KR20100004546A - 돼지 써코바이러스 타입 1 및 2의 감별진단을 위한미니어레이법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돼지이유후전신성소모성증후군 또는 돼지피부염신부전증후군으로부터 돼지 써코바이러스 1 및 2를 감별진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 돼지 써코바이러스 타입 1과 2의 DNA 및 공통 프로브로 구성되는 나일론막을 이용하는 미니어레이법을 도입하여 돼지이유후전신성소모성증후군 또는 돼지피부염신부전증후군으로부터 돼지 써코바이러스 1 및 2를 정확하게 감별진단하는 방법에 관한 것이다.
미니어레이법, 돼지 써코바이러스 감별진단법
Description
본 발명은 돼지이유후전신성소모성증후군 또는 돼지피부염신부전증후군으로부터 돼지 써코바이러스 1 및 2를 감별진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 돼지 써코바이러스 타입 1과 2의 DNA 및 공통 프로브로 구성되는 나일론막을 이용하는 미니어레이법을 도입하여 돼지이유후전신성소모성증후군 또는 돼지피부염신부전증후군으로부터 돼지 써코바이러스 1 및 2를 정확하게 감별진단하는 방법에 관한 것이다.
돼지 써코바이러스는 타입 1, 2로 나누어지며, 돼지 써코바이러스 타입 1은 1974년 돼지 신장세포에서 처음 분리된 이래 돼지에 임상증상이 없는 형으로 분리되었으나, 2006년 호주에서 분리된 3주는 돼지 만성소모성질병 양상을 보이며 자돈 및 신생자돈의 척수 등에서 분리되면서 병원성의 논란이 되고 있다. 또한 써코바이러스 타입 1은 돼지신장세포에서 지속적 감염이 이루어지고 있어 신장세포로 타백 신 제조 시 미입으로 존재할 수 있다.
돼지 써코바이러스 타입 2는 1990년 말경에 출현하여 돼지이유후전신성소모성증후군 또는 돼지피부염신부전증후군과 밀접한 관계가 있는 원인체로 다른 병원체들과 혼합되어 복합질병양상을 보이고 있다.
지금까지는 유전자증폭 및 조직 내 PCR법 등으로 돼지 써코바이러스의 타입 1과 2를 구분해 왔다. 그러나, 유전자증폭(PCR)법은 일반적으로 비특이적 산물을 증폭할 확률이 있고, 조직 내 PCR(In situ hybridization) 법은 감염조직에서만 사용할 수 있으며 바이러스가 액상상태나 조직이 아닌 현탁액(suspenstion) 상태에서는 활용하지 못하여 오직 바이러스감염 돼지 장기조직에서만 검출할 수 있는 문제점이 있었다.
따라서, 이들에 대한 정확하고 확실한 감별진단법이 만들어져 백신 제조에 사용되는 돼지 신장세포에서 미입바이러스 동정 및 돼지소모성질환에 감염된 돼지에서의 감별진단이 필요한 실정이다.
DNA 마이크로어레이(Microarray)란 염기서열을 알고 있는 DNA 분자를 소형 기판 위에 고밀도로 배열해 놓은 것이다. DNA 칩이라고 알려지기도 한 DNA 마이크로어레이는 작은 조각의 유리, 나일론, 실리콘 또는 실리카 위에 정해진 위치에 심은 유전자 집합이다. 혈액과 같은 조직에서 형광물질로 표시된 DNA를 추출하여 칩과 반응시키면 칩 위의 DNA와 일치하는 조직의 DNA가 있으면 형광을 발생한다. 컴퓨터의 프로그램을 이용하여 그 점에 위치한 유전자를 파악하고, 기능을 밝혀 형광 점들이 주는 패턴의 의미를 분석한다.
마이크로어레이의 장점은 대량의 유전자 발현 상황을 총체적으로 탐색할 수 있다는 것이다. DNA 마이크로어레이 기술은 화학과 분자생물학을 비롯한 기계공학, 전자공학 등의 여러 분야가 융합되어 만들어진 기술로 생명현상과 관련된 유전체 수준의 연구에 크게 기여하고 있다. DNA 마이크로어레이 기술은 수 만개의 유전자 조각들을 하나의 마이크로어레이에 놓을 수 있기 때문에, 전체 유전자에 대한 정보를 한번의 실험에서 얻을 수 있다. 몇 개의 유전자만을 대상으로 하던 서던(southern)법이나 노던(northern)법을 통한 기존 기술과는 달리 상당히 많은 정보를 얻을 수 있는 특징이 있다. 마이크로어레이의 종류로는 현재 칩 위에 올려지는 물질 종류에 따라 DNA 칩, 단백질 칩, 세포 칩, 신경세포 칩 등 여러 가지가 있다. 마이크로어레이의 응용분야는 유전자 발굴, 암분류, 유전자 발현 형태에 따른 질병 위험도 평가, 질병 예후 진단, 질병진단, 신약개발, 독성학 연구, 식품 안정성 평가, 유전병 연구 등 그 범위가 아주 넓다.
마이크로어레이는 서로 다른 조직이나 조건의 차이에서 다르게 발현되는 유전자를 찾고, 기존에 알고 있는 유전자 발현 형태를 기초로 하여 새로운 유전자 발굴에도 사용되고 있다. 또한 하나의 유전자가 다른 유전자들과 어떻게 상호작용하는지를 규명하는 연구에도 널리 쓰이고 있다.
그러나, 이러한 마이크로어레이법은 검사비용이 고가이기 때문에 고가의 검사비용으로도 검사가 가능한 인체분야에서는 널리 사용되고 있으나, 수의학 분야에서는 최소의 검사비용을 요구하는 실정이고 마이크로어레이의 결과를 분석하기 위 한 판독기 등의 고가의 장비를 모두 갖추는 것이 불가능하여 마이크로어레이법의 도입이 어려운 실정이다.
이에 본 발명자들은 보다 정확하고 확실한 돼지 써코바이러스 타입 1과 2의 감별 진단법을 찾고자 노력한 결과, 고가의 마이크로어레이법을 응용한 미니어레이법을 개발함으로써 백신 제조에 사용되는 돼지 신장세포에서 미입바이러스 동정 및 돼지이유후전신성소모성증후군에 감염된 돼지에서 써코바이러스 타입 1과 2의 감별진단이 용이함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 돼지이유후전신성소모성증후군 또는 돼지피부염신부전증후군으로부터 돼지 써코바이러스 1 및 2를 정확하게 감별진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는
1) 나일론막에 돼지 써코바이러스 타입 1(서열번호 1)과 2(서열번호 2)의 DNA 및 공통 프로브(서열번호 3)를 각각 적하시키는 단계;
2) 야외샘플에서 분리한 돼지 써코바이러스 DNA를 PCR로 증폭하는 단계;
3) 상기 1) 단계의 나일론 막과 상기 2) 단계의 PCR 증폭 산물을 하이브리드화시키는 단계;
4) 상기 3) 단계의 하이브리드화물을 니트로브로테트라졸리움과 브로모클로로인도린 포스페이트로 염색하는 단계; 및
5) 상기 4) 단계의 발색 결과를 통하여 음성 또는 양성을 판단하는 단계;
를 포함하는 돼지 써코바이러스 1 및 2의 감별진단방법을 제공한다.
본 발명에 의한 미니어레이법은 최종 판독 시 판독기를 필요로 하지 않고 육안으로도 판독이 가능하여 기존의 마이크로어레이법 보다 경제적이며, 돼지이유후전신성소모성증후군 또는 돼지피부염신부전증후군으로부터 돼지 써코바이러스 1 및 2를 정확하게 감별진단할 수 있었다.
이하, 본 발명을 구체적으로 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용하는 “미니어레이법”이라는 용어는 프로브를 나일론막에 적하하고 PCR로 증폭된 유전자를 나일론막과 하이브리드화하여 육안으로 판독하는 일련의 과정을 말한다.
이러한 미니어레이법은 DNA, RNA 및 단백질을 이용한 칩 개발기술의 마이크로어레이법의 변형된 일종으로서, 마이크로어레이법 보다 비용 면에서 훨씬 저렴하며 판독기 등을 요구하지 않아 경제적이다. 또한 본 발명에 의한 미니어레이법을 응용하면 다양한 상품적 가치를 창출할 수 있을 것이다.
본 발명에 의한 미니어레이법은 도 1에 도시된 일련의 과정을 거쳐 수행되며, 하기 단계들을 포함한다:
1) 나일론막에 돼지 써코바이러스 타입 1(서열번호 1)과 2(서열번호 2)의 DNA 및 공통 프로브(서열번호 3)를 각각 적하시키는 단계;
2) 야외샘플에서 분리한 돼지 써코바이러스 DNA를 PCR로 증폭하는 단계;
3) 상기 1) 단계의 나일론 막과 상기 2) 단계의 PCR 증폭 산물을 하이브리드화시키는 단계;
4) 상기 3) 단계의 하이브리드화물을 니트로브로테트라졸리움과 브로모클로로인도린 포스페이트로 염색하는 단계; 및
5) 상기 4) 단계의 발색 결과를 통하여 음성 또는 양성을 판단하는 단계.
본 발명에 의한 미니어레이법은 하기 표 1에 기재된 3종의 프로브(서열번호 1 내지 3), 한 쌍의 프라이머(서열번호 4 및 5), 나일론막 및 하이브리드화 시약들로 구성되어 있으며, 미니어레이의 작용은 돼지 써코바이러스 타입에 관계없이 한 쌍의 프라이머는 써코바이러스의 변이가 거의 없는 부위인 OFR1 유전자 부위 내에 위치하고 이들에 의해 증폭된 유전자는 나일론막에 적하된 프로브들 중 해당 타입과 결합에 의해 결정되는 방식이다.
| 구분 | 서열 | 서열번호 | |
| 프로브 | 돼지 써코바이러스 1 | 5'-GCGGAACCAGGGGAAGT44-3' | 1 |
| 돼지 써코바이러스 2 | 5'-AGCGGGAGTCTGGTGACCT42-3' | 2 | |
| 공통 프로브 | 5'-GACCTGTCTACTGCTGTGAGTACCT36-3' | 3 | |
| 프라이머 | 센스프라이머 | 5'-CCGCTGCCACATCGAGAAAG-3' | 4 |
| 안티센스프라이머 | 5'-CCCGCTCACTTTCAAAAGTTCAGC-3' | 5 | |
본 발명에서 사용하는 돼지 써코바이러스 타입 1(서열번호 1)과 2(서열번호 2) 및 공통 프로브(서열번호 3)의 작성은 유전자뱅크에서 돼지 써코바이러스 17주에 대한 염기서열을 일렬로 정렬한 후 변이가 없는 ORF1 유전자 부위를 선정하였으며, 이 부위에 대한 프라이머는 한 가지로 증폭하였다. 즉, 상기 3종의 프로브는 ORF1 프라이머 작성 부위 안쪽에서 모두 작성하였으며 총 프로브 길이는 60 bp로 하였다.
본 발명에 의한 미니어레이법을 통한 돼지 써코바이러스 타입 1과 2의 감별진단 과정을 보다 상세히 살펴보면, 먼저, 나일론막을 1.5cm 정삼각형으로 자른 후 정삼각형의 나일론 막의 위쪽에는 서열번호 3의 공통프로브를, 왼쪽에는 서열번호 1의 돼지 써코바이러스 타입 1을, 오른쪽에는 서열번호 2의 돼지 써코바이러스 타입 2를 나일론막의 ㎛당 10pM씩 적하시킨 후 70℃에서 30분 동안 정치시킨다.
야외샘플에서 분리한 돼지 써코바이러스 타입별 DNA를 표적 유전자로 PCR하기 위해 서열번호 4 및 5의 프라이머쌍과 바이오틴을 혼합하여 PCR을 수행한다. 상기 PCR의 반응은 DNA 5μl, 1 x PCR 완충액, 1.5mM MgCl2, 0.2mM dNTPs, 0.3mM 바이오틴-16-dUTP, 1U Taq DNA 폴리머라아제, 및 서열번호 4 및 5의 프라이머 10pM을 혼합하여 전체를 20μl에 맞추어 진행하며, 이때 반응 조건은 94℃ 5분간 예비-변성한 후 95℃에서 30초간 변성, 65℃에서 40초간 어닐링 및 72℃에서 50초간 확장하는 사이클을 35회 반복한 다음 72℃에서 5분간 반응을 진행한다.
상기 PCR 증폭 산물을 3종의 프로브를 적하하여 미리 제작한 나일론막과 함께 1.5ml 에펜돌프 튜브 안에 넣고 일련의 하이브리드화 과정을 실시한다. 즉, 3종의 프로브가 적하된 나일론막을 에펜돌프 튜브 안에 넣고 10분 동안 프리하이브리드화 완충액을 이용하여 45℃에서 10분 동안 반응시킨 다음 PCR 증폭 산물을 혼합하여 하이브리드화 완충액을 넣고 45℃에서 60분 동안 반응한다. 하이브리드화가 완료된 후 세척완충액 2로 2번 실온에서 5분 동안 2번 세척을 실시하고 1번은 10분 동안, 마지막 세척은 3분 동안 세척완충액 1로 수행한다. 상기 과정에서 사용된 프리하이브리드화 완충액은 5ⅹSSC(Roche), 0.5% SDS 및 1% 차단 용액(Roche)으로 구성될 수 있고, 하이브리드화 완충액은 5ⅹSSC 및 0.5% SDS로 구성될 수 있으며, 세척완충액 1은 1ⅹPBS 및 0.3% Tween 20 (v/v)으로 구성될 수 있고, 세척완충액 2는 1ⅹSSC 및 0.5% SDS로 구성될 수 있으나, 이에만 한정되지 않는다.
세척을 마친 반응물을 스트렙토아비딘이 포함된 알칼라인포스파타제로 30분 동안 반응시킨 후 5분 동안 세척완충액 2로 처리한 다음 니트로브로테트라졸리움과 브로모크로로인도린 포스페이트로 염색한다. 색상이 나타날 때까지 반응시킨 후 군청색을 띠면 양성으로, 무색인 경우는 음성으로 판단하며 보통 반응시간은 10분 내로 발색이 완료되어 판독기 없이 직접 눈으로 판독이 가능하다.
이하, 실시예를 참고로 하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 하기의 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하려는 것이며, 하기의 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.
[실시예 1] 돼지 써코바이러스 감별진단을 위한 미니어레이법
1.5cm 정삼각형으로 자른 나일론막에 위쪽에는 서열번호 3의 공통프로브를, 왼쪽에는 서열번호 1의 돼지 써코바이러스 타입 1을, 오른쪽에는 서열번호 2의 돼지 써코바이러스 타입 2를 마이크로당 10pM씩 각각 도팅(dotting)하고 70℃에서 30분 동안 정치시켰다.
야외샘플에서 분리한 돼지 써코바이러스 DNA 5μl, 1 x PCR 완충액, 1.5mM MgCl2, 0.2mM dNTPs, 0.3mM 바이오틴-16-dUTP, 1U Taq DNA 폴리머라아제, 및 서열번호 4 및 5의 프라이머 10pM을 혼합하여 전체 20μl에 맞춘 다음 94℃ 5분간 예비-변성한 후 95℃에서 30초간 변성, 65℃에서 40초간 어닐링 및 72℃에서 50초간 확장하는 사이클을 35회 반복한 다음 72℃에서 5분간 반응시켜 PCR 증폭 산물을 제조하였다.
상기에서 제작한 나일론막을 1.5ml 에펜돌프 튜브 안에서 넣고 10분 동안 프리하이브리드화 완충액(5ⅹSSC(Roche), 0.5% SDS 및 1% 차단용액(Roche))을 이용하여 45℃에서 10분 동안 반응시킨 다음 PCR 증폭 산물을 혼합하여 하이브리드화 완충액(5ⅹSSC 및 0.5% SDS)을 넣고 45℃에서 60분 동안 반응하였다. 하이브리드화가 완료된 후 세척완충액 2(1ⅹSSC 및 0.5% SDS)로 2번 실온에서 5분 동안 2번 세척을 실시하고 1번은 10분 동안, 마지막 세척은 3분 동안 세척완충액 1(1ⅹPBS 및 0.3% Tween 20(v/v))로 수행한 다음 스트렙토아비딘이 포함된 알칼라인포스파타제로 30분 동안 반응시킨 후 5분 동안 세척완충액 2(1ⅹSSC 및 0.5% SDS)로 처리한 다음 니트로브로테트라졸리움과 브로모크로로인도린 포스페이트로 염색하였다. 색상이 나타날 때까지 반응시킨 후 그 결과를 육안으로 음성 또는 양성을 판단하였으며, 동일한 실험을 2회씩 반복하여 그 결과를 각각 도 2a 및 2b에 도시하였다.
도 2a 및 2b의 결과에서, 샘플이 PCV1 또는 PCV2인지에 따라 왼쪽과 오른쪽 그리고 공통적으로 위쪽에 심어져 있는 프로브들과 반응하고 하이브리드화 반응을 거친 다음 니트로브로테트라졸리움과 브로모크로로인도린 포스페이트로 염색한 후 약 10분 정도에서 군청색 색상이 각각 샘플의 감염 양상에 따라 PCV1(도 2a)과 PCV2(도 2b)로 확연히 감별되었다. 또한 도 2a 및 2b에서 2회 반복하여 실시한 결과(각 a 및 b)에서 동일한 결과를 얻음으로써 반복 재현성이 존재함을 확인할 수 있었다.
본 발명에 의한 미니어레이법은 동물약품백신 산업체에서 돼지용 백신 생산 시 사용되는 돼지 신장세포에서 돼지 써코바이러스 감염을 측정할 수 있으며 생산된 백신에 대한 미입바이러스 품질 검사 시 타입에 따른 돼지 써코바이러스 감염유무를 감별진단할 수 있다. 또한, 야외 돼지이유후전신성소모성증후군 및 돼지피부염신부전증후군 가검물에 대한 돼지 써코바이러스 원인체를 다른 병원체들과 정확하게 감별진단할 수 있다.
또한 본 발명에 의한 미니어레이법은 향후 조건을 맞추어 수십 개의 질병유전자 프로브를 나일론막에 적하한 후 PCR법으로 증폭된 유전자와 하이브리드화함으로써 다른 동물 질병 및 병원체 검색에 대한 더 많은 진단 분야에서 보다 유용하게 사용될 것으로 보이며 감별진단에 효율성이 높아 국내 축산업에 큰 걸림돌이 되는 가축 전염병의 방역에도 도움이 될 것이다.
도 1은 본 발명에 의한 돼지 써코바이러스 감별진단을 위한 미니어레이법의 모식도이다.
도 2a 및 2b는 본 발명에 의한 미니어레이법을 통한 돼지 써코바이러스 PCV1 및 PCV2의 감별진단 결과를 각각 보여준다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Management: Ministry of Agriculture and Forestry, National Veterinary Research)
<120> Miniarray for differential diagnosis between the porcine
circovirus type 1 and 2
<160> 5
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> porcine circovirus type 1
<400> 1
gcggaaccag gggaagtttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
60
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> porcine circovirus type 2
<400> 2
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60
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> common probe of porcine circovirus type 1 and 2
<400> 3
gacctgtcta ctgctgtgag tacctttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
60
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer
<400> 4
ccgctgccac atcgagaaag 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense primer
<400> 5
cccgctcact ttcaaaagtt cagc 24
Claims (2)
1) 나일론막에 돼지 써코바이러스 타입 1(서열번호 1)과 2(서열번호 2)의 DNA 및 공통 프로브(서열번호 3)를 각각 적하시키는 단계;
2) 야외샘플에서 분리한 돼지 써코바이러스 DNA를 PCR로 증폭하는 단계;
3) 상기 1) 단계의 나일론 막과 상기 2) 단계의 PCR 증폭 산물을 하이브리드화시키는 단계;
4) 상기 3) 단계의 하이브리드화물을 니트로브로테트라졸리움과 브로모클로로인도린 포스페이트로 염색하는 단계; 및
5) 상기 4) 단계의 발색 결과를 통하여 음성 또는 양성을 판단하는 단계;
를 포함하는 돼지 써코바이러스 1 및 2의 감별진단방법.
제 1항에 있어서, 상기 2) 단계의 PCR 증폭 반응은 94℃ 5분간 예비-변성한 후 95℃에서 30초간 변성, 65℃에서 40초간 어닐링 및 72℃에서 50초간 확장하는 사이클을 35회 반복한 다음 72℃에서 5분간 반응을 진행시키는 것임을 특징으로 하는 돼지 써코바이러스 1 및 2의 감별진단방법.
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| US10609304B2 (en) | 2018-08-08 | 2020-03-31 | Joshua Soper | System and method for providing and automobile image and information capturing and processing system |
| US10796617B2 (en) | 2013-06-12 | 2020-10-06 | Infineon Technologies Ag | Device, method and system for processing an image data stream |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE07008633T1 (de) * | 1997-12-11 | 2008-12-18 | Merial | Virus des multisystemischen Kümmersyndroms bei Absatzferkeln |
-
2008
- 2008-07-04 KR KR1020080064772A patent/KR100983873B1/ko active IP Right Grant
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