KR20100015658A

KR20100015658A - 발효 음료에서 ｈ₂ｓ 수준을 감소시키기 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20100015658A
Application number: KR1020097021691A
Authority: KR
Inventors: 린다 에프. 비슨; 안젤라 린더홀름; 케빈 엘. 디첼
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2007-03-16
Filing date: 2008-03-13
Publication date: 2010-02-12
Also published as: US20130071542A1; EP2132318B1; BRPI0808821B1; JP2010521169A; CA2680787A1; EP2132318A2; KR101449972B1; CN101641442A; CA2680787C; RU2476590C2; ES2390524T3; HK1138328A1; AU2008229168A1; CN106222100A; WO2008115759A2; WO2008115759A3; US20100143536A1; AU2008229168B2; PT2132318E; CN101641442B

Abstract

본 발명은 발효 음료에서 H₂S 수준을 감소시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

발효 음료에서 Ｈ₂Ｓ 수준을 감소시키기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR REDUCING H2S LEVELS IN FERMENTED BEVERAGES}

알코올 발효 동안 황화수소 (H₂S)와 같은 휘발성 황 화합물의 생성은 양조 및 와인 산업에 영향을 끼치는 논쟁거리이다. 황화수소 (H₂S)는 설페이트 환원 경로의 바람직하지 못한 부산물이다 (도 1). 이는 발효 조건하에서 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae)에 형성된다. S. 세레비시애 균주에 의한 H₂S의 생성은 0ug/L 내지 290u/L이며, 이는 11ng/L의 인간 감지 역치값을 훨씬 초과한다 (Amoore and Hautala 1983). 이러한 바람직하지 못한 질은, 와인에서 썩은 계란 악취를 나게하며, H₂S가 휘발성 화합물이고, 통풍에 의해 제거될 수 있음에도 불구하고, 메르캅탄 및 티올을 형성시킬 가능성을 가지며, 이들은 낮은 pH로 인해 와인에 유지될 것이라는 점으로부터 기인한다 (Thoukis 1962). 메르캅탄 및 티올은 양파 또는 식물 통조림 향으로서 그 자체로 존재하며, 휘발성 H₂S가 처리될 수 있는 경우에도, 기타 바람직하지 못한 황 화합물의 제거는 기술적으로 어려우며, 와인에서 다른 향 화합물도 제거하게 된다.

사카로마이세스 세레비시애에 의한 황화수소의 형성은 와인, 맥주 및 쉐이크 산업에서 널리 보고된 문제점이다 (Acree et al. 1972, Eschenbruch et al. 1978, Guidici and Kunkee 1994, Jiranek et al. 1995, Rauhut and Kurbel 1994, Walker and Simpson 1993). 질소 인자 예컨대, 질소, 비타민 및 보조인자의 수준 (Giudici and Kunkee 1994, Jiranek et al. 1995) 및 환경 인자 예컨대, 온도, pH, 원소 황의 수준 (Rauhut and Kurbel 1994), 이산화황의 존재 (Stratford and Rose 1985) 및 황을 함유하는 유기 화합물의 수준 (Acree et al. 1972)은 발효 음료에서 휘발성 황 화합물의 생성과 관련되었다. 휘발성 황 화합물의 생성에서의 차이는 효모 균주 대사에서의 차이로 인한 것이다 (Acree et al. 1972, Spiropoulos et al. 2000).

황화수소 형성과 관련하여 적어도 6개의 상이한 부류의 효모 균주 성향이 존재한다: 1) 모든 조건하에서 증가된 수준; 2) 모든 조건하에서 낮은 수준; 3) 질소의 역치 수준 미만 및 초과의 증가된 생성; 질소 수준의 '윈도우' 동안의 저하된 생성 및 이러한 윈도우의 초과 또는 미만의 질소 수준에서 설파이드 증가; 4) 질소 함량에 관계 없이 미량 영양소 수준 제한에 대한 증가된 생성; 5) 질소 및 미량 영양소 둘 모두에 대해 제한될 경우에만 증가된 설파이드 생성; 및 6) 발효 속도 증가시 증가된 설파이드 생성 (이는 발효 속도 및 이산화탄소 발생 또는 증가된 열 발생과 같은 일부 다른 요인에 관련될 수 있다) (Spiropoulos 2000, Jiranek 1995, Giudici 1994, Linderholm 2006).

와인으로부터 설파이드를 제거하기 위한 현존하는 방법은 구리 정제이다. 구리 첨가는 유독한 조성물 변화의 촉매를 유도할 수 있으며, 와이너리(winery)에 의해 생성된 특별한 처리가 요망되는 폐기물의 양을 증가시시켜, 결국에는 와이너리에게는 더 높은 생산 비용 및 소비자에게는 더 높은 와인 가격을 유도할 수 있다. 또한, 정제 제제로서 구리의 사용은 와인중의 높은 잔여 구리 수준을 초래할 수 있다. 세금무역국 (Trade and Tax Bureau)은 와인에 대해 0.5mg/L의 잔여 구리 수준을 허용하고 있다 (예를 들어, 월드와이브 웹사이트의 justia.com/view/89060/ 참조). 황화수소를 제거하기 위해 구리를 사용하는 와인 제조업자는 와인중의 구리 수준을 저하시키기 위해 방책을 취해야 한다. 과도한 구리 섭취와 관련하여 건강상의 악영향, 특히, 신경계 질환, 예컨대, 알츠하이머이 유발되는 경우, 세계 보건 기구는 이러한 화합물의 소비에 대한 식이 제한을 권고한다 (에를 들어, 월드웹사이트의 who.int/water_sanitation_health/dwq/chemicas/copper.pdf 참조). 황화수소를 생성할 수 없거나 감소된 수준의 황화수소를 생성하는 시중의 효모 균주의 이용가능성은 와인의 구리 처리 필요성을 배제시킬 것이다.

따라서, 발효 음료에서 H₂S 수준을 감소시키기 위한 조성물 및 방법이 당해분야에서 요구된다. 본 발명은 이러한 요구 및 기타 요구를 충족시킨다.

발명의 간단한 요약

본 발명은 발효 음료에서 H₂S 수준을 감소시키기 위한 조성물 방법을 제공한다.

본 발명의 일 양태는 발효 생성물 또는 배지에서 H₂S 수준을 감소시키거나 제거하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 방법은 설파이트로부터 자유로운 황화수소 방출을 촉매하지 않는 변형된 MET10 폴리펩티드 (즉, "설파이드 불활성" MET10 폴리펩티드)를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 효모 균주, 효모 세포 또는 효모 배양물과 발효 생성물 또는 배지를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서, MET10 폴리펩티드의 662번 위치의 아미노산은 트레오닌이 아니다. 일부 구체예에서, 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO:3의 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하며, 662번 위치의 X는 트레오닌이 아니다. 일부 구체예에서, 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO:1을 포함한다.

설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드의 구체예에 있어서, 일부 구체예에서, MET10 폴리펩티드의 662번 위치의 아미노산 잔기는 트레오닌 또는 세린이 아니다. 일부 구체예에서, MET10 폴리펩티드의 662번 위치에서 아미노산 잔기는 Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr (SEQ ID NO:3)이다. 일부 구체예에서, MET10 폴리펩티드의 662번 위치의 아미노산 잔기는 Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp 또는 Tyr (SEQ ID NO:5)이다. 일부 구체예에서, 662번 위치에서의 아미노산 잔기는 Lys, Arg, His, Gln 및 Asn (SEQ ID NO:6)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 662번에서의 아미노산 잔기는 Lys (SEQ ID NO:7)이다.

일부 구체예에서, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드 또는 MET10 폴리누클레오티드는 효모 MET10이다. 일부 구체예에서, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4의 MET10과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 더 높은 서열 동일성을 공유하며, 여기서, 662번 위치에서의 X는 상기 및 본원에 기술된 바와 같다. 일부 구체예에서, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO:1과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 더 높은 서열 동일성을 공유한다.

일부 구체예에서, 효모 세포는 또한, 설파이트를 설파이드로 전환시킬 수 있는 설파이드 활성 MET10 폴리펩티드를 발현하지 않는다. 일부 구체예에서, 발효 생성물은 와인, 맥주 또는 샴페인이다. 일부 구체예에서, 발효 배지는 머스트 (must) (예를 들어, 포주 쥬스 머스트) 및 맥아즙으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

효모 세포의 구체예에 있어서, 일부 구체예에서, 효모 균주는 사카로마이세스 세레비시애 균주일 수 있다. 일부 구체예에서, 효모 균주는 본원에 기술된 바와 같이 맥주 또는 와인 제조에 사용되는 시중에서 입수가능한 균주일 수 있다. 종종, 어미 균주 또는 기원 균주는 설파이드 활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산으로 대체함으로써 황화수소 비생산체가 되는 황화수소 생산체이다. 예시적인 S. 세레비시애 와인 균주는 비제한적으로, 프리스 데 모세 (Prise de Mousse), 프리미어 쿠베 (Premier Cuvee), 프렌치 레드 (French Red), 몽타셋 (Montachet), 랄레만드 K1 (Lallemand K1), 보르데욱스 (Bordeaux), UCD522, UCD940, Ba25, Ba126, Ba137, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bb19 및 Bb22를 포함한다. 효모 세포의 추가의 구체예는 본원 에 기술된 바와 같다.

본 발명의 또 다른 양태는 설파이트의 설파이드로의 전환을 촉진하지 않는 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리누클레오티드로서, MET10 폴리펩티드의 662번 위치의 아미노산이 트레오닌이 아닌 폴리누클레오티드를 제공한다. 일부 구체예에서, MET10 폴리펩티드의 662번 위치에서의 아미노산은 트레오닌 또는 세린이 아니다 (SEQ ID NO:5). 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드의 구체예는 상기 및 본원에 기술된 바와 같다. 일부 구체예에서, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO: 1과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 분리된 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO:1 또는 이의 보체에 제공된 핵산 서열을 포함한다.

관련 양태에서, 본 발명은 설파이트의 설파이드 전환을 촉매하지 않는 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 발현 카세트 및 발현 벡터로서, MET10 폴리펩티드의 662번 위치의 아미노산이 트레오닌이 아니며 (SEQ ID NO:3), 폴리누클레오티드가 발현 조종 서열에 작동가능하게 연결된 발현 카세트 및 발현 벡터를 제공한다. 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드의 추가의 구체예는 상기 및 본원에 기술된 바와 같다. 발현 벡터 또는 발현 카세트를 포함하는 숙주 세포가 추가로 제공된다. 숙주 세포는 효모 세포 예를 들어, 사카로마이세스 세레비시애 세포일 수 있다. 효모 세포의 추가의 구체예는 상기 및 본원에 기술된 바와 같다. 일 부 구체예에서, 발현 카세트 또는 발현 벡터는 효모 세포에서 발현을 촉 진하는 프로모터를 포함한다.

관련 양태에서, 본 발명은 검출가능한 정도의 황화수소를 생성하지 않거나 낮은 수준의 황화수소를 생성하는 개선된 효모 세포를 제공하며, 이러한 개선된 세포는 설파이트의 설파이드로의 전환을 촉매하지 않는 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 외생성 폴리누클레오티드를 포함하며, 여기서, MET10 폴리펩티드의 662번 위치의 아미노산은 트레오닌이 아니며 (SEQ ID NO:3), 개선된 효모 세포의 어미 세포는 황화수소를 생성한다. 일부 구체예에서, MET10 폴리펩티드의 662번 위치의 아미노산은 트레오닌 또는 세린이 아니다 (SEQ ID NO: 5). 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드 및 효모 세포의 추가의 구체예는 상기 및 본원에 기술된 바와 같다.

추가의 양태에서, 본 발명은 감소된 수준의 황화수소를 생성하거나 검출가능한 황화수소를 생성하지 않는 개선된 효모 세포 배양물을 제공하며, 이러한 개선된 배양물은 설파이트의 설파이드로의 전환을 촉매하지 않는 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 외생성 폴리누클레오티드를 포함하는 효모 세포의 군집을 포함하며, 여기서, MET10 폴리펩티드의 662번 위치의 아미노산은 트레오닌이 아니며 (SEQ ID NO:3), 개선된 효모 세포 배양물은 어미 세포의 배양물과 비교하여 황화수소를 생성하기 않거나 황화수소 생성이 감소된다. 일부 구체예에서, MET10 폴리펩티드의 662번 위치의 아미노산은 트레오닌 또는 세린이 아니다 (SEQ ID NO: 5). 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드 및 효모 세포의 추가의 구체예는 상기 및 본원에 기술된 바와 같다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 검출가능한 황화 수소를 생성하지 않는 개선된 효모 세포를 생성하는 방법으로서, 개선된 효모 세포의 어미에 설파이트의 설파이드로의 전환을 촉매하지 않는 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 외생성 폴리누클레오티드를 유입시킴으로써 설파이드 활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 내생성 핵산을 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산으로 대체하는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드의 662번 위치의 아미노산은 트레오닌이 아니며 (SEQ ID NO:3), 개선된 효모 세포의 어미는 황화수소를 생성한다. 일부 구체예에서, MET10 폴리펩티드의 662번 위치의 아미노산은 트레오닌 또는 세린이 아니다 (SEQ ID NO: 5). 일부 구체예에서, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산은 재조합에 의해 유입된다. 일부 구체예에서, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산은 백-크로싱 (back-crossing)에 의해 유입된다. 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드 및 효모 세포의 추가 구체예는 상기 및 본원에 기술된 바와 같다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 검출가능한 황화수소를 갖지 않거나 황화수소 또는 이들로부터의 전여물의 수준이 낮은 발효 생성물 예를 들어, 와인, 맥주, 샴페인을 제공하며, 여기서, 발효 생성물은 본원에 기술된 방법에 따라 생성된다.

본 발명의 추가의 구체예는 SEQ ID NO:1에 제공된 서열 또는 이의 보체와 야생형 MET10을 엔코딩하는 핵산을 구별할 수 있는 분리된 폴리누클레오티드, 발현 조종 서열에 작동가능하게 연결된 이러한 폴리누클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 (예를 들어, 사카로마이세스 세리비시애 세포)를 제공한다.

본 발명의 추가의 구체예는 SEQ ID NO:1에서 하나 이상의 치환 (예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 치환)을 포함하는 분리된 폴리누클레오티드로서, 하나 이상의 치환은 404번에서 A->C, 514번에서 A->G, 1278번에서 A->G 및 1532번에서 C->T, 1768번에서 G->A 및 1985번에서 A->C로부터 선택되는 폴리누클레오티드, 발현 조종 서열에 작동가능하게 연결된 이러한 폴리누클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 (예를 들어, 사카로마이세스 세리비시애 세포)를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 SEQ ID NO:2에서 하나 이상의 치환 (예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 치환)을 포함하는 분리된 폴리누클레오티드로서, 하나 이상의 치환은 404번에서 C->A, 514번에서 G->A, 1278번에서 G->A 및 1532번에서 T->C, 1768번에서 A->G 및 1985번에서 C->A로부터 선택되는 폴리누클레오티드, 발현 조종 서열에 작동가능하게 연결된 이러한 폴리누클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 (예를 들어, 사카로마이세스 세리비시애 세포)를 제공한다.

도면의 간단한 설명

도 1은 설페이트 환원 경로를 나타낸다. 유전자에 대해 수행된 서열 분석은 굵은 글씨체로 표시하고, 발견된 대립유전자의 번호는 괄호안에 표시하였으며, UCD932에서 발견된 대립유전자는 점선으로 나타내었다.

도 2A-2Z는 다양한 사카로마이세스 균주에서 MET10 대립유전자의 서열 정렬을 나타낸다 (각각 SEQ ID NO: 8, 9, 1, 10-14, 2, 15 및 16). 코돈 변화가 발생 하는 핵산은 하이라이트로 처리하였다.

도 3은 예시적인 유전자 스와핑 기법 (gene swapping technique)을 나타낸다. MET10^S = S288C 대립유전자. MET10^W = 와인 균주 대립유전자.

도 4는 다양한 사카로마이세스 균주에서 MET10 유전자의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다 (S288C = SEQ ID NO:17, UCD932 = SEQ ID NO:18; UCD950 = SEQ ID NO:19). 상이한 균주 사이의 아미노산 차이는 하이라이트로 표시하였다.

도 5는 MET10 단백질에서 662번 잔기 주위의 아미노산 변화를 나타낸다. S288C (SEQ ID NO:20), UCD932 (SEQ ID NO:21) 및 UCD950 (SEQ ID NO:20)으로부터의 MET10 대립유전자의 DNA 서열을 누클레오티드 1985번 근처에서 주요 변이를 하이라이트 처리하고 굵은체로 처리하면서 정렬시켰다. 코돈 (SEQ ID NO: 22 및 23) 및 상응하는 아미노산 (SEQ ID NO:24) (밝은 회색으로 하이라이트 처리함)을 삽입표에 나타내었다. C로부터 A로의 변화는 단백질의 662번 위치에서 트레오닌 잔기의 리신으로의 상응하는 변화를 유도한다.

도 6은 MET10 단백질의 공지되고 추정된 작용 도메인에 관련하여 662번 아미노산 잔기의 위치를 나타낸다. MET10 단백질의 공지된 모티프 및 도메인의 맵이 기술되어 있다. 662번 위치에서 변형된 염기의 위치는 검정 화살표로 표시하였다. 변이는 생성물의 설파이트 환원효소 도메인내에 존재한다. 월드와이드웹의 //db.yeastgenome.org/cgi-bin/protein/domainPage.pl?dbid=S000001926으로부터의 데이타.

도 7은 설파이트 환원효소 도메인의 구조적 특징부를 나타내며, 단백질의 구조적 특징부에서 트레오닌 잔기의 리신으로의 변화로 인한 영향을 나타낸다. 구조적 상동성 추정법에 기초한 MET10 단백질의 구조적 리본 모델이 묘사되어 있다. 삽입표에 확대하여 나타낸 662번 잔기 주위의 영역을 갖는 633번 리신 내지 1035번 티로신의 추정된 설파이트 환원효소 도메인만 도시하였다. UCD932에 대한 추정된 구조 (도 A)에서는 662번 잔기의 리신을 하이라이트하였으며, UCD950에 대한 추정된 구조 (도 B)에서는 662번 잔기의 트레오닌을 하이라이트하였다.

도 8은 일부 산업적으로 관련된 효모 종으로부터의 MET10 단백질의 서브서열의 정렬을 나타내며 (UCD 932 MetlO = SEQ ID NO:25; S288c MetlO = SEQ ID NO:26; S. 세레비시애 (carlsbergensis) = SEQ ID NO:27; 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis) = SEQ ID NO:28; 야로비아 리폴리티카 (Yarowwia lipolytica) = SEQ ID NO:29; 쉬조사카로마이세스 폼브 (Schizosaccharomyces pombe) = SEQ ID NO:30), 이들의 설파이트 환원효소 촉매 영역에서의 서열이 공지되어 있다. 정렬된 종 전반에 걸쳐 보존된 아미노산 잔기는 굵은 글씨체로 나타내었다. 대부분의 관련 종에서 보존된 아미노산 잔기는 음영으로 나타내었다. 662번 또는 모티프 (N/K)(R/K)R(V/L)TP(A/D/E)(D/N/E)Y(D/N)R(Y/N)IFH(I/V)EFD(I/L) (SEQ ID NO:31)내의 트레오닌은 모든 정렬된 효모 종에 걸쳐 활성 MET10 폴리펩티드에서 보존된다.

표의 간단한 설명

표 1은 천연 및 산업적 효모 균주의 리스트이다.

표 2는 변형된 트리플 M (MMM) 배지에 대한 조성물이다.

표 3은 BiGGY 플레이트 및 MMM에서 성장한 천연 효모 분리물의 분석 결과를 나타낸다.

표 4는 추가적인 효모 균주를 나타낸다.

표 5는 특히, MET10을 증폭시키기 위한 PCR 프라이머의 서열이다.

표 6은 특히, MET10에 대한 프라이머를 시퀀싱하기 위한 서열이다.

표 7은 MET10으로 형질변환된 효모 균주로부터의 H₂S 생성을 요약한 결과이다.

표 8은 MET10 대립유전자에서의 아미노산 차이를 나타낸다.

표 9는 MET10으로 형질변환된 추가적인 효모 균주에 의한 H₂S 생성을 요약한 결과이다.

표 10은 MET10으로 형질변환된 효모 균주에 의한 H₂S 생성을 요약한 결과이다.

표 11은 MET10 대립유전자로 형질변환된 효모 균주에 의한 H₂S 생성을 요약한 결과이다.

I. 도입

본 발명은 발효 음료에서 H₂S 수준을 감소시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 662번 위치에서 트레오닌 이외의 아미노산 잔기를 갖는 MET10 폴리펩티드가 설파이트의 자유롭거나 방출된 황화수소로의 전환을 촉매하지 않는다는 발견에 일부 기초한다. 이는 효모 균주 UCD932에서 MET10 대립유전자로부터 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드의 발현에 의해 예증되며, 여기서 MET10 유전자의 1985번 위치에서 단일 누클레오티드 변화는 MET10 단백질의 촉매 도메인의 662번 위치에서 트레오닌의 리신으로의 아미노산 변화를 유도한다.

II. 정의

달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 당해분야의 일반적인 기술을 가진 당업에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 하기 기술된 본원에 사용된 명명법 및 세포 배양의 실험 공정, 분자 유전학, 유기 화학 및 핵산 화학 및 하이브리디화는 널리 공지되어 있으며, 당해분야에 통상적으로 이용된다. 핵산 및 펩티드 합성에 표준 기법이 이용된다. 일반적으로, 효소 반응 및 정제 단계는 제조업자의 지시에 따라 수행한다. 기법 및 공정은 일반적으로 당해분야 및 본 문헌 전체에 걸쳐 제공된 다양한 일반적인 참고문헌에 있는 통상적인 방법에 따라 일반적으로 수행된다 (Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Ausubel, et al, eds., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons 1987-2008)). 본원에 사용된 명명법 및 하기 기술된 분석 화학 및 유기 합성에서의 실험 공정은 널리 공지되어 있으며 당해분야에 통상적으로 이용된다. 표준 기법 및 이의 변형이 화학 합성 및 화학 분석에 이용된다.

본원에 사용된 바와 같은 "발효 배지"는 효모 첨가전의 비발효된 혼합물을 나타낸다. 발효 배지는 예를 들어, 머스트 및 맥아즙을 포함한다. 발표 배지는 추가의 당 공급원 (예를 들어, 꿀, 사탕수수 당, 비트 당, 옥수수 당, 프룩토오스, 수크로오스 또는 글루코오스); 산 (예를 들어, 시트르산, 말산, 타르타르산 및 이의 혼합물) 및 효모 영양소 (예를 들어, 디암모늄 포스페이트 또는 다른 질소 공급원, 비타민 등)을 추가로 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "머스트"는 과일을 갈아서 생성된 과일 쥬스, 줄기 단편, 과일 껍질, 씨 및/또는 과육의 비발효된 혼합물을 나타낸다. 발효가능한 당을 함유하는 과일 예를 들어, 포도, 사과, 체리, 복숭아, 승도 복숭아, 플럼, 살구, 배, 감, 파인애플, 망고, 키위, 딸리, 로즈베리, 블루베리, 엘더베리, 블랙베리, 크렌베리, 무화과 및 로캣 (loquat)이 이용될 수 있다. 과일을 갈기전에 건조시키거나, 끓거나, 짓이기거나 다른 처리를 할 수 있다. 머스트는 두개 또는 그 초과의 과일을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "맥아즙"은 곡물 및/또는 곡물 껍질을 갈아서 생성된 비발효된 액체를 나타낸다. 발효가능한 당을 함유하는 곡물 예를 들어, 보리, 밀, 호밀, 쌀, 옥수수 및 귀리가 사용될 수 있다. 곡물을 갈기전에 로스트하거나, 플레이크하거나 다르게 처리할 수 있다. 맥아즙은 두개 또는 그 초과의 곡물을 포함하는 혼합물로부터 생성될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "Met10" 및 "MET10"은 사카로마이세스의 동화성 설파이트 환원효소의 α 서브유닛을 나타낸다. 기능적으로, MET10 폴리펩티드는 설파이트의 설파이드로의 전환을 촉매한다. 구조적으로, MET10 폴리펩티드, 특히, 효모 MET10 폴리펩티드는 특성 결정되었다. MET10 폴리펩티드는 C-말단부에서 보존된 설파이트 환원효소 촉매 도메인 및 FAD 및 NAD 결합 도메인을 함유한다. 폴리펩티드의 중앙부는 피루베이트-페레독신 옥시도환원효소 도메인을 함유한다. 설파이트의 자유롭거나 방출된 황화수소로의 전환을 촉매할 수 있는 설파이드 활성 MET10 폴리펩티드에서, 662번에서의 아미노산 잔기는 보존되며, 특히, 효모에서 일반적으로, 트레오닌 또는 때때로 세린이다. 확인된 MET10 폴리펩티드 도메인은 도 6에 도시되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "MET10"은 (1) MET10 핵산에 의해 엔코딩된 기준 아미노산 서열에 대해 바람직하게는, 적어도 약 25, 50, 100, 200, 500, 1000개 또는 그 초과의 아미노산의 영역 또는 이의 전장에 걸쳐 약 80% 초과의 아미노산 서열 동일성, 예를 들어, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 초과의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열 (효모 MET10 핵산 서열에 있어서, 예를 들어, SEQ ID NO:1, 도 2 및 하기 예시된 진뱅크 수탁 번호 참조)을 가지며; (2) MET10 폴리펩티드 (예를 들어, SEQ ID NO:1에 의해 엔코딩된) 및 이의 보존적으로 변형된 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 면역원에 대해 발생된 항체 예를 들어, 폴리클로날 항체에 결합하며; (3) 엄격한 하이브리드화 조건하에서 MET10 단백질 및 이의 보존적으로 변형된 변이체를 엔코딩하는 핵산 서열에 상응하는 안티-센스 가닥에 특이적으로 하이브리드화되며; (4) MET10 기준 핵산 서열에 대해 바람직하게는, 적어도 약 25, 50, 100, 200, 500, 1000개 또는 그 초과의 핵산의 영역 또는 이의 전장에 걸쳐 약 95% 초과, 바람직하게는, 약 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 누클레오티드 서열 동일성을 갖는, 핵산 서열을 갖는 핵산 및 폴리펩티드 다형성 변이체, 대립유전자, 돌연변이 및 종간 상동체를 나타낸다. 본 발명의 핵산 및 단백질은 천연 발생 또는 재조합 분자 둘 모두를 포함한다. 일부 구체예에서, MET10 폴리펩티드 및 MET10 폴리누클레오티드는 효모로부터 유래한다. 예시된 MET10 아미노산 및 핵산 서열은 진뱅크 수탁 번호 EF058164, EF058165, EF058166, EF058167, EF058168, EF058169, EF058170, EF058171, EF058172, EF058173이다.

본원에 사용된 바와 같은, "설파이드 활성 MET10" 폴리펩티드는 설파이트의 황화수소로의 전환을 촉매할 수 있다. 효모에서, 설파이드 활성 MET10 폴리펩티드는 662번 아미노산 위치에서 세린 또는 트레오닌 잔기를 가질 수 있다. 효모 균주에서, S. 세리비시애에서 662번의 아미노산은 트레오닌 또는 세린으로서 보존되며, 설파이트 환원효소 촉매 영역내의 하기 모티프에 존재한다:

(N/K)(R/K)R(V/L)TP(A/D/E)(D/N/E)Y(D/N)R(Y/N)IFH(I/V)EFD(I/L) (SEQ ID NO:31). 도 8 참조.

본원에 사용된 바와 같은, "설파이드 불활성 MET10" 폴리펩티드는 설파이트의 자유롭거나 방출된 황화수소로의 전환을 촉매하지 않는다. 효모에서, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드는 662번 아미노산 위치에서 또는 모티프 (N/K)(R/K)R(V/L)XP(A/D/E)(D/N/E)Y(D/N)R(Y/N)IFH(I/V)EFD(I/L) (SEQ ID NO:32)내에 트레오닌을 갖지 않을 것이며, 즉, 상기에서 X는 T가 아니다. 일부 구체예에서, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드는 662번 아미노산 위치에서 트레오닌 또는 세린 잔기를 가질 수 없을 것이다. 일부 구체예에서, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드는 662번 위치에서 Ala, Cys, Asp, GIu, Phe, GIy, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr (SEQ ID NO:3)을 가질것이다. 일부 구체예에서, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드에서 662번의 아미노산 잔기는 히드록실기를 갖지 않으며, 예를 들어, Thr, Ser, 또는 Tyr (SEQ ID NO:33)이 아니다. 일부 구체예에서, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드의 662번 위치의 아미노산 잔기는 크거나 거대한 아미노산이며, 예를 들어, Lys, Arg, His, Gln, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr, 또는 Trp (SEQ ID NO:34)이다. 일부 구체예에서, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드에서 662번 위치의 아미노산 잔기는 기본적인 또는 양으로 하전된 아미노산 예를 들어, Lys, Arg, His, Gln 또는 Asn (SEQ ID 0:6)이다. 일부 구체예에서, 662번 위치의 아미노산 잔기는 Lys (SEQ ID NO: 7)이다.

본원에 사용된 바와 같은 "외생성" MET10 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 인간에 의해 어미 효모 세포 또는 어미 효모 균주로 유입된다. 외생성 핵산 서열 또는 외생성 아미노산 서열의 효모 세포로의 유입은 재조합 방법 또는 전통적인 효모 브리딩 (breeding) 방법 (예를 들어, 백-크로싱)을 포함하는 당해분야에 공지된 수단에 의해 수행될 수 있다.

용어 "핵산" 및 "폴리누클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태로 데옥시리보누클레오티드 또는 리보누클레오티드 및 이들의 폴리머로서 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 합성, 천연 발생 및 비천연 발생의 공지된 누클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포함하며, 이는 기준의 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며, 기준의 누클레오티드와 유사한 방식으로 대사된다. 이러한 유사체의 예로는 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보누클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA)를 포함한다.

다르게 언급되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 퇴화성 코돈 치환) 및 상보적 서열 및 명백하게 기재된 서열을 포함한다. 특히, 퇴화성 코돈 치환은 하나 또는 그 초과의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세번째 위치가 혼합된-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 용어 핵산은 유전자, cDNA, mRNA, 올리고누클레오티드 및 폴리누클레오티드와 상호교환적으로 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은 "구별될 수 있는" 핵산은 (1) 엄격한 하이브리드화 조건하에서 MET10 단백질 및 이의 보존적으로 변형된 변이체를 엔코딩하는 핵산 서열에 상응하는 안티-센스 가닥에 특이적으로 하이브리드화하거나; (2) MET10 핵산에 대해 바람직하게는, 적어도 약 25, 50, 100, 200, 500, 1000개 또는 그 초과의 누클레오티드의 영역에 걸쳐 약 80%, 85%, 90%, 95% 초과, 바람직하게는, 약 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 누클레오티드 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 폴리누클레오티드를 나타낸다.

문구 "엄격한 하이브리드화 조건"은 프로브가 전형적으로 핵산의 복잡한 혼합물중에서 이의 표적 서열에 하이브리드화되고 다른 서열에는 하이브리드화되지 않을 조건을 나타낸다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며, 다양한 조건에서 다양해질 것이다. 더 긴 서열이 더 높은 온도에서 특정하게 하이브리드화된다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 안내는 문헌 [Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 찾아볼 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 Ph에서 특이적 서열에 대해 열 용융점 I 보다 약 5-10℃ 낮도록 선택된다. T_m은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평행하게 표적 서열에 하이브리드화되는 온도 (규정된 이온 강도, Ph 및 핵산 농도하에서)이다 (표적 서열이 과량으로 존재하는 경우, T_m에서 프로브의 50%가 평행하게 차지하게 된다). 엄격한 조건은 염 농도가 Ph 7.0 내지 8.3에서 약 1.0M 미만의 나트륨 이온, 전형적으로, 약 0.01 내지 1.0M 나트륨 이온 농도 (또는 다른 염)이며, 온도는 짧은 프로브 (예를 들어, 10 내지 50개 누클레오티드)에 있어서는 약 30℃이상 및 긴 프로브 (예를 들어, 50개 초과의 누클레오티드)에 있어서는 약 60℃ 이상인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한, 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 하이브리드화에 있어서, 포지티브 시그널은 2배 이상의 배경, 임의적으로, 10배의 배경 하이브리드화이다. 예시적인 엄격한 하이브리드화 조건은 다음과 같다: 50% 포름아미드, 5x SSC 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션, 또는 5x SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션, 65℃에서 0.2x SSC 및 0.1% SDS로 세척.

엄격한 조건하에서 서로 하이브리드화되지 않는 핵산은 이들이 엔코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일한 경우, 여전히 실질적으로 동일하다. 이는 예를 들어, 핵산의 복사체가 유전자 코드에 의해 허용되는 최대 코돈 퇴화도를 이용하여 생성되는 경우 발생한다. 이러한 경우, 핵산은 일반적으로, 완만하게 엄격한 하이브리드화 조건하에서 하이브리드화된다. 예시적인 "완만하게 엄격한 하이브리드화 조건"은 37℃하에 40% 포름아미드, 1M NaCl, 1% SDS의 완충제에서의 하이브리드화 및 45℃에서 1X SSC로 세척을 포함한다. 포지티브 하이브리드화는 2배 이상의 배경을 갖는다. 당업자는 대안적인 하이브리드화 및 세척 조건을 이용하여 유사한 엄격한 조건을 제공할 수 용이하게 인지할 수 있을 것이다.

용어 "분리된", "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 이의 천연 상태에서 발견되는 바와 같이 일반적으로 수반하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 나타낸다. 순도 및 동질성은 전형적으로 분석 화학 기법 예컨대, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 제조물에 존재하는 우세한 종인 단백질은 실질적으로 정제된다. 특히, 분리된 MET10 핵산은 MET10 유전자 측면에 위치하고, MET10 이외의 단백질을 엔코딩하는 오픈 리딩 프레임으로부터 분리된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 실질적으로 하나의 밴드를 발생시킨다. 특히, 이는 핵산 또는 단백질이 85% 이상, 더욱 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는, 99% 이상 순수함을 의미한다.

핵산 부분과 관련하여 사용되는 경우 용어 "이종성"은 핵산이 서로로부터 분기되는 2개 또는 그 초과의 서브서열을 포함함을 의미하며, 이러한 분기는 연속적 변이 또는 유전자 재배열을 통해 군집에서 자연적으로 발생할 수 있거나 인공적으로 유도될 수 있다. 예를 들어, 새로운 기능의 핵산을 제조하기 위해 배열된 비관련 유전자로부터의 2개 또는 그 초과의 서열을 갖는 핵산이 전형적으로, 재조합에 의해 생성되며, 예를 들어, 하나의 공급원으로부터의 프로모터 및 다른 공급원으로부터의 코딩 영역이 생성된다. 유사하게는, 이종성 단백질은 단백질이 분기되거나 자연적으로 서로 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 또는 그 초과의 서브서열을 포함함을 나타낸다 (예를 들어, 융합 단백질).

"발현 벡터"는 재조합 또는 합성에 의해 생성된 핵산 작제물이며, 숙주 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특이적 핵산 요소를 갖는다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 전사될 핵산을 포함한다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 나타내는 것으로 본원에 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 하나 또는 그 초과의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공적인 화학 모방체 (mimetic)인 아미노산 폴리머 및 천연 발생 아미노산 폴리머 및 비천연 발생 아미노산 폴리머에 적용된다.

용어 "아미노산"은 천연 및 합성 아미노산을 나타내며, 또한, 천연 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 나타낸다. 천연 아미노산은 유전자 코드에 의해 엔코딩되는 아미노산이며, 후에 변형되는 아미노산 예를 들어, 히드록시프롤린,

-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 아미노산과 동일한 기본 화학 구조 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R 기에 결합된

탄소를 갖는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 나타낸다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 가지나, 천연 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 가지나, 천연 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학 화합물을 나타낸다.

아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명법에 의해 권고된 이들의 공통적으로 공지된 3 문자 심볼 또는 1 문자 심볼로 나타낼 수 있다. 마찬가지로, 누클레오티드는 이들의 공통적으로 허용되는 단일 문자 코드로 나타낼 수 있다.

"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열에 있어서, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 엔코딩하는 핵산을 나타내거나, 핵산이 아미노산 서열을 엔코딩하지 않는 경우, 본질적으로 동일한 서열을 나타낸다. 유전자 코드의 퇴화로 인해, 많은 기능적으로 동일한 핵산이 주어진 단백질을 엔코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 모두는 아미노산 알라닌을 엔코딩한다. 이와 같이, 알라닌이 코돈에 의해 특정화되는 모든 위치에서, 코돈은 엔코딩된 폴리펩티드를 변형시키지 않으면서 기술된 상응하는 코돈으로 변형될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이"이며, 이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종류이다. 폴리펩티드를 엔코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기술한다. 당업자는 핵산중의 각각의 코돈 (보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG 및 보통 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG를 제외)은 기능적으로 동일한 분자를 생산하도록 변형될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 각 기술된 서열에 내재된다.

아미노산 서열에 있어서, 당업자는, 엔코딩된 핵산에서 단일 아미노산 또는 적은 분율의 아미노산을 변형, 첨가 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 첨가가 "보존적으로 변형된 변이체"이며, 여기서, 변형은 화학적으로 유사한 아미노산으로의 아미노산의 치환을 유도함을 인지할 수 있을 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당해분야에 널리 공지되어 있다. 또한, 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 또한, 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자이며, 이들을 제외시키지 않는다.

하기 8개의 그룹은 서로에 대한 보존적 치환체인 아미노산을 각각 함유한다:

1) 알라닌 (A), 글리신 (G);

2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);

3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);

4) 아르기닌 (R), 리신 (K);

5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);

6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W);

7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및

8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M)

(예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)] 참조).

2개 또는 그 초과의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 있어서 용어 "동일한" 또는 "동일율"은, 비교 윈도우에 걸쳐 또는 후속 서열 비교 알고리즘 또는 수동 정렬과 육안 관찰중 하나를 이용하여 측정된 지정 영역에 걸쳐 최대 상응성을 위해 비교되고 정렬되는 경우, 아미노산 잔기 또는 누클레오티드가 동일하거나 특정의 동일 백분율 (즉, 특정 영역 즉, SEQ ID NO:1의 영역에 걸쳐 60% 동일성, 바람직하게는, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성)을 갖는 2개 또는 그 초과의 서열 또는 서브서열을 나타낸다. 그 후, 이러한 서열은 "실질적으로 동일한"것으로 불려진다. 이러한 정의는 또한, 시험 서열의 보완물을 나타낸다. 바람직하게는, 적어도 약 25개 아미노산 또는 누클레오티드 길이의 영역, 또는 더욱 바람직하게는, 50-100개 아미노산 또는 누클레오티드 길이의 영역에 걸쳐 동일성이 존재한다.

서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 시험 서열과 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우, 시험 및 기준 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요에 따라, 서브서열 코디네이트가 설계되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 설계된다. 디폴트 프로그램 파라미터 (default program parameter)를 사용하거나, 대안적인 파라미터가 설계될 수 있다. 그 후, 서열 비교 알고리즘으로 프로그램 파라미터에 기초하여 기준 서열과 비교하여 시험 서열에 대한 서열 동일율을 계산한다. 핵산 및 단백질의 MET10 핵산 및 단백질로의 서열 비교를 위해, 하기 논의된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘 및 디폴트 파라미터를 이용한다.

본원에 사용된 바와 같은 "비교 윈도우"는 20 내지 600, 일반적으로, 약 50 내지 약 200, 더욱 일반적으로, 약 100 내지 약 150개로 구성된 군으로부터 선택된 연속 위치의 번호중 어느 하나의 세그먼트에 대한 기준을 포함하며, 여기서, 서열은 두개의 서열이 최적으로 정렬된 후 연속 위치의 동일한 번호의 기준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당해분야에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 예를 들어, 문헌 [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌 [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌 [Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사한 방법에 대한 서치, 이들 알고리즘의 컴퓨터처리된 임플러멘테이션 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 수동 정렬과 육안 검사 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.

서열 동일율 및 서열 유사율을 결정하는데 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 각각 문헌 [Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) and Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기술되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0이 본원에 기술된 파라미터와 함께 사용되어 본 발명의 핵산 및 단백질에 대한 서열 동일율을 결정한다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 내셔널 센터 퍼 바이오테크놀로지 인포메이션을 통해 공공연하게 입수가능하다 (the worldwide website at ncbi.nlm.nih.gov/). 이러한 알고리즘은 먼저, 의문의 서열에서 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 높은 스코어링 서열 쌍 (HSP)를 확인하는 것을 포함하며, 이는 데이타베이스 서열에서의 동일한 길이의 워드와 정렬되는 경우 일부 포지티브의 역치가와 매칭되거나 이를 충족시킨다. T는 이웃의 워드 역치가로서 불린다 (Altschul et al, supra). 이러한 초기의 이웃 워드 힛 (word hit)은 서치를 개시하기 위한 시드 (seed)로서 작용하여 이를 함유하는 더 긴 HSP를 찾아낸다. 워드 힛은 누적 정렬 스코어가 증가할 수 있는 만큼 멀리 각 서열에 따라 양 방향으로 연장된다. 누적 스코어는 누클레오티드 서열에 있어서, 파라미터 M (정합 잔기쌍에 대한 리워드 스코어; 항상 >0) 및 N (부정합 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 <0)을 이용하여 계산한다. 아미노산 서열에 있어서, 스코어링 매트릭스는 누적 스코어를 계산하는데 사용된다. 각 방향에서 워드 힛의 연장은 누적 정렬 스코어가 이의 최대 달성된 값으로부터 X 양만큼 떨어지는 경우; 누적 스코어가 하나 이상의 네거티브-스코어 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 또는 그 미만에 도달하는 경우; 또는 한 서열의 말단에 도달하는 경우 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 선택성 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램 (누클레오티드 서열에 있어서)은 디폴트로서 11개의 워드 길이 (W), 10의 기대값 (E), M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 이용한다. 아미노산 서열에 있어서는, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3개의 워드 길이 및 10의 기대값 (E)을 이용하며, BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)) 50의 정렬 (B), 10의 기대값, M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 이용한다.

BLAST 알고리즘은 또한, 두 서열간의 유사성의 통계적 분석을 수행한다 (예를 들어, 문헌 [Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 한 측정은 가장 작은 확률 합계 (P(N))이며, 이는 두 누클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 정합이 우연히 발생할 확률을 나타낸다. 예를 들어, 핵산은 시험 핵산의 기준 핵산으로의 비교시 가장 작은 확률 합계가 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는, 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는, 약 0.001 미만인 경우 기준 서열에 유사한 것으로 간주된다.

두 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 지표는, 하기 설명된 바와 같이 첫번째 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드가 두번째 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드에 대해 발생된 항체에 면역학적으로 교차 반응성을 나타낸다는 점이다. 이와 같이, 폴리펩티드는 전형적으로, 예를 들어, 두개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 서로 상이한 경우 제 2 폴리펩티드에 실질적으로 동일하다. 두개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는, 두개의 분자 또는 이들의 보체가 하기 기술된 바와 같은 엄격한 조건하에서 서로 하이브리드화된다는 점이다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는 서열을 증폭하는데 동일한 프라이머가 사용될 수 있다는 점이다.

문구 "선택적으로 (또는 특이적으로) 하이브리드화되는"은 서열이 복잡한 혼합물 (예를 들어, 전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA)중에 존재하는 경우, 엄격한 하이브리드화 조건하에서 특정 누클레오티드 서열로만으로의 분자의 결합, 듀플렉싱 또는 하이브리드화를 나타낸다.

"숙주 세포"는 발현 벡터를 함유하고, 발현 벡터의 복제 또는 발현을 지지하는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 예를 들어, 원핵 세포 예컨대, E.coli 또는 진핵 세포 예컨대, 효모일 수 있다.

III. MET10을 엔코딩하는 핵산

A. 일반적인 DNA 재조합 방법

본 발명은 재조합 및 전통적인 유전학 분야의 일정한 기법에 의존한다. 일반적으로, 하기 기술된 재조합 DNA 기법의 실험실 공정 및 명명법은 널리 공지된 것이며, 당해분야에 공통적으로 사용된다. 표준 기법이 클로닝, DNA 및 RNA 분리, 증폭 및 정제에 사용된다. 일반적으로, DNA 리가아제, DNA 중합효소, 제한 엔도누클레아제 등을 포함하는 효소 반응은 제조업자의 명세서에 따라 수행된다. 본 발명에 사용되는 일반적인 방법을 기재하고 있는 기본 문헌으로는 문헌 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons 1987-2008); and Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)]을 포함한다.

핵산에 있어서, 크기는 킬로베이스 (kb) 또는 염기쌍 (bp)로 나타낸다. 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동, 시퀀싱된 핵산 또는 공개된 DNA 서열로부터의 평가가 이루어 진다. 단백질에 있어서, 크기는 킬로달톤 (kDa) 또는 아미노산 잔기 수로 나타낸다. 단백질 크기는 겔 전기영동, 시퀀싱된 단백질, 유래된 아미노산 서열, 또는 공개된 단백질 서열로부터 평가된다.

시중에서 입수불가능한 올리고누클레오티드는 문헌 [Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)]에 기술된 바와 같이 자동 합성기를 이용하여 문헌 [Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22: 1859-1862 (1981)]에 처음 기술된 고체상 포스포로아미디트 트리에스테르 방법에 따라 화학적으로 합성될 수 있다. 올리고누클레오티드의 정제는 문헌 [Pearson & Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983)]에 기술된 바와 같은 네이티브 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 음이온-교환 HPLC에 의해 수행된다.

클로닝된 유전자 및 합성 올리고누클레오티드의 서열은 예를 들어, 문헌 [Wallace et al, Gene 16:21-26 (1981)]의 이중가닥 주쇄 시퀀싱을 위한 사슬 종결법을 이용하여 클로닝 후 입증될 수 있다.

B. MET10을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 분리하기 위한 클로닝 방법

일반적으로, MET10을 엔코딩하는 핵산 서열 및 관련된 핵산 서열 상동체는 cDNA 및 게놈 DNA 라이브러리로부터 클로닝되거나, 올리고누클레오티드 프라이머로의 증폭 기법을 이용하여 분리된다. 예를 들어, MET10 서열은 전형적으로, 핵산 프로브와의 하이브리드화에 의해 핵산 (게놈 또는 cDNA) 라이브러리로부터 전형적으로 분리되며, 상기 프로브의 서열은 SEQ ID NO:1 또는 이의 서열로부터 유래될 수 있다. MET10 RNA 및 DNA는 효모 균주로부터 분리될 수 있다.

MET10과 실질적으로 동일한 MET10 다형성 변이체, 대립유전자 및 종간 상동체는 라이브러리를 스크리닝함으로써 엄격한 하이브리드화 조건하에서 MET10 핵산 프로브 및 올리고누클레오티드를 사용하여 분리될 수 있다. 대안적으로, 발현 라이브러리를 사용하여, MET10 상동체를 인식하고 선택적으로 결합하는 MET10의 코어 도메인에 대해 제조된 항혈청 또는 정제된 항체로 면역학적으로 발현된 상동체를 검출함으로써 MET10 다형성 변이체, 대립유전자 및 종간 상동체를 클로닝할 수 있다.

cDNA 라이브러리를 제조하기 위해, MET10 mRNA는 효모 균주로부터 정제될 수 있다. 그 후, mRNA는 역전사효소를 사용하여 cDNA로 제조되고, 재조합 벡터로 결찰되고, 증식, 스크리닝 및 클로닝을 위한 재조합 숙주로 트랜스펙션된다. cDNA 아리브러리를 제조하고 스크리닝하는 방법은 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Gubler & Hoffman, Gene 25:263-269 (1983); Sambrook et al., supra; Ausubel et al. supra] 참조).

유전자 라이브러리에 있어서, DNA는 조직으로부터 추출되고, 기계적으로 전단되거나 효소적으로 분해되어 약 1-8kb의 단편을 생성시킨다. 그 후, 이러한 단편은 구배 원심분리에 의해 원하지 않은 크기의 단편으로부터 분리되며, 박테리오파아자 람다 벡터에서 작제된다. 이러한 벡터 및 파아지는 실험관내에서 패키징된다. 재조합 파아지는 문헌 [Benton & Davis, Science 196:180-182 (1977)]에 기술된 바와 같이 플라크 하이브리드화에 의해 분석된다. 콜로니 하이브리드화는 일반적으로 문헌 [Grunstein et al, PNAS USA., 72:3961-3965 (1975)]에 기술된 바와 같이 수행된다.

MET10 핵산 및 이들의 상동체를 분리하는 대안적인 방법은 합성 올리고누클레오티드 프라이머의 사용 및 RNA 또는 DNA 주쇄의 증폭을 조합시킨다 (문헌 [U.S. Patents 4,683,195 and 4,683,202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)] 참조). 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및 리가아제 연쇄 반응 (LCR)과 같은 방법을 이용하여 mRNA, cDNA, 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접 MET10의 핵산 서열을 증폭시킬 수 있다. 퇴화한 올리고누클레오티드는 본원에 제공된 서열을 이용하여 MET10 상동체를 증폭하도록 설계될 수 있다. 제한 엔도누클레아제 부위는 프라이머로 통합될 수 있다. 중합효소 연쇄 반응 또는 다른 실험관내 증폭 방법은 또한, 예를 들어, 발현될 단백질을 클로닝하는 핵산 서열을 코딩하기 위해, 생리학적 샘플에서 mRNA를 엔코딩하는 MET10의 존재를 검출하기 위한 프로브로서 사용하기 위한 핵산을 제조하기 위해, 핵산 시퀀싱을 위해 또는 다른 목적으로도 유용할 수 있다. PCR 반응에 의해 증폭된 유전자는 아가로스 겔로부터 정제되며, 적합한 벡터로 클로닝될 수 있다.

프라이머를 이용한 증폭 기법은 또한, MET10 DNA 또는 RNA를 증폭하고 분리하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, MET10 또는 이의 단편을 엔코딩하는 핵산은 효모 cDNA 라이브러리의 증폭에 의해 수득될 수 있거나, 표 5에 기술된 서열을 갖는 분리된 핵산 프라이머 쌍을 이용하여 효모 RNA로부터 역전사될 수 있다.

이러한 프라이머는 예를 들어, 전장 서열 또는 1 내지 수백개의 누클레오티드의 프로브를 증폭하는데 사용될 수 있으며, 상기 프로프는 후에 전장 MET10에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된다.

MET10의 유전자 발현은 또한, 당해분야에 공지된 기법 예를 들어, mRNA의 역전사 및 증폭, 총 RNA 또는 폴리 A+ RNA의 분리, 노던 블롯, 돗 블롯, 동일계 하이브리드화, RNase 보호, 프로빙 DNA 마이크로칩 어레이 등에 의해 분석될 수 있다.

합성 올리고누클레오티드는 단백질 발현을 위해 또는 프로브로서 사용하기 위해 재조합 MET10 유전자를 작제하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로, 유전자의 센스 및 비-센스 가닥 둘 모두를 나타내는 40-120bp 길이의 일련의 중복 올리고누클레오티드를 사용하여 수행된다. 그 후, 이러한 DNA 단편은 어닐링되고, 결찰되고 클로닝된다. 대안적으로, 증폭 기법은 MET10 유전자의 특이적 서브서열을 증폭하기 위한 정확한 프라이머와 함께 이용될 수 있다. 그 후, 특이적 서브서열은 발현 벡터로 결찰된다. MET10 키메라가 제조될 수 있으며, 이는 예를 들어, MET10 부분과 이종성 MET10 부분을 혼합하여, 키메라의 기능성 MET10을 생성시킨 것이다.

설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자는 전형적으로, 복제 및/또는 발현을 위해 원핵 또는 진핵 세포로 형질변환되기 전에 중개 벡터로 클로닝된다. 이러한 중개 벡터는 전형적으로, 원핵 벡터 예를 들어, 플라스미드 또는 셔틀 벡터이다. 설파이드 불활성 MET10 단백질을 엔코딩하는 분리된 핵산은 설파이드 불활성 MET10 단백질 및 서브서열, 이의 종간 상동체, 대립유전자, 및 다형성 변이체를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 설파이드 불활성 MET10 단백질을 엔코딩하는 분리된 핵산은 SEQ ID NO:1 또는 이의 보체이다.

C. 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드의 발현

클로닝된 유전자 예컨대, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 cDNA의 높은 발현 수준을 달성하기 위해, 전형적으로, 설파이드 불활성 MET10의 핵산 서열을 전사를 유도하는 강한 프로모터, 전사/번역 종결인자 및 단백질을 엔코딩하는 핵산을 위해서는, 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위를 함유하는 발현 벡터로 설파이드 불활성 MET10의 핵산 서열을 서브클로닝한다. 적합한 박테리아 프로모터는 당해분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. and Ausubel et al]에 기술되어 있다. 설파이드 불활성 MET10 단백질을 발현시키기 위한 박테리아 발현 시스템은 예를 들어, E.coli, 바실러스 sp., 및 살모넬라에서 입수가능하다 (Palva et al, Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983)). 이러한 발현 시스템을 위한 키트는 시중에서 입수가능하다. 포유동물 세포, 효모 및 곤충 세포에 대한 진핵 발현 시스템은 당해분야에 널리 공지되어 있으며 시중에서 입수가능하다.

이종성 핵산의 발현을 유도하는데 사용된 프로모터는 특정 적용에 의존적이다. 프로모터는 바람직하게는, 이의 천연 세팅에서 전사 개시 부위로부터 떨어져 있는 것과 거의 동일한 간격으로 이종성 전사 개시 부위로부터 떨어져서 위치한다. 그러나, 당해분야에 공지된 바와 같이, 이러한 간격의 다양한 변화가 프로모터 기능의 손실없이 조절될 수 있다.

프로모터 이외에, 발현 벡터는 전형적으로 숙주 세포에서 핵산을 엔코딩하는 설파이드 불활성 MET10의 발현에 요구되는 모든 추가적인 요소를 함유하는 전사 유닛 또는 발현 카세트를 함유한다. 이와 같이, 전형적인 발현 카세트는 설파이드 불활성 MET10을 엔코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 전사체의 유효한 폴리아데닐화에 요구되는 시그널, 리보좀 결합 부위 및 번역 종결부를 함유한다. 카세트의 추가적인 요소는 인핸서를 포함할 수 있으며, 게놈 DNA가 구조적 유전자로서 사용되는 경우, 작용성 스플라이스 도너 및 어셉터 부위를 갖는 인트론을 포함할 수 있다.

프로모터 서열 이외에, 발현 카세트는 또한, 효과적인 종결을 위해 구조 유전자의 다운스트림에 전사 종렬 영역을 함유하여야 한다. 종결 영역은 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 수득될 수 있거나 다른 유전자로부터 수득될 수 있다.

유전자 정보를 세포로 전달하는데 사용된 특정 발현 벡터는 특별히 중요하지 않다. 진핵 또는 원핵 세포에서 발현에 사용된 통상적인 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 표준 박테리아 발현 벡터는 플라스미드, 예컨대, pBR322 기재 플라스미드, pSKF, pET23D, 및 융합 발현 시스템 예컨대, GST 및 LacZ를 포함한다. 에피토프 태그 예를 들어, c-myc가 또한 재조합 단백질에 부가되어 편리한 분리 방법을 제공한다.

진핵 바이러스로부터의 조절 요소를 함유하는 발현 벡터는 전형적으로, 진핵 발현 벡터 예를 들어, SV40 벡터, 파필로마 바이러스 벡터, 및 엡스테인-바르 바이러스로부터 유래된 벡터에 사용된다. 기타 예시적인 진핵 벡터는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 바쿨로바이러스 pDSVE, 및 SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스 프로모터, 로우스 사르코마 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터 또는 진핵세포의 발현에 효과를 나타내는 다른 프로모터의 유도하에 단백질 발현을 허용하는 기타 벡터를 포함한다.

일부 발현 시스템은 유전자 증폭을 제공하는 마커 예컨대, 티미딘 키나아제, 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라아제 및 디히드로폴레이트 환원효소를 갖는다.

발현 벡터에 전형적으로 포함된 요소는 또한, E.coli에서 작용하는 레플리콘, 재조합 플라스미드를 잠복하고 있는 박테리아를 선택할 수 있게 하는 항생제 내성부를 엔코딩하는 유전자, 및 진핵 서열의 삽입을 허용하는 플라스미드의 비필수 영역의 독특한 제한 부위를 포함한다. 선택된 특정 항생제 내성 유전자는 중요하지 않으며, 당해분야에 공지된 많은 내성 유전자가 적합하다. 원핵 서열은 바람직하게는, 필요에 따라, 진핵 세포에서 DNA의 복제를 간섭하지 않도록 선택된다.

D. 숙주 세포 및 이의 생성 방법

본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 외생성의 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 발현하고 황화수소의 수준을 감소시키거나 황화수소를 생성시키지 않는 숙주 세포를 제공한다. 662번의 아미노산이 트레오닌 또는 세린이 아닌 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 외생성 폴리펩티드는 당해분야에 공지된 방법에 의해 예를 들어, 재조합 또는 유전자 교차 방법을 이용하여 어미 숙주 세포로 유입된다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 설파이드 활성 MET10 폴리펩티드를 발현하지 않는다. 즉, 활성 MET10 폴리펩티드에 대한 코딩 서열이 녹아웃되고, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드에 대한 코딩 서열로 대체되었기 때문이다.

낮은 또는 감소되거나 저하된 수준의 황화수소를 생성하는 숙주 세포는 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 유입하기 전의 어미 균주와 비교할 경우 H₂S를 50% 또는 그 미만으로 생성한다. 일부 구체예에서, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 유입하기 전의 어미 균주와 비교할 경우 낮은 또는 저하된 수준의 황화수소를 생성하는 숙주 세포는 40%, 30%, 25%, 20% 또는 그 미만의 H₂S를 생성한다.

숙주 세포는 예를 들어, 진핵 또는 원핵 세포일 수 있다. 숙주 세포는 박테리아, 포유동물, 효모 또는 곤충 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 효모 세포 예를 들어, S. 세리비시애, 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 야로비아 리폴리티카 (Yarowwia lipolytica) 또는 쉬조사카로마이세스 폼브 (Schizosaccharomyces pombe) 효모 세포이다. 발효 음료 예를 들어, 와인, 포트, 마디에라, 맥주, 샴페인 등의 생성에 사용된 효모 세포 (예를 들어, "와인 효모", "맥주 효모", "샴페인 효모" 등)는 외생성의 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 유입에 사용된다. 발효 음료 제조에 사용하고, MET10 불활성화에 대한 후보인 효모 세포 균주 (즉, 이들은 황화수소 생산체임)는 비제한적으로, 랄레만드 (Lallemand) (Lalvin) (Petaluma, CA; on the web at lallemandwine.us/products/yeast_chart.php) 레드 스타 (Red Star) (on the web at www.redstaryeast.net/), 화이트 랩스 (White Labs) (Boulder, CO; on the web at whitelabs.com/yeast search. html), 더블류이스트 (Wyeast) (Odell, OR; on the web at wyeastlab.com), 키트진거스 (Kitzinger's), 제이. 라포르트 (J. Laffort), 비에르카 (Vierka), 거빈 (Gervin), 에스비 액티브 (SB Active), 유니칸 (Unican), 시에벨 인스트. (Siebel Inst.), 및 퍼멘티스 (Fermentis) (on the web at fermentis.com/FO/EN/00-Home/10- 10_home.asp)를 포함하는 다양한 공급원으로부터 시중에서 입수가능하다. 예를 들어, 와인 및 샴페인 효모 균주의 대표적인 목록에 있어서는, 웹사이트 (the worldwide web at winemaking.jackkeller.net/strains.asp) 및 맥주 효모 균주의 대표 목록에 있어서는, 웹사이트 (byo.com/referenceguide/yeaststrains/) 참조.

일부 구체예에서, 효모 세포 균주는 S. 세레비시애 균주이다. 일부 구체예에서, S. 세레비시애 효모 세포 균주는 예를 들어, 프리스 데 모세, 프리미어 쿠베, 프렌치 레드, 몽타셋, 랄레만드 K1, 보르데욱스, UCD522, UCD940, Ba25, Ba126, Ba137, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bb19 및 Bb22로부터 선택된 와인 효모이다. 예를 들어, 본원에 참조로 통합된 U.S. 특허 제 6,140,108호 참조. MET10 불활성화를 위한 즉, 설파이드 불활성화 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 유입하기 위한 후보자인 추가적인 효모 균주는 표 1, 3 및 4에 기록되어 있다.

표준 트랜스펙션 방법을 이용하여 다량의 설파이드 불활성 MET10 단백질을 발현하는 박테리아, 포유동물, 효모 또는 곤충 세포주를 생성하고, 그 후, 표준 기법을 이용하여 정제한다 (예를 들어, 문헌 [(see, e.g., Colley et al, J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)] 참조). 진핵 및 원핵 세포의 형질변환은 표준 기법에 따라 수행된다 (예를 들어, 문헌 [Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101 :347-362 (Wu et al, eds, 1983)] 참조).

이종 누클레오티드 서열의 숙주 세포로의 유입을 위해 널리 공지된 공정이 이용될 수 있다. 이는 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, 폴리브렌, 프로토플라스트 융합, 일렉트로포레이션, 리포좀, 미세주입, 플라즈마 벡터, 바이러스 벡터, 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 다른 이종 유전자 물질을 숙주 세포로 유입시키기 위해 기타 널리 공지된 방법의 이용을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., supra] 참조). 하나 이상의 유전자를 설파이드 불활성 MET10을 발현할 수 있는 숙주 세포로 성공적으로 유입시킬 수 있는 특정 유전자 조작 공정이 필요하다. 황화수소를 생성하지 않도록 개선된 숙주 세포 (즉, H₂S 비생산체)는 일반적으로, 녹아웃되거나(knocked-out), 대체되거나 변이된 활성 MET10을 가질 것이다. 예를 들어, 어미 균주에서 설파이드 활성 MET10을 엔코딩하는 핵산은 662번 위치에서 아미노산을 엔코딩하는 코돈 (핵산 위치 1984-1986)에서 변이되어 이러한 코돈이 트레오닌 (또는 세린)을 엔코딩하지 못하게 한다. 상동성 재조합 기법이 또한, 본원에 기술된 바와 같이 설파이드 활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산으로 대체시키는데 사용된다. 예를 들어, 도 3 및 문헌 [Baudin, et al., Nucleic Acids Res (1993) 21(14):3329] 참조.

발현 벡터를 세포에 유입시킨 후, 트랜스펙션된 세포를 설파이드 불활성 MET10의 발현에 유리한 조건하에 배양하며, 이는 하기 확인된 표준 기법을 이용하여 배양물로부터 회수된다.

불활성 효소를 엔코딩하는 외생성 MET10 핵산은 또한, 포자 분리, 반대 정합 유형 (opposite mating type)의 포자 정합 및 생성된 디플로이드 균주의 분리의 전통적인 효모 유전자 기법을 이용하여 신규한 유전자 배경으로 전달될 수 있다. 여러차례의 유전자 교차를 이용하여 상이한 균주 배경에서 신규한 MET10 대립유전자를 분리할 수 있다. 재조합 도구는 변형된 균주의 생성에 사용하지 않아도 된다. 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 전통적인 효모 유전자 기법을 이용하여 효모 숙주 세포로 유입시키기 위한 예시적인 방법이 예를 들어, U.S. 특허 6,140,108에 기술되어 있다.

E. MET10 단백질의 정제

천연 또는 재조합 MET10 단백질은 기능 분석에 사용하기 위해 정제될 수 있다. 천연 MET10 단백질은 예를 들어, 효모 또는 MET10 상동체의 다른 공급원으로부터 정제된다. 재조합 MET10은 적합한 발현 시스템으로부터 정제된다.

MET10은 암모늄 설페이트와 같은 물질과의 선택 침전; 칼럼 크로마토그래피, 면역정제법 및 기타를 포함하는 표준 기법에 의해 실질적으로 순수한 형태로 정제될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); U.S. Patent No. 4,673,641; Ausubel et al, supra; and Sambrook et αl., supra] 참조).

재조합 MET10 단백질이 정제되는 경우 많은 공정이 이용될 수 있다. 예를 들어, 확립된 분자 접착 특성을 갖는 단백질은 역으로 MET10에 융합될 수 있다. 적합한 리간드로, MET10은 선택적으로 정제 칼럼에 흡착되고, 비교적 순수한 형태로 칼럼으로부터 유리된다. 그 후, 융합된 단백질은 효소 활성에 의해 제거된다. 최종적으로, MET10은 면역친화도 칼럼을 이용하여 정제될 수 있다.

IV. 효모 균주가 MET10 핵산 서열을 검출함으로써 H ₂ S를 생성할 것인지의 여부 결정

본 발명의 일 구체예에서, 특정 효모 균주가 H₂S 생산체인지의 여부를 결정하는 방법이 제공된다. 본 발명의 방법에 따라, 효모 균주의 MET10 대립유전자가 분석되고, 본원에 기술된 MET10 대립유전자와 비교되어 효모 균주가 높은, 낮은 또는 비-H₂S 생산체인지를 결정한다. 특정 MET10 대립유전자의 존재 또는 부재의 결정은 일반적으로, 분석할 효모 (예를 들어, 사카로마이세스 속)로부터 수득된 핵산 샘플을 분석함으로써 수행된다. 종종, 핵산 샘플은 게놈 DNA를 포함한다. 또한, MET10 대립유전자의 존재에 대해 RNA 샘플을 분석하는 것이 가능하다.

단일 염기 변화의 존재에 대한 핵산 평가를 위한 검출 기법은 분자 유전학 분야에 널리 공지된 공정을 포함한다. 또한, 많은 방법이 핵산의 증폭을 포함한다. 이러한 방법을 수행하기 위한 광대한 지침은 당해분야에 제공되어 있다. 예시적 참조로는 매뉴얼 예컨대, [PCR Technology: PRINCIPLES AND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N. Y., 1992); PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS (eds. Innis, et al, Academic Press, San Diego, Calif, 1990); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, 1994-2008, Wiley Interscience, including supplemental updates through April 2004; Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd Ed, 2001)]을 포함한다.

당해분야에 널리 공지된 단일 염기 변화를 검출하는 방법은 여러 일반적인 프로토콜중 하나를 수반한다: 서열-특이적 올리고누클레오티드를 이용한 하이브리드화, 프라이머 연장, 서열-특이적 결찰, 시퀀싱 또는 전기영동 분리 기법, 예를 들어, 단일-가닥 구조 다형성 (SSCP) 및 헤테로듀플렉스 분석. 예시적인 검정은 5' 누클레아제 검정, 주쇄 유도된 염색-종결인자 혼입, 분자 베아콘 대립유전자-특이적 올리고누클레오티드 검정, 단일-염기 연장 분석, 및 실시간 피로포스페이트 서열에 의한 SNP 스코어링을 포함한다. 증폭된 서열의 분석은 다양한 기법 예컨대, 마이크로칩, 형광 분극화 검정 및 매트릭스-보조된 레이저 탈착 이온화 (MALDI) 질량 분광계를 이용하여 수행될 수 있다. 단일 염기 변화를 검출하기 위해 핵산 샘플 분석에 빈번하게 사용된 이러한 방법들 이외에, 당해분야에 임의의 공지된 방법을 사용하여 본원에 기술된 MET10 변이의 존재를 검출할 수 있다.

이러한 방법이 전형적으로, PCR 단계를 이용하지만, 다른 증폭 프로토콜 또한 이용될 수 있다. 적합한 증폭 방법은 리가아제 연쇄 반응 (예를 들어, 문헌 [Wu & Wallace, Genomics 4:560-569, 1988]; 가닥 변위 검정 (예를 들어, 문헌 [Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396, 1992; U.S. Pat. No. 5,455,166] 참조); 및 U.S. 특허 5,437,990; 5,409,818; 및 5,399,491에 기술된 방법을 포함하는 수개의 전사-기초 증폭 시스템; 전사 증폭 시스템 (TAS) (Kwoh et ah, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177, 1989); 및 자가-지속 서열 복제 (3SR) (Guatelli et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878, 1990; WO 92/08800)를 포함한다. 대안적으로, 검출가능한 수준으로 프로브를 증폭시키는 방법 예컨대, Qβ-복제효소 증폭법 (Kramer & Lizardi, Nature 339:401-402, 1989; Lomeli et al., Clin. Chem. 35: 1826-1831, 1989)이 이용될 수 있다. 공지된 증폭 방법에 대한 고찰은 예를 들어, 문헌 [Abramson and Myers in Current Opinion in Biotechnology 4:41-47, 1993]에 제공되어 있다.

일부 구체예에서, MET10 대립유전자는 올리고누클레오티드 프라이머 및/또는 프로브를 사용하여 검출된다. 올리고누클레오티드는 화학 합성을 포함한 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 올리고누클레오티드는 시중에서 입수가능한 시제 및 장치를 이용하여 합성될 수 있다. 대안적으로, 이들은 시중의 공급원을 통해 구입될 수 있다. 올리고누클레오티드를 합성하는 방법은 당해분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Narang et al, Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; Brown et al, Meth. Enzymol. 68: 109-151, 1979; Beaucage et al, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862, 1981; and the solid support method of U.S. Pat. No. 4,458,066] 참조).

A. MET10 대립유전자의 PCR 확인

일부 구체예에서, PCR은 MET10 대립유전자를 엔코딩하는 핵산을 증폭하는데 사용된다. 적용가능한 기법의 일반적인 개관은 PCR 프로토콜에서 찾아볼 수 있다: A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds. (1990)) and PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Erlich, ed. (1992)). 또한, 증폭 기법은 U.S. 특허 4,683,195 및 4,683,202에 기술되어 있다.

PCR은 표적 핵산 예를 들어, MET10을 엔코딩하는 핵산의 복사 및 결과적으로 증폭을 허용한다. 간단하게는, 표적 핵산 예를 들어, 해당 효모 균주를 포함하는 샘플로부터의 DNA는 센스 및 안티센스 프라이머, dNTP, DNA 중합효소 및 기타 반응 요소와 혼합된다 (Innis et al., supra). 이러한 센스 프라이머는 해당 DNA 서열의 안티센스 가닥에 어닐링될 수 있다. 안티센스 프라이머는 센스 프라이머가 DNA 표적에 어닐링되는 위치의 다운스트림에서 DNA 서열의 센스 가닥에 어닐링될 수 있다. 첫회 증폭에서, DNA 중합효소는 표적 핵산에 어닐링되는 안티센스 및 센스 프라이머를 연장시킨다. 제 1 가닥은 무차별한 길이의 긴 가닥으로서 합성된다. 두번째 증폭에서, 안티센스 및 센스 프라이머는 어미 표적 핵산 및 긴 가닥상의 보체 서열에 어닐링된다. 그 후, DNA 중합효소는 어닐링된 프라이머를 연장시켜 서로 상보적인 별개 길이의 가닥을 형성시킨다. 후속 증폭은 별개 길이의 DNA 분자를 주로 증폭시키는 작용을 한다.

일반적으로, PCR 및 증폭의 기타 방법은 해당 DNA의 말단에 어닐링되는 프라이머를 이용한다. 예를 들어, MET10 대립유전자 또는 이의 단편을 엔코딩하는 핵산은 표 5의 서열을 갖는 분리된 핵산 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있다.

B. 증폭된 생성물의 검출

증폭된 생성물은 예를 들어, 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 분석; 변성 겔 전기영동 (예를 들어, 문헌 [Erlich, ed., PCR TECHNOLOGY, PRINCIPLES AND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION1 W. H. Freeman and Co, New York, 1992, Chapter 7] 참조), 직접 시퀀싱 및 HPLC-기초 분석을 포함한 당해분야에 공지된 임의의 수단을 이용하여 검출될 수 있다. 적합한 서열 방법은 예를 들어, 디데옥시 시퀀싱-기초 방법 및 막삼 앤 길버스 시퀀스 (Maxam and Gilbert sequence)를 포함한다 (Sambrook and Russell, supra). 적합한 HPLC-기초 분석은 예를 들어, 문헌 [Premstaller and Oefner, LC-GC Europe 1-9 (July 2002); Bennet et ah, BMC Genetics 2: 17 (2001); Schrimi et ah, Biotechniques 28(4):740 (2000); and Nairz et ah, PNAS USA 99(16): 10575-10580 (2002)]에 기술된 바와 같은 변성 HPLC (dHPLC); 및 예를 들어, 문헌 [Oberacher et ah; Hum. Mutat. 21(1):86 (2003)]에 기술된 바와 같은 이온쌍 역상 HPLC-전기분무 이온화 질량 분광법 (ICMES)를 포함한다. MET10 대립유전자에서 단일 염기 변화를 특징화하는 또 다른 방법은 예를 들어, 단일 염기 연장 (예를 들어, 문헌 [Kobayashi et al, Mol. Cell. Probes, 9: 175-182, 1995] 참조); 에를 들어, 문헌 [Orita et al, Proc. Nat. Acad. ScL 86, 2766-2770 (1989)]에 기술된 바와 같은 단일-가닥 구조 다형성 분석, 대립유전자 특이적 올리고누클레오티드 하이브리드화 (ASO) (예를 들어, 문헌 [Stoneking et ah, Am. J. Hum. Genet. 48:70-382, 1991; Saiki et al, Nature 324, 163-166, 1986; EP 235,726; and WO 89/11548] 참조); 및 예를 들어, WO 93/22456; U.S. 특허 5,137,806; 5,595,890; 5,639,611; 및 U.S. 특허 4,851,331에 기술된 바와 같은 서열-특이적 증폭 또는 프라이머 연장 방법; 문헌 [U.S. Pat. Nos. 5,210,015; 5,487,972; and 5,804,375; and Holland et ah, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280]에 기술된 바와 같은 5'-누클레아제 검정을 포함한다.

V. 발효 음료에서 H ₂ S 수준을 감소시키는 방법

본원에 기술된 MET10 핵산 서열을 포함하는 효모 균주는 발효 음료(예를 들어, 와인 및 맥주)에서 H₂S 수준을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 본원에 기술된 바와 같은 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 외생성 핵산 서열로 형질변환된 효모 세포는 발효 매질 (예를 들어, 머스트 또는 맥아즙)과 접촉되고, 혼합물은 발효를 진행시키기에 적합한 온도 (예를 들어, 70-75℉)에서 적합한 제 1 발효 용기 (예를 들어, 탱크, 바렐, 크록, 항아리, 들통 또는 폴리에틸렌 컨테이너)에서 적합한 시간 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14 일) 동안 인큐베이션된다. 그 후, 액체는 제 2 발효 용기로 이동될 수 있다. 제 2 용기는 밀봉되거나 밀봉되지 않을 수 있으며, 내용물은 혐기성 발효 및 숙성이 진행되기에 적합한 온도 (예를 들어, 약 60-65℉)에서 적합한 시간 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 주) 동안 인큐베이션된다. 그 후, 액체는 래킹 (racking) (즉, 분류)을 위해 제 3 용기로 전달된다. 제 3 용기는 밀봉되고, 퇴전물은 적합한 시간 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 주) 동안 침전된다. 래킹은 발효 음료를 바틀링 (bottling)하기 전에 1, 2, 3 또는 그 초과의 횟수로 반복될 수 있다. 천연 MET10 대립유전자는 재조합 DNA 기법을 이용하여 대체되거나 전통적인 브리딩 기법을 통해 교차될 수 있다. UCD932 MET10 대립유전자는 BiGGY 아가에 백색 콜로니 색상을 부여하며, 이는 대립유전자가 유전자 교차되고, 균주의 성공적인 이식을 입증하기 위해 생성 동안 용이하게 스크리닝될 수 있게 하다.

와인이 투명하면, 모든 발효 및 사전-바틀 숙성은 중단되고, 와인 바틀로부터 사이펀(siphon)처리하고, 바틀을 확실하게 코르크로 막는다. 코르크 마개 버틀을 3-5일 동인 위로 세워 방치하고, 이들을 샘플링 전에 눕혀서 55℉에서 6개월 (화이트 와인) 내지 1년 (레드 와인) 동안 저장한다. 예상치에 이르지 못한 경우, 또 다른 일년 또는 더 많이 숙성시킨다.

효모는 예를 들어, 문헌 [Liac/SS carrier DNA/PEG method described by Gietz and Woods Methods in Enzymology 350: 87-96 (2002); Agatep et al, Technical Tips Online Transformation of Saccharomyces cerevisiae by the lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol (LiAc/ss- DNA/PEG) protocol (1998)]에 기술된 Liac/SS 캐리어 DNA/PEG 방법; 및 문헌 [Gietz et al., Mol Cell Biochem 172:67-79 (1997)]에 기술된 효모 2 하이브리드 방법을 포함하는 당해분야에 공지된 방법을 이용하여 형질변환된다. 형질변환에 적당한 효모 세포를 제조하는 방법은 예를 들어, 문헌 [Dohmen et al. (1991) Yeast 7: 691-692]에 기술되어 있다.

VI. 키트

MET10 및 이의 상동체는 낮은 H₂S 생산체인 효모 균주의 더욱 특이적이고 민감한 확인에 유용한 도구이다. 예를 들어, MET10 핵산에 특이적으로 하이브리드화하는 핵산 예컨대, MET10 프로브 및 프라이머 (예를 들어, 표 5에 기재된 바와 같은), MET10 핵산 (예를 들어, 도 2에 기재된)은 낮은 H₂S 생산체인 효모 균주를 확인하는데 사용된다.

본 발명은 또한, 본원에 기술된 MET10 대립유전자를 검출하기 위한 키트 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 반응 요소의 일부 또는 전부의 분취물을 갖는 하나 이상의 반응 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 분취물은 액체 또는 건조된 형태일 수 있다. 반응 용기는 동일한 용기에서의 오염, 처리 및/또는 샘플의 증폭을 허용하는 샘플 처리 카트리지 또는 다른 용기를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 본 발명의 증폭 생성물의 표준 또는 휴대용 증폭기로의 용이한 검출을 가능하게 한다. 키트는 또한, 표적 샘플의 증폭 및 증폭 조정을 위해 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.

키트는 예를 들어, 하나 이상의 MET10 대립유전자를 증폭시키기에 충분한 프라이머, 및 폴리누클레오티드 서열을 증폭시키고 검출하기 위한 하나 이상의 프로브를 포함하는 증폭 시제를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 누클레오티드 (예를 들어, A, C, G 및 T), DNA 중합효소 및 적합한 완충제, 염 및 증폭 반응을 촉진하기 위한 기타 시제를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 키트는 문헌 [Bel grader, et al., Biosensors and Bioelectronics 14:849-852 (2000); Belgrader, et al., Science, 284:449-450 (1999); and Northrup, M. A., et al. "A New Generation of PCR Instruments and Nucleic Acid Concentration Systems" in PCR PROTOCOLS (Sninsky, JJ. et al (eds.)) Academic, San Diego, Chapter 8 (1998))]에 기술된 바와 같은 샘플의 신속한 증폭에 유용한 샘플 처리 카트리지와 같은 용기를 포함한다.

하기 실시예는 설명을 위한 것이며 청구된 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: H ₂ S 생성에 영향을 미치는 유전자 확인

H₂S가 형성되는 메카니즘 및 경로를 더욱 잘 이해하기 위해, 그리고, 앞으로의 억제 또는 조절 기법을 개발하기 위해, 4,827개 변이체로 이루어진 효모 결실 균주 세트의 스크리닝을 수행하여 H₂S 생성에 영향을 끼치는 유전자를 확인하였다. 와인 발효의 천연 분리물의 수집물 (Mortimer 1994)을 콜로니 색상 대 실제 H₂S 생 성의 치우침 (bias)의 기초를 규정하기 위해 스크리닝하였다. 또한, 변이되는 경우, H₂S 형성을 증가시키는, 어미 균주가 H₂S 비생산체인 효모 무변이체 수집물을 스크리닝하였다. 이러한 변이의 H₂S 형성에 대한 가능한 부가적인 효과를 평가하였다.

재료 및 방법

효모 균주 및 배양 조건. 본 연구에 사용된 효모 균주 및 이의 결과를 표 1의 목록에 나타내었다. 효모 균주를 유지시키고, 2% 글루코오스를 갖는 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 배지 (YPD)에서 성장시켰다 (Sherman et al. 1974). 제네티신 (G418, 0.2mg/ml)을 갖는 동일한 배지 (YPD)를 G418^R 마커를 수반하는 결실 균주의 유지에 이용하였다.

DNA 및 유전자 조작. 교차 분석, 포자형성(sporulation) 분석 및 사분자(tetrad) 분석을 포함하는 유전자 조작을 표준 절차(Gunthrie 1991)를 사용하여 수행하였다. 유전자 결실을 업스트림 전방향 프라이머 내부 역방향 프라이머를 사 용하는 PCR에 의해 확인하였다. KanMX 파괴 마커-JKKanRE에 대한 업스트림 전방향 프라이머 및 내부 역방향 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 확인하였다. 증폭 조건은 하기와 같았다: 2분 동안 94℃, 45초 동안 92℃, 30초 동안 56℃, 1분 동안 72℃ 및 마지막 연장부인 7분 동안 72℃의 30회 사이클. 프라이머 서열은 표 5에 기재되어 있다.

결실 세트 및 네이티브 균주의 스크리닝. 결실 세트(오픈 바이소시스템즈(Open Biosystems, Huntsville, AL)) 및 네이티브 분리물의 수집물을 비스무트 글루코스 글리신 효모 아가인 BiGGY 아가 상에서 스크리닝하였다(Nickerson 1953). 그것들을 또한 초기에 123mg의 질소 등가물/ℓ을 지닌 합성 포도 쥬스 배지 "미니멀 머스트 미디어(Minimal Must Media)" (MMM) (Spiropoulos et al. 2000)로 스크리닝하였다. 질소 수준을 0.2g의 L-아르기닌/ℓ 및 0.5g의 암모늄 포스페이트/ℓ를 사용하여 생성시켰다.

황화수소 형성의 분석. 황화수소 생성을 아세트산납 방법을 사용하여 평가하였다(Spiropoulos et al. 2000; Giudici, P., and R. E. Kunkee, 1994). 황화수소 형성은, 미리 50μL의 5% 아세트산납 용액으로 처리되고, 실온으로 건조된 페이퍼 스트립(2 x 10 cm, 3mm 와트만 여과지)을 사용하여 초기에 검출하였다. 아세트산납 스트립을 반으로 접고, 스트립의 한 말단을 고정시키는 배양 튜브 캡을 갖는 50mL 배양 튜브에 넣어 액체 배지에 대해 기체 환경에서 아세트산납 스트립의 중간 부분을 감쌌다. 황화수소 형성을 아세트산납 스트립의 흑화도(degree of blackening)에 의해 정성적으로 측정하였다. 이 스크리닝은 캐리 핀들레톤(Carrie Findleton)에 의해 그녀의 MS 이론 논설의 일부로서 수행되었다.

보다 민감한, 반정량적 방법(semi-quantitative method)을 사용하여 모든 포지티브를 확인하였다. 와트만 여과지 스트립(1.5 x 8.0 cm, 3mm)을 감아서, 1ml의 무수은구(bulb-less) 플라스틱 피펫에 넣고, 250μl의 3% 아세트산납 용액으로 처리하였다. 상기 여과지를 실온에서 건조시키고, 이후 플라스틱 아세트산납 컬럼을 실리콘 마개가 있는 50mL 배양 튜브에 결합시켰다. 황화수소 형성을 상기 여과지의 흑화된 mm에 의해 측정하였다.

이후 실험에서는, H₂S 생성을 정량화하기 위해, 패킹된 아세트산납 컬럼들을 사용하였으며, 각 컬럼 상의 흑화 mm는 4μg/L H₂S로 나타났다. 아세트산납 컬럼들은 피가사 인터내셔널 인코포레이티드(Figasa International Inc. Seoul, Korea)로부터 구입하였다.

발효 조건. 황화수소 형성에 영향을 주는 영양 조건 및 효모 균주를 확인하기 위해, 효모 배양물을 125rpm의 진탕 테이블 상에서 25℃에서 50mL 배양 튜브내 5mL의 변형된 트리플 M 배지(Triple M Medium)에서 성장시켰다. 합성 포도 쥬스 배지 "미니멀 머스트 미디엄"(MMM) (Giudici et al. 1993)을 사용하고, 원래의 레시피로부터 변형하여 7개의 상이한 질소 및 미량영양원소 조성물을 생성하였다. 아르기닌, 암모늄 포스페이트, 및 카사미노산 첨가를 조작하여 질소 농도를 조절하고, YNB (아미노산 및 암모늄 설페이트 없는 효모 질소 베이스) 첨가를 조절하여 영양소 및 비타민 농도를 조절하였다. 트리플 M 개질화가 표 2에 기재되어 있다.

표 2. 변형된 트리플 M 배지 조성물
MMM 다양성	아르기닌 (g/ℓ)	암모늄 포스페이트 (g/ℓ)	카사미노산 (g/ℓ)	YNB (g/ℓ)
433g 질소 등가물/ℓ	0.8	1	2	1.7
123g 질소 등가물/ℓ	0.2	0.1	2	1.7
123g 질소 등가물/ℓ 및 1/5 YNB	0.2	0.1	2	0.34
65g 질소 등가물/ℓ, 무 카사미노산	0.2	0.03	0	1.7
65g 질소 등가물/ℓ	0.107	0.015	1	1.7
65g 질소 등가물/ℓ 및 1/2 YNB	0.107	0.015	1	0.85
65g 질소 등가물/ℓ 및 1/3 YNB	0.107	0.015	1	0.567

효모 접종물(yeast inocula)을 플레이팅된 효모 콜로니로부터 얻었다. 이 과정이 접종시 세포 수에서 약간 변동을 초래할 수 있으나, 예비 스크리닝 과정에 포함되는 많은 수의 효모 균주로 인해 필요하였다. 황화수소 형성을 아세트산납의 흡화도에 의해 4일 후에 평가하였다. 4일내에 성장하지 않은 균주는, 성장의 부재를 초래한 다른 변수가 없었는 지에 대해 반복하여 확인하였다.

주목되는 선택된 균주에 대해, 황화수소 형성을 아세트산납 컬럼을 사용하여 정량화하였다. 이를 위해, 플라스크의 상부가 고무 마개로 막힌 아세트산납 컬럼과 함께, 300mL MMM을 함유하는 500-mL 에른마이어 플라스크(Erlenmeyer flask)에서 발효를 수행하였다. 이를 위해, 저농도 포도 쥬스 조건에 보다 정확하게 대항하기 위해서 123mg/L 질소 MMM를 사용하였다. 동일한 조성의 트리플 M 배지 중에서 예비성장된 배양물로부터 고정상 세포와의 접종에 의해 1.33 x 10⁵ 세포/ml의 밀도로 발효를 개시하였다. 발효를 3회 수행하고, 25℃ 및 120rpm에서 인큐베이션하고, 7일에 걸쳐 아세트산납 컬럼 상의 흑화 및 중량 손실에 의한 모니터링을 하였다.

BiGGY 아가 상에서의 결실 세트 및 네이티브 분리물의 스크리닝. 결실 균주 및 네이티브 분리물의 H₂S 생성을 평가하기 위해, 이들을 초기에 모두 BiGGY 아가 상에서 플레이팅시키고, 콜로니의 색상을 평가하였다. 콜로니 색상은 백색, 연황갈색, 황갈색(결실 세트 어미의 균주 색상), 연갈색, 갈색 또는 흑색이었다(Linderholm et al. 2006). 결실 세트로부터, 네개의 콜로니는 백색, 258개의 콜로니는 연황갈색, 4478개의 콜로니는 황갈색, 59개의 콜로니는 연갈색, 28개의 콜로니는 갈색, 그리고 하나의 콜로니가 밝은 색상에서 흑색까지의 콜로니 색상 범위에 이르는 흑색이었다.

합성 쥬스 중의 네이티브 및 상업적 분리물의 스크리닝. 30개의 네이티브 분리물을 123mg/L의 질소를 지닌 합성 쥬스 MMM으로 스크리닝하여 콜로니 색상에 대한 H₂S 생성을 평가하였다. 비-H₂S-생산체(즉, UCD932, UCD713 UCD819, UCD938, UCD942, UCD954 및 UCD956)는 백색에서 연갈색 범위의 콜로니 색상을 지녔다. H₂S 를 생성하는 균주는 연황갈색(3)에서 황갈색(10), 연갈색(5), 갈색(5)으로의 색상 범위를 지녔다. 가장 어두운 콜로리(갈색)는 H₂S가 2-6mm 범위였고, 생성은 중간 범위였다. 세개의 최고 생산체(10mm 초과)는 BiGGY 상에서 연황갈색, 황갈색 및 연갈색이었다. BiGGY 상의, 그리고 MMM에서의 네이티브 분리물이 하기 표 3에 기재된다.

실시예 2: UCD932의 METlO 대립유전자의 돌연변이 확인

상기 실시예 1에서 언급된 바와 같이, UCD932는 다양한 환경 조건 하에서 황화수소를 검출불가능할 정도로 거의 생성하지 않는 효모로서 확인되었다. 또한, 상기 균주는 낮은 설파이트 환원효소 활성과 관련된, BiGGY 아가 상에서의 백색 콜로니를 생성하였다. 에스. 세레비시애(S. cerevisiae)에 대한 균주의 결실 세트의 스크리닝은 백색 콜로니를 유도하는 4개의 가능한 돌연변이를 산출하였으며, 이들 모두는 설파이트 환원효소의 성분을 엔코딩한다. 유전자 교차는, UCD932에서 백색 콜로니 BiGGY 표현형은 METlO 유전자의 변경으로 인해 기인한 것임을 밝혀냈다. METlO 결실 균주는 메티오닌 영양요구체(methionine auxotroph)였으나, UCD932는 메티오닌 영양요구체가 아니었으며, 이는 설파이트 환원효소 활성이 여전히 상기 세포에 의해 보유됨을 나타내는 것이다. 이러한 낮은 설파이드 생성력의 유전적 베이스(genetic basis)를 정의하기 위해, 에스. 세레비시애에서 H₂S의 억제에 역할을 할 가능성이 있는 것으로서 확인된, 설페이트 환원 경로에서의 METlO 및 수개의 그 밖의 유전자(Linderholm et al. 2006)를 시퀀싱하였다. 이는 바람직하지 않은 설파이드 특징을 제거하기 위해 H₂S 생성 와인 균주에서 대체될 수 있는 대립유전자를 확인시켜 줄 수 있다.

물질 및 방법

효모 균주 및 배양 조건. 본 연구에 사용된 효모 균주가 표 4에 나열된다. 효모 균주를 2% 글루코스를 지닌 효모 추출 펩톤 덱스트로스 배지(YPD) 상에서 유지시키고, 성장시켰다(Sherman et al. 1974). 제네티신(geneticin)(G418, 0.2mg/ml) 또는 하이그로마이신(hygromycin)(Hph, 0.3mg/ml)을 지닌 동일 배지(YPD)를 G418^R 또는 HphMX 마커를 지닌 결실 균주를 유지시키는데 사용하였다. 최소 배지(YNB)는 아미노산 없이 0.67% 효모 질소 베이스로 제조하고, 권장되는 바와 같이 카사미노산을 보충하였다(Sherman). 선택적-부합 중퇴 배지(selective-met dropout media)는 메티오닌 없이 YNB와 유사하게 제조되었다.

결실 세트의 스크리닝. 결실 세트(오픈 바이소시스템즈(Open Biosystems, Huntsville, AL))를 비스무트 글루코스 글리신 효모 아가인 BiGGY 아가 상에서 스크리닝하였다(Nickerson 1953). 각각의 균주를 BiGGY 아가로 플레이팅하고, 30℃ 에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 형성되는 콜로니를 색상에 대해 평가하였다.

서열 분석. METlO, H0M2, H0M6, SER33, METl, MET5 및 MET8의 서열 분석을 169개의 효모의 네이티브 및 산업적 균주에서 수행하였다. 염색체 DNA를 스매시(smash) 및 그랩(grab) 프로토콜(Hoffman and Winston 1987)을 사용하여 세포 펠릿으로부터 추출하고, 하이 피델리티 플래티뮴 태크(High Fidelity Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 METlO에 대해 프라이머 PCR-METlO-F/PCR-METlO-R, H0M2에 대해 HOM2-F/HOM2-R, HOM6에 대해 HOM6-F/HOM6-R, SER33에 대해 SER33-F/SER33-R, MET1에 대해 MET1-F/MET1-R, MET5에 대해 MET5-F/MET5-R 및 MET8에 대해 MET8-F/MET9-R를 사용하여 증폭시켰다(표 5). 증폭 조건은 하기와 같았다: 1분 동안 94℃, 30초 동안 94℃, 30초 동안 50℃, 4분 동안 68℃ 및 마지막 연장부로 7분 동안 68℃의 30회 사이클.

표 5. PCR 프라이머

모든 시퀀싱은 캘리포니아 유니버시티, 데이비스(University of California, Davis)의 컬리지 오브 바이올로지컬 사이언시스 시퀀싱 퍼실리티(College of Biological Sciences Sequencing Facility)에서 ABI 3730 모세관 전기영동 유전자 분석기 및 ABI 빅다이 터미네이터 버전 3.1 사이클 시퀀싱 케미스트리(ABI BigDye Terminator version 3.1 cycle sequencing chemistry) (Foster City, CA)를 사용하여 수행하였으며, 사용된 프라이머는 표 6에 열거되어 있다. 서열 데이타를 바이오에딧트 시퀀스 얼라인먼트 에디터(BioEdit sequence Alignment Editor)(버전 5.0.9; Nucleic Acids Symp. Ser. 41 :95-98)로 편집하고 분석하였다.

표 6 MET 시퀀싱 프라이머

이들 서열에 대한 진뱅크 수탁 번호(GenBank Accession number)는 다음과 같다: UCD932 METlO (EF058164), UCD938 MET10 (EF058165), UCD939 MET10 (EF058166), UCD940 METlO (EF058167), UCD942 METlO (EF058168), UCD956 (EF058169), UCD522 METlO (EF058170), UCD957 METlO (EF058171), UCD934 MET10 (EF058172), UCD95O MET10 (EF058173), UCD932 SER33 (EF058174), UCD939 SER33 (EF058175), UCD940 SER33 (EF058176), UCD956 SER33 (EF058177), UCD950 SER33 (EF058178), UCD932 H0M6 (EF058179), UCD932 MET1 (EF058180), UCD939 MET1 (EF058181), UCD940 MET1 (EF058182), UCD950 MET1 (EF058183), UCD956 MET1 (EF058184), UCD956 MET5 (EF058185), UCD932 MET5 (EF058186), UCD940 MET5 (EF058187), UCD939 MET5 (EF058188), UCD932 MET8 (EF058189), UCD939 MET8 (EF058190), UCD940 MET8 (EF058191), UCD950 MET8 (EF058192), UCD956 MET8 (EF058193).

유전자 조작. 교차 분석, 포자형성 분석 및 사분자 분석을 포함하는 유전자 조작을 표준 절차(Gunthrie 1991)를 사용하여 수행하였다.

플라스미드, DNA 조작, 및 형질변환 방법. 플라스미드 pAL51 (METlO ^S288C), pAL52 (METlO ^UCD932)를 본 연구에 사용하였다. 제한 부위 BamHI 및 SacII를 지닌 프라이머, PCR-MET1O-F/PCR-MET1O-R(표 5)를 설계하여 효모 균주 UCD932 및 S288C 염색체 DNA (Invitrogen, Carlsbad, CA)로부터 METlO를 증폭시켰다. 플라스미드 pYC130 (Olesen et al. 2000)는 BamHI 및 SacII로 분해되어(New England Biolabs, Ipswich, MA) METlO를 결찰시키는 선택성 마커 G418^R를 지닌 동원체 벡 터(centromeric vector)이다. 형성되는 플라스미드, pAL51 (METlO ^S288C), pAL52 (METlO ^UCD932)를 형질변환에 사용하였다. METlO의 유전자를 도 3의 PCR-기재 기술(Baudin 1993)을 사용하여 결실시켰다. MET10의 한 측상에 비-코딩 영역의 오버행(overhange)을 지닌 KanMX 함유 결실 카세트(효모 결실 콜렉션(Yeast Deletion collection))를 프라이머, METlO-F-KO/MET1O-R-KO를 사용하여 PCR 증폭시키고, 선형 PCR 단편을 효모 디플로이드 균주(yeast diploid strain), UCD522, UCD932, UCD939, UCD940 및 UCD950로 형질변환시켰다. 상동 재조합(homologous recombination)에 의해, 무손상 METlO의 한 복사체를 METlO의 무손상 복사체 및 KanMX 마커 둘 모두의 복사체를 지닌 녹아웃 카세트 생성 균주로 대체하였다. UCD522MET10/KanMX를 제외한 모든 균주를 이후 포자형성시키고, G418^R에 상동성인 것들을 추가 실험에 사용하였다. 유전자 결실을 KanMX 파괴 마커-JKKanRE에 대한 업스트림 전방향 프라이머 및 내부 역방향 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인하였다.

UCD522 MEr70/KanMX 중의 METlO의 나머지 무손상 복사체를 녹아웃시키기 위해, HphMX 카세트를 프라이머 MET10-hphMX-F/MET10-hphMX-R를 사용하여 BamHI 선형화된 pYC140(Hansen et al. 2003)로부터 증폭시키고, 선형 PCR 단편을 ALY29으로 형질변환시켰다. G418^R 및 Hph^R 둘 모두를 나타내는 메티오닌 영양요구 콜로니를 선택하고, HphMX 결실을 HphMX 파괴 마커-HYGROB CHK_R에 대한 업스트림 전방향 프 라이머 및 내부 역방향 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인하였다.

METlO의 대립유전자를 PCR 기재 기술을 사용하여 변환시켰다(도 3)(Baudin 1993). METlO의 대립유전자를 프라이머 MET10-F-KO/MET10-R-KO를 사용하여 S288C, UCD932, UCD939, UCD940, UCD950 및 UCD522로부터 증폭시켰다. 이후, S288C 및 UCD932로부터의 선형 PCR 단편을 메티오닌 영양요구 균주에 형질변환시켰다. 나머지 단편을 개개의 균주에 형질변환시켜 상응하는 대조 균주를 생성하였다.

메티오닌 영양요구 플레이트 상에서의 성장 능력을 보이는 균주를 선택하고, 포자형성시켜 추가 실험을 위한 METlO에 상동성인 균주를 생성시켰다. 에스. 세레비시애(S. cerevisiae)를 쉬에틀(Schiestl) 및 기에츠(Gietz)(1989)의 방법으로부터 변형된 리튬 아세테이트 방법을 사용하여 형질변환시키고, E. coli를 이노우에(Inoue) 등(1990)에 의해 기술된 방법을 사용하여 형질변환시켰다. E. coli INVαF'(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 플라스미드 제조에 사용하였다. 암피실린(ampicillin)을 지닌 루리아-버타니(Luria-Bertani) 배지(Miller 1972)를 형질변환된 E. coli 세포를 선택하는데 사용하였다.

발효 조건. 발효 실험에서는, 208mg의 질소 등가물/ℓ을 지닌 합성 포도 쥬스 배지 "미니멀 머스트 미디엄"(MMM) (Giudici et al. 1993)을 사용하였다. 질소 수준을 0.2g의 L-아르기닌/ℓ 및 0.5g의 암모늄 포스페이트/ℓ를 사용하여 생성시켰다. MMM 출발 배지에서 예비 성장된 배양물로부터의 고정상 세포와의 접종에 의해 1.33 x 10⁵ 세포/ml의 밀도로 발효를 개시하였다. 발효는 300mL의 배지를 함유 하는 500-mL 에른마이어 플라스크에서 수행하였다. 각각의 플라스크는 아세트산납 튜브가 부착되어 있는 실리콘 마개를 구비하였다. 플라스크를 120rpm으로 진탕하면서 25℃에서 인큐베이션하였다. CO₂ 생성 추정치로서 중량 손실을 사용하여 7일 동안 발효를 모니터링하였다.

결과

결실 균주의 황화수소 생성의 특징화. 전체 결실 균주 세트의 황화수소 생성을 평가하기 위해, 이들을 초기에 모두 BiGGY 아가 상에서 플레이팅시키고, 콜로리의 색상을 평가하였다. 콜로니 색상은 백색, 연황갈색, 황갈색(어미 균주 색상), 연갈색, 갈색 또는 흑색이었다. 4개의 콜로니는 백색, 258개의 콜로니는 연황갈색, 4478개의 콜로니는 황갈색, 59개의 콜로니는 연갈색, 28개의 콜로니는 갈색, 1개의 콜로니는 흑색이었다. 4개의 결실체(deletant) 생성 백색 콜로니가 METlO, MET8, MET5 또는 METl에 존재하였다. 본 발명자들은 또한 황화수소의 억제에 역할을 할 가능성이 있는 것으로서 H0M2, H0M6 및 SER33를 확인하였다(Linderholm et al. 2006).

네이티브 균주의 백색의 원인이 되는 유전자의 확인. 이태리(Italy)(Mortimer et al. 1994)로부터 분리된 네이티브 균주인 UCD932는 BiGGY 아가 상에서의 백색의 비-H₂S 생산체이다. 백색 표현형의 원인이 되는 유전자를 확인하게 위해, 각각의 백색 결실 균주와 짝을 지었다. 하나의 균주만이 UCD932의 백색 표현형인 YFR030W BY4742와 상보작용하는데 실패하였다.

METlO의 야생형 복사체인 pAL51 (METlO ^S288C)을 지닌 벡터가 UCD932로 형질변환되면, UCD932를 생성하는 황갈색 콜로리의 균주가 생성되었으나, 설파이드의 형성을 유발하지 않았다(표 7). 이는 가능하게는 METlO와 함께 하나 초과의 유전자가 UCD932의 낮은 H₂S 생성 표현형의 원인됨을 시사하는 것이다.

표 7

METlO로 형질변환된 황화수소 생성 발효의 특성

균주^a	최대 발효 속도(g/h)^bcd	총 H₂S (㎍)
UCD932 벡터	0.437	<1
UCD932pMET10^S288C	0.446	<1
UCD932pMET10^UCD932	0.408	<1

^a 벡터: pYC130; pMETl0^S288C: pAL51; pMET10^UCD932: pAL52

^b 최대 발효 속도를 중량에서의 최대 급감에 상응하는 시점을 사용함으로써 발효 속도 데이타로부터 계산하였다.

^c 값은 두 복사체의 개별 측정값의 평균을 나타낸다.

^d 발효가 건조에 이르렀다(<0.5% 당 잔류로 정의됨).

설페이트 환원 경로에서의 유전자의 서열 분석. UCD932는, 둘 모두가 설페이트 환원 경로에서 중요한 효소를 엔코딩하는 CYS4 및 MET6의 돌연변이를 지닌다는 것이 이미 입증되었다(Linderholm et al. 2006). 그러나, 이러한 배경으로 야생형 대립유전자를 도입시키는 것은 낮은 H₂S 생성 특징을 변화시키지 않았다. 그 러므로, 이 균주가 상기 경로내 다른 유전자에서 어떠한 다른 돌연변이를 지닐 수 있는지를 확인하는 것이 주목되었다. 설페이트 환원 경로로부터의 여러 유전자, 즉, METlO, H0M2, H0M6, SER33, METl, MET5 및 MET8을 UCD932로부터 뿐만 아니라 합성 쥬스에서 H₂S 생성이 다양하고, BiGGY 아가 상에서의 색상이 다양한 수개의 다른 네이티브 및 산업적 균주로부터 시퀀싱하여(Spiropoulos et al. 2000) 설페이트 환원 경로의 유전적 다양성(genetic diversity)을 평가하였다(여러 사카로마이에스 균주로부터 METlO의 서열 배열이 도 2에 있다). METlOp 아미노산 차이는 표 8에 기재된다.

METlO(효소 설파이트 환원효소의 성분)의 서열 분석으로, 효모 균주 중에서 보존되지 않음이 입증되었다(표 9). S288C의 것과 상이한 6개의 대립유전자가 시퀀싱된 10개의 균주에서 발견되었다. 이들을 BiGGY 상에서의 색상 및 H₂S 생성에 의해 그룹으로 나누었다. 황갈색 H₂S 생산체인 UCD934, UCD957 및 UCD950이 동일한 대립유전자를 지녔다. 황갈색 비-H₂S 생산체인 UCD938 및 UCD942이 동일한 대립유전자를 지녔다. 갈색 H₂S 생산체인 UCD522 및 UCD940은 이형접합성(heterozygous)이지만, 두 대립유전자는 다른 균주에서 발견된 것과 동일하였다. 백색 비-H₂S 생산체인 UCD932 및 UCD95 및 황갈색 H₂S 생산체인 UCD939는 각각 상이한 대립유전자를 지녔다.

^a최대 발효 속도를 중량에서의 최대 급감에 상응하는 시점을 사용함으로써 발효 속도 데이타로부터 계산하였다.

^b 값은 두 복사체의 개별 측정값의 평균을 나타낸다.

^c 발효가 건조에 이르렀다(<0.5% 당 잔류로 정의됨).

설페이트 환원 경로의 나머지 유전자는 보다 잘 보존되는 것으로 나타났다. H0M2(아스파르트산 베타 세미-알데히드 탈수소효소를 엔코딩함)에서 아미노산 또는 DNA 서열의 차이가 없었으며, UCD932의 H0M6(호모세린 탈수소효소를 엔코딩함)에서 하나의 아미노산 차이가 있었으며, S288C와 나머지 와인 균주 모두 간에 SER33 (3-포스포글리세레이트 탈수소효소를 엔코딩함)에서 하나의 아미노산 차이가 있었고 METl, MET5 및 MET8(모두 설파이트 환원효소의 성분)에는 수개의 아미노산 차이가 있었다.

METlO 대립유전자의 스와핑. METlO 대립유전자의 유전적 다양성 및 H₂S 생성 및 콜로니 색상과의 명백한 상관 관계는, BiGGY 아가 상의 색상이 설파이트 환원효소 활성의 검출을 통해 H₂S 생성과 막연하게 상관되기 때문에, 설페이트 환원 경로에서의 유전자가 와인 균주의 H₂S 표현형의 원인이 될 수 있다는 가설을 지지하였다. 이에 따라 H₂S 생성 균주에서 H₂S 생성에 대한 METlO의 효과가 평가되었다. H₂S 생성 효모 균주의 METlO 대립유전자를 대립유전자 METl0 ^UCD932로 대체하였다(도 3). UCD950, UCD940, UCD939, UCD522 및 UCD932에서 네이티브 METlO를 KanMX 또는 HphMX 카세트로부터 결실시킨 후, KanMX 또는 HphMX 카세트를 대조군으로서 UCD932, S288C로부터의 METlO 대립유전자 또는 그 자체의 대립유전자로 대체하였다. METlO ^UDC932를 지닌 모든 균주를 어미 및 대조군 균주로서 동일한 속도로 발효시켰으나, 비-H₂S 생산체가 되었으나, BiGGY 아가 상에서의 색상은 더 밝아졌다. S288C로부터의 대립유전자 또는 그 자체의 대립유전자를 지닌 균주를 이들의 H₂S 생성 표현형으로 유지시켰다(표 9).

METlO ^UDC932 대립유전자를 지닌 UCD939 균주는 다른 와인 및 상업적 분리물과는 대조적으로 메티오닌 영양요구체로 회복되지 않았다. 이는 상기 균주가 설페이트 환원 경로에서 지니는 다른 돌연변이의 존재에 의해 설명될 수 있다. UCD939는 설파이트 환원효소에서 다른 서브유닛을 엔코딩하는 유전자에 두개의 돌연변이를 지닌다. 제 3 돌연변이의 부가는 설파이트 환원효소의 활성을 극적으로 낮춤으로써 메티오닌 또는 시스테인과 같은 황 함유 아미노산으로의 혼입될 수 있는 설파이드를 감소시킨다. 따라서, 균주는 메티오닌 없이 플레이트 상에서 성장할 수 없다. 또한, 설페이트 경로의 억제는 S-아데노실 메티오닌과 같은 황 함유 아미노산의 부재에 의해 경감되기 때문에 설파이트 환원효소의 독성 중간체 업스트림의 축적 효과가 있을 수 있다. 그러나, METlO ^S288C 대립유전자가 그 자체 대립유전자 대신 대체되고, BiGGY 상의 균주 색상이 황갈색에서 백색으로 변하고, 그의 H₂S 생성이 현저히 감소되는 경우, 균주는 생존할 수 있다.

이수체(aneuploid)로서 특징화된 상업적 와인 균주인 USD522(Bakalinsky and Snow 1990)는 염색체 수의 불균형으로 포자형성시 세포 치사를 유발하였다. 그러므로, 두 대립유전자는 나머지 균주에 의해 행해진 것과 같이 한 대립유전자를 녹아웃시킨 후, 균주를 포자형성시켜서 상동성 녹아웃을 얻는 것과는 대조적으로 개별적으로 붕괴될 필요가 있었다(도 3). METlO 대립유전자를 녹아웃 균주로 형질변환시킨 후, 포자 형성시켜서 G418^R/hphNTl^R인 두개의 균주 및 METlO 대립유전자를 지닌 두개의 균주를 얻었다. 각각의 균주를 실험에 사용하여 유전자 조작으 로 인한 어떠한 불일치가 있는지를 관찰하였다(표 10). 균주는 발효 완료되었으며, H₂S 생성에 대해 예상된 바와 같이 거동하였다. 약물 내성 마커를 지닌 각각의 균주가 메티오닌 영양요구체였으며, H₂S를 생성하지 않았다. METl0 ^S288C 또는 METl0 ^{UCD522 대립유전자}를 지닌 균주는 H₂S를 생성하였고, METl0 ^UCD932를 지닌 균주는 H₂S를 생성하지 않았다.

^a A, B, C, D - 상이한 포자를 나타낸다.

^b최대 발효 속도를 중량에서의 최대 급감에 상응하는 시점을 사용함으로써 발효 속도 데이타로부터 계산하였다.

^c 값은 두 복사체의 개별 측정값의 평균을 나타낸다.

^d 발효가 건조에 이르렀다(<0.5% 당 잔류로 정의됨).

또한, 본 발명자들은 YFR030W BY4742 및 UCD932에서 KanMX 카세트를 UCD950으로부터의 METlO 대립유전자로 대체하였으며, 둘 모두는 BiGGY 아가 상에서 황갈색이었으나, 둘 모두 H₂S 생산체가 존재하지 않았다. BY4742 또는 UCD932과 UCD950간의 교차는 H₂S 생성을 위해 분리되는 적어도 4개 내지 5개의 대립유전자가 존재함을 시사하였다.

결론

에스. 세레비시애에서 설파이드 생성시 관찰된 자연 발생 차이점에 대한 가능성 중 하나는 설페이트 환원 경로에서 효소의 발현 또는 활성의 유전적 변경이 발생하는 것이다. 설페이트 환원 경로는 복잡한 조절을 나타내며(Mountain et al. 1991), 어느 한 효소적 활성의 증가는 경로 내 다른 단백질의 활성 변화에 의해 완충될 수 있다.

본 발명자들의 실험에서의 이전의 연구로는 네이티브 비-H₂S 생산체인 UCD932에서, 설페이트 환원 경로내 수개의 대립유전자를 확인하였다. 그러나, 본 발명자들은, 그러한 특정 대립유전자 만이 H₂S 표현형의 원인이 되는 것은 아님을 입증하였다(Linderholm et al. 2006). H₂S 형성 억제제에 대한 결실 수집물의 스크리닝으로, 본 발명자들은 이러한 역할에 설페이트 환원 경로에서의 수개의 다른 유전자, 즉, H0M2, H0M6, SER33, METl, MET5, MET8 및 METlO을 확인하였다(Linderholm et al. 2006). 이러한 유전자들이 H₂S 생성이 상이한 UCD932 및 다른 네이티브 및 산업적 효모 균주로 시퀀싱된 경우, UCD932은 CYS4 및 MET6을 포함하는, 9개의 유전자 중 5개에 상이한 대립유전자를 지님을 밝혀냈다(Linderholm et al. 2006). 시퀀싱된 균주 수집물 중에 METlO의 많은 대립유전자들이 발견되었다.

상기 연구에서, METlO는 H₂S 형성의 역할에 중요한 역할을 한 반면, 단독으로는 UCD932의 비-H₂S 형성에 관여하지 않으며, 다른 H₂S 생성 균주의 H₂S 표현형을 극적으로 변경시킴이 입증되었다. 상기 기술된 실험에서, METlO ^UCD932는 세개의 H₂S 생성 균주의 네이티브 대립유전자를 성공적으로 전환시켰으며, 이것이 그것들을 비-H₂S 생산체로 변경시켰다. 이러한 결과는 적합한 대립유전자를 트랜스퍼함으로써 임의의 유전적 배경으로 황 생성이 감소된 상업적 균주를 구성할 수 있거나, 사카로마이세스 세리비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 임의의 균주에 대해 특징적인 H₂S 생성을 예측할 수 있음으로 인해 와인 산업에 대해 다수의 긍정적인 함축성을 지닌다. 두 기술 모두 상당히 간단하고, 와인기술자에게 유용할 것이다.

UCD939에서 METlO ^UCD932를 변환시키는 실험은 비성공적이었으며; UCD939 METlO ^UCD932는 메티오닌 결핍된 플레이트 상에서 생존할 수 없었다. 그러나, 이는 설페이트 환원 경로에 있는 다른 돌연변이에 의해 설명될 수 있다. UCD939는 설파이트 환원효소에서 다른 서브유닛을 엔코딩하는 유전자에 두개의 돌연변이를 지니며, 메티오닌 영양요구체가 아닐지라도, 제 3 돌연변이의 부가는 활성을 급격히 낮출 수 있음으로써 효소 다운스트림이 보상하기에 충분한 활성을 촉발시킬 수 없기 때문에, 그것이 메티오닌 영양요구체가 된다. 황 함유 아미노산에 의한 설페이트 환원의 조절은, 균주가 더 이상 메티오닌을 생성할 수 없고, 독성 중간체가 설파이트 환원효소 상에 축적될 수 있고, 또한 균주가 생존할 수 없기 때문에, 무너질 수 있다.

UCD522는 이수체 균주로서 특징화되었다(Bakalinsky and Snow 1990). METlO 유전자가 UCD522에서 시퀀싱되면, UCD522는 이형접합성 균주이고, METlO의 두개의 대립유전자를 지니는 것으로 관찰되었다. 나머지 균주와 같이 유전적으로 조작할 수 없게 된 성분들 간에는 몇몇 결합 타입이 있을 수 있다. METlO 대립유전자 또는 이를 엔코딩하는 단백질 간에 소정 타입의 착물이 형성되는 것이 가능하며, 이는 대립유전자중 하나만 결실된 경우 포자형성 동안에 적합하게 분리되지 않도록 한다. 그러나, 각각의 대립유전자가 개별적으로 대체되는 경우, 균주는 적절하게 포자형성할 수 있다. UCD522 METlO ^UCD932는 포자 형성되어 G418^R/hphNTl^R 및 메티오닌 영양요구체인 두개의 균주 및 약물 민감성이고, METlO 대립유전자를 지닌 두개의 균주를 생성시켰다. 각각의 균주가 발효 완료되었으며, 이들의 H₂S 특징은 예상된 바와 같았다.

실시예 3: UCD 932의 METlOp 대립유전자의 추가적 특징화

상기 실시예들에서 입증된 바와 같이, 효모 균주 UCD932에 존재하는 METlO 대립유전자는 높은 황화수소 (H₂S) 생성 균주를 검출가능한 H₂S를 생성하지 않는 균주로 전환시킬 수 있다. 이는 높은 생성 균주 UCD522 및 UCD950에 의해 명백하게 나타났으며, 이는 UCD932로부터 METlO 대립유전자를 지니는 경우에 검출가능한 H₂S를 생성하지 않았다. 균주를 낮은 H₂S 생산체로 전환시킬 수 있다는 것은 와인, 양조주, 및 연료 에탄올 산업을 포함하는 효모를 사용하는 임의의 산업에서 함축하는 바가 있다. 최종 생산체에 강력한 썩은 계란 냄새를 부가시킴으로써 문제를 일으 키는 것 외에, 발효시 생성되는 CO₂는 흔히 그 자체로 가스로서 판매되거나, 제품(양조제품)의 이동을 위한 모터 가스로서 사용되는 유용한 부산물이다. 그러므로, 가스가 썩은 계란 냄새가 나지 않도록 하는 것이 확실히 유익하다.

이전의 연구에서는, UCD932 및 UCD950으로부터의 METlO 대립유전자는 6개의 누클레오티드가 상이하며, 이러한 변화 중 5개는 주 단백질 서열을 변경되게 하는 것으로 입증되었다(도 2 참조). UCD932 METlO 대립유전자를 추가로 특징화하기 위해, METlO의 네이티브 대립유전자를 셔틀 벡터 pUG6로 클로닝하였다. 퀵 체인지 PCR 돌연변이생성 기술(Quick Change PCR mutagenesis technique)을 사용하여 단일 누클레오티드를 변경하였다(참조예: Cormack, B. and Castano, I. (2002) Introduction of Point Mutations into Cloned Genes. Methods in Enzymology (350) 199-218). 별개의 반응에서, 상기 기술을 사용하여 하나의 상이한 누클레오티드를 다른 대립유전자의 유사한 누클레오티드로 전환시켰다. 예를 들어, UCD932 METlO는 404번 위치에서 아데닌을 지닌 반면, UCD950는 시토신을 지녔다. 아데닌에 대해 1985번 위치에서 UCD950 시토신의 변경은 UCD950 배경에서 설파이드 생성의 손실에 대해 필요하고, 충분한 것으로 나타났다(표 11). UCD932에서 아데닌을 시토신 950으로 전환시키는 것은 설파이드 생성을 제거하는 UCD932 단백질의 능력을 없앴다(표 11). 그러므로, 662번 위치에서 트레오닌의 리신 잔기로의 단일 변경은 변형된 MetlO 단백질을 생성시켜서 설파이드 방출 감소를 유도한다.

* 932 균주 배경은 H₂S 생성의 또 다른 결정인자를 지니나, 시험된 어떠한 조건 하에서도 H₂S를 생성하지는 않음.

실시예 4: METlO 유전자의 1985번 위치에서의 대립유전자 차이가 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에 의한 황화수소 생성을 결정한다.

균주 UCD932의 METlO 대립유전자는 상업적 네이티브 대립유전자 및 와인 효모의 네이티브 분리물을 대체하는 대립유전자 대체 기술에 사용된 경우, 황화수소(H₂S)를 생성할 수 없게 유도한다. 이러한 대립유전자는 수개의 염기쌍 변화를 함유하여 엔코딩된 단백질의 아미노산 서열에서의 차이를 유도하는 것으로 밝혀졌 다. 이러한 아미노산 변화가 평가되어 어떤것이 H₂S를 생성하는 능력에 영향을 끼치는지를 결정한다.

H₂S 생성에서의 이러한 극적인 변화의 원인이 되는 정확한 변이 또는 변이의 조합을 확인하기 위해, 본 발명자들은 UCD932 및 UCD950으로부터 MET10 대립유전자를 클로닝하고, 각 단일 염기부위 특이적 변이유발을 이용하여 반대 대립유전자의 염기와 다르게 단일 염기를 조직적으로 변환시켰다. 생성된 대립유전자는 단일의 스와핑된 염기 변화를 제외하고는 어미 대립유전자와 동일하였다. 그 후, 변형된 대립유전자를 양 균주로 다시 삽입하고, BiGGY 아가를 설파이트 감소 및 아미도, H₂S 생성의 변화의 표시제로서 사용하였다. 변이가 콜로니 색상의 변화를 유도하기 때문에, 1985번 위치에서의 단일 염기 변화를 이러한 스크리닝으로 확인하였다. 이러한 균주를 합성 와인 쥬스에서 소규모 발효 동안 이중으로 H₂S 생성에 대해 시험하였다. 10mL의 합성 와인 배지에 각각의 균주를 접종하고, H₂S를 발효 4일 후 아세트산납 (lead acetate) 칼럼에 의해 검출하였다. 1985번에서 UCD50 대립유전자에 대한 변이 (932 MET10 1985 A-C)를 갖는 UCD932 대립유전자 및 비변화된 UCD950 MET10 대립유전자는 H₂S를 생성시키나, 1985번에서 UCD932에 대한 변화 (950 MET10 1985 C-A)를 갖는 UCD950 대립유전자 및 비변화된 대립유전자 UCD932 MET10은 검출가능한 H₂S 생성을 유도하지 않았다. 이러한 결과는 1985번에서 단일 염기 변화가 이러한 대립유전자의 H₂S 생성에서의 차이의 주요 결정요인임을 나타낸다. 그 후, 이러한 결과는 단일 변이 대립유전자를 두개의 H₂S 고생성의 시중의 균주 UCD522 및 UCD940으로 위치시킬 경우 H₂S 생성을 시험함으로써 보강되었다. 932 MET10 1985A-C 대립유전자를 갖는 이러한 균주 둘 모두는 H₂S를 생성하나, 950 MET10 1985C-A는 H₂S가 검출되지 않았다. 결과는 상기 표 11에 요약되어 있다.

본 연구는 MET10 대립유전자에서의 1985번의 단일 염기쌍 변화가 황화수소의 생성을 지시함을 입증한다. 1985번에서의 누클레오티드 차이는 엔코딩된 아미노산을 변화시키고, 따라서, 엔코딩된 아미노산을 변화시키는 주위 누클레오티드 서열의 변화는 마찬가지로 H₂S 생성을 배제시킬 것이다. 고생성 대립유전자에 존재하는 트레오닌은 경로의 흐름을 변화시키는 조절점으로서 작용할 수 있는데, 포스페이트 기를 함유하는 아미노산 잔기가 포스포릴화를 통해 조절될 수 있기 때문이다. 아미노산 잔기 662번은 설파이트 환원효소 촉매 도메인내에 위치하는 것으로 추정된다 (도 6). 이러한 변화를 갖는 단백질의 추정 구조의 분석은, 단백질의 전체적인 구조는 비변형되나, 이러한 잔기 주위의 활성 부위의 국소 영역이 영향을 받음을 나타낸다. 이러한 변화는 단백질 구조를 단지 미약하게 변형시킨다.

참고 문헌

본원에 기술된 실시예 및 구체예는 단지 예시를 위한 것이며, 이의 관점에서 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 시사될 것이며, 이는 첨부된 청구범위 및 복 출원의 사상 및 범위내에 포함됨이 이해될 것이다. 본원에 언급된 모든 문헌, 수탁 번호, 특허 및 특허 출원은 이들 전체가 본원에 참조로서 통합되었다.

SEQUENCE LISTING <110> Bisson, Linda F. Linderholm, Angela Dietzel, Kevin L. The Regents of the University of California <120> Compositions and Methods for Reducing H-2S Levels in Fermented Beverages <130> 02307O-177920PC <140> WO Not yet assigned <141> Not yet assigned <150> US 60/918,616 <151> 2007-03-16 <150> US 60/959,366 <151> 2007-07-12 <160> 93 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 3108 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> yeast assimilatory sulfite reductase alpha subunit (Met 10, MET10), strain UCD932 allele <400> 1 atgccagttg agtttgctac caatcctttt ggcgaggcca aaaatgcaac ttcactgcca 60 aaatatggta cacccgtaac tgccatttca tctgtgctgt tcaataacgt ggactccatt 120 tttgcttaca agtccttttc tcaacccgat ttgttacacc aagatctaaa aaaatggtct 180 gaaaagcgtg gtaacgaatc acgtgggaag ccatttttcc aagagctgga tatcagatct 240 ggcgctggtt tggctccttt agggttttct catggattga agaacactac agcaattgtt 300 gctccagggt tttcgctgcc atacttcatt aactctttga aaaccgtctc tcatgatggt 360 aagtttcttt tgaatgttgg tgctttaaac tacgacaatg ctaacggctc tgtcaccaac 420 gattatgtaa ccgcattgga tgctgcttcc 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<210> 3 <211> 1035 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:sulfide inactive yeast assimilatory sulfite reductase alpha subunit (Met 10, MET10) consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (135) <223> Xaa = Thr or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (172) <223> Xaa = Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (511) <223> Xaa = Thr or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (590) <223> Xaa = Glu or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (662) <223> Xaa = Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp or Tyr, not Thr <400> 3 Met Pro Val Glu Phe Ala Thr Asn Pro Phe Gly Glu Ala Lys Asn Ala 1 5 10 15 Thr Ser Leu Pro Lys Tyr Gly Thr Pro Val Thr Ala Ile Ser Ser Val 20 25 30 Leu Phe Asn Asn Val Asp Ser Ile Phe Ala Tyr Lys Ser Phe Ser Gln 35 40 45 Pro Asp Leu Leu His Gln Asp Leu Lys Lys Trp Ser Glu Lys Arg Gly 50 55 60 Asn Glu Ser Arg Gly Lys Pro Phe Phe Gln Glu Leu Asp Ile Arg Ser 65 70 75 80 Gly Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Phe Ser His Gly Leu Lys Asn Thr 85 90 95 Thr Ala Ile Val Ala Pro Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Phe Ile Asn Ser 100 105 110 Leu Lys Thr Val Ser His Asp Gly Lys Phe Leu Leu Asn Val Gly Ala 115 120 125 Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Xaa Gly Ser Val Thr Asn Asp Tyr Val Thr 130 135 140 Ala Leu Asp Ala Ala Ser Lys Leu Lys Tyr Gly Val Val Thr Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ala Asn Glu Val Gln Ser Val Ala Leu Leu Xaa Leu Ala Ile Ala 165 170 175 Thr Phe Ser Asn Asn Ser Gly Ala Ile Asn Leu Phe Asp Gly Leu Asn 180 185 190 Tyr Ser Lys Thr Val Leu Pro Leu Val Glu Ser Val Pro Glu Ala Ser 195 200 205 Ile Leu Ala Lys Leu Ser Lys Val Ile Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp 210 215 220 Asp Val Leu Asp Lys Phe Asn Glu Leu Thr Gly Leu Arg Leu His Asn 225 230 235 240 Phe Gln Tyr Phe Gly Ala Gln Asp Ala Glu Thr Val Phe Ile Thr Tyr 245 250 255 Gly Ser Leu Glu Ser Glu Leu Phe Asn Ser Ala Ile Ser Gly Asn Asn 260 265 270 Ser Lys Ile Gly Leu Ile Asn Val Arg Val Pro Leu Pro Phe Asn Val 275 280 285 Ala Lys Phe Val Thr His Val Pro Ser Thr Thr Lys Gln Ile 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Xaa Asn 500 505 510 Asp Glu Ser Lys Leu Ser Leu Phe Ile Gln Ala Val Phe Trp Lys Leu 515 520 525 Ala Phe Gly Leu Asp Val Ala Glu Cys Thr Asn Arg Ile Trp Lys Ser 530 535 540 Ile Asp Ser Gly Ala Asp Ile Ser Ala Ala Ser Ile Ser Glu Phe Leu 545 550 555 560 Thr Gly Ala Phe Lys Asn Phe Leu Ser Glu Val Pro Leu Ala Leu Tyr 565 570 575 Thr Lys Phe Ser Glu Ile Asn Ile Glu Lys Lys Glu Asp Xaa Glu Glu 580 585 590 Pro Ala Ala Leu Pro Ile Phe Val Asn Glu Thr Ser Phe Leu Pro Asn 595 600 605 Asn Ser Thr Ile Glu Glu Ile Pro Leu Pro Glu Thr Ser Glu Ile Ser 610 615 620 Asp Ile Ala Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Glu Val Glu Asn 625 630 635 640 Lys Leu Arg Pro Asp Leu Pro Val Lys Asn Phe Val Val Lys Val Lys 645 650 655 Glu Asn Arg Arg Val Xaa Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr Ile Phe His 660 665 670 Ile Glu Phe Asp Ile Ser Gly Thr Gly Met Thr Tyr Asp Ile Gly Glu 675 680 685 Ala Leu Gly Ile His Ala Arg Asn Asn Glu Ser Leu Val Lys Glu Phe 690 695 700 Leu Thr Phe Tyr Gly Leu Asn Glu Ser Asp Val Val Leu Val Pro 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Lys Tyr Ile Ser Asp Leu Ala Val Gly Ser 850 855 860 Glu Leu Val Val Ser Val Lys Pro Ser Val Met Lys Leu Pro Pro Ser 865 870 875 880 Pro Lys Gln Pro Val Ile Met Ser Gly Leu Gly Thr Gly Leu Ala Pro 885 890 895 Phe Lys Ala Ile Val Glu Glu Lys Leu Trp Gln Lys Gln Gln Gly Tyr 900 905 910 Glu Ile Gly Glu Val Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Arg His Lys Arg Glu 915 920 925 Glu Tyr Leu Tyr Gly Glu Leu Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Ala Gly Ile 930 935 940 Ile Thr His Ile Gly Ala Ala Phe Ser Arg Asp Gln Pro Gln Lys Ile 945 950 955 960 Tyr Ile Gln Asp Arg Ile Lys Glu Asn Leu Asp Glu Leu Lys Thr Ala 965 970 975 Met Ile Asp Asn Lys Gly Ser Phe Tyr Leu Cys Gly Pro Thr Trp Pro 980 985 990 Val Pro Asp Ile Thr Gln Ala Leu Gln Asp Ile Leu Ala Lys Asp Ala 995 1000 1005 Glu Glu Arg Gly Ile Lys Val Asp Leu Asp Ala Ala Ile Glu Glu Leu 1010 1015 1020 Lys Glu Ala Ser Arg Tyr Ile Leu Glu Val Tyr 1025 1030 1035 <210> 5 <211> 1035 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:sulfide inactive yeast assimilatory sulfite reductase alpha subunit (Met 10, MET10) <220> <221> MOD_RES <222> (135) <223> Xaa = Thr or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (172) <223> Xaa = Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (511) <223> Xaa = Thr or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (590) <223> Xaa = Glu or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (662) <223> Xaa = Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp or Tyr, not Thr or Ser <400> 5 Met Pro Val Glu Phe Ala Thr Asn Pro Phe Gly Glu Ala Lys Asn Ala 1 5 10 15 Thr Ser Leu Pro Lys Tyr Gly Thr Pro Val Thr Ala Ile Ser Ser Val 20 25 30 Leu Phe Asn Asn Val Asp Ser Ile Phe Ala Tyr Lys Ser Phe Ser Gln 35 40 45 Pro Asp Leu Leu His Gln Asp Leu Lys Lys Trp Ser Glu Lys Arg Gly 50 55 60 Asn Glu Ser Arg Gly Lys Pro Phe Phe Gln Glu Leu Asp Ile Arg Ser 65 70 75 80 Gly Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Phe Ser His Gly Leu Lys Asn Thr 85 90 95 Thr Ala Ile Val Ala Pro Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Phe Ile Asn Ser 100 105 110 Leu Lys Thr Val Ser His Asp 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1620 atctggaaaa gcattgattc aggtgcagac atttcagcag cctcgatttc tgaatttctc 1680 actggtgcat tcaaaaactt cctcagtgag gttccgctag cgctgtacac taaattttct 1740 gaaataaaca ttgaaaagaa agaggataag gaagagcctg cagctttacc aattttcgtt 1800 aatgaaacat ctttcctccc aaataacagt accattgaag aaataccatt acctgagacc 1860 tctgagatct ctgatattgc caagaagttg tccttcaaag aggcatatga agttgagaat 1920 aaactaagac ccgatttacc cgtcaagaac ttcgtcgtga aagttaaaga aaatagacgt 1980 gttacgcctg ctgattatga tagatatatt ttccatattg aattcgatat ttctggtact 2040 ggaatgactt atgacatcgg tgaagccctc ggtattcatg ccagaaacaa tgaatctttg 2100 gtcaaagaat tcttaacctt ctatggtcta aatgaatccg atgttgtctt agtccccaac 2160 aaggacaacc accatttgtt agaaacaaga accgtcttac aagcatttgt ggaaaatttg 2220 gatattttcg gtaaaccacc aaaaagattt tacgaatcat tgattccata tgcctctaac 2280 gaagaggaga agaaaaaatt agaggatttg gttactcctg ccggtgcagt agatttgaag 2340 agatttcaag atgtggagta ttatacatat gctgacattt ttgaattgtt cccatctgtt 2400 cgcccatctc ttgaggaact tgttactatc attgaaccat tgaagagaag agaatactca 2460 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tttacttgtg tggccctact tggccagttc cagatattac tcaagctttg 3000 caagacattc tggctaaaga cgccgaggaa agaggcatca aagtcgactt ggatgccgca 3060 attgaagaat taaaggaagc atcaagatac attttagaag tctactaa 3108 <210> 15 <211> 3108 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> yeast assimilatory sulfite reductase alpha subunit (Met 10, MET10), strain UCD956 allele <400> 15 atgccagttg agtttgctac caatcctttt ggcgaggcca aaaatgcaac ttcactgcca 60 aaatatggta cacccgtaac tgccatttca tctgtgctgt tcaataacgt ggactccatt 120 tttgcttaca agtccttttc tcaacccgat ttgttacacc aagatctaaa aaaatggtct 180 gaaaagcgtg gtaacgaatc acgtgggaag ccatttttcc aagagctgga tatcagatct 240 ggcgctggtt tggctccttt agggttttct catggattga agaacactac agcaattgtt 300 gctccagggt tttcgctgcc atacttcatt aactctttga aaaccgtctc tcatgatggt 360 aagtttcttt tgaatgttgg tgctttaaac tacgacaatg ctaccggctc tgtcaccaac 420 gattatgtaa ccgcattgga tgctgcttcc aagctgaagt atggtgtcgt gactccgatt 480 tccgctaacg aggtacaaag tgtcgcctta ctgacattgg cgattgccac tttcagtaat 540 aactccggag 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aaaaagattt tacgaatcat tgattccata tgcctctaac 2280 gaagaggaga agaaaaaatt agaggatttg gttactcctg ccggtgcagt agatttgaag 2340 agatttcaag atgtggagta ttatacatat gctgacattt ttgaattgtt cccatctgtt 2400 cgcccatctc ttgaggaact tgttactatc attgaaccat tgaagagaag agaatactca 2460 attgcctcct ctcagaaagt tcatccaaat gaagttcatt tattgatcgt tgttgttgat 2520 tgggtggata ataaaggaag aaaaaggtac ggtcaagctt ctaagtatat ctcagacctt 2580 gctgtcggtt cagaattggt cgttagcgtt aaaccatctg ttatgaaatt accaccatct 2640 ccaaagcaac cagttattat gagtggttta ggtactggtt tggcatcatt caaggccatt 2700 gttgaagaga aattatggca aaagcagcaa ggttatgaga ttggtgaagt cttcctatat 2760 ctaggttcaa gacacaaaag agaagaatat ttatatggtg agttatggga ggcttacaaa 2820 gatgcaggta ttatcacaca catcggcgct gctttctcaa gagaccaacc tcaaaaaatt 2880 tacattcaag atcgtatcaa agagaatttg gatgaattaa aaactgcaat gattgataat 2940 aaaggttcat tttacttgtg tggccctact tggccagttc cagatattac tcaagctttg 3000 caagacattc tggctaaaga cgccgaggaa agaggcatca aagtcgactt ggatgccgca 3060 attgaagaat taaaggaagc atcaagatac attttagaag tctactaa 3108 <210> 16 <211> 3108 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> yeast assimilatory sulfite reductase alpha subunit (Met 10, MET10), strain UCD957 allele <400> 16 atgccagttg agtttgctac caatcctttt ggcgaggcca aaaatgcaac ttcactgcca 60 aaatatggta cacccgtaac tgccatttca tctgtgctgt tcaataacgt ggactccatt 120 tttgcttaca agtccttttc tcaacccgat ttgttacacc aagatctaaa aaaatggtct 180 gaaaagcgtg gtaacgaatc acgtgggaag ccatttttcc aagagctgga tatcagatct 240 ggcgctggtt tggctccttt agggttttct catggattga agaacactac agcaattgtt 300 gctccagggt tttcgctgcc atacttcatt aactctttga aaaccgtctc tcatgatggt 360 aagtttcttt tgaatgttgg tgctttaaac tacgacaatg ctaccggctc tgtcaccaac 420 gattatgtaa ccgcattgga tgctgcttcc aagctgaagt atggtgtcgt gactccgatt 480 tccgctaacg aggtacaaag tgtcgcctta ctggcattgg cgattgccac tttcagtaat 540 aactccggag ctatcaattt atttgacgga ttaaactact cgaaaaccgt cttgccgttg 600 gtcgaatctg ttcctgaggc atctattttg gcaaaactat ccaaagttat tgcaccagat 660 gctgcctttg atgatgtctt 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attaacgacg agtccaaatt gtccttgttt 1560 atccaagccg ttttctggaa attggccttc ggtctagatg tcgcagaatg taccaaccgt 1620 atctggaaaa gcattgattc aggtgcagac atttcagcag cctcgatttc tgaatttctc 1680 actggtgcat tcaaaaactt cctcagtgag gttccgctag cgctgtacac taaattttct 1740 gaaataaaca ttgaaaagaa agaggataag gaagagcctg cagctttacc aattttcgtt 1800 aatgaaacat ctttcctccc aaataacagt accattgaag aaataccatt acctgagacc 1860 tctgagatct ctgatattgc caagaagttg tccttcaaag aggcatatga agttgagaat 1920 aaactaagac ccgatttacc cgtcaagaac ttcgtcgtga aagttaaaga aaatagacgt 1980 gttacgcctg ctgattatga tagatatatt ttccatattg aattcgatat ttctggtact 2040 ggaatgactt atgacatcgg tgaagccctc ggtattcatg ccagaaacaa tgaatctttg 2100 gtcaaagaat tcttaacctt ctatggtcta aatgaatccg atgttgtctt agtccccaac 2160 aaggacaacc accatttgtt agaaacaaga accgtcttac aagcatttgt ggaaaatttg 2220 gatattttcg gtaaaccacc aaaaagattt tacgaatcat tgattccata tgcctctaac 2280 gaagaggaga agaaaaaatt agaggatttg gttactcctg ccggtgcagt agatttgaag 2340 agatttcaag atgtggagta ttatacatat 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Arg Pro Ser Leu Glu Glu Leu Val Thr Ile Ile Glu Pro Leu Lys Arg 805 810 815 Arg Glu Tyr Ser Ile Ala Ser Ser Gln Lys Val His Pro Asn Glu Val 820 825 830 His Leu Leu Ile Val Val Val Asp Trp Val Asp Asn Lys Gly Arg Lys 835 840 845 Arg Tyr Gly Gln Ala Ser Lys Tyr Ile Ser Asp Leu Ala Val Gly Ser 850 855 860 Glu Leu Val Val Ser Val Lys Pro Ser Val Met Lys Leu Pro Pro Ser 865 870 875 880 Pro Lys Gln Pro Val Ile Met Ser Gly Leu Gly Thr Gly Leu Ala Pro 885 890 895 Phe Lys Ala Ile Val Glu Glu Lys Leu Trp Gln Lys Gln Gln Gly Tyr 900 905 910 Glu Ile Gly Glu Val Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Arg His Lys Arg Glu 915 920 925 Glu Tyr Leu Tyr Gly Glu Leu Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Ala Gly Ile 930 935 940 Ile Thr His Ile Gly Ala Ala Phe Ser Arg Asp Gln Pro Gln Lys Ile 945 950 955 960 Tyr Ile Gln Asp Arg Ile Lys Glu Asn Leu Asp Glu Leu Lys Thr Ala 965 970 975 Met Ile Asp Asn Lys Gly Ser Phe Tyr Leu Cys Gly Pro Thr Trp Pro 980 985 990 Val Pro Asp Ile Thr Gln Ala Leu Gln Asp Ile Leu Ala Lys Asp Ala 995 1000 1005 Glu Glu Arg Gly Ile Lys Val Asp Leu Asp Ala Ala Ile Glu Glu Leu 1010 1015 1020 Lys Glu Ala Ser Arg Tyr Ile Leu Glu Val Tyr 1025 1030 1035 <210> 19 <211> 1035 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> yeast assimilatory sulfite reductase alpha subunit (Met 10, MET10), strain UCD950 allele <400> 19 Met Pro Val Glu Phe Ala Thr Asn Pro Phe Gly Glu Ala Lys Asn Ala 1 5 10 15 Thr Ser Leu Pro Lys Tyr Gly Thr Pro Val Thr Ala Ile Ser Ser Val 20 25 30 Leu Phe Asn Asn Val Asp Ser Ile Phe Ala Tyr Lys Ser Phe Ser Gln 35 40 45 Pro Asp Leu Leu His Gln Asp Leu Lys Lys Trp Ser Glu Lys Arg Gly 50 55 60 Asn Glu Ser Arg Gly Lys Pro Phe Phe Gln Glu Leu Asp Ile Arg Ser 65 70 75 80 Gly Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Phe Ser His Gly Leu Lys Asn Thr 85 90 95 Thr Ala Ile Val Ala Pro Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Phe Ile Asn Ser 100 105 110 Leu Lys Thr Val Ser His Asp Gly Lys Phe Leu Leu Asn Val Gly Ala 115 120 125 Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Thr Gly Ser Val Thr Asn Asp Tyr Val Thr 130 135 140 Ala Leu Asp Ala Ala Ser Lys Leu Lys Tyr Gly Val Val Thr Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ala Asn Glu Val Gln Ser Val Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ile Ala 165 170 175 Thr Phe Ser Asn Asn Ser Gly Ala Ile Asn Leu Phe Asp Gly Leu Asn 180 185 190 Tyr Ser Lys Thr Val Leu Pro Leu Val Glu Ser Val Pro Glu Ala Ser 195 200 205 Ile Leu Ala Lys Leu Ser Lys Val Ile Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp 210 215 220 Asp Val Leu Asp Lys Phe Asn Glu Leu Thr Gly Leu Arg Leu His Asn 225 230 235 240 Phe Gln Tyr Phe Gly Ala Gln Asp Ala Glu Thr Val Phe Ile Thr Tyr 245 250 255 Gly Ser Leu Glu Ser Glu Leu Phe Asn Ser Ala Ile Ser Gly Asn Asn 260 265 270 Ser Lys Ile Gly Leu Ile Asn Val Arg Val Pro Leu Pro Phe Asn Val 275 280 285 Ala Lys Phe Val Thr His Val Pro Ser Thr Thr Lys Gln Ile Val Val 290 295 300 Ile Gly Gln Thr Leu Asp Gly Ser Ser Pro Ser Phe Leu Arg Ser Gln 305 310 315 320 Val Ser Ala Ala Leu Phe Tyr His Gly Arg Thr Ser Ile Ser Val Ser 325 330 335 Glu Tyr Ile Tyr Gln Pro Asp Phe Ile Trp Ser Pro Lys Ala Val Lys 340 345 350 Ser Ile Val Ser Ser Phe Ile Pro Glu Phe Thr Tyr Asn Ala Asp Ser 355 360 365 Ser Phe Gly Glu Gly Phe Ile Tyr Trp Ala Ser Asp Lys Ser Ile Asn 370 375 380 Ile Asp Val Ala Ser Lys Leu Val Lys Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gly 385 390 395 400 Lys Phe Val Ser Leu Arg Thr Lys Phe Asp Asn Leu Ala Asn Ala Gly 405 410 415 Thr Phe Gln Ala Gln Phe Val Thr Ser Lys Glu Gln Ile Pro Val Ser 420 425 430 Asn Ile Asp Ser Thr Lys Leu Ser Val Val Glu Asp Val Ser Leu Leu 435 440 445 Lys His Leu Asp Val Ala Ala Thr Val Ala Glu Gln Gly Ser Ile Ala 450 455 460 Leu Val Ser Gln Lys Ala Val Lys Asp Leu Asp Leu Asn Ser Val Glu 465 470 475 480 Ser Tyr Val Lys Asn Leu Gly Ile Pro Glu Ser Phe Leu Ile Ser Ile 485 490 495 Ala Lys Lys Asn Ile Lys Leu Phe Ile Ile Asp Gly Glu Thr Ile Asn 500 505 510 Asp Glu Ser Lys Leu Ser Leu Phe Ile Gln Ala Val Phe Trp Lys Leu 515 520 525 Ala Phe Gly Leu Asp Val Ala Glu Cys Thr Asn Arg Ile Trp Lys Ser 530 535 540 Ile Asp Ser Gly Ala Asp Ile Ser Ala Ala Ser Ile Ser Glu Phe Leu 545 550 555 560 Thr Gly Ala Phe Lys 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Gly Ala Val Asp Leu Lys Arg Phe Gln Asp 770 775 780 Val Glu Tyr Tyr Thr Tyr Ala Asp Ile Phe Glu Leu Phe Pro Ser Val 785 790 795 800 Arg Pro Ser Leu Glu Glu Leu Val Thr Ile Ile Glu Pro Leu Lys Arg 805 810 815 Arg Glu Tyr Ser Ile Ala Ser Ser Gln Lys Val His Pro Asn Glu Val 820 825 830 His Leu Leu Ile Val Val Val Asp Trp Val Asp Asn Lys Gly Arg Lys 835 840 845 Arg Tyr Gly Gln Ala Ser Lys Tyr Ile Ser Asp Leu Ala Val Gly Ser 850 855 860 Glu Leu Val Val Ser Val Lys Pro Ser Val Met Lys Leu Pro Pro Ser 865 870 875 880 Pro Lys Gln Pro Val Ile Met Ser Gly Leu Gly Thr Gly Leu Ala Pro 885 890 895 Phe Lys Ala Ile Val Glu Glu Lys Leu Trp Gln Lys Gln Gln Gly Tyr 900 905 910 Glu Ile Gly Glu Val Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Arg His Lys Arg Glu 915 920 925 Glu Tyr Leu Tyr Gly Glu Leu Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Ala Gly Ile 930 935 940 Ile Thr His Ile Gly Ala Ala Phe Ser Arg Asp Gln Pro Gln Lys Ile 945 950 955 960 Tyr Ile Gln Asp Arg Ile Lys Glu Asn Leu Asp Glu Leu Lys Thr Ala 965 970 975 Met Ile Asp Asn Lys Gly 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residue 662 of yeast assimilatory sulfite reductase alpha subunit (Met 10, MET10), strain S288c and UCD950 alleles <400> 22 aatagacgtg ttacgcctgc tgattat 27 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA sequence surrounding residue 662 of yeast assimilatory sulfite reductase alpha subunit (Met 10, MET10), strain UCD932 allele <400> 23 aatagacgtg ttaagcctgc tgattat 27 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:amino acid sequence surrounding residue 662 of yeast assimilatory sulfite reductase alpha subunit (Met 10, MET10), strains S288c, UCD932 and UCD950 alleles <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> Xaa = Thr or Lys <400> 24 Asn Arg Arg Val Xaa Pro Ala Asp Tyr 1 5 <210> 25 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:subsequence of yeast assimilatory sulfite reductase alpha subunit (Met 10, MET10) catalytic region of Saccharomyces cerevisiae strain UCD932 <400> 25 Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Glu Val Glu Asn Lys Leu Arg 1 5 10 15 Pro Asp Leu Pro Val Lys Asn Phe Val Val Lys Val Lys Glu Asn Arg 20 25 30 Arg Val Lys Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr Ile Phe His Ile Glu Phe 35 40 45 Asp Ile 50 <210> 26 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:subsequence of yeast assimilatory sulfite reductase alpha subunit (Met 10, MET10) catalytic region of Saccharomyces cerevisiae strain S288c <400> 26 Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Glu Val Glu Asn Lys Leu Arg 1 5 10 15 Pro Asp Leu Pro Val Lys Asn Phe Val Val Lys Val Lys Glu Asn Arg 20 25 30 Arg Val Thr Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr Ile Phe His Ile Glu Phe 35 40 45 Asp Ile 50 <210> 27 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:subsequence of yeast assimilatory sulfite reductase alpha subunit (Met 10, MET10) catalytic region of Saccharomyces cerevisiae (carlsbergensis) <400> 27 Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Gly Val Glu Asn Lys Leu Arg 1 5 10 15 Pro Asp Leu Pro Val Lys Asn Phe Val Val Lys Val Lys Glu Asn Arg 20 25 30 Arg Val Thr Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr Ile Phe His Ile Glu Phe 35 40 45 Asp Ile 50 <210> 28 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:subsequence of yeast assimilatory sulfite reductase alpha subunit (Met 10, MET10) catalytic region of Kluyveromyces lactis <400> 28 Lys Lys Leu Thr Phe Gln Glu Ala Tyr Gly Val Ser Gln Gln Leu Arg 1 5 10 15 Pro Asp Leu Pro Val Asn Asn Tyr Val Val Lys Val Lys Glu Asn Arg 20 25 30 Arg Val Thr Pro Asp Asp Tyr Asp Arg Tyr Ile Phe His Ile Glu Phe 35 40 45 Asp Ile 50 <210> 29 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:subsequence of yeast assimilatory sulfite reductase alpha subunit (Met 10, MET10) catalytic region of Yarowwia lipolytica <400> 29 Lys Arg Val Val Phe Lys Glu Ala Tyr Gly Thr Glu Asn Ser Leu Arg 1 5 10 15 Pro Asp Ile Ser Thr Lys Asn Phe Val Val Lys Val Gln Glu Lys Arg 20 25 30 Arg Val Thr Pro Glu Asn Tyr Asp Arg Asn Ile Phe His Val Glu Phe 35 40 45 Asp Ile 50 <210> 30 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:subsequence of yeast assimilatory sulfite reductase alpha subunit (Met 10, MET10) catalytic region of Schizosaccharomyces pombe <400> 30 Lys Gln Ile Ile Phe Pro Glu Ala Tyr Lys Lys Lys Asp Ala Leu Arg 1 5 10 15 Pro Asp Val Ser Glu Lys Val Phe Thr Val His Val Arg Ala Asn Lys 20 25 30 Arg Leu Thr Pro Ala Glu Tyr Asn Arg Asn Ile Phe His Ile Glu Phe 35 40 45 Asp Leu 50 <210> 31 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:conserved yeast motif in sulfite active sulfite reductase catalytic region <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Xaa = Asn or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> Xaa = Arg or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> Xaa = Val or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> Xaa = Ala, Asp or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> Xaa = Asp, Asn or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (12) <223> Xaa = Tyr or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (16) <223> Xaa = Ile or Val <220> <221> MOD_RES <222> (20) <223> Xaa = Ile or Leu <400> 31 Xaa Xaa Arg Xaa Thr Pro Xaa Xaa Tyr Asx Arg Xaa Ile Phe His Xaa 1 5 10 15 Glu Phe Asp Xaa 20 <210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:conserved yeast motif in sulfite inactive sulfite reductase catalytic region <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Xaa = Asn or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> Xaa = Arg or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> Xaa = Val or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> Xaa = Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp or Tyr, not Thr <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> Xaa = Ala, Asp or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> Xaa = Asp, Asn or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (12) <223> Xaa = Tyr or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (16) <223> Xaa = Ile or Val <220> <221> MOD_RES <222> (20) <223> Xaa = Ile or Leu <400> 32 Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Tyr Asx Arg Xaa Ile Phe His Xaa 1 5 10 15 Glu Phe Asp Xaa 20 <210> 33 <211> 1035 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:sulfide inactive yeast assimilatory sulfite reductase alpha subunit (Met 10, MET10) <220> <221> MOD_RES <222> (135) <223> Xaa = Thr or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (172) <223> Xaa = Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (511) <223> Xaa = Thr or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (590) <223> Xaa = Glu or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (662) <223> Xaa = Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val or Trp, not Thr, Ser or Tyr <400> 33 Met Pro Val Glu Phe Ala Thr Asn Pro Phe Gly Glu Ala Lys Asn Ala 1 5 10 15 Thr Ser Leu Pro Lys Tyr Gly Thr Pro Val Thr Ala Ile Ser Ser Val 20 25 30 Leu Phe Asn Asn Val Asp Ser Ile Phe Ala Tyr Lys Ser Phe Ser Gln 35 40 45 Pro Asp Leu Leu His Gln Asp Leu Lys Lys Trp Ser Glu Lys Arg Gly 50 55 60 Asn Glu Ser Arg Gly Lys Pro Phe Phe Gln Glu Leu Asp Ile Arg Ser 65 70 75 80 Gly Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Phe Ser His Gly Leu Lys Asn Thr 85 90 95 Thr Ala Ile Val Ala Pro Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Phe Ile Asn Ser 100 105 110 Leu Lys Thr Val Ser His Asp Gly Lys Phe Leu Leu Asn Val Gly Ala 115 120 125 Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Xaa Gly Ser Val Thr Asn Asp Tyr Val Thr 130 135 140 Ala Leu Asp Ala Ala Ser Lys Leu Lys Tyr Gly Val Val Thr Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ala Asn Glu Val Gln Ser Val Ala Leu Leu Xaa Leu Ala Ile Ala 165 170 175 Thr Phe Ser Asn Asn Ser Gly Ala Ile Asn Leu Phe Asp Gly Leu Asn 180 185 190 Tyr Ser Lys Thr Val Leu Pro Leu Val Glu Ser Val Pro Glu Ala Ser 195 200 205 Ile Leu Ala Lys Leu Ser Lys Val Ile Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp 210 215 220 Asp Val Leu Asp Lys Phe Asn Glu Leu Thr Gly Leu Arg Leu His Asn 225 230 235 240 Phe Gln Tyr Phe Gly Ala Gln Asp Ala Glu Thr Val Phe Ile Thr Tyr 245 250 255 Gly Ser Leu Glu Ser Glu Leu Phe Asn Ser Ala Ile Ser Gly Asn Asn 260 265 270 Ser Lys Ile Gly Leu Ile Asn Val Arg Val Pro Leu Pro Phe Asn Val 275 280 285 Ala Lys Phe Val Thr His Val Pro Ser Thr Thr Lys Gln Ile Val Val 290 295 300 Ile Gly Gln Thr Leu Asp Gly Ser Ser Pro Ser Phe Leu Arg Ser Gln 305 310 315 320 Val Ser Ala Ala Leu Phe Tyr His Gly Arg Thr Ser Ile Ser Val Ser 325 330 335 Glu Tyr Ile Tyr Gln Pro Asp Phe Ile Trp Ser Pro Lys Ala Val Lys 340 345 350 Ser Ile Val Ser Ser Phe Ile Pro Glu Phe Thr Tyr Asn Ala Asp Ser 355 360 365 Ser Phe Gly Glu Gly Phe Ile Tyr Trp Ala Ser Asp Lys Ser Ile Asn 370 375 380 Ile Asp Val Ala Ser Lys Leu Val Lys Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gly 385 390 395 400 Lys Phe Val Ser Leu Arg Thr Lys Phe Asp Asn Leu Ala Asn Ala Gly 405 410 415 Thr Phe Gln Ala Gln Phe Val Thr Ser Lys Glu Gln Ile Pro Val Ser 420 425 430 Asn Ile Asp Ser Thr Lys Leu Ser Val Val Glu Asp Val Ser Leu Leu 435 440 445 Lys His Leu Asp Val Ala Ala Thr Val Ala Glu Gln Gly Ser Ile Ala 450 455 460 Leu Val Ser Gln Lys Ala Val Lys Asp Leu Asp Leu Asn Ser Val Glu 465 470 475 480 Ser Tyr Val Lys Asn Leu Gly Ile Pro Glu Ser Phe Leu Ile Ser Ile 485 490 495 Ala Lys Lys Asn Ile Lys Leu Phe Ile Ile Asp Gly Glu Thr Xaa Asn 500 505 510 Asp Glu Ser Lys Leu Ser Leu Phe Ile Gln Ala Val Phe Trp Lys Leu 515 520 525 Ala Phe Gly Leu Asp Val Ala Glu Cys Thr Asn Arg Ile Trp Lys Ser 530 535 540 Ile Asp Ser Gly Ala Asp Ile Ser Ala Ala Ser Ile Ser Glu Phe Leu 545 550 555 560 Thr Gly Ala Phe Lys Asn Phe Leu Ser Glu Val Pro Leu Ala Leu Tyr 565 570 575 Thr Lys Phe Ser Glu Ile Asn Ile Glu Lys Lys Glu Asp Xaa Glu Glu 580 585 590 Pro Ala Ala Leu Pro Ile Phe Val Asn Glu Thr Ser Phe Leu Pro Asn 595 600 605 Asn Ser Thr Ile Glu Glu Ile Pro Leu Pro Glu Thr Ser Glu Ile Ser 610 615 620 Asp Ile Ala Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Glu Val Glu Asn 625 630 635 640 Lys Leu Arg Pro Asp Leu Pro Val Lys Asn Phe Val Val Lys Val Lys 645 650 655 Glu Asn Arg Arg Val Xaa Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr Ile Phe His 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870 875 880 Pro Lys Gln Pro Val Ile Met Ser Gly Leu Gly Thr Gly Leu Ala Pro 885 890 895 Phe Lys Ala Ile Val Glu Glu Lys Leu Trp Gln Lys Gln Gln Gly Tyr 900 905 910 Glu Ile Gly Glu Val Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Arg His Lys Arg Glu 915 920 925 Glu Tyr Leu Tyr Gly Glu Leu Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Ala Gly Ile 930 935 940 Ile Thr His Ile Gly Ala Ala Phe Ser Arg Asp Gln Pro Gln Lys Ile 945 950 955 960 Tyr Ile Gln Asp Arg Ile Lys Glu Asn Leu Asp Glu Leu Lys Thr Ala 965 970 975 Met Ile Asp Asn Lys Gly Ser Phe Tyr Leu Cys Gly Pro Thr Trp Pro 980 985 990 Val Pro Asp Ile Thr Gln Ala Leu Gln Asp Ile Leu Ala Lys Asp Ala 995 1000 1005 Glu Glu Arg Gly Ile Lys Val Asp Leu Asp Ala Ala Ile Glu Glu Leu 1010 1015 1020 Lys Glu Ala Ser Arg Tyr Ile Leu Glu Val Tyr 1025 1030 1035 <210> 34 <211> 1035 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:sulfide inactive yeast assimilatory sulfite reductase alpha subunit (Met 10, MET10) <220> <221> MOD_RES <222> (135) <223> Xaa = Thr or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (172) <223> Xaa = Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (511) <223> Xaa = Thr or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (590) <223> Xaa = Glu or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (662) <223> Xaa = large or bulky amino acid, Lys, Arg, His, Gln, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr or Trp <400> 34 Met Pro Val Glu Phe Ala Thr Asn Pro Phe Gly Glu Ala Lys Asn Ala 1 5 10 15 Thr Ser Leu Pro Lys Tyr Gly Thr Pro Val Thr Ala Ile Ser Ser Val 20 25 30 Leu Phe Asn Asn Val Asp Ser Ile Phe Ala Tyr Lys Ser Phe Ser Gln 35 40 45 Pro Asp Leu Leu His Gln Asp Leu Lys Lys Trp Ser Glu Lys Arg Gly 50 55 60 Asn Glu Ser Arg Gly Lys Pro Phe Phe Gln Glu Leu Asp Ile Arg Ser 65 70 75 80 Gly Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Phe Ser His Gly Leu Lys Asn Thr 85 90 95 Thr Ala Ile Val Ala Pro Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Phe Ile Asn Ser 100 105 110 Leu Lys Thr Val Ser His Asp Gly Lys Phe Leu Leu Asn Val Gly Ala 115 120 125 Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Xaa Gly Ser Val Thr Asn Asp Tyr Val Thr 130 135 140 Ala Leu Asp Ala Ala Ser Lys Leu Lys Tyr Gly Val Val Thr Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ala Asn Glu Val Gln Ser Val Ala Leu Leu Xaa Leu Ala Ile Ala 165 170 175 Thr Phe Ser Asn Asn Ser Gly Ala Ile Asn Leu Phe Asp Gly Leu Asn 180 185 190 Tyr Ser Lys Thr Val Leu Pro Leu Val Glu Ser Val Pro Glu Ala Ser 195 200 205 Ile Leu Ala Lys Leu Ser Lys Val Ile Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp 210 215 220 Asp Val Leu Asp Lys Phe Asn Glu Leu Thr Gly Leu Arg Leu His Asn 225 230 235 240 Phe Gln Tyr Phe Gly Ala Gln Asp Ala Glu Thr Val Phe Ile Thr Tyr 245 250 255 Gly Ser Leu Glu Ser Glu Leu Phe Asn Ser Ala Ile Ser Gly Asn Asn 260 265 270 Ser Lys Ile Gly Leu Ile Asn Val Arg Val Pro Leu Pro Phe Asn Val 275 280 285 Ala Lys Phe Val Thr His Val Pro Ser Thr Thr Lys Gln Ile Val Val 290 295 300 Ile Gly Gln Thr Leu Asp Gly Ser Ser Pro Ser Phe Leu Arg Ser Gln 305 310 315 320 Val Ser Ala Ala Leu Phe Tyr His Gly Arg Thr Ser Ile Ser Val Ser 325 330 335 Glu Tyr Ile Tyr Gln Pro Asp Phe Ile Trp Ser Pro Lys Ala Val Lys 340 345 350 Ser Ile Val Ser Ser Phe Ile Pro Glu Phe Thr Tyr Asn Ala Asp Ser 355 360 365 Ser Phe Gly Glu Gly Phe Ile Tyr Trp Ala Ser Asp Lys Ser Ile Asn 370 375 380 Ile Asp Val Ala Ser Lys Leu Val Lys Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gly 385 390 395 400 Lys Phe Val Ser Leu Arg Thr Lys Phe Asp Asn Leu Ala Asn Ala Gly 405 410 415 Thr Phe Gln Ala Gln Phe Val Thr Ser Lys Glu Gln Ile Pro Val Ser 420 425 430 Asn Ile Asp Ser Thr Lys Leu Ser Val Val Glu Asp Val Ser Leu Leu 435 440 445 Lys His Leu Asp Val Ala Ala Thr Val Ala Glu Gln Gly Ser Ile Ala 450 455 460 Leu Val Ser Gln Lys Ala Val Lys Asp Leu Asp Leu Asn Ser Val Glu 465 470 475 480 Ser Tyr Val Lys Asn Leu Gly Ile Pro Glu Ser Phe Leu Ile Ser Ile 485 490 495 Ala Lys Lys Asn Ile Lys Leu Phe Ile Ile Asp Gly Glu Thr Xaa Asn 500 505 510 Asp Glu Ser Lys Leu Ser Leu Phe Ile Gln Ala Val Phe Trp Lys Leu 515 520 525 Ala Phe Gly Leu Asp Val Ala Glu Cys Thr Asn Arg Ile Trp Lys Ser 530 535 540 Ile Asp Ser Gly Ala Asp Ile Ser Ala Ala Ser Ile Ser Glu Phe Leu 545 550 555 560 Thr Gly Ala Phe Lys Asn Phe Leu Ser Glu Val Pro Leu Ala Leu Tyr 565 570 575 Thr Lys Phe Ser Glu Ile Asn Ile Glu Lys Lys Glu Asp Xaa Glu Glu 580 585 590 Pro Ala Ala Leu Pro Ile Phe Val Asn Glu Thr Ser Phe Leu Pro Asn 595 600 605 Asn Ser Thr Ile Glu Glu Ile Pro Leu Pro Glu Thr Ser Glu Ile Ser 610 615 620 Asp Ile Ala Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Glu Val Glu Asn 625 630 635 640 Lys Leu Arg Pro Asp Leu Pro Val Lys Asn Phe Val Val Lys Val Lys 645 650 655 Glu Asn Arg Arg Val Xaa Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr Ile Phe His 660 665 670 Ile Glu Phe Asp Ile Ser Gly Thr Gly Met Thr Tyr Asp Ile Gly Glu 675 680 685 Ala Leu Gly Ile His Ala Arg Asn Asn Glu Ser Leu Val Lys Glu Phe 690 695 700 Leu Thr Phe Tyr Gly Leu Asn Glu Ser Asp Val Val Leu Val Pro Asn 705 710 715 720 Lys Asp Asn His His Leu Leu Glu Thr Arg Thr Val Leu Gln Ala Phe 725 730 735 Val Glu Asn Leu Asp Ile Phe Gly Lys Pro Pro Lys Arg Phe Tyr Glu 740 745 750 Ser Leu Ile Pro Tyr Ala Ser Asn Glu Glu Glu Lys Lys Lys Leu Glu 755 760 765 Asp Leu Val Thr Pro Ala Gly Ala Val Asp Leu Lys Arg Phe Gln Asp 770 775 780 Val Glu Tyr Tyr Thr Tyr Ala Asp Ile Phe Glu Leu Phe Pro Ser Val 785 790 795 800 Arg Pro Ser Leu Glu Glu Leu Val Thr Ile Ile Glu Pro Leu Lys Arg 805 810 815 Arg Glu Tyr Ser Ile Ala Ser Ser Gln Lys Val His Pro Asn Glu Val 820 825 830 His Leu Leu Ile Val Val Val Asp Trp Val Asp Asn Lys Gly Arg Lys 835 840 845 Arg Tyr Gly Gln Ala Ser Lys Tyr Ile Ser Asp Leu Ala Val Gly Ser 850 855 860 Glu Leu Val Val Ser Val Lys Pro Ser Val Met Lys Leu Pro Pro Ser 865 870 875 880 Pro Lys Gln Pro Val Ile Met Ser Gly Leu Gly Thr Gly Leu Ala Pro 885 890 895 Phe Lys Ala Ile Val Glu Glu Lys Leu Trp Gln Lys Gln Gln Gly Tyr 900 905 910 Glu Ile Gly Glu Val Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Arg His Lys Arg Glu 915 920 925 Glu Tyr Leu Tyr Gly Glu Leu Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Ala Gly Ile 930 935 940 Ile Thr His Ile Gly Ala Ala Phe Ser Arg Asp Gln Pro Gln Lys Ile 945 950 955 960 Tyr Ile Gln Asp Arg Ile Lys Glu Asn Leu Asp Glu Leu Lys Thr Ala 965 970 975 Met Ile Asp Asn Lys Gly Ser Phe Tyr Leu Cys Gly Pro Thr Trp Pro 980 985 990 Val Pro Asp Ile Thr Gln Ala Leu Gln Asp Ile Leu Ala Lys Asp Ala 995 1000 1005 Glu Glu Arg Gly Ile Lys Val Asp Leu Asp Ala Ala Ile Glu Glu Leu 1010 1015 1020 Lys Glu Ala Ser Arg Tyr Ile Leu Glu Val Tyr 1025 1030 1035 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer HOM2-F <400> 35 cacttaagta cacatacaaa 20 <210> 36 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer HOM2-R <400> 36 gggtcagcga gagaatt 17 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer HOM6-F <400> 37 cctggtggta aagttggg 18 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer HOM6-R <400> 38 gattgtagaa gattgagtag 20 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer SER33-F <400> 39 ggaatctccc aggtttaat 19 <210> 40 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer SER33-R <400> 40 gggcaatcaa aggctat 17 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer MET1-F <400> 41 cgctaataaa ctcgctacaa aag 23 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer MET1-R <400> 42 cgtccttttt gctcaatatc c 21 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer MET5-F <400> 43 gctgcaagca gttatataaa gtg 23 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer MET5-R <400> 44 aaaaccgaac tagccgaag 19 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer MET8-F <400> 45 aaaatcgcta caaagtccg 19 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer MET8-R <400> 46 gcattgttgt tcgttctcc 19 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer PCR-MET10-F <400> 47 cggatcccca atcaccataa cactt 25 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer PCR-MET10-R <400> 48 gccgcggtag ggtcttcagg acgag 25 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer MET10-F-KO <400> 49 caaatagttt cgtttagatg g 21 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer MET10-R-KO <400> 50 gtataatgtg atggttagtt 20 <210> 51 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer MET10-hphMX-F <400> 51 actgtgttta tcacttatgg gtctttagaa tccgaattgt attttgatgg ccgcacgg 58 <210> 52 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer MET10-hphMX-R <400> 52 aacaattcaa aaatgtcagc atatgtataa tactccacat aatcgacagc agtatagcga 60 cca 63 <210> 53 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR confirmation primer JKKanRE <400> 53 gggcgacagt cacatcat 18 <210> 54 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR confirmation primer HYGROB CHK_R <400> 54 tgacggtgtc gtccatcac 19 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET1-S1F <400> 55 tggggagagt tctggtatgc aag 23 <210> 56 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET1-S2F <400> 56 cagatggtta tctcagataa tggag 25 <210> 57 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET1-S3F <400> 57 tttcttcaaa gatcacggat atatt 25 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET1-S1R <400> 58 gctatatcac gttgagtagc gg 22 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET1-S2R <400> 59 ggtactacac cctctgtgac agtt 24 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET1-S3R <400> 60 ctcagttttt ggcattgcca 20 <210> 61 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET5-S1F <400> 61 cctaataaac ttccattggt gatta 25 <210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET5-S2F <400> 62 ccgttttaca gggtgtctct aaga 24 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET5-S3F <400> 63 gacgcgatct tgacgaagct 20 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET5-S4F <400> 64 gaatctggtt actggccatt gt 22 <210> 65 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET5-S5F <400> 65 ctgaaaaatg acaccgactt gg 22 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET5-S6F <400> 66 tggcttgctc tggatcactt 20 <210> 67 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET5-S7F <400> 67 cgatgtcggt ttagttgcta tagtt 25 <210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET5-S8F <400> 68 tggtaatcaa catttggtta tctct 25 <210> 69 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET5-S1R <400> 69 gggcaaccag tcattctcat aa 22 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET5-S2R <400> 70 cttcgacacc catatcatct acag 24 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET5-S3R <400> 71 caattttccc atatcagcga 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET5-S4R <400> 72 catcatcaac agcagcgccg 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET5-S5R <400> 73 ctgatcgaag gcagccttgc 20 <210> 74 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET5-S6R <400> 74 catatggctc tgaatcaatc aataa 25 <210> 75 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET5-S7R <400> 75 ttcacaactt ttttgacaga agaa 24 <210> 76 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET5-S8R <400> 76 cgttagcaat ctccaaggta ggaa 24 <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET8-S1F <400> 77 gcagtgactt caaagacgaa tacc 24 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET8-S2F <400> 78 ctggaggacg ctgtcgtcaa 20 <210> 79 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET8-S1R <400> 79 tcatctctta ctagagcgcc aa 22 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET8-S2R <400> 80 ggtcccagtt cggattgata a 21 <210> 81 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET10-SEQ1-F <400> 81 agtcatcttc gagcaaa 17 <210> 82 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET10-SEQ2-F <400> 82 tcatgatggt aagtttc 17 <210> 83 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET10-SEQ3-F <400> 83 tcaacgtcag agtgccatt 19 <210> 84 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET10-SEQ4-F <400> 84 atcagtcgtt gaagatgtc 19 <210> 85 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET10-SEQ5-F <400> 85 ctgagatctc tgatattgc 19 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET10-SEQ6-F <400> 86 tgcagtagat ttgaagagat 20 <210> 87 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET10-SEQ7-F <400> 87 cacacacatc ggcgct 16 <210> 88 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET10-SEQ1-R <400> 88 cggagtcacg acaccat 17 <210> 89 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET10-SEQ2-R <400> 89 ggctgaaact tgagatctc 19 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET10-SEQ3-R <400> 90 cttgacgtaa ctttctacag 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET10-SEQ4-R <400> 91 tcataatcag caggcgtaac 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET10-SEQ5-R <400> 92 cttctcttca atggttcaat 20 <210> 93 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MET sequencing primer MET10-SEQ6-R <400> 93 agtagggcca gacaagt 17

Claims

설파이트 (sulfite)의 설파이드 (sulfide)로의 전환을 촉매하지 않는 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 효모 세포와 발효 배지를 접촉시키는 것을 포함하여, 발효 배지에서 H₂S 수준을 감소시키는 방법으로서, MET10 폴리펩티드의 662번 위치의 아미노산이 트레오닌이 아닌 방법.
제 1항에 있어서, 폴리누클레오티드가 SEQ ID NO:3의 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하며, 662번의 X는 트레오닌이 아닌 방법.
제 1항에 있어서, 폴리누클레오티드가 SEQ ID NO:3의 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하며, 662번의 X는 리신이 아닌 방법.
제 1항에 있어서, 폴리누클레오티드가 SEQ ID NO:1의 핵산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 공유하는 방법.
제 1항에 있어서, 검출가능한 수준의 H₂S를 갖지 않는 발효 생산물이 생성되며, 발효 생산물이 와인, 맥주 및 샴페인으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제 1항에 있어서, 효모 세포가 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) 세포인 방법.
제 6항에 있어서, 효모 세포가 프리스 데 모세 (Prise de Mousse), 프리미어 쿠베 (Premier Cuvee), 프렌치 레드 (French Red), 몽타셋 (Montachet), 랄레만드 K1 (Lallemand K1), 보르데욱스 (Bordeaux), UCD522, UCD940, Ba25, Ba126, Ba137, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bb19 및 Bb22로 구성된 군으로부터 선택된 와인 효모 균주인 방법.
제 1항에 있어서, 발효 배지가 머스트 (must) 및 맥아즙으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제 1항에 있어서, 발효 배지가 포도 쥬스 머스트인 방법.
설파이트의 설파이드로의 전환을 촉매하지 않는 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 발현 벡터로서, MET10 폴리펩티드의 662번 위치의 아미노산이 트레오닌이 아니며, 폴리누클레오티드는 발현 조종 서열에 작동가능하게 연결된 발현 벡터.
제 10항에 있어서, 폴리누클레오티드가 SEQ ID NO:3의 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하며, 662번의 X는 트레오닌이 아닌 발현 벡터.
제 10항에 있어서, 폴리누클레오티드가 SEQ ID NO:3의 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하며, 662번의 X는 리신이 아닌 발현 벡터.
제 10항에 있어서, 폴리누클레오티드가 SEQ ID NO:1의 핵산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 공유하는 발현 벡터.
제 10항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제 14항에 있어서, 세포가 효모 세포인 숙주 세포.
제 14항에 있어서, 세포가 사카로마이세스 세레비시애 세포인 숙주 세포.
설파이트의 설파이드로의 전환을 촉매하지 않는 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 외생성 폴리누클레오티드를 포함하는 황화수소를 생성하지 않는 개선된 효모 세포로서, MET10 폴리펩티드의 662번 위치의 아미노산이 트레오닌이 아니며, 개선된 효모 세포의 어미 세포는 황화수소를 생성하는 효모 세포.
제 17항에 있어서, 폴리누클레오티드가 SEQ ID NO:3의 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하며, 662번의 X는 트레오닌이 아닌 효모 세포.
제 17항에 있어서, 폴리누클레오티드가 SEQ ID NO:3의 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하며, 662번의 X는 리신이 아닌 효모 세포.
제 17항에 있어서, 폴리누클레오티드가 SEQ ID NO:1의 핵산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 공유하는 효모 세포.
제 17항에 있어서, 효모 세포가 사카로마이세스 세레비시애 세포인 효모 세포.
제 21항에 있어서, 효모 세포가 프리스 데 모세, 프리미어 쿠베, 프렌치 레드, 몽타셋, 랄레만드 K1, 보르데욱스, UCD522, UCD940, Ba25, Ba126, Ba137, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bb19 및 Bb22로 구성된 군으로부터 선택된 와인 효모 균주인 효모 세포.
효모 세포 군집을 포함하는 감소된 수준의 황화수소를 생성하는 개선된 효모 세포 배양물로서, 효모 세포가 설파이트의 설파이드로의 전환을 촉매하지 않는 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 외생성 폴리누클레오티드를 포함하며, MET10 폴리펩티드의 662번 위치의 아미노산이 트레오닌이 아니며, 개선된 효모 세포 배양물이 어미 세포의 배양물과 비교하여 감소된 황화수소를 생성하는 효모 세포 배양물.
제 23항에 있어서, 배양물이 검출가능한 수준의 황화수소를 생성하지 않는 효모 세포 배양물.
제 23항에 있어서, 폴리누클레오티드가 SEQ ID NO:3의 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하며, 662번의 X는 트레오닌이 아닌 효모 세포 배양물.
제 23항에 있어서, 폴리누클레오티드가 SEQ ID NO:3의 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하며, 662번의 X는 리신이 아닌 효모 세포 배양물.
제 23항에 있어서, 폴리누클레오티드가 SEQ ID NO:1의 핵산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 공유하는 효모 세포 배양물.
제 23항에 있어서, 효모 세포가 사카로마이세스 세레비시애 세포인 효모 세포 배양물.
제 23항에 있어서, 효모 세포의 군집이 프리스 데 모세, 프리미어 쿠베, 프렌치 레드, 몽타셋, 랄레만드 K1, 보르데욱스, UCD522, UCD940, Ba25, Ba126, Ba137, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bb19 및 Bb22로 구성된 군으로부터 선택된 와인 효모 균주로부터 유래되는 효모 세포 배양물.
감소된 수준의 황화수소를 생성하는 개선된 효모 세포를 생성시키는 방법으로서, 설파이트의 설파이드로의 전환을 촉매하지 않는 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 어미 효모 세포에 유입시켜 설파이드 활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 외생성 폴리누클레오티드를 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드로 대체하는 것을 포함하며, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드의 662번 위치의 아미노산이 트레오닌이 아니며, 개선된 효모 세포의 어미 세포는 황화수소를 생성하는 방법.
제 30항에 있어서, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 재조합에 의해 유입되는 방법.
제 30항에 있어서, 설파이드 불활성 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 백-크로싱 (back-crossing)에 의해 유입되는 방법.
제 30항에 있어서, 개선된 효모 세포가 검출가능한 수준의 황화수소를 생성하지 않는 방법.
제 30항에 있어서, 폴리누클레오티드가 SEQ ID NO:3의 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하며, 662번의 X는 트레오닌이 아닌 방법.
제 30항에 있어서, 폴리누클레오티드가 SEQ ID NO:3의 MET10 폴리펩티드를 엔코딩하며, 662번의 X는 리신이 아닌 방법.
제 30항에 있어서, 폴리누클레오티드가 SEQ ID NO:1을 포함하는 방법.
SEQ ID NO:1에 제공된 서열 또는 이의 보체와 야생형 MET10을 엔코딩하는 핵산을 구별할 수 있는 분리된 폴리누클레오티드.
발현 조종 서열에 작동가능하게 연결된 제 37항에 따른 폴리누클레오티드를 포함하는 박현 벡터.
제 38항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제 39항에 있어서, 세포가 사카로마이세스 세레비시애 세포인 숙주 세포.