KR20100011173A

KR20100011173A - 스트레스 유도성 자가-절단형 식물형질전환 벡터 및 이를이용한 선발 마커 프리 식물체의 제조방법

Info

Publication number: KR20100011173A
Application number: KR1020080072282A
Authority: KR
Inventors: 우희종; 조현석; 이시명; 임선형; 신공식
Original assignee: 대한민국(관리부서:농촌진흥청)
Priority date: 2008-07-24
Filing date: 2008-07-24
Publication date: 2010-02-03
Also published as: KR101040579B1

Abstract

본 발명은 식물 선발마커 제거 식물 형질전환체의 제조를 위한 벡터와 이를 이용한 식물 형질전환체의 제조방법에 관한 것으로서, 그 구성은 마커-프리(marker free) 형질전환 식물체 제조를 위해 스트레스 유도성 프로모터에 의한 부위 특이적 재조합 유전자의 발현을 이용하여 선발마커를 제거할 수 있는 벡터를 제조하고, 상기 벡터를 이용하여 형질전환 과정에서 발생되는 스트레스에 의해 자발적으로 식물선발마커 유전자가 제거된 형질전환체를 제조하는 과정과, 선발표지를 이용하여 획득한 형질전환체를 재분화를 통해 식물선발마커를 제거하는 제조 방법을 제공한다.

이러한 방법은 식물 형질전환체내에서 식물선발마커를 제거하기 위해 사용되는 동시형질전환방법에 비해 형질전환 효율이 높고 선발표지 제거 형질전환체의 제조가 간편하며 자가 및 타가수정식물의 적용이 가능하다.

스트레스 유도성 프로모터, 선발마커 제거 발현 벡터, 선발마커 제거 식물체,

Description

스트레스 유도성 자가-절단형 식물형질전환 벡터 및 이를 이용한 선발 마커 프리 식물체의 제조방법{Plant transformation vector and marker free transgenic plants using stress inducible site-specific recombination}

본 발명은 식물선발마커 제거 식물 형질전환체 제조를 위한 벡터와 이를 이용한 식물 형질전환체의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 스트레스 유도성 프로모터 (stress inducible peroxidase promoter)에 의해 부위 특이적 재조합효소(site specific recombinase)를 발현하도록 하여 식물 선발마커를 제거할 수 있는 벡터 그리고 이를 이용한 선발마커제거 형질전환 식물체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

현재까지 식물체의 형질전환에 선발마커로서 사용된 대부분의 유전자는 항생제나 제초제 저항성 유전자로서 매우 유용하게 사용되고 있지만 단점도 있다. 항생제와 제초제를 이용하여 형질전환된 세포를 선발할 때 있어 증식이나 분화에 부정적 효과를 미칠 수 있을 뿐 아니라 부정 발아(adventitious shoots)가 생길 수 있 다(Ebinuma H, Sugita K, Matsunaga E and Yamakado M (1997) Selection of marker-free transgenic plants using the isopentenyl transferase gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2117-2121). 또한, 계속적으로 발현되는 이러한 유전자들이 실험실 밖의 다른 생물체로 전이 될 수 있는 가능성의 문제로 환경 및 인체 유해성 논란이 되고 있다.

현재까지 형질전환 식물로부터 선발마커 유전자 제거는 넓게 보아 두 가지 접근 방법을 이용하고 있다. 첫 번째는 동시형질전환 방법(co-transformation)을 이용하여 원하는 유전자와 선발마커를 식물의 다른 염색체내에 삽입되도록 한 후 교잡에 의해 분리시키는 방법이며 다른 방법은 위치-특이적 재조합 시스템(site-specific recombination)을 이용하는 것으로 위치 특이적 재조합 효소의 활성을 유도하여 선발마커 양쪽에 위치한 두개의 인식부위를 절단하도록 만드는 것이다.

식물체 내에서 기능을 보이는 위치-특이적 재조합 효소는 여러 가지가 보고되었으며 대표적으로는 bacteriophage P1 유래 Cre-lox 시스템 (Dale, E.C. and Ow, D.W. (1991) Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 10: 558-562), Saccharomyces cerevisiae 유래 FLP-frt 시스템(O'Gorman S., Fox D. T. and Wahl G. M. (1991) Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Science. 251: 1351-1355) 그리고 Zygosaccharomyces rouxii 유래 R-RS 시스템(Onouchi H, Yokoi K, Machida C, Matsuzaki H, Oshima Y, Matsuoka K, Nakamura K, Machida Y.(1991) Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Nucleic Acid Res. 19: 6373-6378)이 있다.

위치-특이적 재조합 효소를 이용하여 형질전환체의 선발마커를 제거할 경우 원하는 시기에 재조합 유전자의 발현을 유도하여 다른 불필요한 유전자를 제거하는 방법은 매우 유용하며 이런 필요에 의해 유도성이나 조직 특이적 프로모터가 같이 사용되고 있다. 예를 들면 식물체내에서 사이토키닌의 생물학적 검정을 위해 사용되었던 열 충격 유도성(heat shock inducible) 프로모터나 화합물인 덱사메타손 유도성 (dexamethasone inducible) 프로모터를 위치 특이적 재조합 효소의 유도에 접합시키려는 시도 (Yong W., Bojun C., Yuanlei H., Jingfu L. and Zhongping L. (2005) Inducible excision of selectable marker gene from transgenic plants by the Cre/lox site-specific recombination system. Transgenic Res. 14: 605-614; Sreekala C., Wu L., Gu K., Wang D., D Tian D. and Yin Z. (2005) Excision of a selectable marker in transgenic rice ( Oryza sativa L.) using a chemically regulated Cre /loxP system. Plant Cell Rep 24: 86-94)가 현재 활발히 시도되고 있다. 그러나 위치-특이적 재조합 시스템의 사용으로 선발마커 프리 식물체를 만드는 체계화된 방법은 없으며, 형질전환 후 재분화, 아그로인필트레이션 (agroinfiltration) 등의 과정을 거쳐야 하는 약점을 가지고 있다.

지금까지 국내외 연구 현황을 살펴보면, 한국과학기술원에서 동시형질전환 시스템에 의한 선발 마커의 제거 방법을 연구하였고, 한국의 특정 기업에서는 애그로-인필트레이션을 사용하여 유전자를 식물에 삽입시켜 선발마커가 제거되는 식물 체 및 이를 제조하는 방법을 개발한 바 있었다. 또한, 일본 기업에서도 네거티브 선발마커 및 화합물 유도성 자가 선발마커 제거 시스템의 개발을 시도하였다. 또한, 중국 대학에서는 고온 유도성 프로모터 발현을 이용한 선발마커 제거에 관하여 연구하였고, 싱가포르에서도 화합물 유도성 자가 선발마커 제거 벡터를 이용한 작물을 개발 시도하였다. 이외에도 미국 대학에서 재조합 유전자를 이용한 선발마커 제거에 관하여 연구하였고, 화합물 유도성 자가 선발마커 제거 시스템도 개발한 바 있었다.

한편 이와 관련된 국내외 특허 출원 현황을 살펴보면, 2003년에 이선교 등을 포함한 넥스젠사에서 마커-프리 형질전환 식물체 생산을 위한 신규방법을 기술하여 특허 출원 (2003년 대한민국 특허출원 1020030064926호 참조)하였고, 정원일 등을 포함한 한국과학기술원에서는 선발표지 유전자가 제거된 형질전환 식물체의 제조를 위한 벡터 및 이를 이용한 형질전환체의 제조방법 (2003년 대한민국 특허출원 1020030076449호)에 관한 특허를 출원한 바도 있었다. 또한 2001년 사지타 등 (Sugita et al.,; Nippon paper Industries Co.)이 마커 유전자를 조건적으로 제거하는 식물체 형질전환용 벡터를 개발하여 특허 출원하였다 (미국 특허출원 US6326192호) 이외에도 2004년 몰러 등이 록펠러 대학 (Moller et al.,; Rockefeller University)에서 형질전환 식물의 전이 유전자를 활성화하고 제거하여 유도성 부위-특이적 재조합에 관해 특허 출원한 바도 있었다 (미국 특허출원 US6723896호; Inducible site-specific recombination for the activation and removal of transgenes in transgenic plants). 또한, 2007년 주오 등이 록펠러 대 학교 (Zuo 등; Rockefeller University)에서 발현되지 않는 마커를 가진 형질전환 식물을 제조하는 데 화합물 유도성 프로모터를 사용하여 특허 출원하였다 (미국 특허출원 US7230157; Chemical inducible promoter used to obtain tansgenic plants with a silent marker and organisms and cells and methods of using same for screening for mutations).

이에 본 연구에서는 다양한 환경 스트레스에 의해 발현이 유도되는 고구마 유래의 스트레스 유도성 프로모터와 위치-특이적 재조합 시스템(FLP-frt)이 결합된 식물형질전환용 벡터를 개발하고, 상기 발현 벡터를 이용하여 담배 식물체에서 다른 과정의 처리 없이, 형질전환 과정의 스트레스에 의한 재조합유전자의 발현에 의하여 선발마커 제거가 이루어진 이형 선발마커 제거 식물체(heterozygous marker-free plant)를 획득하여 종자에 의한 유전자 분리를 이용하여 선발마커 프리 식물체(homozygous marker free plant)를 얻을 수 있었다. 또한 상기 벡터의 형질전환체를 hydrogen peroxide 화합물을 이용한 재조합효소 발현 유도 재분화 과정을 거쳐 선발마커 프리 식물체를 개발하였고 종자의 후대검정을 실시하여 선발마커 프리 상태가 안정적으로 유지되는 것을 확인함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.

본 발명의 목적은 선발마커 제거 식물체의 제조를 위해 스트레스 유도성 프로모터와 재조합 시스템을 결합시킨 자가 절단형 식물 형질전환 벡터를 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 다른 목적은 식물체 형질전환 벡터를 이용하여 선발표지 및 재조합효소 유전자가 제거된 형질전환체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스트레스 유동성 프로모터, 부위-특이 재조합효소 유전자, 재조합효소 인식 부위를 포함하여 선발 마커를 제거할 수 있는 식물 형질전환용 발현 벡터를 제공한다.

상기 프로모터는 스트레스 유동성 퍼옥시다제 프로모터 (stress inducible peroxidase promoter)인 것이 바람직하고, 고구마로부터 유래한 스트레스 유동성 퍼옥시다제 프로모터인 것은 더욱 바람직하다.

상기 재조합효소 유전자는 스트레스 유동성 퍼옥시다제 프로모터로부터 발현되는 부위 특이적 재조합효소 유전자인 것이 바람직하고, 부위 특이적 재조합효소 FLP (site specific recombinase FLP) 유전자인 것은 더욱 바람직하다. 또한, 상기 인식 부위는 재조합효소 인식부위 frt의 염기서열인 것이 바람직하다.

본 발명은 식물 형질전환용 발현 벡터 pWHF-P를 제공한다 (수탁번호: KACC 95088P). 상기 식물 형질전환용 발현 벡터를 2008년 07월 22일자로 농업생명공학연구원 부설 미생물기탁기관에 기탁하였다.

또한, 본 발명은 식물 형질전환용 발현 벡터 pWHF-P로 형질전환되어 식물 운반체로 사용되는 아그로박테리움 속 (Agrobacterium sp.) 미생물을 제공한다.

상기 미생물은 상기 발현 벡터 pWHF-P로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 (Agrobacterium tumefaciens LBA4404)인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 아그로박테리움 속 미생물로 형질전환되어 선발 마커를 제 거할 수 있는 형질전환 식물체를 제공한다. 상기 식물체는 자가 수정 및 타가 수정할 수 있는 식물체를 모두 포함하고, 바람직하게는 담배를 포함한다.

또한, 본 발명은 (1) 식물체의 잎을 절단하고; (2) 상기 아그로박테리움 속 미생물을 감염시키고; (3) 과산화수소 (hydrogen peroxide)가 첨가된 선발배지를 사용하여 재분화를 유도하고; (4) 뿌리를 유도하여 순화하고; 및 (5) 유전자의 형질전환을 분석하는; 과정으로 이루어진 선발 마커를 제거할 수 있는 식물체의 제조방법을 제공한다.

상기 식물체는 자가 수정 및 타가 수정할 수 있는 식물체를 모두 사용하여 제조될 수 있고, 바람직하게는 담배를 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 i) 스트레스 유도성 프로모터(SWPA2 promoter), 재조합 유전자와 인식부위(FLP/frt)와 발현이 가능 선발마커 유전자(hph)를 포함하는 식물 형질전환 벡터를 제조하는 단계; ii) 상기 발현 벡터를 식물체에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; iii) 상기 형질전환체의 유전자 분석을 이용하여 외래유전자가 제거가 일어난 종자분리 마커제거 형질전환체(Segregated marker-free plant line)를 선발하여 배양 후 종자의 유전자 분리를 이용하여 선발마커 프리 식물체를 만드는 단계; iv) 형질전환체를 화합물 처리한 재조합효소 발현 유도 배지에서 재분화하여 외래유전자를 제거한 선발마커 프리 식물체를 만드는 단계로 구성된다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 스트레스 유도성 발현에 의해 항생제 선발마커와 같은 외래 유전자를 선택적으로 자가 절단할 수 있는 벡터 시스템을 제작하고 식물체에 도입하여 선발마커 프리 식물체를 제조하였다. 본 벡터 시스템은 선발마커 제거를 위해 다른 처리나 과정 없이 일반적인 형질전환 과정만으로 선발마커 제거가 가능하기 때문에 효율적이며 간편하다. 또한 화합물 처리를 이용한 재분화 과정을 통해서도 고효율의 선발마커 프리 식물체의 제조가 가능하기 때문에 자가 수정 식물체 뿐 아니라 타가수정 식물체의 선발마커 프리 형질전환체 제조에 사용할 수 있는 장점이 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 자가 절단형 선발마커 제거를 위한 식물 형질전환용 벡터 제조

본 발명에 따른 자가 절단형 선발마커 프리 식물체 제조를 위한 식물형질전환용 벡터를 도 1 및 도 2에 모식도로 나타내었다. 형질전환 벡터는 스트레스 유도성 프로모터에 의해 위치특이적 재조합 효소인 FLP가 발현되도록 하였고 하이그로마이신 저항성 유전자 상류와 부위 특이적 재조합 유전자 하류에 재조합 효소 인식 부위인 frt를 위치시켜 절단 되도록 하였다. 이하 상세한 벡터의 제조과정을 구체적으로 설명하기로 한다.

벡터의 제조는 우선 기본 벡터의 오른쪽 경계면(Right border, RB)에 위치시킬 35S 프로모터, frtm 인식부위, 하이그로마이신 항생제 저항성 유전자와 polyA tail 유전자를 가진 벡터 클론, 퍼옥시다제 (peroxidase) 프로모터와 FLP 재조합효소 유전자, Nos 터미네이터 부위를 가지는 클론, frt 인식부위와 bar 유전자와 Nos 터미네이터를 가지는 클론을 각각 달리 만들어 식물 형질전환 벡터 pBI121을 기본 골격으로 연결하여 완성하였다 (표 1, 도 1 및 도 2 참조).

(1-1) P35S - frtm - HPT - pA 유전자 클론 벡터의 제조

35S 프로모터와 하이그로마이신 저항성 유전자(HPT) 를 얻기 위하여 pCAMBIA 1304를 template DNA로 이용하여 PCR 반응을 실시하였다. 공급자가 제공한 매뉴얼에 따라 증폭된 반응물은 pGEM-T easy 벡터(promega, USA)에 각각 클로닝 하였고, 염기서열 분석에 의하여 상기 목적하는 DNA서열이 정확히 증폭된 것을 확인하였다. HPT 유전자와 35S 프로모터 클로닝을 위한 프라이머 염기서열에는 제한효소 ClaI, HindIII 부위와 SpeI, BamHI 부위를 각각 포함하고 있기 때문에 제한효소로 처리한 후 pBluescript SK로 클로닝하여 연결하였다. frt DNA 염기서열은 제한효소 HindIII, BamHI 부위와 상보성(compatible) 있는 두개의 프라이머를 연결(ligation)한 후 35S 프로모터와 하이그로마이신 저항성 유전자(HPT)가 연결된 벡터의 HindIII, BamHI, 제한효소부위에 연결시켰다.

(1-2) SWPA2 - FLP - NosT 유전자 클론의 제조

위치-특이적 재조합 유전자(FLP)는 pOG44 운반체 DNA를 template DNA로 사용하여 PCR 반응하여, 5'말단에 BamHI, 3'말단부위에 SacI 제한 효소 부위를 가지는 약 1.2 Kb길이의 DNA 반응물을 얻었다. 획득한 DNA 산물은 pBI121 벡터에 제한효소 BamHI, SacI 제한효소 절단부위를 이용하여 클로닝 하였고 P35S-FLP-NosT 부위를 제한효소 HindIII, EcoRI으로 부분절단하여 정제한 후 pBlueScript 벡터에 클로닝 하였다. 또한 스트레스 유도성 프로모터(peroxidase promoter)는 고구마의 엽록체를 분리하여 DNA를 추출한 뒤 제한효소 ClaI, BamHI 위치가 염기서열 내에 포함되도록 합성한 primer를 이용하여 PCR을 실시하여 증폭하였다. 증폭된 DNA는 pGEM-T easy 벡터에 클로닝한 후 제한효소를 처리하여 pBlueScript-P35S-FLP-NosT 벡터의 35S 프로모터 부위와 교체하여 완성하였고 염기서열 분석에 의하여 상기 목적하는 DNA서열이 정확한 것을 확인하였다.

(1-3) frt-Bar-pA 유전자 클론의 제조

제초제 내성 유전자인 Bar 유전자와 PolyA tail 부위를 얻기 위하여 5'말단과, 3'말단 부위에 제한효소 SpeI, XbaI site가 만들어질 수 있도록 primer를 합성하여 pCAMBIA3301 운반체를 template로 이용하여 PCR 반응을 실시하였다. PCR 증폭된 약 750bp의 DNA 반응물을 pGEM-T easy 벡터에 클로닝하여 적절한 제한효소 절단 후 전기영동으로 목적하는 DNA임을 확인하였고, pBlueScript KS에 클로닝하였다. frt의 염기서열은 pBlueScript KS에 존재하는 제한효소 부위 XmaI, SpeI에 상보적인 염기말단부위를 가지는 frt DNA 절편을 합성하여 연결한 후 pBlue-BarpA 벡터에 삽입시켜 완성하였고 염기서열 분석에 의하여 상기 목적하는 DNA서열이 정확한 것을 확인하였다.

(1-4) pWHF -P 식물 벡터의 제조

식물 형질전환 벡터인 pBI121을 기본벡터로 하여 pBlue-frt-Bar-pA 벡터는 제한효소 XmaI, SacI을 이용하여 frt-Bar-pA 부위를 pBI121에 치환하였고, SWPA2-FLP 부위의 치환은 ClaI, SmaI 제한효소를 사용하였다. 또한 35S promoter-frt-HPT-pA DNA의 치환은 NheI/SpeI, ApaI 제한효소를 이용한 상보 접합을 실시하여 식물형질전환 벡터 pWHF-P를 완성하였다 (서열목록의 서열번호 1 참조).

실시예 2: pWHF-P 벡터를 이용한 형질전환 담배의 제조

(2-1) 담배 형질전환체의 제조

실시예 1에서 제작된 pWHF-P 식물발현벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)(H, R. and Willmitzer L. (1988) Nucleic Acids Res 16:9877)에 freeze-thaw방법을 이용하여 형질전환 후, 형질전환된 아그로박테리움액과 담배(Nicotiana tabaccum cv Xanthi) 잎 절편과 공동 배양하여 담배를 형질전환 하였다.

형질전환을 위해 대조군인 야생형 담배를 1 mg/L NAA, 1 mg/L BA, 10 g/L 슈크로스(sucrose), 8 g/L 한천(agar)이 첨가된 MS배지에서 2일간 공동배양한 후, 형질전환된 재분화 식물체를 얻기 위하여 1 mg/L NAA, 1 mg/L BA, 300 mg/L 카르베니실린(carbenicillin), 10 mg/l 하이그로마이신(hygromycine), 10 g/L 수크로스, 8 g/L 한천 첨가된 MS배지에서 배양한 다음, 3주마다 계대배양 하였다. 재분화된 신초는 300 mg/L 카르베니실린, 10 mg/L PPT(Phosphinothricin), 10 g/L 수크로스, 8 g/L 한천이 첨가된 MS배지로 옮겨 발근을 유도하였다. 배양은 26℃, 16시간 광주기/8시간 암주기의 조건에서 배양하였고, 발근된 개체는 순화 후 화분으로 이식하여 온실에서 평균기온 26℃이상의 조건에서 생육시켰다.

(2-2) PCR에 의한 형질전환체 분석

실시예 2-1에서 제조한 형질전환 담배의 형질전환 여부를 확인하기 위하여, 하이그로마이신 배지에서 일차 선발한 재분화 소식물들의 잎이 4내지 5엽으로 자랐을 때 식물의 잎을 절단하여 게놈 DNA를 분리한 후 표 2에 기재된 하이그로마이신 저항성 유전자(hpt)와 35S 프로모터, 제초제 저항성 유전자(Bar)의 특이 프로모터를 이용하여 PCR을 실시하여 형질전환체를 분석하였다 (도 3 참조). 그 결과 실험한 모든 식물체에서 0.8kb의 하이그로마이신 저항성 유전자가 검출되어 형질전환이 이루어진 것임을 확인하였다. 또한 35S 프로모터와 Bar 유전자에 특이적인 primer로 PCR한 12개체 중 4개체에서는 위치-특이적 재조합 유전자의 발현에 의한 자가 절단이 이루어졌을 때 생길수 0.7kb, 1.1kb의 DNA 밴드가 검출되었다. 이러한 결과는 일부 개체에서는 벡터의 카피수가 2 이상이 삽입되어 이중 일부가 선발마커 제거가 이루어진 것으로 판단된다.

실시예 3: 종자분리에 의한 선발마커 프리 형질전환체 확인 및 형질전환체 분석

(3-1) 염기분석을 이용한 pWHF -P 벡터의 식물체내 절단 검증

실시예 2-2에서 수행한 35S promoter와 Bar 유전자 내의 염기서열 내의 프라이머를 사용하여 실시한 PCR 반응 산물 (도 3의 B1)이 FLP 효소의 작용에 의한 frt 부위에서의 절단인지를 확인하기 위하여 제조자의 매뉴얼에 따라 pGEM-easy 벡터에 클로닝 한 후 M13 reverse와 forward primer를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 염기서열 결과 35S primer의 뒤쪽 부분과 bar 유전자의 앞쪽에 존재하는 FRT site를 확인할 수 있었으며, FRT의 염기서열 분석으로 정확한 위치에서 선발마커 제거가 이루어짐을 확인하였다(도 4 참조)

실시예 2-1에서 제조한 형질전환 담배를 하이그로마이신 배지에서 일차 선발한 후 화분으로 옮긴 후 bar 유전자의 발현 여부를 알아보기 위하여 Trait LL test kit(SDI, USA) 분석 실험과 0.1% 바스타(Basta) 제초제 (경농, 한국) 현탁액을 엽면에 살포하였다. 실시예 2-2의 35F와 barR 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였을 때 FRT부위가 절단되었을 때 예상되는 DNA 밴드가 검출된 식물체들은(도 5의 B) trait LL 테스트 키트에서 양성으로 판별되었고, 바스타 현탁액에 대해서도 저항성을 나타내어, FRT 부위의 정확한 절단에 의해 bar 유전자가 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 5 참조).

(3-3) 형질전환체의 종자의 항생제 및 제초제 저항성 후대 검정

실시예 2를 통해서 형질전환하여 유전자 도입 및 발현이 확인된 담배식물체를 자가수정하여 얻은 T1 종자를 70% (v/v) 에탄올에서 2분간 표면 살균한 다음, 2.5% (v/v) 소듐 하이포클로라이트 (sodium hypochlorite) 용액에서 10분간 살균하고 멸균수로 3회 세척하였다. 살균된 종자는 1/2 MS 기본배지 (Murashige and Skoog, 1962)에 40 mg/l 하이그로마이신 (hygromycine)과 15 mg/l PPT (phosphinothricin)를 각각 첨가하여 제조한 배지에 파종하였다. 파종된 종자는 26℃ 16L/8D 광주기에서 2주간 배양하여 저항성 개체와 감수성 개체의 분리비를 추정하였다. 담배 형질전환체의 하이그로마이신 배지와 PPT 배지에서의 후대종자 분리비율을 도 3b에 나타내었다. 하이그로마이신 저항성에 대해서는 모든 개체에서 식물체에 유전자가 삽입되어 후대 종자에서도 유전자가 분리비에 따라 저항성을 나타내는 것을 확인할 수 있었고, 실시예 2-2에서 하이그로마이신 (hygromycine) 유전자에 특이적인 DNA 염기서열을 이용하여 제조한 프라이머를 가지고 PCR 하였을 때 DNA 증폭이 일어났던 개체들에서는 PPT 배지에서 약 3:1의 비율로 후대종자 분리비가 나타나 선발마커의 자가 절단이 일어난 삽입유전자가 독립적으로 존재하여, 발현되고 있음을 확인할 수 있었다.

(3-4) 유전자 세대분리에 의한 선발마커 제거 형질전환체 선발 및 PCR 분석 확인

항생제 하이그로마이신와 PPT 내성을 함께 보이는 실시 예 3-3의 종자를 15mM PPT가 첨가된 MSO 배지에 파종 후 발아된 식물체를 다시 무 제초제 배지로 옮겨 배양하였고, 식물체의 일부를 채취하여 DNA를 추출 후 하이그로마이신 저항성 유전자 특이적 프라이머 및 35S 프로모터-bar 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 하이그로마이신 저항성 유전자가 제거된 개체만을 선발하여 도 6에 나타난 바와 같이 항생제 선발마커가 제거된 식물체를 완성하였다.

실시예 4: 재분화 과정의 화합물 유도에 의한 선발마커 프리 형질전환체 확인 및 분석

(4-1) 형질전환체 캘로스에서 과산화수소 농도별 처리에 따른 유전자 발현 분석

도 5의 3번과 10번 형질전환체 라인의 엽을 절단하여 0, 1, 5mM 과산화수소가 첨가된 MSBN 배지에 치상한 후 캘러스 (callus)를 유도하였고, 만들어진 캘러스를 분쇄하여 전체 RNA를 추출하였다. 분리된 전체 RNA는 Superscriptase II (Life Technologies, 미국)를 이용하여 cDNA를 합성하였고 FLP, Bar, Hyg 및 Ubi의 유전자 특이적 DNA 염기서열을 가진 프라이머를 제작하여 증폭물이 과다하게 생성되지 않는 PCR 반복 사이클 내에서 RT-PCR을 실시하였고 도 8에 나타내었다. 과산화수소 농도를 높게 처리한 배지에서의 캘로스에서 FLP와 Bar에 대한 유전자 발현이 많은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 과산화수소 (hydrogen peroxide)의 농도가 높아짐에 따라 스트레스 유도성 프로모터인 SWAP2가 활성화되어 FLP 발현이 높아졌고, FLP 부위 특이적 재조합효소에 의한 FRT 부위의 절단이 많이 발생하여 Bar 유전자의 발현이 증가한 것으로 보인다 (도 8 참조)

(4-2) 화합물 처리 재분화 과정을 이용한 선발마커 제거 식물체 선발 및 검증 실시예 3-3의 도 3b의 9, 10번 형질전환체의 절편을 이용하여 실시예 4-1에서 FLP유전자의 발현이 가장 높았던 5mM 과산화수소가 첨가된 MSBN 배지에 엽을 절단 치상하여 캘로스를 유도시켰다. 재분화된 캘로스에서 발생한 신초는 10 g/L 수크로스, 8 g/L 한천이 첨가된 MS배지로 옮겨 발근을 유도시켰다. 재분화시킨 식물체 엽을 채취하여 total DNA를 추출하여 하이그로마이신 유전자 및 절단을 알아보기 위해 35S 프로모터와 Bar 유전자의 염기서열을 가진 프라이를 이용하여 PCR을 수행하였다 (표 2). 도 9에 나타난 바와 같이, 효율의 차이는 있지만 9번, 10번 두 line에서 모두 하이그로마이신 유전자가 검출되지 않는 재분화 개체를 얻을 수 있었다. 또한 하이그로마이신 유전자가 제거된 개체에 대한 35S와 bar 유전자 부분의 프라이머를 사용하여 PCR을 실시한 결과 DNA 산물이 매우 강하게 증폭되었다. 이러한 결과는 하이그로마이신 선발마커 유전자의 절단이 올바르게 이루어졌음을 확인하는 것이다.

재분화 식물체 가운데 PCR 검증을 사용하여 하이그로마이신 저항성 유전자가 증폭되지 않은 식물체를 골라 서던 분석을 실시하였다 (Sambrook J and Russell D.W., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, cold spring harbor laboratory press).

도 10에서 나타난 바와 같이, 하이그로마이신 저항성을 나타내는 9번 line의 형질전환 식물체는 단편이 검출되었지만 (도 10의 P), 선발마커 제거가 이루어진 식물체에는 단편이 발견되지 않아 완전히 하이그로마이신 저항성 유전자가 식물체내에서 제거된 것을 확인하였다 (도 10의 1 내지 4).

(4-3) 화합물 처리 재분화 선발마커 프리 식물체의 후대 검정

실시예 4-2의 과정을 거쳐 선발마커가 제거된 식물체들의 종자를 채종하여 하이그로마이신 저항성에 대한 판별을 실시하여 완전히 항생제 선발마커가 제거되었는지를 확인하기 위하여 후대 검정을 실시하였다. 실시예 3-3에 기술된 조건에 따라 자가 수분된 종자를 하이그로마이신 항생제와 PPT 제초제가 각기 첨가된 1/2 MS 기본배지 (Murashige and Skoog, 1962)에 종자를 소독 후 치상하여 종자의 발아를 관찰하였다. 도 7에 나타난 바와 같이 재분화 이전의 형질전환 담배의 종자는 Hyg (hygromycine) 첨가배지에서 발아되며 PPT 첨가 배지에서는 발아되지 않지만 화합물 hydrogen peroxide 처리 재분화에 의해 항생제 선발마커가 제거된 개체의 종자에서는 반대로 Hyg 첨가배지에서 완전히 발아되지 못하였고, 선발마커가 제거되면서 bar 유전자의 발현이 유도되어 PPT 첨가 배지에서 발아되는 것을 확인할 수 있었다.

도 1은 본 발명의 선발 마커를 제거하는 식물 형질전환용 벡터의 제작 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.

LB: 왼쪽 경계 (left border); 35S^P: 칼리플라워 모자익 바이러스 프로모터 (Cauliflower mosaic virus promoter); pA: 노팔린 합성효소 (Nopaline synthase; nos) 종결 서열; Bar: 제초제 저항성 유전자; FRT: 위치 특이적 재조합효소 (FLP) 인식부위; POD^P: 고구마 엽록체의 퍼옥시다제 프로모터; FLP: 위치 특이적 재조합효소 유전자; HPT: 하이그로마이신 저항성 유전자; RB: 오른쪽 경계 (right border).

도 2는 본 발명의 선발 마커를 제거하는 식물 형질전환용 운반체를 모식적으로 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 형질전환 식물로 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 실시하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 형질전환 식물의 PCR 산물을 염기서열 분석하여 선발 마커의 제거를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명의 형질전환 담배에 제초제인 바스타를 처리하여 선발 마커의 제거를 확인한 담배 형질전환체의 사진을 나타낸 것이다.

A: 선발 마커가 제거되지 않은 형질전환 담배; B: 선발 마커가 제거된 형질전환 담배.

도 6는 본 발명의 형질전환 담배에 제초제인 바스타를 처리한 효과와 후대 종자의 항생제 저항성 및 제초제 저항성을 검정한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명의 형질전환 담배에서 종자의 세대 진전에 따라 선발 마커 유전자가 제거되는 양상을 PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명의 형질전환 담배의 재분화 캘러스 (callus)에 과산화수소 (hydrogen peroxide; H₂O₂)를 농도별로 처리하고 유전자 발현 양상을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

Ubi: 담배의 유비퀴틴 유전자.

도 9는 본 발명의 재분화 담배에서 과산화수소의 처리에 따라 선발 마커 유전자가 제거되는 양상을 PCR로 분석하여 나타낸 것이다.

도 10은 본 발명의 재분화 담배에서 과산화수소의 처리에 따라 선발 마커 유전자가 제거되는 양상을 서던 블럿으로 분석하여 나타낸 것이다.

PC: 양성 대조군; p: 형질전환 식물; 1 내지 4: 선발 마커가 제거된 식물; NC: 음성 대조군.

도 11은 본 발명의 선발 마커가 제거된 형질전환 담배의 종자에 대한 항생제 저항성 및 제초제 저항성을 후대검정 결과의 사진으로 나타낸 것이다.

Claims

스트레스 유동성 퍼옥시다제 프로모터, 부위-특이 재조합효소 유전자, 재조합효소 인식 부위를 포함하여 선발 마커를 제거할 수 있는 식물 형질전환용 발현 벡터.
제 1항에 있어서,

상기 프로모터는 고구마로부터 유래한 스트레스 유동성 퍼옥시다제 프로모터 (stress inducible peroxidase promoter)인 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 발현 벡터.
제 1항에 있어서,

상기 재조합효소 유전자는 스트레스 유동성 퍼옥시다제 프로모터로부터 발현되는 부위 특이적 재조합효소 유전자이고, 바람직하게는 부위 특이적 재조합효소 FLP (site specific recombinase FLP) 유전자인 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 발현 벡터.
제 1항에 있어서,

상기 인식 부위는 재조합효소 인식부위 frt의 염기서열인 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 발현 벡터.
제 1항에 있어서,

상기 발현 벡터는 pWHF-P인 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 발현 벡터 (수탁번호: KACC 95088P).
제 5항의 식물 형질전환용 발현 벡터 pWHF-P로 형질전환되어 식물 운반체로 사용되는 아그로박테리움 속 (Agrobacterium sp.) 미생물.
제 6항에 있어서,

상기 미생물은 상기 발현 벡터 pWHF-P로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 (Agrobacterium tumefaciens LBA4404)인 것을 특징으로 하는 아그로박테리움 속 미생물.
제 5항의 아그로박테리움 속 미생물로 형질전환되어 선발 마커를 제거할 수 있는 형질전환 식물체.
제 8항에 있어서,

상기 식물체는 자가 수정 및 타가 수정할 수 있는 식물체를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제 8항 또는 제 9항에 있어서,

상기 식물체는 담배를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
(1) 식물체의 잎을 절단하고; (2) 제 6항의 아그로박테리움 속 미생물을 감염시키고; (3) 과산화수소 (hydrogen peroxide)가 첨가된 선발배지를 사용하여 재분화를 유도하고; (4) 뿌리를 유도하여 순화하고; 및 (5) 유전자의 형질전환을 분석하는; 과정으로 이루어진 선발 마커를 제거할 수 있는 제 8항의 식물체의 제조방법.
제 11항에 있어서,

상기 식물체는 담배를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.

(서열목록)

서열번호 1

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