을 지니는 트리플루오로아세틸-폴리펩티드를 형성하는 것을 포함하는 공정에 의해 요망되는 분자량을 갖는 DSP를 제조할 수 있다. 이 반응은 하나 이상의 시험 반응에 의해 미리 결정된 시간과 온도에서 수행된다. 시험 반응 동안, 시간과 온도는 변화되며, 주어진 회분의 시험 폴리펩티드의 분자량 범위가 결정된다. 그 폴리펩티드 회분에 대한 최적의 분자량 범위를 제공하는 시험 조건을 그 회분에 이용한다. 따라서, 요망되는 분자량 프로필을 갖는 트리플루오로아세틸-폴리펩티드를, 보호된 폴리펩티드를 시험 반응에 의해 미리 결정된 온도와 시간 동안 브롬화수소산과 반응시키는 것을 포함하는 공정에 의해 생성할 수 있다. 요망되는 분자량 프로필을 갖는 트리플루오로아세틸-폴리펩티드를 이후 피페리딘 수용액으로 추가로 처리하여 요망되는 분자량을 갖는 저 독성 폴리펩티드를 형성한다.
바람직한 일 구체예에서, 주어된 회분으로부터의 보호된 폴리펩티드의 시험 샘플을 브롬화수소산과 약 10-50시간 동안 약 20-28℃의 온도에서 반응시킨다. 이 회분에 가장 좋은 조건은 여러 시험 반응을 거쳐 결정된다. 예를 들어, 일 구체예에서, 보호된 폴리펩티드를 브롬화수소산과 약 17시간 동안 약 26℃의 온도에서 반응시킨다.
특정 구체에에서, DSP를 합성 후에 변형시킨다. 이러한 변형은 예를 들어 탐색, 진단, 또는 치료적 환경에 적용되는 DSP의 특징에 대해 후속적인 항체 반응을 지시하기 위한 DSP를 생성하는데 유용하다. 합성-후 변형의 예로는 이로 제한되는 것은 아니나 글리코겐과 같은 당, 대안적인 아미노산, 예컨대 시트룰린, 포스페이트 부분(미리포스포릴화된 아미노산도 합성 동안 첨가될 수 있다), 다양한 길이의 PEG 첨가, 비오틴, 형광성 부분, 담체 단백질로의 커플링, 이황화 다리와 같이 특정 이차 구조를 형성하는 변화, 또는 예를 들어 리신 측쇄를 통해 DSP의 분지를 가능하게 하는 변형이 있다. 일 구체예에서, 합성-후 변형은 효소를 이용하여 수행된다. 추가의 구체예에서, 합성-후 변형은 당 분야에 널리 공지된 화학적 복합체화 기술을 이용하여 수동으로 수행된다.
본 발명의 추가의 구체예는 펩티딜아르기닌 데이미나아제에 의한 DSP의 합성-후 변형이다. 시트룰린은 아미노산으로서 화학식 C6H13N3O3을 지닌다. 시트룰린은 하기 구조를 지닌다:
Figure 112009075436064-PCT00004
이것은 우레아 사이클에서 오르니틴 및 카르바모일 포스페이트로부터 제조되며, 산화질소 합성효소에 의해 촉매화된 아르기닌의 부산물이다. 시트룰린은 DNA에 의해 엔코딩되지 않으나, 펩티딜아르기닌 데이미나아제에 의해 번역-후 변형 사건 동안 단백질에 첨가된다. 류마티스 관절염으로 진단된 환자는 시트룰린화된 단백질에 대한 면역 반응과 관련이 있는 것으로 나타났다 (Migliorini, P., Autoimmunity Reviews, 4:561-564). 본 발명의 구체예는 류마티스 관절염에 대한 진단제로서 이용되는 항체용 리간드로서의 시트룰린화된 DSP를 생성하는 것이다.
본 발명의 추가의 구체예는 그러한 리간드 형태에 대해 항체를 생성하는 DSP의 특수한 길로겐화된(gylogenated) 형태의 이용에 관한 것이다. 일 구체예에서, 리간드 자체가 항체이다. 본 발명의 일 구체예에서, DSP의 번역-후 변형이 글리코겐 합성효소를 이용하거나, 대안적으로 당 분야에 널리 공지된 화학적 복합체화 기술을 이용하여 수행된다.
정의
"항체"라는 용어는 (1) 표적을 포함하는 분자 구조를 인식하고, (2) 분자 구조의 적어도 일부와 상호작용함에 의해 표적에 결합되고, (3) 표적의 생리적 활성을 변경시키거나 (4) 표적을 품는 숙주의 반응을 표적에 대해 변경시키는, 단쇄이고 다중쇄 둘 모두인 임의의 면역글로불린 펩티드를 의미하며, 이로 제한되는 것은 아니나 임의의 종으로부터의 IgG, IgM, IgA 또는 면역글로불린으로부터 유래된 임의의 단편 또는 임의의 변형되고/거나 공학처리된 펩티드를 포함한다. 항체는 예를 들어 인간화된 항체에서와 같이 키메라일 수 있고, 항체는 천연 발생 펩티드의 CDR 영역의 부위 유도된 돌연변이발생에 의해 공학처리될 수 있다. 항체는 Fab 및 Fab' 단편과 같이 원시 면역글로불린의 고변이 부위를 포함하는 펩티드 및 전장 뿐만 아니라, 결합 부위가 연속되거나 비연속된 펩티드 서열을 포함하든지 간에 천연 발생 항체의 결합 부위를 포함하는 짧은 합성 또는 공학처리된 펩티드이다. 후자의 경우에, 합성 또는 공학처리된 펩티드는 하나의 연속 서열로서 원래 비연속된 아미노산 스트레치의 펩티드 서열을 포함할 것이다.
"관련된"이라는 용어는 "같은 범위로" 또는 "관련하여"를 의미한다. 상기 용어는 이러한 관계가 존재할 수 있긴 하나, 반드시 인과관계인 것은 아님을 나타낸다.
"결합"이라는 용어는 생리적 조건하에, 예를 들어 공유, 정전기, 소수성, 이온 및/또는 수소-결합 상호작용으로 인한 두 분자간 직접 결합을 언급하며, 염 다리 및 수(water) 다리와 같은 상호작용을 포함한다.
"HLA 분자"라는 용어는 임의의 클래스 II 주조직적합성 복합체 당단백질을 의미한다.
"면역조절"이라는 용어는 주조직적합성 복합체("MHC") 및 항원에 의해 형성된 복합체의 T-세포 수용체 ("TCR") 인식을 통한 특정 항원성 결정인자에 대한 반응을 개시하는 면역 시스템의 능력을 증가시키거나 감소시키는 과정을 의미한다.
"면역억제"라는 용어는 기관 또는 골수 타가이식편의 수용체에서 면역 반응 및 반응성의 저하를 의미한다.
"MHC 활성"이라는 용어는 예컨대 T 세포를 활성화시킴에 의해 면역 반응을 자극하는 MHC 분자의 능력을 언급한다. MHC 활성의 억제제는 이 활성을 억제할 수 있으므로, MHC에 의한 T 세포의 활성화를 억제한다. 바람직한 구체예에서, 피검체 억제제는 특정 클래스 II MHC 이소형 또는 동종이형에 의해 활성화를 선택적으로 억제한다. 이러한 억제제는 유기체에서 모든 MHC 활성을 방해하지 않으면서 요망되지 않는 특정 MHC 활성을 억제할 수 있으므로, 일반적으로 동물의 면역 반응을 손상시키지 않으며 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간에서 원치 않는 면역 반응을 선택적으로 치료할 수 있다.
"기관-특이적 단백질" 또는 "기관-특이적 항원"이라는 용어는 특정 기관을 포함하는 세포에 의해 우세하거나 배타적으로 발현되는 단백질을 의미한다.
"환자"는 동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물 뿐만 아니라 가축 및 다른 수의적 피검체를 언급한다.
"펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 변형되지 않은 아미노산 사슬을 언급하며, 인산화, 글리코실화 및 지질 변형과 같은 작은 변형들도 포함한다. "펩티드" 및 "펩티도미메틱"이라는 용어는 상호 배타적이지 않으며 실질적인 중복을 포함한다.
"펩티도미메틱"은 비천연 백본 및/또는 측쇄 구조를 포함하며, 인산화, 캡핑, 지방산 변형과 같은 아미노산 사슬의 임의의 변형된 형태를 포함한다. 하기 개시된 대로, 펩티도미메틱은 아미노산 사슬과 비펩티드 소형 분자간에 구조적 연속체를 포함한다. 펩티도미메틱은을 일반적으로 인식할 수 있는 펩티드-유사 폴리머 유닛 구조를 보유한다. 따라서, 펩티도미메틱은 자가면역 질환에 걸린 환자에서 자가반응성 T 세포를 활성화시키는 복합체를 형성하는 HLA 단백질에 결합하는 능력을 보유할 수 있다.
"아미노산 잔기"는 당 분야에 공지되어 있다. 일반적으로 본원에서 아미노산 및 보호기를 언급하기 위해 사용된 약어들은 IUPAC-IUB 커미션 온 바이오케미컬 명명법 (Biochemistry (1972) 11:1726-1732 참조)에 의한 권고에 기초한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 출원에 사용된 아미노산은 단백질에서 발견되는 천연 발생 아미노산이거나 아미노기 및 카르복실기를 함유하는 이러한 아미노산의 천연 발생 동화작용 및 이화작용 생성물이다. 특히 적합한 아미노산 측쇄는 하기 아미노산의 것들로부터 선택된 측쇄를 포함한다: 글리신, 알라닌, 발린, 시스테인, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 글루탐산, 아스파르트산, 글루타민, 아스파라긴, 리신, 아르기닌, 프롤린, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판.
"아미노산 잔기"라는 용어는 본원에 언급된 임의의 특정 아미노산의 유사체, 유도체 및 동류체(congener) 뿐만 아니라 C-말단 또는 N-말단 보호된 아미노산 유도체를 추가로 포함한다 (예컨대, N-말단 또는 C-말단 보호기로 변형됨). 예를 들어, 본 발명은 고리화를 위해 여전히 카르복실, 아미노 또는 다른 반응성 전구체 작용기를 제공하면서 측쇄가 늘어나거나 줄어든 아미노산 유사체 뿐만 아니라 적합한 작용기를 지니는 변이 측쇄를 갖는 아미노산 유사체의 이용을 고려한다. 예를 들어, 당해 화합물은 예를 들어 시아노알라닌, 카나바닌, 젠콜산(djenkolic acid), 노르류신, 3-포스포세린, 호모세린, 디히드록시-페닐알라닌, 5-히드록시트립토판, 1-메틸히스티딘, 3-메틸히스티딘, 디아미노피멜산, 오르니틴, 또는 디아미노부티르산과 같은 아미노산 유사체를 포함할 수 있다. 당업자는 본원에서 적합한 측쇄를 지니는 다른 천연 발생 아미노산 대사산물 또는 전구체를 인식할 것이고 이들은 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 DSP에 이용된 아미노산의 대부분은 특정 기하 형태 또는 입체이성질체 형태로 존재할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 당해 DSP를 형성하기 위해 이용된 아미노산은 (L)-이성질체이나, (D)-이성질체가 예컨대 비-앵커 위치에서 또는 DSP의 펩티도미메틱 버젼의 경우에 DSP에 포함될 수 있다.
본원에서 사용된 "예방"은 질병 또는 질환의, 예를 들어 하나 이상의 징후의 개시를 지연시키거나 방해하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 "치료"는 질병 또는 질환의, 예를 들어 하나 이상의 징후의 중증도를 적어도 감소시키거나 그 효과를 개선시키는 것을 의미한다.
본원에서 이용된 "치료 섭생"은 하나 이상의 DSP 조성물을 포함하는 하나 이상의 조성물의 투여의 치료적, 경감적 및 예방적 양상을 포함한다. 특정 치료 섭생은 특정 투약 패턴에서 소정 기간 동안 지속될 수 있고, 이는 특정 질병 또는 질환의 특성, 이의 중증도 및 환자의 전체적인 조건에 따라 달라질 것이며, 상기 치료 섭생은 하루에 1회부터, 또는 보다 바람직하게는 매 36시간 또는 48시간 또는 그 초과마다 1회 내지 매달 또는 수 개월마다 1회로 연장될 수 있다.
"구조-활성 상관관계" 또는 "SAR"는 약물의 분자 구조를 변경시켜 이들과 수용체, 효소 등과의 상호작용을 변경시키는 방식을 언급한다.
적절한 경우 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 실행은 당 분야의 기술 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자이식 생물학, 미생물학, 바이러스학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 개시되어 있다. 예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook and Russell (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 2001); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Using Antibodies, Second Edition by Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Current Protocols in Cell Biology, ed. by Bonifacino, Dasso, Lippincott-Schwartz, Harford, and Yamada, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999; and PCR Protocols, ed. by Bartlett et al. , Humana Press, 2003; PHARMACOLOGY A Pathophysiologic Approach Edited by Josehp T. DiPiro, Robert Talbert, Gary, Yee, Gary Matzke, Barbara Wells, and L. Michael Posey. 5th edition 2002 McGraw Hill; Pathologic Basis of Disease. Ramzi Cotran, Vinay Kumar, Tucker Collins. 6th Edition 1999. Saunders]을 참조한다.
실시예 1. 가상 기본 펩티드로부터 DSP 조성물의 제조
이해를 쉽게 하기 위해, 예시로서, 공지된 에피토프를 나타내는, 두 가상 펩티드 서열로부터 유래된 DSP 조성물의 제조를 개시하고 도 6에 도시된 표에 제시한다. 이 예시에서, 카세트는 각각 5개의 아미노산으로 구성된다 (x1, x2, x3, x4, x5 = THMCE (y1에서) 및 PWKNA (y2에서)). THMCE는 a=7, b=1, c=1, d=1, e=10의 입력 비율을 지니는 것으로 정의된다. PWKNA는 a=1, b=3, c=3, d=3, e=20의 입력 비율을 지니는 것으로 정의된다. 합성을 위해, 각 펩티드에 대해 각 아미노산 위치를 차지하는 아미노산의 그룹의 실체를 도 4에 도시된 대로 문헌[Kosiol et al., J. Theoretical Biol. 228:97-106, 2004]에 개시된 바람직한 아미노산 치환 방법 (또는 덜 바람직하게는 조직적으로 아미노산을 변경시키는 동등한 수단)을 이용하여 결정하고, 생성된 집합적 DSP 조성물에서 이러한 위치 각각을 차지하는 아미노산의 전체 비율을 상기에 제공한다. 각 카세트에서, y1 및 y2는 2회로 두 번 반복되어 y1 y1 y2 y2 y1 y1 y2 y2의 순서를 생성한다. N n 는 카세트 내에서 반복되는 서열의 횟수이고, 본 발명자들의 가상예에서 N=2이다. MN은 변형 부분의 임의의 유형일 수 있다. MN은 고체상 합성 방법에 따를 수 있다. 이러한 가상예에서, 알파V베타3과 같은 특정 인테그린 상의 RGD-기재 서열 모티프와 같은, DSP를 피검체 내의 특정 부위로 표적화할 아미노산의 변형 부분이 선택된다. 본 실시예에서, C-말단 변형제도 RGD-기재 모티프일 수 있으나, D-아미노산으로 구성된다.
상기 개시된 DSP 조성물을 본 설명의 다른 부분에 개시되어 있는 고체상 펩티드 합성 방법을 이용하여 제조한다.
DSP 조성물을 이용하여, B 세포 라이브러리를 DSP 조성물에 노출시키고 DSP에 결합하여 증식되는 B 세포 계통의 자체-선택이 가능하도록 하여 B 세포 라이브러리를 스크리닝한다. 증식되는 B 세포를 단리시키고, 항체의 CDR 영역을 서열화하여 DSP에 대한 항체를 동정한다.
대안적으로, 고정된 DSP 조성물을 항체의 어레이를 발현시키는 파지 디스플레이 라이브러리에 노출시킬 수 있다. 인큐베이션 후, 결합되지 않은 파지를 씻어내고, DSP에 결합된 것들을 단리시키고 서열화한다.
실시예 2. 펩티드원으로서의 Gp100 (아미노산 잔기 154-162)으로부터 DSP 조 성물의 제조.
도 7A-B는 펩티드원으로서 Gp100 (아미노산 잔기 154-162)을 이용한 DSP 합성 규칙의 적용예를 도시한다. 생성된 펩티드의 각 위치에 대해 아미노산의 실체를 정의하는 방법 및 규칙은 상기 실시예 1에 개시되어 있다. 실시예 1에서와 같이, DSP 조성물을 고체상 펩티드 합성 방법을 이용하여 합성한다.
실시예 3. 펩티드원으로서의 HLA 펩티드로부터 DSP 조성물의 제조.
도 8A-B는 HLA-유래된 펩티드 및 HLA 모의-유래된 펩티드를 펩티드원으로서 이용한 DSP 합성 규칙의 적용예를 도시한다. 생성된 펩티드의 각 위치에 대해 아미노산의 실체를 정의하는 방법 및 규칙은 상기 실시예 1에 개시되어 있다. 실시예 1에서와 같이, DSP 조성물을 고체상 펩티드 합성 방법을 이용하여 합성한다.
실시예 4. 펩티드원으로서의 hTRT-유래된 에피토프 펩티드로부터의 DSP 조성물의 제조.
도 9A-B는 hTRT-유래된 에피토프 펩티드를 펩티드원으로서 이용하고 실험적으로 결정된 치환 규칙을 적용시킨 DSP 합성 규칙의 적용예를 도시한다. 생성된 펩티드의 각 위치에 대해 아미노산의 실체를 정의하는 방법 및 규칙은 상기 실시예 1에 개시되어 있다. 실시예 1에서와 같이, DSP 조성물을 고체상 펩티드 합성 방법을 이용하여 합성한다.
하기는 각각의 내용 전체가 본원에 참조로서 포함된 추가 참조문헌의 목록이다.
Figure 112009075436064-PCT00005
Figure 112009075436064-PCT00006
하기 참조문헌은 기본 펩티드 서열로서 유용한 에피토프의 예시적인 공급원이다. 왼쪽에 있는 번호는 표 I의 참조 번호이다.
Figure 112009075436064-PCT00007
Figure 112009075436064-PCT00008
본 출원에 모든 곳에 언급된 여하한 특허, 특허출원, 특허공개 또는 과학 논문의 내용이 그 전체로서 본원에 포함된다.
Figure 112009075436064-PCT00009
SEQUENCE LISTING <110> BONNIN, DUSTAN <120> METHODS FOR THE DIRECTED EXPANSION OF EPITOPES FOR USE AS ANTIBODY LIGANDS <130> PEPT-020-101 <140> 12/151,762 <141> 2008-05-07 <150> 61/124,689 <151> 2008-04-17 <150> 60/999,283 <151> 2007-10-16 <150> 60/999,284 <151> 2007-10-16 <150> 60/928,225 <151> 2007-05-07 <150> 11/787,229 <151> 2007-04-13 <150> 60/792,085 <151> 2006-04-13 <160> 90 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Cys Ala Leu Met Ile Ala Asn Ser Cys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Cys Trp Trp Glu Trp Thr Ile Gly Cys 1 5 <210> 3 <211> 297 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro 1 5 10 15 Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg 20 25 30 Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu 35 40 45 Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile 50 55 60 Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile 65 70 75 80 Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile 85 90 95 Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu 100 105 110 Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile 115 120 125 Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser 130 135 140 His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro 145 150 155 160 Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn 165 170 175 Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly 180 185 190 Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile 195 200 205 Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys 210 215 220 Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile 225 230 235 240 Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro 245 250 255 Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu 260 265 270 Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser 275 280 285 Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro 290 295 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Arg Ile Tyr His Phe Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Cys Trp Tyr His Tyr Ile Trp Glu Cys 1 5 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Lys Phe Gly Ala Asp Ala Arg Ala Leu Met Leu Gln Gly Val Asp Leu 1 5 10 15 Leu Ala Asp Ala 20 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Leu Lys Val Gly Leu Gln Val Val Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly Gly Ala Val Phe Gly Glu Glu Gly Leu Thr Leu Asn Leu Glu 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Thr Leu Asn Leu Glu Asp Val Gln Pro His Asp Leu Gly Lys Val 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Val Gly Ala Ala Thr Glu Ile Glu Met Lys Glu Lys Lys Asp Arg 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Val Gly Gly Thr Ser Asp Val Glu Val Asn Glu Lys Lys Asp Arg 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala 1 5 10 15 <210> 13 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp 1 5 10 15 Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp 20 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Thr 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Glu Ile Ile Lys Arg Thr Leu Lys Ile Pro Ala Met Thr Ile Ala 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Val Glu Lys Ile Met Gln Ser Ser Ser Glu Val Gly Tyr Asp Ala 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Ala Gly Asp Phe Val Asn Met Val Glu Lys Gly Ile Ile Asp 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Val Asn Met Val Glu Lys Gly Ile Ile Asp Pro Thr Lys Val Val 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Val Ala Val Thr Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile Glu 1 5 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Lys Gly Ile Ile Asp Pro Thr Lys Val Val Arg Thr Ala Leu Leu 1 5 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Pro Thr Lys Val Val Arg Thr Ala Leu Leu Asp Ala Ala Gly Val 1 5 10 15 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ala Ser Leu Leu Thr Thr Ala Glu Val Val Val Thr Glu Ile Pro 1 5 10 15 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His 1 5 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly 1 5 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu 1 5 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly His Asp Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly 1 5 10 15 <210> 28 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Lys Ala 1 5 10 <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Trp Asp Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Lys Ala Gln Ala Gln Thr Asp Arg 1 5 10 15 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Lys Ala Gln 1 5 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Arg Glu Ser Leu Arg Asn Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu 1 5 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gly Ser His Thr Leu Gln Ser Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro 1 5 10 15 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp 1 5 10 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asx Thr Ala Ala 1 5 10 15 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Asp Lys Gly Gln Val Leu Asn Ile Gln 1 5 <210> 36 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Leu Glu Asp Lys Gly Gln Val Leu Asn Ile Gln Met Arg Arg 1 5 10 <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Ala Phe Lys Gly Ser Ile Phe Val Val Phe Asp Ser Ile Glu 1 5 10 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Glu Ser Ala Lys Lys Phe Val Glu Thr 1 5 <210> 39 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Ile Glu Ser Ala Lys Lys Phe Val Glu Thr Pro Gly Gln Lys 1 5 10 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Ala Lys Asp Ala Asn Asn Gly Asn Leu Gln Leu Arg 1 5 10 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Glu Ala Leu Lys Lys Ile Ile Glu Asp 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Glu Gln Ile Lys Leu Asp Glu Gly Trp 1 5 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Leu Lys Glu Gln Ile Lys Leu Asp Glu Gly Trp Val 1 5 10 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Ala Glu Leu Met Glu Ile Ser Glu Asp 1 5 <210> 45 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Ser Lys Ala Glu Leu Met Glu Ile Ser Glu Asp Lys Thr 1 5 10 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Lys Gly Ser Ile Phe Val Val Phe Asp 1 5 <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Ala Lys Asp Ala Asn Asn Gly Asn Leu Gln Leu Arg Asn Lys 1 5 10 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Asp Ala Asn Asn Gly Asn Leu Gln Leu 1 5 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Ile Val Glu Ala Leu Ser Lys Ser Lys Ala Glu Leu 1 5 10 <210> 50 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Ala Phe Lys Gly Ser Ile Phe Val Val Phe Asp Ser Ile 1 5 10 <210> 51 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Gly Ser Ile Phe Val Val Phe Asp Ser Ile Glu Ser Ala Lys 1 5 10 <210> 52 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Ile Phe Val Val Phe Asp Ser Ile Glu Ser Ala Lys Lys Phe 1 5 10 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Val Val Phe Asp Ser Ile Glu Ser Ala 1 5 <210> 54 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Glu Leu Met Glu Ile Ser Glu Asp Lys Thr Lys Ile Arg 1 5 10 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val 1 5 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val Leu 1 5 10 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Ile Thr Asp Gln Val Pro Phe Ser Val 1 5 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Thr Ile Thr Asp Gln Val Pro Phe Ser Val 1 5 10 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu 1 5 10 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Val Leu Tyr Arg Tyr Gly Ser Phe Ser Val 1 5 10 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Val Leu Lys Arg Cys Leu Leu His Leu 1 5 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Ala Leu Asp Gly Gly Asn Lys His Phe Leu 1 5 10 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Val Leu Pro Ser Pro Ala Cys Gln Leu Val 1 5 10 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala 1 5 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Ser Leu Ala Asp Thr Asn Ser Leu Ala Val 1 5 10 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Ser Val Ser Val Ser Gln Leu Arg Ala 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Leu Asn Val Ser Leu Ala Asp Thr Asn 1 5 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Ser Leu Tyr Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala 1 5 10 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu 1 5 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 10 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 10 <210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ile 1 5 10 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Lys Met Val Glu Leu Val His Phe Leu 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Arg Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val 1 5 <210> 77 <211> 10 <212> PRT <213> Human herpesvirus 5 <400> 77 Ile Leu Ala Arg Asn Leu Val Pro Met Val 1 5 10 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Human herpesvirus 5 <400> 78 Glu Leu Glu Gly Val Trp Gln Pro Ala 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Human herpesvirus 5 <400> 79 Arg Ile Phe Ala Glu Leu Glu Gly Val 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Human herpesvirus 5 <400> 80 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5 <210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus 1 <400> 81 Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys 1 5 10 15 <210> 82 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 82 Ala Lys Ala Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 83 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 83 Thr His Met Cys Glu 1 5 <210> 84 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Pro Trp Lys Asn Ala 1 5 <210> 85 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 85 Arg Gly Asp Ser 1 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 86 Arg Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val 1 5 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 87 Tyr His Met Lys Gly Arg Arg Tyr Val 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 88 Leu Arg Asp Met Ala Pro Tyr Arg Pro 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 89 Thr Thr Phe Tyr Thr Ser Ser Lys Glu 1 5 <210> 90 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 90 Ser Tyr His Met Phe 1 5

Claims (18)

  1. A.(1) 관심있는 에피토프의 아미노산 서열인 제1 기본 펩티드 서열을 선택하는 단계;
    A.(2) 고체상 펩티드 합성에 의해 지시된 서열 폴리머(directed sequence polymer, DSP)의 제1 카세트를 합성하는 단계로서,
    여기서, DSP의 제1 카세트의 각 아미노산 위치에 대하여, 아미노산이 DSP로 혼입되고, 이러한 아미노산은,
    (i) 상기 제1 펩티드 서열의 상응하는 위치에서 발견되며 a0의 상대 몰 농도로 푸울(pool)에 존재하는 아미노산;
    (ii) 상기 선택된 아미노산 서열의 상기 위치에서 발견되는 아미노산의 일차 치환으로서 이러한 일차 치환은 아미노산 유사성에 따라 정의되는, a1의 상대 몰 농도로 혼합물에 존재하는 일차 치환 아미노산;
    (iii) 적용가능한 경우, 상기 선택된 아미노산 서열의 상기 위치에서 발견되는 아미노산의 이차 치환으로서 이러한 이차 치환은 아미노산 유사성에 따라 정의되는, a2의 상대 몰 농도로 혼합물에 존재하는 이차 치환 아미노산;
    (iv) 적용가능한 경우, 상기 선택된 아미노산 서열의 상기 위치에서 발견되는 아미노산의 삼차 치환으로서 이러한 삼차 치환은 삼차 아미노산 유사성에 따라 정의되는, a3의 상대 몰 농도로 혼합물에 존재하는 삼차 치환 아미노산;
    (v) 고정된 상대 몰 농도 A로 혼합물에 존재하는 A:알라닌으로 구성된 아미노산의 혼합물로부터 임의로 선택되며,
    여기서 혼합물 중의 아미노산들은 합성을 시작하기에 앞서 결정된 서로에 대한 고정된 몰 입력 비율로 존재하고,
    여기서 A의 상대 몰 양은 DSP의 총 아미노산 농도의 50%를 초과하고, a0 및 a1 각각은 0.05-50%의 범위 내에 있고, a2 및 a3 각각은 0-50%의 범위 내에 있으며, a0+a1+a2+a3=100-A인 단계;
    A.(3) (a) 동일한 조건하에서 단계 (2)를 2 내지 15회 사이클 반복하여 DSP를 연장시키거나;
    (b) 각 사이클에 대해 혼합물 중 아미노산들의 상이한 입력 비율을 이용하여 단계 (2)를 2 내지 15회 사이클 반복하여 DSP를 연장시키거나;
    (c) 하나를 초과하는 기본 펩티드에 기초한 카세트들을 이용하여 단계 (1) 및 (2)를 2 내지 15회 사이클 반복하여 DSP를 연장시키거나;
    (d) 단계 (2)의 단일 사이클에서 합성된 2 내지 15개의 카세트를 어셈블링시키거나;
    (e) 첫 번째 카세트는 단계 (2)의 일 조건하에 합성되고, 두 번째 및 그 초과의 카세트들은 단계 (2)의 두 번째 조건하에 합성된 것인 2 내지 15개의 카세트를 어셈블링시킴에 의해 DSP의 길이를 연장시키는 단계;
    A.(4) 임의로 단계 (2) 및 (3)을 2 내지 15회 사이클 반복하여 DSP를 추가로 연장시키는 단계로서, 여기서 각 사이클에 대하여 DSP의 새로운 카세트가 단계 (2)의 이전 사이클에 의해 지정된 임의의 이전 카세트와 무관하게 설계되고,
    여기서 단계 (3) 및 (4)에서 선택된 사이클의 수는 DSP의 최종 길이가 약 25개 내지 300개의 아미노산 잔기가 되도록 선택되는 단계를 포함하는 방법으로 DSP 조성물을 제조하고;
    B.(1) 상기 DSP를 항체를 생성하는 수단과 접촉시키는 단계;
    B.(2) DSP에 결합되는 후보 항체를 선택하는 단계;
    B.(3) 후보 항체를 동정하고 첫 번째 기본 펩티드와 추가로 첫 번째 기본 펩티드 서열이 유래된 단백질에 대한 이의 결합 친화력을 결정하는 단계; 및
    B.(4) 유용한 양의 후보 항체를 생성하는 단계에 의해서
    항체를 제조하는 단계를 포함하여, DSP를 포함하는 조성물을 항원으로서 이용하여 항체를 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 항체를 생성하는 수단이 파지 디스플레이 라이브러리인 항체의 제조 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 항체를 생성하는 수단이 B 세포 라이브러리인 항체의 제조 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 항체를 생성하는 수단이 인간화된 세포 라이브러리인 항체의 제조 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 에피토프의 아미노산 서열이 암에 관련된 에피토프인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 에피토프가 G-단백질 커플링된 수용체(GPCR), CD20, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), CD52, 표피 성장 인자 수용체(EGFR+), CD33, 및 HER2로부터 선택된 단백질을 포함하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 에피토프의 아미노산 서열이 TNF 알파, 면역억제를 위한, CD25 또는 면역글로불린 E, CD11a, 알파4-베타1 인테그린; 감염성 질환 관련 베타 케모킨 수용체 CCR5 및 RSVgpP와 관련된 에피토프인 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 에피토프의 아미노산 서열이 서열번호 1-2로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 에피토프의 아미노산 서열이 감염성 질환 물질의 존재에 의해 야기되거나 이에 동반하여 발견되는 질환과 관련된 것인 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 감염성 질환 물질이 AIDS, AIDS 관련 증후군(AIDS Related Complex), 수두 (바리셀라), 일반 감기, 시토메갈로바이러스 감염, 콜로라도 진드기 열, 뎅기열, 에볼라 출혈열, 손, 발 및 입병, 간염, 단순 헤르페스, 대 상포진, HPV, 인플루엔자(플루), 라사 열, 홍역, 마르부르그 출혈열, 감염성 단핵구증, 이하선염, 회색질척수염, 진행성 다초점 백색질뇌병증, 광견병, 루벨라, SARS, 스몰폭스(바리올라), 바이러스 뇌염, 바이러스 위소장염, 바이러스 수막염, 바이러스 폐렴, 웨스트 나일병, 및 황열병으로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 질환을 야기하거나 이에 동반하여 발견되는 바이러스인 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 감염성 질환 물질이 탄저병, 세균 수막염, 보툴리눔독소증, 브루셀라증, 캄필로박터증, 고양이 찰상병, 콜레라, 디프테리아, 임질, 농가진, 레지오넬라증, 나병(한센병), 렙토스피라증, 리스테리아증, 라임병, 유비저, MRSA 감염, 노카르디아증, 백일해 (백일 기침), 페스트, 폐렴구균성 폐렴, 앵무새병, Q열, 록키산 홍반열 (RMSF), 살모넬라증, 성홍열, 이질, 매독, 파상풍, 트라코마, 결핵, 야토병, 장티푸스, 발진티푸스 (유행성 발진티푸스 포함), 및 요로 감염으로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 질환을 야기하거나 이에 동반하여 발견되는 세균인 방법.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 감염성 질환 물질이 아메바증, 회충증, 바베스열원충증, 챠가스병, 간흡충증, 와포자충증, 낭미충증, 긴촌충증, 메디나충증, 포충증, 요충증, 간질증, 비대흡충증, 사상충증, 자유-생활 아메바 감염, 편모충증, 악구충증, 막양조충증, 포자충증, 칼라-아자르, 리슈만편모충증, 말라리아, 메타고니무스흡충증, 구더기증, 회선사상충증, 이감염증, 요충 감염, 열원충증, 옴, 주혈흡충 증, 조충증, 개회충증, 톡소포자충증, 선모충증(trichinellosis), 선모충증(trichinosis), 편충증, 트리코모나스증, 및 파동편모충증 (아프리카 트리파노소마증 포함)으로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 질환을 야기하거나 이에 동반하여 발견되는 기생충인 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 제1 기본 펩티드 서열이 하나 이상의 펩티드로 된 둘 이상의 원래 서열을 포함하는데, 그 서열들은 단백질에서 인접하여 있지 않고, 상기 원래 서열들은 제1 기본 펩티드 서열에서 인접하여 있는 것인 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 원래 서열이 두 개를 초과하거나 그보다 많은 펩티드로부터 유래되는 방법.
  15. 제 1항에 따른 방법에 의해 제조된 항체를 포함하는 조성물.
  16. 질환을 치료하는 약제를 제조하기 위한 제 15항에 따른 조성물의 용도.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 항체가 다수의 종에 대하여 단백질을 인식하는 모노클로날 항체인 조성물.
  18. 제 15항에 있어서, 지시된 서열 펩티드가 합성 후 변형되는 조성물.
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