KR20100005327A - 바이오칩 표면의 생체물질의 반응성 유지를 위한 바이오칩및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알데하이드(-CHO) 기능화된 고체 지지체 및 -NH₂ 기를 갖는 생체물질을 포함하고, 상기 알데하이드 기능화된 고체 지지체 상의 -CHO 기와 생체물질의 -NH₂ 기가 공유결합하여 구성되는 바이오칩에 대한 발명이다. 본 발명에 의해 고체 지지체 표면에 고정화된 항원을 동결건조시켜 보관할 경우, 동결건조 전후에 있어서 항원의 반응성이 유지되어 보관성이 탁월한 항원-항체 바이오칩을 제작할 수 있으며, 기존의 마이크로어레이 기법에 의한 방법보다 항원-항체 반응을 이용한 정확하고 신속하며 간편한 진단이 가능하다.

마이크로어레이, 유리칩, 공유결합, 동결건조, 미세진동저울(QCM)

Description

바이오칩 표면의 생체물질의 반응성 유지를 위한 바이오칩 및 이의 제조 방법{A BIOCHIP FOR MAINTAINING REACTIVITY OF BIOMOLECULES ON BIOCHIP SURFACE AND A MANUFACTURING METHOD OF THE SAME}

본 발명은 바이오칩 및 그 제조 방법에 관한 발명으로서, 보다 구체적으로는 단백질-단백질 상호작용을 이용한 진단칩 및 그 제조 방법에 대한 발명이다.

바이오칩(biochip)은 생물에서 유래된 DNA, 단백질 또는 그 외의 리간드를 고체(금속, 유리, 플라스틱 등) 표면에 고밀도로 집적화하고 조합하여 마이크로어레이(microarray)화시킨 칩을 말한다. 여기서, 마이크로어레이란 작은 고형체 기판 위에 수십 개 내지 수만 개의 DNA 를 고밀도로 배열해 놓은 것을 의미한다. 이러한 바이오칩은 암을 비롯한 각종 질병의 조기 진단지표로서 사용될 수 있으며, 최근에는 체외진단을 위하여 항원-항체 반응을 이용한 다양한 진단칩이 상품화되고 있다.

인간의 혈액 및 체액을 이용한 진단칩은 신속하고 용이하게 질병의 유무를 확인할 수 있는 장점이 있지만, 마이크로어레이 시스템의 반정량적 질병평가가 용이하지 않은 단점이 있다. 따라서 마이크로어레이 시스템에서 주로 사용하고 있 는 유리 지지체를 이용한 진단칩이 개발된다면 정량적 질병 평가가 가능할 것으로 예상된다.

현재 주로 사용되고 있는 체외 진단칩은 셀루로스막(cellulose membrane)을 사용하고 있다. 이러한 형태의 체외 진단칩은 막의 친수성 및 다공성 특징을 이용하여 항원을 흡착한 후 동결건조된 형태로서 상품화되고 있으며, 그 후 혈액 및 체액과 반응시키고 미반응 항체를 세척을 통하여 제거하게 된다. 따라서 체외 진단용 마이크로어레이 칩의 제작을 위해서는 세척 및 동결건조 전후에 있어서 항원의 반응성을 유지하는 것이 매우 중요하다.

한편, 유리 지지체는 마이크로어레이 시스템에 있어서 주로 사용되고 있는 지지체로서, 유리의 표면개질을 통하여 생체물질 및 기능화된 유리표면과의 공유결합을 형성할 수 있다. 이와 관련하여, 공유결합을 통하여 생체물질을 유리표면에 고정화하는 기술들이 개발되어 왔으나, 동결건조를 시켜 이의 반응성을 보존한 사례는 현재까지 없다.

진단 기술에 있어서 신속하고 효율적으로 질병의 진단 여부를 판단하는 것은 매우 중요하다. 그러나, 종래의 마이크로어레이 기법으로 진단을 행할 경우 비교적 장시간이 소요되어, 신속하고 정확한 분석을 위한 진단칩으로서는 한계가 있었다.

따라서, 마이크로어레이 기법에서 사용하는 유리 지지체에 생체물질을 공유결합 방법으로 고정화시킨 후 이를 동결건조된 형태로서 진단칩으로 사용한다면 종래 진단방법과 비교하여 보다 정확하고 신속한 진단이 가능할 것인 바, 이를 위한 새로운 형태의 진단칩의 개발 방법이 요구된다.

이와 관련하여, 상기 언급된 바와 같이 공유결합을 통하여 생체물질을 유리표면에 고정화하는 기술들이 개발되어 왔으나, 동결건조를 시켜 이를 적용한 사례는 현재까지 없다.

이에 본 발명자들은 항원-항체 반응을 이용하여 정확하고 신속한 체외 진단이 가능한 바이오칩 제작을 위하여서는 세척 및 동결건조 과정이 필수적이며, 이때 항원-항체의 반응성 유지가 매우 중요하다는 점에 주목하였다.

따라서 본 발명자들은 유리 지지체 상에 항원(래빗 IgG, HBsAg)을 결합시키고 세척 및 동결건조 후, 항체와의 반응을 통하여 항원의 반응성 유지를 평가하였다. 이를 위하여 항원과 특이적으로 결합하는 항체(항-래빗 IgG, 항-HBsAg)를 사 용하여 정량적 비교평가를 행하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 알데하이드(-CHO) 기능화된 고체 지지체 및 -NH₂ 기를 갖는 생체물질을 포함하고, 상기 알데하이드 기능화된 고체 지지체 상의 -CHO 기와 생체물질의 -NH₂ 기가 공유결합하여 구성되는 바이오칩에 대한 발명이다. 본 발명의 바이오칩에 사용될 수 있는 생체물질은 -NH₂ 기를 갖는 생체 기원의 임의의 물질일 수 있으며, 바람직하게는 -NH₂ 기를 갖는 단백질, 더욱 바람직하게는 -NH₂ 기를 갖는 항원이다. 본 발명의 바이오칩에 사용되는 항원은 이와 특이적으로 결합하는 항체와 조합하여 사용함으로써 항원의 반응성 유지를 평가할 수 있다. 본 발명의 바이오칩에 사용되는 항원의 구체적 예로서, 래빗 IgG 또는 HBbsAg 등을 들 수 있으며, 이와 특이적으로 결합하는 항체는 항-래빗 IgG 또는 항-HBsAg 등이다. 한편, 본 발명의 바이오칩에 사용되는 고체 지지체는 금속, 유리 및 플라스틱 지지체를 포함하며, 바람직하게는 유리 지지체이다.

또한, 본 발명은 a) 알데하이드(-CHO) 기능화된 고체 지지체 상에 -NH₂ 기를 갖는 생체물질을 공유결합에 의하여 고정화하는 단계; 및 b) 상기 생체물질이 고정된 고체 지지체를 세척하는 단계를 포함하는 바이오칩의 제조방법에 대한 발명이다.

또한, 본 발명은 상기 a) 및 b) 단계에 이어 c) 상기 생체물질이 고정된 고체 지지체를 동결건조하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 칩의 제조방법을 제공한다.

한편, 본 발명의 바이오칩에서 항원의 반응성이 유지되었는지 여부의 평가는 4CN(4-클로로-1-나프톨) 발색 분석 및 형광 분석 또는 미세진동저울(QCM) 방법을 통하여 수행될 수 있다. 4CN 발색 분석은 Chemi-doc (BioRad, USA) 분석기기를 이용하여 발색이미지를 검출할 수 있으며 정량적으로 확인이 가능하다. 형광 분석의 경우, 형광 스캐너를 이용하여 형광이미지를 검출할 수 있으며, 상기 형광 이미지는 이미지-J 프로그램을 통하여 정량적으로 확인 가능하다. 이미지-J 프로그램은 미 국립보건연구소 웹사이트에서 다운로드받을 수 있다. 한편, 미세진동저울은 극소량의 질량변화를 실시간으로 측정할 수 있는 장비로서 일반전자 저울보다 100 배 이상의 정밀한 측량이 가능하며, QCM D-300 등 다수의 미세진동저울이 시판중이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

유리 지지체 상에 항원을 결합시키는 방법으로서 단순흡착 방법과 공유결합 방법의 두 가지 방법을 사용하였으며, 세척 및 동결건조 전후에 있어서의 항원의 반응성 유지를 비교·평가하였다. 이때 단순흡착 방법의 경우에 있어서는 일반 유리칩을 사용하였고, 공유결합 방법의 경우에 있어서는 알데하이드기로 기능화된 유리 지지체에 공유결합시킴으로써 세척 및 동결건조와 같은 물리적 공정에 거의 영향을 받지 않도록 하였다.

한편, 세척 전후의 평가를 위하여 HRP(horseradish-peroxidase)가 결합된 항체를 사용하였으며, 단순흡착된 항원은 세척과정에서 모두 세척되어 제거되었으나, 공유결합된 항원은 세척 후에도 반응성을 유지함을 4CN 발색분석을 이용한 수치화 방법을 통하여 확인하였다.

또한, 동결건조 전후의 반응성 유지 여부를 평가하기 위하여 FITC (fluorescein isothiocyanate)와 결합된 항체를 사용하였고, 공유결합된 항원의 반응성이 동결건조 후에도 유지되었음을 역시 형광 분석을 이용한 수치화 방법을 통하여 확인하였다.

또한, 미세진동저울(quartz cystal microbalance; QCM)을 이용한 실시간 질량변화를 통하여 세척 및 동결건조 후에 있어서, 유리 지지체 상에 공유결합된 항원은 그 반응성이 유지된 반면, 셀루로스막에서 적용되는 항원의 단순흡착 방법을 유리 지지체에 적용한 경우에 있어서는 항원이 세척과정에서 제거되어 그 반응성을 유지하지 못하였음을 확인하였다.

결론적으로, 본 발명에서는 유리 지지체를 이용한 체외진단칩 및 마이크로어레이 기술에서 생체물질의 공유결합이 필수적이며, 본 발명의 공유결합 방법을 이용할 경우, 세척 및 동결건조 과정에서 생체물질의 반응성이 유지됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 방법은 고체 지지체 상에 생체물질을 공유결합시킴으로써 반응성을 유지시키는 데에 사용됨으로써, 상온 보관이 가능한 새로운 형태의 체외 진단칩 및 바이오칩 개발에 활용될 수 있을 것이다.

본 발명에 의한 바이오칩을 이용할 경우, 동결건조 전후에 있어서 항원의 반응성이 유지되어 기존의 마이크로어레이 기법에 의한 방법보다 항원-항체 반응을 이용한 정확하고 신속한 진단이 가능하다.

이하에서, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 의도일 뿐, 본 발명의 보호범위가 하기의 실시예에 기재된 예만으로 국한되는 것은 결코 아니다. 또한, 하기의 실시예 뿐만 아니라, 당업자에 의해서 이로부터 용이하게 추론될 수 있는 사항까지도 본 발명의 보호범위에 속함은 자명하다.

실시예 1 : 유리칩 상의 항원 고정화 방법에 따른 세척 후 반응성 분석

유리칩 상의 항원을 고정화하는 방법으로서, 단순흡착과 공유결합 방법의 두 가지 방법을 실험하였다. 이를 위하여 두 개의 상이한 유리칩을 사용하였다. 단순흡착 방법은 일반 유리칩을 사용하였고, 공유결합 방법은 알데하이드기로 기능화된 유리 칩을 사용하였다(도 1). 각 유리칩 상의 스폿(spot) 웰을 형성하기 위하여 아세테이트지(紙)를 접착하였다. 우선 증류수를 이용하여 유리 표면을 세척하고, 질소가스를 이용하여 웰에 남아있는 증류수를 완전히 제거하였다. 여러 농도(0, 1.2, 2.5, 5, 10, 20 ㎍/㎖)의 래빗 IgG 를 0.01 M PBS 완충액(pH 7.4, 0.1 M NaBH₃CN 함유)에 용해시킨 후 각 웰 당 10 ㎕ 씩 스폿팅(spotting)하고 1 시간 동안 반응시켰다. 세척 완충액(0.01 M PBS 완충액, pH 7.4, 0.05% 트윈 20 함유)을 이용하여 미반응 래빗 IgG 를 제거하기 위하여 5 분 동안 세척하고 질소 가스를 이용하여 건조하였다. 0.01 M PBS 완충액(pH 7.4, 0.1 M NaBH₃CN 함유)에 용해시킨 1% BSA 를 이용하여 유리칩 표면의 미반응 알데하이드기를 1 시간 동안 블록킹(blocking)하였다. 다시 세척 완충액으로 미반응 BSA 를 제거하였다. 1% BSA 에 용해시킨 1.0 ㎎/㎖ 의 HRP 결합 항-래빗 IgG 를 10 ㎕ 씩 스폿팅하고, 2 시간 동안 반응시킨 후, 세척 완충액으로 미반응 HRP 결합 항-래빗 IgG 를 제거하였다. 여기에 H₂O₂ 에 용해시킨 0.01% 4CN 발색 반응을 10 분 동안 진행시킨 후, 세척 완충액으로 발색반응을 정지시켰다.

4CN 발색 결과에서 일반 유리 지지체, 즉 래빗 IgG 를 단순흡착 방법으로 고정화시킨 경우에는 발색이 나타나지 않았다(도 2(a)). 즉 항원을 단순흡착 했을 경우에는 세척 과정에서 모두 씻겨내려감을 알 수 있었다. 하지만 알데하이드 기능화된 유리 지지체에서는 공유결합 방법으로 래빗 IgG 를 고정화했을 경우 발색이 나타남을 확인할 수 있었다. 이는 항원이 유리 표면의 알데하이드기와 래빗 IgG 의 아민기가 환원성 아미노화 반응을 일으켰음을 의미하며, 그 강도는 세척과정에서 항원이 제거되지 않았음을 의미한다(도 2(b)). 또한 래빗 IgG 의 농도에 따른 신호 밀도가 상이하게 나타남을 Chemi-doc 이미지 분석 프로그램(BioRad, USA)을 통하여 수치화하여 확인하였다(도 2(c)). 이로써 유리 지지체에 공유결합시킬 경우 반응성을 유지하고 있음을 확인할 수 있었으며, 따라서 유리 지지체를 이용하여 단백질을 고정화하기 위하여서는, 공유결합 방법이 필수적임을 확인하였다.

실시예 2 : 유리칩 상에 공유결합으로 고정화된 래빗 IgG , HBsAg 의 세척 및 동결건조 후 반응성 유지 평가

아세테이트지를 이용하여 알데하이드기 기능화된 유리 칩에 웰을 형성한 후 증류수를 이용하여 세척하고, 질소가스를 이용하여 건조시켰다. 0.01 M PBS (pH 7.4, 0.1 M NaBH₃CN 함유)에 용해시킨 래빗 IgG(0. 1.1, 3.1, 6.3, 12.5, 25, 50, 100 ㎍/㎖)와 HBsAg(0. 6.25, 6.25, 25, 50, 100, 300 ㎍/㎖)을 10 ㎕ 와 2 ㎕ 씩 스폿팅하고 1 시간 동안 반응시켰다. 세척 완충액을 이용하여 5 분 동안 미반응 래빗 IgG 와 HBsAg 를 제거하였다. 1% BSA를 이용하여 1시간 동안 블록킹시킨 후 다시 세척 완충액으로 5 분 동안 세척을 하고 동결건조기(FD-1000, Tokyo Rikakikai co., Japan)를 이용하여 24 시간 동안 동결건조시켰다. 주요 공정조건은 (1) 건조온도 -51.3 ℃, (2) 건조압력 9.8 Pa 이다. 그 후 1% BSA 에 용해시킨 1 ㎎/㎖ 의 FITC 결합 항-래빗 IgG 와 2 ㎎/㎖ 의 FITC 결합 항-HBsAG 를 10 ㎕ 와 2 ㎕ 씩 스폿팅하여 2 시간 동안 반응시킨 후 세척 완충액으로 세척하였다. 형광 스캐너(Genepix, Axon Instrument, USA)를 이용하여 동결건조 전후의 형광이미지를 검출하였다. 형광이미지는 이미지-J 프로그램(미 국립보건연구소 웹사이트에서 다운로드)을 이용하여 신호 강도를 산출하여 항원의 농도에 따른 반응성 유지 여부를 판단하였다.

그 결과 동결건조 전후 농도에 따른 신호 밀도가 거의 비슷하게 나타남을 확인할 수 있었다(도 3). 따라서 유리 지지체 위에 공유결합방법으로 고정화된 단백질의 활성이 동결건조 이후에도 유지됨을 확인하였다.

실시예 3 : QCM 을 이용한 공유결합된 항원의 세척 및 동결건조 후 반응성 유지 분 석

칩 표면 상에서 래빗 IgG 를 단순흡착 및 공유결합 방법으로 결합시킨 후, 세척 및 동결건조 전후의 반응성을 미세진동저울(QCM D-300, Q-sense, Sweden)을 사용하여 평가하였다.

미세진동저울은 목적 물질의 질량과 강성을 가지고 공진하는 시스템의 질량에 증감이 일어나면 공진 주파수가 변하고, 이를 감지하면 변화된 미세 질량을 측정할 수 있다는 원리를 이용한 방법이다. 보다 구체적으로, 미세진동저울은 극소량의 질량변화를 실시간으로 측정할 수 있는 장비로서 일반전자 저울보다 100 배 이상의 정밀한 측량이 가능하며, 따라서 미세진동저울로 단분자의 한 부분이나 원자 한층과 같은 미세한 변화도 감지하여 측정할 수 있다.

한편, 칩과 항-래빗 IgG 를 공유결합 방법을 통하여 결합시키기 위해서, 금 센서칩(QSX 301-standard gold, 14mm×14mm, 615mm², Q-Sense, Sweden) 표면을 100% 에탄올에 용해시킨 1 ㎎/㎖ DSU(dithiobis succinimidyl-undecanoate)와 1 시간 반응시켜 NHS 기로 표면개질하였다. 즉, 센서칩을 NHS 기로 표면개질하고, NHS 기는 항원의 NH₂ 기와 특이적 반응을 통하여 공유결합을 형성하였다. 따라서 항원을 센서칩과 공유결합시킴으로써, 유리칩 상의 공유결합으로 고정화된 항원의 동결건조 후 반응성 유지를 미세진동저울에서 구현하였다. 이와 같이 표면개질된 NHS 표면 센서칩을 증류수로 세척하고, 미세진동저울에 사용하였다.

동결건조 전후의 반응성을 확인하기 위하여 25 ㎍/㎖ 농도의 항 래빗 IgG 와 100 ㎍/㎖ 농도의 래빗 IgG 를 반응시켰으며, 블록킹 용액으로서 2.5 ㎎/㎖ 농도의 BSA 를 사용하였다. 모든 반응을 QCM 챔버(chamber) 내에서 진행시켰다. 금 센서 칩 상에서 항 래빗 IgG 를 고정화 및 블록킹한 후, 동결건조기를 이용하여 24 시간 동결건조시킨 후에 있어서의 래빗 IgG 와의 반응성을 통하여, 동결건조 후 공유결합된 항 래빗 IgG 의 반응성을 질량적으로 평가하였다.

그 결과 동결건조 전후 항-래빗 IgG 와 래빗 IgG 의 질량비가 1 및 0.97 로 나타남을 확인하였다(표 1). 즉 동결건조 전에 항원-항체 반응하는 몰 비율과 동결건조 후에 항원-항체 반응하는 몰 비율이 유사함을 의미하며, 이로써 동결건조 후에도 공유결합으로 고정화된 항원의 반응성이 유지됨을 확인하였다. 결론적으로, 동결건조 후에도 고체 지지체(유리 및 금)에 공유결합으로 고정화된 항원-항체의 반응성이 유지됨을 확인하였다.

실시예 4 : 유리 칩 상에 공유결합으로 고정화된 HBsAg 항체의 동결건조 후 반응성 유지 평가

동결건조 전후의 고정화된 HBsAg 항체의 반응성 유지를 평가하기 위하여 샌드위치-ELISA 기법으로 실험을 진행하였다. 아세테이트지를 이용하여 알데하이드기 기능화된 유리칩에 웰을 형성한 후, 증류수를 이용하여 세척하고, 질소가스를 이용하여 건조하였다. 0.01 M PBS (pH 7.4, 0.1 M NaBH₃CN 함유)에 녹인 HBsAg 다중클론 항체(1 ㎎/㎖)를 2 ㎕ 씩 스폿팅하고 1시간 동안 반응시켰다. 세척 완충액을 이용하여 5 분 동안 미반응된 HBsAg 다중클론 항체를 제거하였다. 1% BSA 를 이용하여 1 시간 동안 블록킹한 후, 이를 다시 세척 완충액으로 5 분 동안 세척하고, 동결건조기(FD-1000, Tokyo Rikakikai co., Japan)를 이용하여 24 시간 동안 동결건조하였다. 그 후 1% BSA 에 녹인 0.005, 0.05, 0.5, 5 ㎍/㎖ 의 HBsAg 를 2 ㎕ 씩 스폿팅하여 2 시간 동안 반응시킨 후, 세척 완충액으로 5 분 동안 세척하였다. FITC 와 결합된 HBsAg 단일클론 항체를 2 ㎕ 씩 스폿팅하고 1 시간 동안 반응시킨 후, 이를 다시 세척 완충액으로 5 분 동안 세척하였다. 그 후 형광 스캐너(Genepix, Axon Instrument, USA)를 이용하여 동결건조 전후의 형광이미지를 검출하였다. 형광이미지는 이미지-J (미 국립보건연구소 웹사이트에서 다운로드) 프로그램을 이용하여 신호 강도를 산출하여 고정화된 항체의 동결건조 후 반응성 유지 여부를 판단하였다.

그 결과 동결건조 전후 HBsAg 농도에 따른 신호 강도가 거의 유사하게 나타남을 확인 할 수 있었다(도 4). 따라서, 유리지지체 상에 공유결합방법으로 고정화된 항체의 반응성이 동결건조 이후에도 유지됨을 확인할 수 있었다.

도 1 은 단순흡착 및 공유결합 방법에 있어서 래빗 IgG 를 고정화하는 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.

도 2(a)는 일반 유리 지지체, 즉 단순흡착 방법에 의한 4CN 발색 결과를 나타내며, 도 2(b)는 알데하이드 코팅 유리, 즉 공유결합 방법에 의한 4CN 발색 결과를 나타낸 것이다. 한편, 도 2(c)는 공유결합된 래빗 IgG 의 신호 밀도(ELISA 기법, 스폿팅 부피 : 10 ㎕)를 나타낸 것이다.

도 3 은 동결건조 과정 전후에 있어서의 형광 강도 분석을 나타낸 것이다. 여기서, 도 3(a)는 공유결합된 래빗 IgG 의 신호 밀도를 나타내며, 도 3(b)는 HBsAg 의 신호 밀도를 나타낸다.

도 4 는 다양한 HBsAg 농도에서의 동결건조 전/후의 신호 강도 분석(샌드위치 ELISA 기법, 스폿팅 부피 : 2 ㎕)을 나타낸다.

Claims (9)

1. 알데하이드(-CHO) 기능화된 고체 지지체 및 -NH₂ 기를 갖는 생체물질(biomolecule)을 포함하고, 상기 알데하이드 기능화된 고체 지지체 상의 -CHO 기와 생체물질의 -NH₂ 기가 공유결합하여 구성되는 바이오칩.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 생체물질은 단백질인 것을 특징으로 하는 바이오칩.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 단백질은 항원 또는 항체인 것을 특징으로 하는 바이오칩.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 유리 지지체인 것을 특징으로 하는 바이오칩.
5. 하기 단계를 포함하는, 바이오칩의 제조방법:

   a) 알데하이드(-CHO) 기능화된 고체 지지체 상에 -NH₂ 기를 갖는 생체물질을 공유결합에 의하여 고정화하는 단계; 및

   b) 상기 생체물질이 고정된 고체 지지체를 세척하는 단계.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 생체물질은 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 단백질은 항원 또는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 유리 지지체인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, c) 상기 생체물질이 고정된 고체 지지체를 동결건조하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

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