KR20100001165A - 은나노입자의 제조방법과 이에 의해 제조된 은나노입자가도입된 세제용 첨가제 - Google Patents

은나노입자의 제조방법과 이에 의해 제조된 은나노입자가도입된 세제용 첨가제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 은나노입자의 제조방법과 이에 의해 제조된 은나노입자가 도입된 세제용 첨가제에 관한 것으로써, 계면활성제 수용액에 질산은(AgNO3)을 적가하여 반응시키고 pH를 조정한 후 다시 계면활성제와 아스코르브산을 첨가하여 충분히 교반한 다음 pH를 조정하여 제조함으로써 입자 크기의 균일성이 부여된 은나노입자를 얻고, 이를 주요성분으로 사용한 세제용 첨가제를 제공한다.
본 발명에 의하여 제조된 은나노입자가 도입된 세제용 첨가제는 생활 속에서 유래된 유해균에 대한 항균력이 우수할 뿐 아니라 내성 유해균에 대한 항균력이 탁월하여 유해균 제거율 및 항균 지속력이 좋고, 인체에 무해하며, 세제용 조성물에 도입시 세정력을 감소시키지 않으면서도 사용 후 피부가 건조해지거나 당기는 감이 적어 피부 마일드성이 월등히 좋아지며, 제품으로서의 안정성이 우수한 효과를 기대할 수 있다.
세제, 은나노입자, 항균력, 세정력, 안정성

Description

은나노입자의 제조방법과 이에 의해 제조된 은나노입자가 도입된 세제용 첨가제{Method for preparing nano-silver particle and detergent composition by using them}
본 발명은 새로운 은나노입자의 제조방법, 상기한 방법으로 제조된 은나노입자가 도입된 세제용 첨가제에 관한 것이다.
주방용 세제는 식기 및 조리기구 등에 묻은 음식물 찌꺼기를 제거하기 위한 목적으로 사용되는데, 이때 맨손으로 세정을 하면 식기의 오염뿐 아니라 피부의 수분과 유분도 동시에 제거되어 피부에 자극을 주며, 피부가 거칠어지는 경향이 있다. 주방용 세제의 성분으로 식기 등의 세정효과를 위하여 사용되는 주성분은 계면활성제(Surfactants)이나, 계면활성제는 상기와 같이 피부에 자극을 주는 주성분이기도 하다.
한편, 주방용 세제의 경우 필수적으로 사용되는 계면활성제는 다음과 같은 독성을 보유하고 있는 것으로 알려지고 있는데, 즉, 시중의 거의 모든 계면활성제 에서 환경호르몬이 검출되고 있으며, 독성이 크고, 체내에서 유입된 경우 분해되지 않고 축적되는 것으로 알려지고 있어, 계면활성제에 대한 소비자들의 불신이 확산되고 있으며, 이들 계면활성제가 체내에 유입되는 경우, 내분비계 장애물질(환경호르몬)로서 인체에 미치는 영향 및 특성은 다음과 같다.
우선, 정자수의 급격한 감소와 정소종양(고환암), 신경기능 장애유발 및 면역력 저하로 인한 아토피성 피부염, 천식, 비염 그리고 요도하열과 같은 기형을 증가시키면서, 생체호르몬과 달리 쉽게 분해되지 않는다고 알려져 있다. 또한, 이들은 인체 내에 잔류하여 수년간 지속 인체의 지방 및 조직에 농축되는 악영향이 발생하는데, 이에 따라 일반 계면활성제(전착제, Surfactants)시장은 LAS, AOS 등의 석유계 계면활성제를 생분해도가 높은 천연재료를 사용한 무공해, 무독성의 환경친화적인 제품 개발쪽으로 당연히 발전하는 추세이다.
한편, 주방용 세제는 피부에 대한 자극을 감소시키기 위하여 피부 보호성분을 사용하기도 하는데, 이러한 피부 보호성분의 보습 및 보유작용으로 세제의 유효성분에 의한 피부의 탈수, 탈유를 억제하는 작용을 하거나, 피부에 영양을 공급하는 역할을 수행하기도 한다. 일반적으로 사용되는 피부 보호성분제는 글리세린, 솔비톨, 피롤리돈, 카르본산 나트륨 등의 보습제와 단백질 유도체, 인지질 유도체, 식물 및 해조류 추출물 등이다.
피부 보호성분을 첨가한 기술로서 출원 및 등록된 특허로는, 변성 단백질을 함유하는 주방세제 조성물이 명시된 미국특허 제4268406호, 부분적으로 가수분해 된 수용성 단백질을 함유하는 주방용 세제조성물이 명시된 미국특허 제3548056호 등이 있다.
이 외에 알로에와 수세미가 각각 단독으로 사용되는 경우 그 효과가 우수한 것으로 기술된 문헌이 있으나, 피부보호 효과가 기대만큼 크지 않았으며. 몇 가지 첨가제는 주방용 세제가 투명하게 유지되지 못하는 문제점이 있고. 또 피부 보습력이 다소 우수한 몇 가지 피부 성분들은 세정력을 저하시키는 문제점을 가지고 있다.
또한, 최근에는 국내·외적으로 과일이나 채소류가 접촉되는 세척제의 경우에는 천연제제만을 사용하도록 법제화되었으나, 현재 100 % 무독성 세제는 출시된 바 없으며, 소비자 기호성과 욕구에 충족된 기존제제는 특별한 것이 없는 상황이다.
이에 본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 세제용 조성물에 적용될 경우 세제용 조성물로서 세정력 등의 기본능력은 당연히 보유하고, 인체의 피부 접촉과 경구를 통한 인체 내부로의 유입시에도 무독성이며, 항균능 및 항균지속능 등이 우수하게 지속되는 세제용 첨가제와, 상기 세제용 첨가제에 주요성분으로 도입되는 은나노입자의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기한 과제를 해결하기 위한 일례로서 본 발명의 은나노입자의 제조방법은, 1) 계면활성제 수용액에 질산은(AgNO3)을 적가하고 교반하여 환원시키는 단계, 2) 상기 1) 단계에서 얻어진 혼합용액에 수산화나트륨 수용액을 첨가하면서 pH를 7로 조정하는 단계, 3) 상기 2) 단계에서 얻어진 혼합용액에 상기 1) 단계에서 사용한 계면활성제와 아스코르브산을 첨가하는 단계, 4) 상기 3) 단계에서 얻어진 혼합용액에 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 pH를 7로 조절하는 단계, 5) 상기 4) 단계에서 pH가 조절된 혼합용액을 증발 및 건조시키는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기한 과제를 해결하기 위한 다른 일례로서 본 발명의 세제용 첨가제는, 상기한 방법으로 제조된 것으로 5 내지 100 ㎚ 범위의 직경을 갖는 은나노입자가 1 내지 100 ppm 범위로 포함된 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명의 은나노입자의 제조방법을 각 단계별로 구체적으로 설명한다.
1) 계면활성제 수용액에 질산은(AgNO3)을 적가하고 교반하여 환원시키는 단계.
상기 1) 단계의 계면활성제는 물에 녹여 완전히 용해시켜 제조된 계면활성제 수용액을 사용하며, 농도가 0.1 내지 5 M 범위인 것을 사용하는데, 0.45 ㎛ 필터멤브레인으로 거른 다음 교반하에 제조한다.
상기 1) 단계의 질산은(AgNO3)은 계면활성제 수용액 중 0.1 내지 5 중량% 범위로 포함되도록 하여 질산은의 환원을 유도하도로 하는데, 첨가되는 질산은의 함량에 따라 얻어지는 은나노입자의 농도가 달라지며, 은나노입자의 크기 변동되므로 질산은의 함량을 이에 따라 조절하도록 한다.
계면활성제 수용액 중에 질산은은 천천히 적가시키도록 하며 질산은의 적가가 끝나면 1 내지 3 시간 동안 격렬하게 교반하여 환원반응이 충분히 이루어지도록 한다.
상기 계면활성제로는 양이온성계면활성제, 음이온성계면활성제, 비이온성계면활성 및 양성이온성계면활성제 등을 사용할 수 있으며, 특히 음이온성계면활성제를 사용하는 것이 고른 은나노입자를 제조하는 측면에서 좋다.
2) 상기 1) 단계에서 얻어진 혼합용액에 수산화나트륨 수용액을 첨가하면서 pH를 7로 조정하는 단계.
상기 수산화나트륨 수용액은 대개 0.2 N 농도로 제조하는 것이 효과적이다. 이러한 수산화나트륨 수용액은 1) 단계에서 얻어진 질산은의 환원이 이루어진 혼합용액에 천천히 첨가하여 이의 pH를 7로 조정한다. pH가 이에 달하지 않을 경우 응집하는 경향이 있으므로 주의를 요한다.
3) 상기 2) 단계에서 얻어진 혼합용액에 상기 1) 단계에서 사용한 계면활성제와 아스코르브산을 첨가하는 단계.
본 단계에서 계면활성제는 응집을 억제하는 역할을 수행하는 성분으로, 상기 2) 단계에서 얻어진 혼합용액 중 0.1 내지 5 중량% 비율로 사용하며, 이때 상기 함량 미만으로 적으면 불안정화되는 경향이 있고, 상기 함량을 초과하여 과다하면 불순물을 제거하기 어려운 경향이 있다. 아스코르브산은 산화 또는 물에 잘 분산시키는 역할을 수행하는 성분으로 상기 2) 단계에서 얻어진 혼합용액 중 0.1 내지 5 중량% 비율로 사용하며, 이때 상기 함량 미만으로 적으면 은이온 입자가 형성되지않는 경향이 있고, 상기 함량을 초과하여 과다하면 응집하는 경향이 있다. 계면활성제와 아스코르브산이 첨가된 용액은 50 내지 100 rpm으로 1 내지 5시간동안 충분히 교반한다.
4) 상기 3) 단계에서 얻어진 혼합용액에 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 pH를 7로 조절하는 단계.
계면활성제와 아스코르브산을 첨가하여 충분히 교반한 후 얻어진 상기 3) 단계의 혼합용액에 수산화나트륨 수용액을 천천히 적가하여 pH가 7이 되도록 조절한 다.
5) 상기 4) 단계에서 pH가 조절된 혼합용액을 증발 및 건조시키는 단계.
상기 4) 단계에서 pH가 조절된 분산물은 진공오븐 등의 다양한 건조 수단을 적용하여 용매의 증발과 건조가 이루어지도록 한다. 상기와 같이 방법으로 5 내지 100 nm 범위의 고른 직경을 가지는 은나노입자를 얻을 수 있다. 이렇게 얻어진 은나노입자는 이를 필요로 하는 다양한 산업분야에 적용할 수 있다.
이하, 본 발명의 세제용 첨가제를 구체적으로 설명한다.
본 발명의 세제용 첨가제는 상기한 방법으로 제조된 은나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하며, 전체 중량 중 1 내지 100 ppm 범위로 포함한다.
본 발명의 세제용 첨가제는 통상의 세제용 조성물의 각 성분들의 고유 기능과 항균능을 저하시키지 않는 특성을 가진다. 본 발명의 세제용 첨가제는 통상의 주방용 및 기타 세제 조성물을 이루는 성분들을 포함하여 구성될 수 있으며, 여기에 상기한 은나노입자를 포함하여 구성된다. 구체적으로 예를 들어 계면활성제, 금속이온봉쇄제 등을 포함할 수 있으며, 이러한 성분들을 일정비율로 첨가한 후 교반하여 혼합상태를 이루도록 한다.
일례로서, 주방용 세제 조성물에 적용될 경우 사용되는 계면활성제 100 중량부를 기준으로 하여 금속이온봉쇄제 0.1 내지 0.5 중량부를 포함할 수 있으며, 여기에 은나노입자는 1 내지 100 ppm 범위로 사용할 수 있다. 이때, 은나노입자의 함량이 1 ppm 미만일 경우 초기 항균성 등은 나타나지만 항균성과 항곰팡이성의 지속 력이 약해지는 경향이 있고, 은나노입자의 함량이 100 ppm을 초과할 경우 제조비용이 상승될 뿐 아니라 세제용 조성물 내부에서 침전될 수 있어 저장성이 저하되는 경향이 있다.
특히, 본 발명에 의하여 제조된 은나노입자는 일반 항생제 성분에 의하여 내성이 생긴 병원균에도 탁월한 항균력을 나타내므로, 주방용 세제 조성물에 적용되어 특히 좋다. 또한, 본 발명에 의하여 제조된 은나노입자는 미세하고 균일한 크기 분포를 나타내므로 분말상으로 사용되더라도 주방용 세제 조성물에 적용되어 장기가 보존시에도 침전되지 않고 저장 안정성이 우수하다.
또한, 본 발명에 의하여 제조된 은나노입자는 별도의 안정화제와 같은 원료를 사용하지 않고 제조되므로 주방용 세제에 적용시 거의 문제를 발생시키지 않는 특성을 가진다.
본 발명의 세제용 첨가제에 사용되는 은나노입자는 상기한 방법으로 제조된 것으로 10 nm 이하의 평균입자크기를 가지는 것을 사용하는 것이 좋으며, 바람직하게는 100 nm이하의 평균입자크기를 가지는 것을 사용하는 것이 좋다.
본 발명의 은나노입자를 포함하는 세제용 첨가제를 주방용 세제 조성물에 도입할 경우, 사용될 수 있는 계면활성제는 양성(± )이온성계면활성제, 양이온성계면활성제, 음이온성계면활성제, 비이온성계면활성제 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종을 사용하며, 혼합물의 경우 혼합비는 크게 한정하지 않고 적용할 수 있다.
상기 양성(± )이온성계면활성제는 베타인계 계면활성제, 이미다졸린계 계면 활성제 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 좋으며, 상기 베타인계 계면활성제로는 코코아미드 프로필 베타인(Cocoamido propyl betain), 라우릴 베타인(Lauryl betain) 등 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하며, 상기 이미다졸린계 계면활성제로는 코코암포디아세테이트(Cocoamphodiacetate)를 사용하는 것이 바람직하고, 본 발명을 저해하지 않는 한 알려진 양성(± )이온성계면활성제들 중 어느 것을 사용하여도 무방하다.
상기 음이온성계면활성제는 크게 한정하지 않으나, 소듐 라우릴 에테르 설페이트(Sodium lauryl ether sulfate), 소듐 라우릴 설페이트(Sodium lauryl sulfate), 소듐 크실렌 설포네이트(Sodium xylene sulfonate) 등 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 비이온성계면활성제는 크게 한정하지는 않으나, 글리콜 스테아레이트(Glycol stearate), 아민 옥사이드(Amine oxide), 코코넛 디에탄올(Coconut diethanol), 에틸렌 옥사이드(Ethylene oxide) 부가물, 라우릴 에테르(Lauryl ether), 세틸에테르(Cetyl ether), 올레일 에테르(Oleyl ether) 등 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 양이온성계면활성제는 베타인계 계면활성제, 이미다졸린계 계면활성제 또는 이들의 혼합물을 사용하며, 베타인계 계면활성제와 이미다졸린계 계면활성제는 어느 것을 사용하여도 무방하다.
한편, 주방용 세제 제조시 사용되는 일반수, 암반수 또는 지하수에 다량의 금속이온이 들어 있으며, 금속이온은 은나노입자와 반응하여 침전되거나 반응성을 저하시킬 수 있다.
이에, 본 발명의 세제용 첨가제는 은나노입자를 포함하므로, 이를 도입하는 세제 조성물에 사용되는 물 속에 포함된 금속이온과의 화학반응을 방지하기 위하여 금속이온봉쇄제를 함께 사용하는 것이 좋다.
상기 금속이온봉쇄제는 사용된 계면활성제 100 중량부에 대해 0.1 내지 0.5 중량부를 첨가하는 것이 바람직하며, 이때, 금속이온봉쇄제의 첨가량이 0.1 중량부 미만으로 혼합될 경우에는 금속이온봉쇄제의 효율이 저하되어 은나노입자가 다른 금속이온물질의 반응에 의하여 변색 또는 침전이 발생하는 문제가 있고, 0.5 중량부를 초과하여 혼합될 경우에는 은나노입자가 가지는 항균성 및 항곰팡이성 특성이 저하되는 경향이 있다.
한편, 상기 금속이온봉쇄제로는 소듐 포스페이트(Sodium phosphate), 모노소듐 포스페이트(Monosodium phosphate), 디소듐 포스페이트(Disodium phosphate), 트리소듐 포스페이트(Trisodium phosphate), 소듐트리폴리 포스페이트(Sodium tripoly phosphate), 소듐헥사메타 포스페이트(Sodium hexametaphosphate), 테트라소듐 피로포스페이트(Tetrasodium pyrophosphate), 소듐엑시드 피로포스페이트(Sodium acid pyroposphate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합물인 인산계화합물을 사용하는 것이 바람직하며, 이와 같은 인산계 화합물을 사용할 경우 색상변화를 방지하고, 은나노입자의 분산, 안정 및 증점 효과를 주어 은(Ag)이 침전되는 현상 방지에 더욱 효과적이다.
상기한 계면활성제 및 금속이온봉쇄제 외에도 당분야에서 사용할 수 있는 계 면활성제 및 금속이온봉쇄제를 당업자의 선택에 따라 적절히 사용할 수 있다.
이와 같이 조성된 주방용 세제 조성물은 일반수, 암반수 또는 지하수에 일정비율로 희석하여 주방용 세제로 제조될 수가 있다.
한편, 본 발명의 세제용 첨가제는 주방용 세제 외에 섬유 유연제 등에 도입되어도 섬유 유연제 등에 포함되는 성분들의 고유 기능을 저해시키지 않으며, 항균능 및 항균지속능이 우수하게 나타난다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 의하면 간단한 방법으로 균일한 입자 크기 분포를 가지는 미세한 은나노입자를 제조할 수 있으며, 이를 적용하여 은나노입자 특유의 항균성 및 항곰팡이성에 더하여, 항균제에 대한 내성이 생긴 병원성 미생물에 대해서도 지속적인 항균성을 나타내는 세제용 첨가제를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 세제용 첨가제가 도입된 주방용 세제 및 섬유 유연제 등을 항균성 및 항곰팡이성이 저하되지 아니하면서 세정력이 유지 또는 상승 될 뿐 아니라 피부 자극도가 급격히 감소되었고, 피부 마일드성이 월등히 상승하며, 제품으로서의 저장 안정성이 향상된 효과를 나타낸다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 구체적으로 설명하겠는바, 다음 실시예에 의하여 본 발명의 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 은나노입자의 제조
HS-5801 계면활성제를 물에 녹여 완전히 용해시키고(1M), 질산은을 천천히 첨가하여 2시간동안 교반하였다. 수산화나트륨(0.2 N)을 추가하여 pH를 7로 맞추고, HS-5801 계면활성제와 아스코르브산(Ascorbic acid, 1M)를 조절하여 천천히 용액에 첨가하였으며, 여기에 수산화나트륨(0.2 N)을 추가하여 pH를 7로 맞추고 2시간동안 교반한 다음 25℃ 회전증발한 후, 진공오븐(45℃ )에서 4 일 동안 건조하여 은나노입자를 얻었다.
실험예 1. 은나노입자의 크기 및 형태 확인
상기 실시예 1에서 얻어진 은나노입자의 형태는 투과전자현미경으로 측정하여 확인하였으며, 은나노입자의 크기는 입자분석기로 측정하였으며, 첨부도면 도 1에 상기 제조된 은나노입자의 입자 크기 분포를 나타내었다. 도 2에는 동일 조건에서 제조한 은나노입자의 투과전자현미경 사진을 나타낸 것이다. 도 1에 의하면 1 내지 50 내지 750 ㎚ 범위의 고른 입자 크기 분포를 나타내는 균일한 크기의 은나노입자를 확인할 수 있으며, 도 2에 의하면 구상으로 형성된 균일한 크기의 은나노입자를 확인할 수 있다.
실험예 2. 병원성 대장균을 대상으로 한 은나노입자의 항균효과 확인
가. 병원성 대장균에 대한 실험실적 항균성 효과검정
1) 대장균 분리 및 은나노입자 준비
가) 시료채취 및 은나노입자의 준비
사용된 공시 균주는 설사가 보여 실험실 진단이 의뢰된 자돈 분변에서 분리하여 사용하였으며, 항균시료로는 상기 실시예 1의 방법에 의하여 제조된 것으로 10 nm 이하의 입자분포가 80 %를 점유하고 있는 구성을 보유하고 있는 은나노입자(나노실버 또는 나노실버-II와 동일한 의미로 사용)[5,000 ppm, 나울(주), 한국]를 이용하였다[도 2참조].
나) 사용배지
대장균(E.coli)을 분리하기 위해 MacConkey agar(Difco)와 Blood agar를 사용하였고, 선모(pili) 생성을 검사하기 위해 Minca medium(KH2PO4 1.36g, Na2HPO4·2H2O 10.1g, MgSO4·7H2O 0.008g, MnCl2·4H2O 0.001g, FeCl·2H2O 0.000135g, CaCl2·2H2O 0.0004g, Glucose 1g, Casamio acid 1g, Yeast extract 1g, Bacto agar 3g, distilled water 1,000ml, pH 7.5)을 사용하였다.
이열성 장독소를 확인하기 위해서는 Trace salt solution(MgSO4 5g, MnCl2 0.5g, 0.5 % FeCl3 solution 10ml, distilled water 90ml)이 1ml 첨가된 Casamino acid-Yeast extract medium(CYEM : casamino acid 20g, Yeast extract 6g, NaCl 2.5g, K2HPO4 8.71g, distilled water 999ml)을 사용하였다.
다) 대장균 분리 및 동정
분변시료를 MacConkey agar와 Blood agar에서 심어 18 내지 24시간 배양하고, MacConkey agar plate의 경우, 유당 분해 집락 1 내지 2개를 선정하고, Blood agar plate에서는 완전 용혈을 나타낸 탄백색(炭白色)의 매끄러운(smooth) 집락을 1 내지 2개 선정하여 순수 분리 하였다.
순수 분리된 집락은 자동 미생물 동정장치(Vitek System, Automicrobic System, AMS)를 이용하여 나타난 생화학적 성상에 의하여 동정 하였다.
라) 혈청학적 동정
분리균을 혈청학적으로 동정하기 위하여, Φrskov 등의 방법(1977)에 준하여 생산된 OK 항혈청을 이용한 평판 응집반응법으로 OK 항혈청을 결정하였다.
마) 선모 생성능 검사
MRHA 테스트(Mannose-resistant hemaglu1tination test)는 Jones와 Rutter의 방법(1972)으로 실시하였다. 즉, MRHA 테스트는 Minca broth에 18 내지 24시간 37℃에서 배양한 항원을 50ppm 만노스 인산완충용액(NaCl 8g, Na2HPO4 11.5g, KH2PO4 0.2g, KCl 0.2g, D-mannose 5g, Distilled water 1.000ml, pH 7,2) 0.025ml 씩을 U 형 마이크로 플레이트(U-form microplate, Dynatech Lab.)에 넣은 후 2배수 희석하였다. Alsever 용액(glucose 2.05g, sodium citrate 0.8g, NaCl 0.42g, Citric acid 0.055g, distilled water 10ml)과 기니 피그(guinea-pig)에서 채혈한 동량의 혈액을 섞은 후 인산완충용액(PBS)으로 3회 세척 후 PBS 에 1%(v/v)로 부유 시켜 만든 1% 기니피그 적혈구액 0.025ml를 드로퍼(dropper, Dynatech Lab.)로 플레이 트(plate)에 점적하면서 잘 혼합하여 0 내지 4℃에서 2 내지 3시간 방치 시킨 후 혈구 응집이 일어난 항원의 최고 희석 배수를 MRHA로 정하였다.
바) 헤몰리신의 검사
분리균을 blood agar에 도말 접종한 다음 용혈 여부로 헤몰리신(Hemolysin)을 증명하였다.
사) 이열성 장독소 ( Heat - labele enterotoxin : LT 검사)
분리균주의 이열성 장독소(LT) 증명을 위해 분리균을 CYEM에 접종 하고, 37℃에서 18 내지 24시간 진탕 배양하여 원심 분리한 후, 그 상층액을 실험재료로 사용하였다. 엘리사(Enzyme linked immunosorbent assay, ElISA)는 WHO방법(1983)에 준하여 검정하였으며, 판정은 웰(Well)의 OD(Optical density)평균치를 음성 대조구의 평균치와 비교하여 OD 치의 차가 0.2 이상일 경우 LT 생성 양성균주로 판정하였다.
아) 대장균 O157 : H7 균의 준비
사용된 균주는 지정병원을 내원한 설사환자 145명으로부터 분리한 O157 설사 유발 대장균중 Brown등(1982)의 방법에 따라 혈청 분석 및 독소형을 판정한 균주로서, 베로톡신 1(Verotoxin 1, VT1)생산 대장균 및 베로톡신 2(Verotoxin 2, VT2) 생산 대장균 VT1 : O157 : H7(ACH5), V2 : O157 : H7(O59)과 V1+V2 : O157 : H7(670), VT2 Cl-0157 : H7, VTe 0138, E57(VTe), VT2 Cl-0157: H7 총 6종을 경상대학교 동물 면역 연구소에서 분양 받아 사용하였다.
자) 대장균 O157 : H7 균주의 혈청학적 동정
적용하고자 하는 인축(人獸) 공통 병원균 O157:H7 대장균에 대하여 혈청학적 시험은 Karmail(1985)의 방법을 적용하여 O-group serotype 6종 균주에 대하여 평판응집반응을 실시하여 응집유무를 판정하였으며, 생화학적 성상시험은 Edwards와 Ewing의 방법(1986)에 준하여 실시하여 추가적으로 O157:H7 대장균임을 확인하였다.
2) 대장균의 배양
대장균(E.coli) 분리주들은 영양 육즙배지(Difco)에 접종하여 37℃, 150 rpm에서 18시간동안 진탕배양하였다. 이 대장균 배양액을 원심분리(500 xg, 4min)하여 E.coli만을 순수하게 분리한 다음 인산완충액(0.1M, pH 7.0)으로 희석하되 필요할 경우 이 원심과정을 수회 반복하여 세균수를 조정하여 실험에 사용하였다.
3) 대장균의 흡광도 측정
은나노입자의 대장균에 대한 증식억압 능력을 측정하기 위하여, 영양 육즙배지(Difco)를 만들어 pH를 6.0으로 조정한 후 250 ㎖ 삼각플라스크에 이 배지액을 분주한 다음, 고압 멸균시켰다. 이 영양 육즙배지에 농도별(50ppm, 25ppm, 5ppm, 1ppm)로 희석한 은나노입자 용액을 첨가하고, 앞서 준비한 대장균 배양액을 1㎖씩 분주한 후, 37℃에서 진탕배양시키면서 1시간부터 한시간 간격으로 12시간까지 흡광도(optical density, OD)를 흡광광도계(Spectronic 20, Bauch & Lomb, 독일)를 이용(660 ㎚)하여 측정하였다.
라. 은나노입자 첨가 후 대장균수 측정
은나노입자의 첨가 농도별 항균성을 알아보기 위해 250 ㎖ 플라스크 내 영양 육즙배지를 만들어 대장균을 접종하여 37℃에 배양시켰다. 이들 대장균 배양액은 2 x 107 cfu/㎖로 조정한 다음, 은나노입자를 농도별(50ppm, 25ppm, 5ppm, 1ppm)로 첨가한 5개 처리구와 은나노입자를 첨가하지 않은 대조구를 두었다. 은나노입자를 첨가한 후 1분, 2분, 3분 4분 및 5분, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 및 12시간에 각 처리구별로 10 ㎕씩 채취하여 990 ㎕의 인산완충액을 넣은 캡 시험관에 잘 섞은 다음 이중 50㎕를 혈액 한천배지에 도말하여 하루동안 배양시켜 나타난 집락수를 세었다.
마. 일반항생제와 은나노입자의 항균효과 비교
은나노입자의 항균성을 검정한 결과 우수한 항균력을 나타내었으나, 최종 pH의 범위가 약산성범위를 보유하고 있어 이러한 pH가 항균력에 효과를 나타내는지를 추가로 확인할 필요성이 대두되었다. 실험구는 다음과 같이 설정하였다.
1) 실험구 1(일반항균성 비교실험)
우선 항생제인 OTC와 은나노입자의 첨가농도별 항균성을 알아보기 위해 250 ㎖ 플라스크 내 영양 육즙배지를 만들어 E. coli O157:K88ac를 접종하여 37℃에 배양시켰다. 이들 대장균 배양액은 2 x 107 cfu/㎖로 조정한 다음, 생리적 식염수에 이들 균을 일정량 첨가한 후 여기에 은나노입자와 OTC를 각각 농도별(50ppm, 25ppm, 5ppm 그리고 1ppm)로 다르게 첨가한 5개 처리구와 생리적 식염수에 희석한 대조구를 비교실험구로 설정하였다.
OTC와 은나노입자를 첨가한 후 1시간, 13시간 그리고 16시간이 경과시 각 처리구별로 100 ㎕씩 채취하여 990 ㎕의 인산완충액을 넣은 캡 시험관에 잘 섞은 다음 이중 50 ㎕를 혈액 한천배지에 도말하여 하루동안 배양시켜 나타난 집락수를 세었다.
2) 실험구 2(pH 조건에 따른 항균효과)
은나노입자의 pH를 약산성과 중성으로 조절하여 항균성을 측정하였고, 대조로서 일반 항생제를 사용하여 첨가농도별 항균성을 알아보았다. 이를 위하여, 분리되고 동정된 E. coli O157:K88ac종을 이용하여 상용화된 일반항생제와 은나노입자의 항균 효과를 비교하였다.
동시에 최종 제조된 은나노입자의 pH가 4.8 내지 5.0 범위임을 감안하여 혹시 이러한 pH가 항균효과에 미치는 효과가 있는지를 더불어 확인하였다. 이를 위하여 비교 항생제로서 OTC (Oxytetracycline-HCl, 한국, 삼양약화학사, Lot No. 9503-1)를 구입하여 은나노입자와 항균성을 비교하였다.
실험조건은 은나노입자와 OTC를 투여하지 않은 비교예에 대하여 일반 멸균수에 각각을 투여한 배지를 조성하고 2 x 1011 cfu/의 대장균 배양액을 혼합한 후 1시간 후, 13 시간 후, 16 시간이 경과 후에 은나노입자와 OTC의 항균효과를 비교함과 동시에 pH 4.8과 pH 6.75를 조성하여 은나노입자의 pH의 영향에 대한 항균효과의 차이도 동시에 검정하였다.
[결과]
1. 병원성 대장균에 대한 실험실적 항균성 효과검정
가. 현장 감염 대장균 분리
이 실험에서 사용된 균주는 설사가 보여 실험실 진단이 의뢰된 자돈 분변에서 분리하였으며 혈청형은 088:K-, 0147:K88ac, 09:K103, 015:K-, 04:K12가 각 1주씩, 0157:K88ac, 015:K-, 09:K103, 020:K101 및 미분류형 등은 각 2주씩, 01:K-가 3주, 그리고 0149:K91가 7주 등 총 26종이었다[표 1].
표 1. 자돈 분변(설사)으로부터 분리된 대장균의 특성
Characteristics of Escherichia coli
Types serotype F4 F5 F6 LT ST
β 0147:K88ac:K89 - + - - -
β 0157:K88ac - - + - +
β 0157:K88ac + - - - +
β 0157:K88ac - - - - +
β 0149:K91 + - - -
β 0149:K91 - - - -
β 0149:K91 - - - -
γ 0149:K91 + - - -
β 0149:K91 + - - -
β 0149:K91 + - - - +
β 0149:K91 - - + - +
γ 020:K101 + - - -
γ 020:K101 - - - -
γ 01:K- - - - -
β 015:K- - - - -
γ 04:K12 - - - -
γ 088:K- - - - -
β 01:K- - - - - +
γ 09:K103:K987 - - - -
β 01:K- - - - - +
γ nontypable + - - -
γ 09:K103:K987 + - - -
β 04:K12 - - - -
γ nontypable - - - -
γ nontypable - - + -
γ 015:K- - - + -
이들 혈청형 중 0157:K88ac, 01:K-, 0149:K91등은 내열성 독소를 생산하는 것들이었다[표 1]. 그리고, 본 실험에 사용된 설사환자 유래 VT생산 대장균들인 O157:H7의 VT1 또는 VT2 인지의 추가 확인 시험을 실시하기 위하여, O157:H7 항혈청을 이용하였고, 이를 이용한 중화 실험을 실시한 결과 분리균 모두 O-group serotype의 VT1 또는 VT2로 판정되었다.
나. 은나노입자의 대장균에 대한 항균성
이 실험에 사용한 E. coli주들의 항균성은 대조구에 비하여 1 ppm 은나노입자 처리 외에 5ppm 내지 50 ppm 농도사이의 은나노입자 첨가 후 1 내지 12 시간 동안에 뚜렷한 차이를 나타내어 매우 우수한 항균효과를 보였다[표 2].
이중, 전체 E. coli O157 : H7 균주들을 대상으로 은나노입자의 성장 억제 효과를 확인한 결과는 도 3과 도 4에 나타내었다.
결과로서 대조구에 비하여 전체적으로 1 ppm 내지 50 ppm농도의 은나노입자를 투여시, 전반적으로 O157:H7 대장균의 성장이 억제되는 것을 확인하였다. 그러나. 대장균중 VT2 Cl-Ol57:H-은 1 ppm이하, VT2 Cl-O157:H7종은 1 ppm 이하 농도의 은나노입자를 첨가시는 성장을 억제시키지 못하는 것으로 나타났다[도 3B 내지 3C, P<0.05). 이는 O157:H7균들 중 혈청형에 따른 항균 효과가 다소 차이가 있는 것으로 나타났다. 그러나, 그 이외의 O157:H7균은 1 내지 12 시간 동안 성장 억제 효과는 뚜렷한 차이를 나타내어 매우 우수한 항균효과를 보였다[도3A, P<0.01].
표 2. 자돈 분변(설사)으로부터 분리된 26 종의 대장균에 대한 농도별 은나노입자처리 후 항균활성(은나노입자 처리 후 1 시간 경과, 37℃).
Serotypes Antibacterial effects(%) after nano-silver treatment of various concentration
control 50ppm* 25ppm* 10ppm* 5ppm* 1ppm**
0147:K88ac:K89 100 1.8±0.7 18.0±6.5 14.7±5.5 24.5±8.9 57.3±13.2
0157:K88ac 100 0.4±0.8 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
0157:K88ac 100 0.0±0.0 0.0±0.0 7.0±2.4 9.5±3.4 10.4±5.6
0157:K88ac 100 0.0±0.0 0.0±0.0 4.6±1.2 6.5±3.2 10.0±4.5
0149:K91 100 0.0±0.0 1.5±0.4 3.8±1.5 7.0±4.1 7.9±2.9
0149:K91 100 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.2±0.3 4.2±2.4
0149:K91 100 0.0±0.0 1.2±0.6 0.9±0.8 1.2±0.8 7.1±3.4
0149:K91 100 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.2±0.3 4.7±2.3
0149:K91 100 0.0±0.0 1.2±1.6 0.9±0.2 1.2±0.8 7.1±4.5
0149:K91 100 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
0149:K91 100 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
020:K101 100 0.0±0.0 0.0±0.0 26.8±12.0 21.8±13.2 0.4±0.3
020:K101 100 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
01:K- 100 0.0±0.0 0.0±0.0 0.2±0.15 2.0±0.12 2.7±2.3
015:K- 100 0.1±0.2 0.0±0.0 0.1±0.02 2.9±1.3 4.1±1.4
04:K12 100 0.0±0.0 1.5±0.34 4.3±2.4 5.1±1.3 7.6±3.3
088:K- 100 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
01:K- 100 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
09:K103:K987 100 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 18.3±8.7 20.4±12.4
01:K- 100 0.0±0.0 1.7±0.7 1.7±0.3 7.1±3.2 0.0±0.0
nontypable 100 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.6±0.2
09:K103:K987 100 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.6±0.23 0.0±0.0
04:K12 100 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
nontypable 100 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 5.0±6.2 0.0±0.0
nontypable 100 0.0±0.0 0.0±0.0 0.03±0.04 0.0±0.0 0.0±0.0
015:K- 100 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.2±0.3 2.9±3.2
* P<0.01 as compared to control, ** P<0.05 as compared to control
다. 은나노입자 투여 후 대장균수 변화
은나노입자를 첨가하지 않은 대조구에 대하여 5 ppm의 은나노입자를 첨가한 실험구의 대장균에 대한 항균성은 도 4와 같다. 1ppm 내지 50 ppm의 은나노입자 첨가시 10분 이내에 대장균주들의 집락수가 대조구에 비해 뚜렷하게 감소하였고, 대조구 내 대장균들은 최초 투여 후 10분에 집락수가 평균 1.21 배 증가하여 있었다.
은나노입자 처리 후 10 분 이내 대장균 집락수는 1ppm 은나노입자 처리시 대조구(100%기준)에 비해 상대적으로 평균 87.7%가 감소하였고, 5ppm 은나노입자 처리시 평균 95.8%가, 10 ppm 은나노입자 처리시 100%까지 떨어져 대장균을 찾아 볼 수 없었다. 또한 1 ppm와 5 ppm 은나노입자 처리시에도 대장균의 집락수가 대조구에 비해 평균 87%, 84.3%로 각각 뚜렷하게 감소하였다[표 2].
10 ppm의 은나노입자 만을 투여한 후 10 분부터 12 시간까지의 항균효과는 10 분이 경과시 E. coli의 집락수가 뚜렷하게 감소되어 있었고, 1ppm 내지 50ppm 은나노입자 처리구의 경우, 12 시간째에는 모든 은나노입자 첨가군에서 대장균의 집락을 볼 수 없었다.
대장균과 살모넬라균을 대상으로 한 항균 기작을 확인하기 위하여, 은나노입자를 처리한 후 이를 전자현미경으로 확인하여 보았는데, 그 결과, 은나노입자에 접촉된 병원성 세균은 우선 세포벽에 부착되고, 2차적으로 세포막을 투과하여 세포벽 단백질을 변성시켜, 결론적으로 빠른 시간에 균의 사멸에 이르게 하는 것으로 조사되었다[도 6].
또한 전체 대장균에 대한 은나노입자의 첨가 농도별 항균효과를 은나노입자를 첨가한 후 1시간이 경과시, 이중 일부를 분취하여 영양고체 배지에 도말하고 배양하여 성장한 대장균 집락수를 확인하여 본 결과, 전체 대장균 중 1ppm이상의 은나노입자 처리구 중 O157:K88ac:K89, O9:K103:K987 대장균은 57.3 및 20.4%가 생존하여 있었으며, 이외의 대장균의 생존률은 약 10% 이내로 나타나 은나노입자에 의한 항균성은 균종 및 혈청형에 따라 다소 차이가 있는 것으로 나타났다. 그러나, 대조구의 경우 대장균수가 최초 측정시에 비해 12 시간 후에는 평균 약 6.9배까지 지속적으로 증식이 이루어지고 있다[표 2, 도 5, P<0.01].
은나노입자를 첨가한 항균억제 효과를 검정한 흡광도(O.D) 실험 결과에서, 은나노입자는 세균에 대한 성장 억압 효과가 확인 되었으나, 이 결과가 사멸에 의한 효과인지, 정균작용에 대한 효과인지는 확인할 수 없어 집락을 확인하고 사멸 및 정균효과를 판정하기 위한 실험을 진행하여 보았다.
결과로서, 은나노입자를 첨가하지 않은 대조구에 대하여 1ppm의 은나노입자를 첨가한 실험구의 각 E. coli O157 : H7에 대한 항균 효과 결과는 다음과 같다. 즉, 1 ppm 은나노입자를 첨가시 10 분 이내에 E. coli O157 : H7주들의 집락수가 대조구(100% 기준)에 비해 VT1 : O157 : H7(ACH5), V2 : O157 : H7(O59)과 V1+V2 : O157 : H7(670) 및 VTe 0138, E57(VTe)의 경우 약 20%에서 49%까지 감소하였다[ 도 4-A, P<0.01].
그러나, VT2 Cl-0157 : H-의 경우는 오히려 약 102 % 내지 105 %로 증가하는 경향을 나타내었으나[도 4-B], 은나노입자 첨가 후 2시간이 경과한 후에는 약 53%로 뚜렷하게 감소하였다(P<0.001). 또한, VT2 Cl-0157: H7의 경우는 1 ppm 이하의 은나노입자 농도군에서도 대장균은 사멸 및 정균효과는 인정되지 않았다[도 4-C]. 그리고, 대조구 내 E. coli O157 : H7들은 최초 투여후 시간이 경과함에 따라 집락수가 점차적으로 증가해 있었다[도 4, P<0.01].
도 4(A)는 E. coli VT1 O157:H7(ACH5)에 대한 은나노입자 첨가 농도별 항균 효과이다. 대조구는 최초 투여시에 비하여 14시간 이후에는 1.8배 성장하여 있었으 며, 전체 은나노입자 처리후 14시간 경과시는 집락은 나타나지 않아, 완전 사멸된 것으로 나타났다(P<0.01). 그리고, 5 ppm의 은나노입자를 첨가하고, 5분 경과시는 최초투여시와 비교시 약 38 %까지 균은 감소되어 있었고, 30분 경과시는 30 %로, 2시간 경과시는 5.5 %로 감소되고 최종 14시간 경과시는 집락은 나타나지 않아 완전히 사멸된 것으로 나타났다(P<0.01).
도 4(B)는 E. coli VT1 O157:H7(O59)에 대한 은나노입자 첨가 농도별 항균 효과이다. 대조구는 최초 투여시에 비하여 14시간 경과시에는 2.72배 성장하여 있었으며, 전체 은나노입자 처리후 14시간 경과시에 집락은 나타나지 않아, 완전 사멸된 것으로 나타났다(P<0.01), 그리고, 5 ppm의 실험구를 기준으로, 은나노입자 첨가후 5분 경과시는 최초와 비교하여 약 28%까지 균은 감소되어 있었고, 30분 경과시는 6%, 최종 14 시간 경과시는 집락은 나타나지 않아 완전히 사멸된 것으로 나타났다(P<0.01).
도 4(C)는 E. coli VT1+VT2 O157:H7(670)에 대한 은나노입자 첨가 농도별 항균 효과이다. 대조구는 최초 투여시에 비하여 14시간 경과시 5.65배로 성장하여 있었으며, 전체 은나노입자 처리후 14시간 경과시 집락은 나타나지 않아, 완전 사멸된 것으로 나타났다(P<0.01). 그리고, 5ppm의 실험구를 기준으로, 은나노입자 첨가후 5분 경과시는 최초와 비교시 약 69%까지 균이 감소되었고, 30분 경과시는 약 48%로, 2시간 경과시는 1.56%로 감소되고 최종 14시간 경과시는 집락은 나타나지 않아 완전히 사멸된 것으로 나타났다(P<0.01).
도 4(D)는 E. coli VTe O138, E57(VTe)에 대한 은나노입자 첨가 농도별 항균 효과이다. 대조구는 최초 투여시에 비하여 14시간이 경과시 6.6배 성장하여 있었으며, 전체 은나노입자 처리후 14시간 경과시 집락은 나타나지 않아, 완전 사멸된 것으로 인정되었다(P<0.01), 그리고, 5ppm의 실험구를 기준으로, 은나노입자 첨가후 5분 경과시는 최초와 비교하여 약 48%까지 균이 감소되었고, 30분 경과시는 약 39%로, 2시간 경과시는 12%로 감소되고 최종 14시간 경과시는 집락은 나타나지 않아 완전히 사멸된 것으로 인정되었다(P<0.01).
도 4(E)는 E. coli VTe O138, E57(VTe)에 대한 은나노입자 첨가 농도별 항균 효과이다. 대조구는 최초 투여시에 비하여 6시간 경과시 1.15배 성장하여 있었으며, 전체 은나노입자 처리후 6시간 경과시에 5ppm 은나노입자 처리구의 집락은 최초와 비교하여 1.6% 감소되어 나타났으나, 1ppm 은나노입자 투여구는 항균효과가 없는 것으로 인정되었으며, 5 ppm이상의 은나노입자를 처리시는 지속적으로 균의 수는 감소되고 있었다(P<0.01).
도 4(F)는 E. coli VT2 Cl-O157:H7에 대한 은나노입자 첨가 농도별 항균 효과이다. 대조구는 최초 투여시에 비하여 6시간 경과시 1.02배 성장하여 있었으며, 전체 은나노입자 처리후 6시간 경과시에 5ppm 은나노입자 처리구의 집락은 최초와 비교하여 약 3%로 감소되어 나타났으나, 1ppm 은나노입자 투여구는 항균효과가 없는 것으로 나타났다. 1 ppm 이상의 은나노입자를 처리시는 지속적으로 균의 수가 감소하는 현상을 보였다(P<0.01).
결론적으로, 은나노입자를 투여후 10 분부터 6시간 및 14시간까지의 항균효과는 10분이 경과시 E. coli 0157 : H균중 E. coli VT2 Cl-O157:H7와 VT2 Cl- O157:H-를 제외한 나머지 4종류의 균의 집락수가 뚜렷하게 감소되어 있었고(P<0.01), 전체적으로는 2시간 이후로부터 급격한 집락수는 뚜렷하게 감소하였으며(P<0.01), 14시간 및 그 이후에는 모든 은나노입자 첨가군에서 E. coli O157 : H7균의 집락을 볼 수 없었다(P<0.001).
그러나, E. coli VT2 Cl-O157:H7는 10ppm, VT2 Cl-O157:H-의 경우는 10ppm이상의 은나노입자가 첨가될 경우 균은 1시간, 10분 이후부터 사멸효과가 나타났다. 이러한 결과는, 세균의 종적인 차이로 사료되었다. 반면, 대조구의 경우 전체 대장균수가 최초 측정시와 비교할 때, 지속적으로 증식이 일어났다(P<0.01).
라. 일반항생제와 은나노입자 제제의 항균효과 비교
본 발명에서 최종 개발제제인 은나노입자가 함유된 세제용 첨가제(나노실버-II, 나노실버제제)의 항균성을 검정한 결과 우수한 항균력을 나타내었으나, 최종 pH의 범위가 약산성 범위를 나타내고 있어 이러한 pH가 항균력에 효과를 나타내는지를 추가로 확인할 필요성이 있어 이를 검정하여 본 결과는 다음과 같다[표 2 및 3, 도 5].
우선 개발제제인 나노실버-II의 pH 조건을 다르게 조성하고 은나노입자 첨가 농도별로 다르게 조성하여 첨가한 후에 대장균의 사멸결과를 조사하여 본 결과, pH 4.8과 6.75처리구의 경우에 항균력은 1 ppm이상의 농도를 처리한 결과 1시간 이내에 99%이상이 사멸된 것으로 조사되었으며, 시간이 경과함에 따라 사멸률은 증가하여 최종 16시간 경과시는 100%로 인정되어 이를 주방용 세제 조성물이나 섬유유연 제 등에 도입시 해당 제조과정에서 예상되는 pH는 항균력에 미치는 영향은 없는 것으로 조사되었다.
그리고, 시중에서 판매되고 있는 일반 상용 항생제인 OTC와 은나노입자가 함유된 세제용 첨가제를 동일 농도조건과 동일 시간으로 배양된 대장균 용액에 첨가하고 시간 경과별 항균력을 조사하여 본 결과, 은나노입자는 1시간 이내에 1ppm 이상의 농도처리시 항균력이 100% 발휘하는데 반하여, OTC 처리구의 경우는 3시간이 경과하고 0.01%(100ppm)이상의 농도를 처리한 경우에 동일 항균력을 나타내는 것으로 조사되었다.
이는 현장에서 분리한 대장균임을 감안해 OTC 등의 항생제에 장기간 노출되었다고 예상되고, 이는 결국 내성을 보유한 결과를 나타냄에 따라 대장균의 사멸 효과가 저하된 것으로 판단되었다.
그리고, 이러한 결과는 일반 항생제에 내성을 보유한 병원성 세균에 대하여도 본 발명의 은나노입자가 우수한 항균력을 보유한 것으로 인정되어 앞에서 실시한 내성보유 세균에 대한 항균력 검정실험과 동일한 결과를 나타내었다.
이 실험에서는 국내에서 문제시되고 있는 설사의 원인균들인 E. coli 를 분리하여 은나노입자에 의한 항균성을 실험실적 조건아래 측정하였다.
액상배지 중 일정 수준이상 배양된 E. coli 분리주들은 은나노입자 첨가 후 대조구와 경과시간에 따라 O·D치를 비교한 결과, 1ppm 농도의 은나노입자가 첨가될 경우 뚜렷한 감소치를 보였다[표 3, 도 5].
그러나, 이러한 O·D 측정에 의한 항균성은 대장균의 성장억제에 의한 것인 지 사멸에 의한 것인지의 여부를 판단하기엔 미흡한 부분이 있다. 따라서, 이를 재확인하기 위해 대장균을 액상배지에서 충분히 배양시킨 후 은나노입자를 농도별(1ppm 내지 50 ppm)로 첨가한 다음 고체배지에 옮겨 하루 동안 길러 집락수를 직접 세어 보았더니 은나노입자 투여후 10분 이내부터 전체 대장균은 대조에 비해 급격한 집락수의 감소를 1ppm과 같은 저농도에서도 탁월한 효과(P<0.001)를 나타내었을 뿐만아니라 은나노입자를 투여하고 10분부터 12시간까지도 역시 모든 은나노입자 첨가시 대장균의 집락이 전혀 나타나지 않아 사멸된 것으로 판단하였다[표 3, 도 5]. 다만, 농도별 은나노입자 처리후 시간에 따른 대장균의 항균력 차이가 다소 있는 것으로 생각되었는데 이는 이 시험에서 은나노입자 투여 후 10분 이내일 경우 50 ppm과 25 ppm의 농도가 가장 빠른 대장균 감소효과를 보였기 때문이다.
따라서, 대장균에 대한 은나노입자의 적정한 항균유효 농도시험이 확인되어야 할 것으로 사료되었다.
한편, 국내에서 사람으로부터 베로톡신(Verotoxin, VT) 생산 대장균의 분리보고는 1994년 식중독 환자로부터 E. coli 혈청형 O157 1주가 분리된 것 이외에는 분포조사가 이루어지고 있지 않으며, 베로톡신 생산 대장균으로 야기되는 질병의 중요성에 대한 홍보도 미미한 실정이다(Sandra 등, 1986).
또한, E. coli O157 : H7에 대한 중산 숙주인 동물 및 이로 인한 축육 유래의 식품의 오염을 조기에 차단하기 위한 뚜렷한 대안은 일반 합성 항생제를 사용할 수 밖에 없는 실정이다. 본 실험에서는 국내외에서 문제시되고 있는 인축(人·獸)에서 감염시 설사 및 사망에 이르게 하는 원인균들인 E. coli O157 : H7를 분리하 여 은나노입자에 의한 항균성을 실험실적 조건아래 측정하였다.
즉, 액상배지 중 일정 수준이상 배양된 E. coli O157 : H7분리주들을 은나노입자 첨가후 대조구와 경과시간에 따라 흡광도를 비교한 결과, 1ppm 내지 50ppm 농도의 은나노입자가 첨가될 경우 뚜렷한 감소치를 보였다.
그러나, 균종류에 따른 효과도 이와 동일한 경향을 나타내는지를 판단할 필요가 있어, 이를 재확인하기 위해 대장균을 액상배지에서 충분히 배양시킨 후 은나노입자를 농도별(50ppm, 25ppm, 5ppm 그리고 1ppm)로 첨가한 다음, 고체배지에 옮겨 하루동안 길러 집락수를 직접 세어 보았더니 은나노입자 투여 후 10분 이내부터 전체 대장균은 대조에 비해 급격한 집락수의 감소를 1ppm과 같은 저농도에서도 탁월한 효과(P<0.01)를 나타내었을 뿐만 아니라 은나노입자를 투여하고 10분부터 6시간 및 14시간까지도 역시 모든 은나노입자 첨가시 대장균의 집락이 전혀 나타나지 않아 완전히 사멸된 것으로 판단하였다.
다만, 균종별, 농도별 은나노입자 처리후 시간에 따른 대장균의 항균력 차이가 다소 있는 것으로 생각되었는데 이는 이 시험에서 은나노입자 처리후 10분 이내일 경우 25 ppm과 50 ppm의 농도처리시 가장 빠른 대장균 감소효과를 보였기 때문이며[표 2].
또한, 전체 실험에서 E. coli 0157 : H 균중 E. coli VT2 Cl-O157:H7와 E. coli VTe O138, E57(VTe)를 제외한 나머지 4종류의 균의 집락수가 뚜렷하게 감소되어 있었으나(P<0.01), 전체적으로는 2시간 이후 급격한 집락수는 뚜렷하게 감소하였으며, 6시간 및 그 이후에는 모든 은나노입자 첨가군에서 E. coli O157 : H7균의 집락을 볼 수 없었다(P<0.01). 그러나, E. coli VT2 Cl-O157:H7와 E. coli VTe O138, E57(VTe)의 경우도 0.01 % 이상의 은나노입자가 첨가될 경우 균은 6시간 이내에 전체가 사멸되는 것으로 나타났기 때문이다[도 3 내지 5].
표 3. 농도와 pH를 다르게 조성한 은나노입자와 OTC 처리에 따른 자돈의 분변(설사)으로부터 분리된 E.coli O157:k88ac 에 대한 항균활성
Experimental groups Nano-silver OTC*
pH 4.8 pH 6.75 pH 6.5
1hr 13 hrs 16 hs 3hrs 16 hrs 1hrs 13 hrs
control 2,000#< 2,000< 2,000< 2,000< 2,000< 2,000< 2,000<
50ppm concentration 0 0 0 0 0 0 0
25ppm concentration 0 0 0 0 0 131 0
10ppm concentration 0 0 0 0 0 1448 624
5ppm concentration 0 0 0 0 0 2,000< 2,000<
1ppm concentration 880 36 8 183 210 2,000< 2,000<
* : OTC(Oxytetracycline HCl), # : 2 x 107 cfu/ml
실험예 3. 은나노입자 유래의 내성형성 유발 여부 및 항균효과 검색
가. 은나노입자 유래의 내성형성 유발 여부 및 항균효과 검색
1)약제내성균 및 내성 미보유균에 대한 내성형성 유발 여부 및 항균효과 검색
가) 대장균 및 은나노입자의 준비
표준균주로서 E. coli NCTC 9001과 설사증상이 보여 실험실 진단이 의뢰된 자돈에서 분리된 대장균으로서 그 혈청형은 O157: K88ac이었으며, 이중 O157: K88ac은 내열성 독소를 생산하는 것이었으며, 항균 시료는 실시예 1에 의하여 제조된 은나노입자를 사용하였다.
나) 대장균의 배양 및 약제 감수성 검사
실험에 적용될 각 대장균주를 각각의 영양 육즙배지(Difco)에 접종하여 37℃, 150 rpm에서 18시간동안 진탕배양하였다. 이 각 대장균 배양액을 원심분리(500 xg, 4min)하여 대장균(E. coli)을 분리한 다음 인산완충액(0.1M, pH 7.0)으로 희석하되 필요할 경우 이 원심과정을 수회 반복하여 세균수를 조정하여 실험에 사용하였다.
또한, 약제 내성 보유 여부를 확인 및 항균성 검사를 위한 공시균으로서는 자돈분변에서 분리한 대장균 O157:K88ac와 표준균주 E. coli NCTC 9001를 사용하였다. 그리고, 항균제 감수성 검사는 Bauer와 Kirby(1966)의 방법에 따라 시험하였다. 항균제 감수성 디스크는 BBL사의 제품으로 겐타마이신(Gentamicin, Gm, 10mcg), 카나마이신(Kanamycin, Km, 30mcg), 네오마이신(Neomycin, N, 30mcg), 세팔로틴(Cephalothin, Cf, 30mcg), 스트렙토마이신(Streptomycin, Sm, 10mcg), 테트라사이클린(Tetracycline, Te, 30mcg), 마이카신(Amikacin, Am, 30mcg) 및 클로로암페니콜(Chloramphenicol, Cm, 30mcg)등 8종의 항균제를 사용하였으며, 감수성은 NCCLS(National Committe for Clinical Laboratory Standards, 1988)의 기준에 의하여 판정하였다.
다) 세대수별 은나노입자 첨가에 따른 내성형성 효과
은나노입자를 첨가하고 세대별 내성 형성 여부를 알아보기 위하여, 250ml 플라스크에 영양육즙배지를 제조한 후, 앞서 준비된 각 E.coli 배양액을 2 x 107 cfu/ ㎖로 조정한 다음 접종하였다.
여기에 은나노입자에 의해 시험균주가 내성이 형성되는지 여부를 확인하기 위하여, 5ppm 은나노입자만을 투여한 첨가군으로 실험구를 설정하고, 전체 실험구에 대해서는 은나노입자를 첨가하지 않은 대조구를 각각 설정하여 37도℃에서 배양 시켰다.
그리고, 5ppm 단일 은나노입자 투여구는 분단위로는 1분, 2분, 3분, 4분, 5분과 10분, 30분 그 이후로는 1시간, 2시간, 3시간, 10시간 및 18시간의 시간이 경과시, 각 처리구별로 10 ㎕씩 채취하여 990 ㎕의 인산완충액을 넣은 캡 시험관에 잘 섞은 다음 이중 50㎕를 혈액 및 MacConkey 한천배지에 도말하여 하루동안 배양시켜 나타난 집락수를 세어 항균성을 확인하고 최소 3시간이 경과한 후 생존하고 있는 잡락을 선택하고 이를 배양하여 다시 전 과정을 10세대까지 반복함으로써 은나노입자에 의한 E.coli에서의 내성 형성 여부를 확인하였다.
라) 은나노입자제제 첨가후 세대수에 따른 사멸
은나노입자를 첨가 후 일정 시간 경과 후 생존하는 E.coli가 내성에 의한 생존인지 혹은 은나노입자 농도차에 의한 것인지를 알아보기 위해, 250ml 플라스크에 영양육즙배지를 각기 다르게 제조한 후, 앞서 준비된 각 대장균 배양액을 2 x 107 cfu/㎖로 조정한 다음 접종하였다.
여기에 은나노입자를 농도별(50ppm, 25ppm, 5ppm 그리고 1ppm)로 첨가한 5개 처리구와 은나노입자를 첨가하지 않은 대조구로 총 12개 실험구를 설정하였고, 은 나노입자를 첨가하기 전(0 분) 및 첨가한 후 30분, 1시간, 2시간, 3시간 4시간 및 18시간에 각 처리구별로 10 ㎕씩 채취하여 990 ㎕의 인산완충액을 넣은 캡 시험관에 잘 섞은 다음 이중 50㎕를 혈액 및 영양 한천배지에 도말하여 하루동안 배양시켜 나타난 집락수를 세어 사멸효과를 판정하고, 일정시간(최소 3시간)이 경과한 후 생존하는 대장균 잡락을 선정 및 이를 배양하여 전 과정을 10세대까지 반복함으로써 은나노입자 처리시, 생존하는 균이 내성에 의한 생존인지 농도차에 의한 생존인지를 추가 확인하였다.
2) 내성인자 도입균에 대한 은나노입자의 항균효과 검색
가) 사용균주 및 배지 조건
사용된 균주는 암피실린(ampicillin) 항생제에 내성이 없는 E. coli JM83 균주(이하 CNTL-JM83)와 동일 균주에 저항성을 나타내도록 플라스미드(plasmid) pUC19로 형질전환된 E.coli JM83(이하 AMP-JM83) 2종을 사용하였다.
E. coli JM83을 위한 액체 배지는 LB(50ppm Yeast extract, Bacto tryptone, 1% NaCl)을, 평판 배지로는 LB에 2% Bacto agar를 첨가하여 사용하였으며, 항생제 저항성 균주를 선별하기 위한 배지로는 암피실린 50㎍ ml-1를 첨가하여 사용하였다.
나) 플라스미드 pUC19에 의한 형질전환
숙주로 쓰일 E.coli JM83은 LB배지에 접종하여 37℃에서 진탕배양하면서 550nm에서 O.D. 값이 0.45 내지 0.5가 될때까지 배양한 후 원심분리(2,000 xg)하여 균체를 얻었다. 이 균체를 15ml의 0.1M CaCl2에 부드럽게 현탁하여 15분동안 얼음에 방치하고, 다시 원심분리(2,000 xg)하여 균체를 회수한 후에 상기용액 3ml에 조심스럽게 현탁하여 얼음에 보관한 후에 12 내지 24시간 범위 내에서 사용하였다.
형질전환은 플라스미드 10㎕와 JM 83 competent cell 200㎕를 혼합하여 얼음에 30분 동안 방치한 후에 42℃에서 1분 동안 열 쇼크를 주고 다시 얼음에 2분 방치한다. 그리고 여기에 1ml의 LB배지를 첨가하여 37℃에서 1시간 방치한 후에 4℃에서 2분간 원심분리(2,000 xg)하여 200㎕정도의 용액을 남기고 상등액을 제거한 후. 남은 용액에 세포를 풀어서 50μg/ml의 암피실린을 함유한 평판배지에 도말하고 37℃에서 16시간 배양하여 형성된 집락들을 사용하였다.
다) 암피실린에 대한 CNTL-JM83, AMP-JM83의 감수성 조사
실험중 CNTL-JM83과 AMP-JM83의 실험액체 및 고체배지에는 배지 ml당 50㎍의 암피실린을 첨가하여 제조한 후, 실험중 일정량의 대장균을 도말하여 플라스미드 DNA 도입전의 CNTL-JM83과 플라스미드 DNA 도입 후의 대장균 AMP-JM83의 암피실린에 대한 감수성 조사를 실시하였다.
라) 플라스미드 DNA 추출 및 검정
은나노입자 처리에 의한 항균성 실험 균주로서, 인위적으로 CNTL-JM83에 암피실린 내성 플라스미드 DNA를 도입한 AMP-JM83의 플라스미드 DNA추출은 Birnboim 등(1979)과 Ish-Horowice 등(1981) 및 Sambrook 등(1989)등의 방법을 적용하여 실시하였다. 은나노입자를 처리한 항균성 실험에 따른 항균 효과와 플라스미드 DNA의 변성유무는 0.8% 아가로스 겔(agarose gel) 전기영동 방법을 통하여 확인하였다(Messing 1983: Norrander 등, 1983; Yonisch-Perron 등, 1985).
AMP-JM83에 도입된 플라스미드 DNA의 추출은 LB배지 ml당 암피실린 50μg 이 첨가된 배지[이하 LB(Amp)]를 조성 후, LB(Amp) plate 배지에서 자라난 집락(colony)를 선발하여 LB(Amp) 배지 10ml에 접종한 후 37℃에서 12 내지 16시간 진탕 배양하였다. 배양이 완료되면, 멸균된 원심분리용 튜브에 옮겨 6,000rpm에서 5분간 원심분리(8,000 xg, 5min)하여 균체를 회수하였다.
회수한 균체를 용액 I(50mM glucose, 25mM Tris-Cl, pH 8.0), 10mM EDTA 혼합액)100㎕에 완전히 세포가 풀릴때까지 현탁한 후, 여기에 용액 II(0.2N NaOH, 1% SDS 혼합액) 200㎕를 첨가한 후 튜브를 조심스럽게 흔들어 섞어준 후 얼음에 5분간 방치하였다. 차갑게 미리 준비한 용액III(5M potassium acetate 60ml, glacial acetic acid 11.5ml, 3차 탈이온수 28.5ml 혼합액) 150 ㎕를 첨가하고 3 내지 4회 튜브를 뒤집어 주면서 부드럽게 섞은 후, 얼음에 5분간 방치시킨 후 10분간 원심 분리(35,000 xg, 4℃)하였다. 이어서, 상층액을 새로운 마이크로퓨즈 튜브(microfuge tube)로 옮긴 후 페놀/클로로포름(phenol/chloroform)을 상층액과 동일한 부피로 혼합하여 5분간 교반하고 다시 10분간 원심분리를 실시하여 잔여 단백질을 제거하였다. 이중 플라스미드 DNA를 함유한 상층액 만을 취해 다른 시험관에 옮긴 후 95% 에탄올을 가하여 잘 혼합한 후 저온에서 5분간 처리한 다음 원심분리(35,000 xg, 10min)하여 침전된 플라스미드 DNA를 얻었다. 이것을 진공건조로 적당히 건조되면 TE 완충용액(10mM Tris Acetic acid, 1mM EDTA pH 8.0)에 녹인 다음 전기영동 하여 DNA의 프로파일(profile)을 조사하였다.
전기영동은 0.8% 아가로스 겔에 로딩 버퍼(loading buffer) 1㎕와 TE에 녹인 DNA를 혼합하여 로딩한 후 100V에서 약 20 분 동안 전개시켰다. 전개가 완료되면 이티듐 브로마이드(ehtidium bromide) 용액(5㎕/ml)으로 염색한 후 단파장 트랜스일루미네이터(Short wave transillumininator)로 플라스미드 DNA 밴드를 확인한 후, 필터가 부착된 폴라로이드(polaroid) UV 55mm 카메라로 촬영하였다. 이때 표준 마커(marker)로서는 λ-hind III size marker를 사용하였다.
플라스미드 DNA 분리 실험은 최초 암피실린 내성 플라스미드를 도입하기 전의 CNTL-JM8과 도입후 AMP-JM83 및 은나노입자를 처리한 후의 항균성 실험 중 생존하는 AMP-JM83에 대해서 플라스미드 DNA의 이상유무를 확인하였다.
마) 은나노입자의 대장균 항균성 실험
본 실험중에 사용한 은나노입자로서는 실시예 1의 방법에 의하여 (주) 나울(한국)에서 제조한 은나노입자를 사용하였으며, 원액내 은나노입자 함유량은 5,000 ppm의 것을 공여 받아 사용하였으며, E.coli CNTL-JM83와 AMP-JM83 균주를 각각 다른 영양 육즙배지(Difco)에 접종하여 37℃, 150 rpm에서 18시간동안 진탕 배양하였다. 이 E.coli 배양액을 원심분리(500 xg, 4min)하여 E.coli를 분리한 다음 인산완충액(0.1M, pH 7.0)으로 희석하되 필요할 경우, 이 원심과정을 수회 반복하여 세균수를 조정하여 실험에 사용하였다.
은나노입자의 첨가농도별 항균성을 알아보기 위해 250 ㎖ 플라스크 내 영양 육즙배지를 만들어 E. coli를 접종하여 37℃에 배양시켰다. 이들 대장균 배양액은 2 x 107 cfu/㎖로 조정한 다음, 은나노입자를 농도별(50ppm, 25ppm, 5ppm 그리고 1ppm)로 첨가한 5개 처리구와 은나노입자를 첨가하지 않은 대조구를 두었다. 은나노입자를 첨가한 후 1분, 2분, 3분 4분 및 5분, 10분, 30분, 1시간, 3시간, 5시간, 12시간 및 24시간에 각 처리구별로 10 ㎕씩 채취하여 990 ㎕의 인산완충액을 넣은 캡 시험관에 잘 섞은 다음 이중 50 ㎕를 MacConKey고체배지에 도말하여 하루동안 배양시켜 나타난 집락수를 세었다.
[결과]
가. 은나노입자 유래의 내성형성 유발 여부 및 항균효과 검색
1) 약제내성균 및 내성 미보유균에 대한 내성형성 유발 여부 및 항균효과 검색
가) 대장균의 약제 내성 검사
자돈분변에서 분리한 대장균 O157:K88ac와 표준균주 E. coli NCTC 9001에 대한 항균제 감수성 검사결과는 표 4와 같다. 즉, 표준 대장균 균주로서 사용한 E. coli NCTC 9001은 전체 항생제에 감수성을 보유하지 않았으며, 자돈에서 분리한 대장균 O157:K88ac는 항생제에 대하여 감수성 보유여부를 확인한 결과 세팔로틴(Cf, Cephalothin)와 클로로암페니콜(Cm, chloramphenicol) 2종의 항생제에 대해서만 감수성을 나타냈다.
나) 은나노입자의 세대별 지속처리에 따른 내성형성 유무판정
은나노입자를 첨가하지 않은 대조구에 대하여 5 ppm의 은나노입자를 첨가한 실험구의 E. coli에 대한 항균성은 도 7 내지 9와 같다.
10 세대까지 은나노입자를 5 ppm 첨가시 10 분 이내에 E. coli주들의 집락수가 대조구에 비해 뚜렷하게 감소하였고(P<0.001), 대조구내 E. coli들은 최초 투여후 18시간이 경과시에 집락수가 평균 2.0 내지 6.6배까지 증가하였다.
은나노입자 처리 후 내성보유 대장균인 O157:K88ac의 경우는 10분 이내 대장균 집락수는 1세대에서 은나노입자 처리시 대조구(100%기준)에 비해 상대적으로 완전 사멸하였고, 2세대에서 10 세대까지 은나노입자 처리시 평균 0% 내지 7.4%까지 감소하였으며, 18시간째에서 생존하여 나타나는 E. coli는 찾아 볼 수 없었다.
또한, 일반 항생제에 내성을 보유하고 있지 않은 대장균 NCTC 9001의 경우에서도 은나노입자를 투여한 후 10 분 경과시 1 세대 및 10 세대까지 전반적으로 생존하는 집락수는 0.8%였으며, 역시 18시간 경과시 어떤 세대에서도 대장균 집락수는 나타나지 않았다[도 9].
그러나, 10분 이후부터 10 시간 이내에 생존하는 집락수는 내성의 형성이 아닌 은나노입자의 농도차에 의해서 생존하는 것으로 인정되었다(P<0.01). 대조구의 경우 대장균수가 최초 측정시에 비해 18시간후에는 평균 약 2 내지 6.6배까지 지속적으로 증식이 이루어지고 있었다(P<0.01).
다) 농도별 은나노입자 처리에 따른 항균 효과
단일농도인 5 ppm의 은나노입자를 첨가시 내성형성 유무와 더불어 미확인된 농도별 대장균의 항균 효과를 검정한 결과로서 도 7 내지 9와 같다.
각 세균들에 대해 은나노입자 처리에 따른 계대 교배에 의해 1ppm 내지 50ppm 은나노입자 첨가시 30 분 이내에 E. coli주들의 집락수가 대조구에 비해 뚜렷하게 감소하였으며, 18시간이 경과시 모든 농도의 은나노입자 처리구에서도 집락은 나타나지 않았다(P<0.001).
약제내성을 보유하고 있는 대장균 O157:K88ac의 경우 1 세대 내지 10 세대까지 은나노입자 처리 후, 30 분 이내 대장균 집락수는 50 ppm 은나노입자 처리시 대조구(최초 100%기준)에 비해 상대적으로 평균 0 내지 6.7%로 감소하였고, 0.1% 은나노입자 처리시 평균 0 내지 12.8%가, 0.01% 와 5ppm 은나노입자 처리시 0 내지 3.58%까지 떨어져 E. coli는 뚜렷하게 감소하였다(P<0.01). 또한 1ppm 은나노입자 처리시에도 E. coli의 집락수가 대조구에 비해 평균 0 내지 37.5 %로 각각 뚜렷하게 감소하였다(P<0.001).
내성을 보유하지 않은 대장균 NCTC 9001의 경우 1 세대에서 10 세대까지 은나노입자 처리후, 30 분 이내 대장균 집락수는 50 ppm 은나노입자 처리시 대조구(최초 100%기준)에 비해 상대적으로 평균 1.2 내지 7.4%로 감소하였고, 25 ppm 은나노입자 처리시 평균 0.4 내지 2.4%가, 5 ppm과 10 ppm 은나노입자 처리시 0 내지 약 2.6%까지 떨어져 E. coli는 뚜렷하게 감소하였다(P<0.01). 또한 1 ppm 은나노입자 처리시에도 E. coli의 집락수가 대조구에 비해 평균 생존률이 0 내지 0.3%로 뚜렷하게 감소하였다(P<0.001). 18 시간째에는 모든 은나노입자 첨가군에서 E. coli의 집락을 볼 수 없었다(P<0.001).
표 4. 대장균(E.coli O157:K88ac and E.coli NCTC 9001)의 항균제에 대한 감수성
Drugs E. coli strains Antibacterial drug susceptibility
Gm Km N Cf Sm Te Am Cm
O157:K88ac R R R S R R R S
NCTC 9001 S S S S S S S S
R : Resistance, S : Sensitivity, Gentamicin(Gm, 10㎍), Kanamycin(Km, 30㎍), Neomycin(N, 30㎍), Cephalothin(Cf, 30㎍), Streptomycin(Sm, 10㎍), Tetracycline(Te, 30㎍), Amikacin(Am, 30㎍) and Chloramphenicol (Cm, 30㎍)
2. 내성인자 도입균에 대한 은나노입자의 항균효과 검색
가. 대장균의 항균성 실험결과
내성보유 내성균 AMP-JM83 과 내성 미보유 대장균 CNTL-JM83을 대상으로 인산완충용액(pH 6.0, 37℃)에 배양시킨 후 은나노입자를 1ppm 내지 50ppm까지 첨가한 다음 1 분부터 12시간까지 배양액을 채취하여 MacConKey배지에 도말하고서 24시간동안 배양시켜 나타나는 집락을 세어 은나노입자의 항균효과를 측정하였다[도 11, 도 12]. 그 결과 대장균 CNTL-JM83 및 AMP-JM83 공히 처리농도에 상관없이 은나노입자투여 후 1 내지 30 분 사이에 대장균이 뚜렷하게 저하됨을 확인하였다(P<0.001).
1 ppm 내지 50 ppm 의 은나노입자 첨가 후 30분에서 12시간 내에서도 지속적으로 대장균의 집락수는 뚜렷하게 감소하였고, 10 ppm이상의 은나노입자가 첨가된 경우는 12 시간 경과시 어떠한 대장균의 집락도 볼 수 없었으나(P<0.001), 10ppm 이하의 농도에서는 24시간이 경과한 후에는 대조구에 비하여 3.5% 내지 11.3 %까지 균수는 전체적으로 감소되었다(P<0.01). 즉, 은나노입자는 내성을 보유한 세균에 대해서도 우수한 항균효과를 나타냄을 인정할 수 있었다(P<0.01).
나. 암피실린에 대한 AMP-JM83와 CNTL-JM83의 감수성 조사 결과
실험중 AMP-JM83의 실험액체 및 고체배지에는 배지 ml당 50 ㎍의 암피실린을 첨가하여 배양한 후, 고체배지에 도말한 대장균 AMP-JM83는 LB(Amp) 배지에서 생존함으로서 암피실린 내성 플라스미드 DNA를 보유하는 것으로 인정되었으나, 대조구으로 사용한 CNTL-JM83 대장균은 LB(Amp)에서 사멸되어 암피실린에 내성을 갖는 플라스미드 DNA는 형성 되지 않은 것으로 나타났다[도 10].
다. 은나노입자 처리에 따른 플라스미드 DNA 반응 양상
CNTL-JM83과 AMP-JM83을 대상으로 아가로스-겔 전기영동으로 내성 플라스미드 DNA를 분리하였다.
즉, 플라스미드를 도입하기 전의 CNTL-JM83에서는 플라스미드에서 기인한 밴드는 출현하지 않았다. 그러나, 암피실린 내성 플라스미드 DNA를 도입한 AMP-JM83의 경우의 플라스미드 분획은 open-circular form 과 circular form으로 2중 밴드의 형태로 나타났으며, 분자량은 약 2.0Kb와 약 3.0Kb에서 출현하여 암피실린에 기인한 플라스미드 DNA가 도입되었음을 확인하였다.
또한, 은나노입자를 처리한 AMP-JM83에서 생존한 잡락을 선발하여 내성 플라스미드 DNA를 분획하여 본 결과도 역시 동일하게 나타나 은나노입자는 일반 약제에 감수성을 나타내는 세균도 효과적으로 사멸시키는 항균성을 보유하는 것으로 나타났으며(P<0.01), 생존하는 AMP-JM83의 잡락은 은나노입자에 의해 저항성을 나타내 는 것이 아닌 은나노입자의 농도차 및 처리시간에 기인하는 것으로 확인되었다.
대장균의 약제 내성균과 약제 플라스미드 DNA를 인위적으로 도입한 후 항균성 은나노입자를 처리시, 약제 내성보유균에 대한 항균효과를 알아보고, 또한, 은나노입자를 처리시, 생존하는 내성도입 대장균의 플라스미드 DNA의 변형유무를 확인하여 보았다.
균주로서 동일 대장균 JM83을 대상으로 대조구는 최초의 균을 사용하였고, 동일균주에 암피실린 내성 플라스미드 DNA를 도입한 균주를 실험균으로 설정하여 실험을 진행하였다.
결과로서 전기영동을 통하여 플라스미드 DNA를 분리 확인한 결과 대조균인 CNTL-JM83은 플라스미드가 검출되지 않았음에 반하여 암피실린 내성 플라스미드 DNA를 도입한 AMP-JM83의 경우의 플라스미드 DNA분획은 open-circular form 과 circular form으로 2중 밴드의 형태로 나타났으며, 분자량은 약 2.0Kb와 약 3.0Kb에서 출현하여 암피실린에 기인한 플라스미드 DNA가 도입되었음이 확인되었다.
여기에 은나노입자 처리시 생존하는 대장균 AMP-JM83도 역시 동일한 패턴의 플라스미드 DNA가 검출된 바, 약제 내성 플라스미드 DNA를 보유하고 있는 세균에 대하여도 은나노입자는 우수한 항균 효과를 나타내는 것으로 나타났다[도 10 내지 12, P<0.01)].
최근 임상 재료로 분리되는 대장균을 포함한 그람 음성균의 대다수는 페니실린(Penicillin)을 비롯한 β-락타마제(β-Lactamase)에 불활성화되는 항균제에 대하여 내성을 나타내고 있으며, 이는 주로 플라스미드 DNA의 획득과 관련이 있다고 알려지고 있다(Neu 1983: Sabath 등, 1975). 이 세균은 플라스미드 DNA가 내성 전달에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 근래에 와서 트랜스포손(transposon)이 약제내성전달과 관계하는 것으로 보고되고 있다(Cohen 등, 1982: Forbes 등, 1983).
이들 중 메티실린(Methicillin), 에리스로마이신(Erythromycin), Rif 등은 염색체 DNA(chromosomal DNA)에 페니실린, 겐타마이신(Gentamycin) 및 테트라사이크린(Tetracycyclin) 등은 플라스미드 DNA에 그 결정인자가 주로 존재하는 것으로 알려져 있다(Carrol 등, 1989: Coleman 등, 1985; Holmberg 등, 1984; Lorian 등, 1986). Lyon등(1984)은 항균제에 있어서 세균이 내성을 나타내는 기전으로는 여러 방법이 알려져 있으나, 플라스미드 DNA가 약제 내성의 매개체로서 중요한 역할을 한다고 보고하고 있다. 이들은 겐타마이신을 비롯한 아미노글루코사이드(aminoglucoside)계 항균제에 대한 내성은 전달성 플라스미드 DNA와 관련이 있는 것으로 보고하고 있으나, Bigelowe 등은 비 전달성이라 하였고, Witt와 Dunnhapt 등은 염색체 DNA와 관련이 있다고 보고 한 바 있다.
그러나, 이상의 결과는 일반 항생제에 대한 전반적인 보고였을 뿐 본 발명에서 사용한 은나노입자는 천연 고분자 재료에서 추출한 항균성 재료임을 고려 할 때, 본 은나노입자를 지속적으로 사용함을 전제로 생각할 때, 전술한 내용에 대한 우려를 생각하지 않을 수 없다.
따라서, 본 실험에서는 약제 내성에 대한 내성 매개체로 인정받고 있는 플라스미드 DNA를 도입한 대장균에 대하여 항균성을 실시한 바 내성을 보유한 세균에 대해서 뚜렷한 항균성을 나타내었다.
이에 본 실험에서는 국내에서 문제시되고 있는 자돈설사의 원인균인 E. coli등이 일반 항생제에 내성을 지속적으로 보유함으로서 차세대 항생제의 지속적 개발 및 사용이 반복됨에 따라 공중학적 피해를 발생시키는 대장균에 약제 내성 매개체로서 중요한 역할을 수행하는 플라스미드 DNA를 삽입한 대장균에 대하여 은나노입자에 의한 항균성을 실험실적 조건아래 측정하였다.
결과로서, 내성 미보유 대장균 CNTL-JM83과 내성 보유 대장균 AMP-JM83을 대상으로 인산완충용액에 배양시킨 후 은나노입자를 1ppm 내지 50ppm까지 은나노입자를 첨가한 다음 1분부터 12시간까지 배양액을 채취하여 MacConKey배지에 도말하고서 24시간동안 배양시켜 나타나는 집락을 세어 은나노입자의 항균효과를 측정한 결과 대장균 CNTL-JM83 및 AMP-JM83을 처리농도에 상관없이 은나노입자 투여 후 1 내지 30분사이에 대장균이 뚜렷하게 저하됨을 확인되었으며(P<0.001), CNTL-JM83과 AMP-JM83을 대상으로 아가로스-겔 전기영동으로 내성 플라스미드 DNA를 분리한 결과, 플라스미드 DNA를 도입하기 전의 CNTL-JM83에서는 플라스미드 DNA에서 기인한 밴드는 출현하지 않았다. 그러나, 암피실린 내성 플라스미드 DNA를 도입한 AMP-JM83의 경우의 플라스미드 DNA 분획은 open-circular form 과 circular form으로 2중 밴드의 형태로 나타났으며, 분자량은 약 2.0Kb와 약 3.0Kb에서 출현하여 암피실린에 기인한 플라스미드 DNA가 도입되었음을 확인하였다.
또한, 은나노입자를 처리한 AMP-JM83에서 생존한 집락을 선발하여 내성 플라스미드 DNA를 분획하여 본 결과도 역시 동일하게 나타나 은나노입자는 일반 약제에 감수성을 나타내는 세균도 효과적으로 사멸시키는 항균성을 보유하는 것으로 인정 되었으며(P<0.01), 생존하는 AMP-JM83의 집락은 은나노입자에 의해 저항성을 나타내는 것이 아닌 은나노입자의 농도차 및 처리시간에 기인하는 것으로 확인되었다[도 10 내지 12].
그리고, 현장분리균인 E.coli O157 : k88ac의 경우는 일반 항생제에 대하여 내성을 보유하고 있어, 이에 대한 사멸효과를 시중에서 판매되고 있는 일반 상용 항생제인 OTC(Oxytetracycline-HCl)와 은나노입자를 동일 농도조건과 동일시간으로 배양된 대장균 용액에 첨가하고 시간 경과별 항균력을 조사하여 본 결과, 은나노입자는 1 시간 이내에 1 ppm 이상의 농도처리 시 항균력이 100% 발휘하는데 반하여, OTC 처리구의 경우는 3시간이 경과하고 0.01 %(100ppm)이상의 농도를 처리한 경우에서 동일 항균력을 나타내는 것으로 조사되었다.
이는 현장에서 분리한 대장균임에 따라 OTC 등의 항생제에 장기간 노출되었다고 예상되고, 이는 결국 내성을 보유한 결과를 나타냄에 따라 대장균의 사멸 효과가 저하 된 것으로 결국 판단되었다. 그리고 이러한 결과는 일반 항생제에 내성을 보유한 병원성 세균에 대하여도 은나노입자는 우수한 항균력을 보유한 것으로 인정되어 앞에서 실시한 내성보유 세균에 대한 항균력 검정실험과 동일한 결과를 나타내었다.
또한, 농도별 은나노입자 처리 후 시간에 따른 대장균의 항균력 차이가 다소 있는 것으로 생각되었는데 이는 이 시험에서 은나노입자 처리 후 10분 이내일 경우 0.01% 이상의 농도가 가장 빠른 대장균 감소효과를 보였기 때문이다. 따라서, 대장균에 대한 은나노입자의 적정한 항균유효 농도시험이 따라야 할 것으로 사료된다.
실시예 2. 은나노입자 도입 세제용 첨가제의 제조(나노실버-II)
실험예 4 내지 7 에서 사용된 은나노입자 도입 세제용 첨가제는 상기 실시예 1에서 제조된 은나노입자가 도입되고, 통상의 세제용 계면활성제와 금속이온봉쇄제가 적용된 것으로서, 계면활성제로서는 PVA을 사용하고, 금속이온봉쇄제로는 PVP를 사용하였으며, 사용량은 계면활성제 100 중량부에 대하여 금속이온봉쇄제 0.3% 중량부 비율로 이루어지고, 은나노입자의 함량은 실험예에 적용된 함량에 의하여 조절되었다.
상기 계면활성제, 금속이온봉쇄제 및 은나노입자는 상온에서 15,000 RPM 조건으로 교반하여 제조되었다.
실험예 4. 시판 제품 및 나노실버 - II 의 기초 항균성 확인
1. 재료 및 방법
가. 재료
본 실험에 사용된 재료는 다음과 같다.
1) 시판 제품: 섬유유연제(제품명: 포프랑 아이키스, 포프랑 그린부케, 포프랑 핑키로즈), 주방세제(제품명: 맑은주방)[이상 시판 제품, (주) 동양물산, 한국]
2) 은나노입자가 도입된 세제용 첨가제 : 나노실버-I[실시예 1의 방법에 준하지 않은 방법으로 제조된 은나노입자 포함, Ag 5,000 ppm(w/v)함유, Brown type, 주식회사 나울], 나노실버-II[실시예 1에 의하여 제조된 은나노입자 함유, Ag 5,000 ppm(w/v)함유, White type, 주식회사 나울]
3) 항균성 검정용 공시균주: Bacillus sp. CK-1
나. 방법
1) 검정용 균 및 균용액배양
표준균주로서는 Bacillus sp. CK-1을 사용하였으며, 준비된 Bacillus sp. CK-1은 영양 육즙배지(Difco)에 접종하여 37℃, 150 rpm에서 18시간동안 진탕배양하였다. 이 균 배양액을 필요할 경우 희석하여 균수를 조절한 후 본 실험에 사용하였다
2) 항균성 검정 조건 조성
제제별, 첨가농도별 항균성을 알아보기 위해 250 ㎖ 플라스크내 영양 육즙배지를 만들어 Bacillus sp. CK-1을 접종하여 37℃에 배양시켰다. 이들 Bacillus sp. CK-1균 배양액은 2 x 107 cfu/㎖로 조정한 다음 사용하였다. 시판 제품의 항균성 보유 유무를 판별하기 위하여 섬유유연제, 주방세제 그리고, 상기 나노실버-I 및 II(나노실버제제)를 원액(100%, 1배), 이를 3차 멸균수에 10배(v/v), 100배(v/v), 250배(v/v), 500배(v/v) 그리고 1,000배(v/v)로 첨가하여 희석 처리한 6개 처리구와 3차 탈이온수를 처리한 대조구를 두었다[도 13].
가) 균도말 배지를 이용한 제제별 및 농도별 항균성 조사
본 실험에서는 고체 배지 환경조건에서 균을 도말한 경우에 제제별 및 농도별로 조성된 제제가 균에 접촉시 어느 정도 항균성을 보유하는지를 검정코져 하였다.
이를 위하여, 공시균인 Bacillus sp. CK-1배양액을 고체 배지에 1회 도말한 후, 농도별로 희석한 제제를 점적시 항균효과를 보기 위해 다음과 같이 실시하였다. 육즙고체배지에 Bacillus sp. CK-1 배양액을 50 ㎕씩 정량 분취하여 이를 배지에 고르게 도말한 다음에 이를 재료로 사용하였으며, 항균성 확인을 위한 처리는 현재 판매되고 있는 제제를 농도별로 희석하여 준비한 처리구별로 점적한 후 대조구와 비교 확인하였다.
항균성 검정을 위하여 제제별로 희석한 용액을 20㎕씩 정량 채취한 후 이를 균이 도말된 육즙고체배지에 일정간격으로 점적한 후, 37℃에서 24시간 배양시켜 나타난 항균효과에 기인하여 형성되는 균 성장저지환의 크기를 대조구와 비교함으로서 항균성 결과를 확인하였다[표 5].
나) 제제별 및 농도별로 희석한 후 균을 첨가한 경우의 항균성 조사
본 실험에서는 항균성 검정을 위해 준비된 Bacillus sp. CK-1균이 제제별 및 농도별로 달리 조성한 처리구에 접촉시 시간 경과에 따라 나타나는 항균성을 검정하고자 하였다[표 5].
즉, 육즙영양액체배지에 제제를 농도별로 희석한 후, 동일시간에 Bacillus sp. CK-1를 동일량(10㎕)을 첨가한 후 3 시간 경과시의 항균성 효과를 검정하였으며, 역시 검정은 점적방법을 적용하였으며, 항균성 효과 검정은 상기와 동일하게 실시하였다.
[결과]
가) 균도말 배지를 이용한 제제별 및 농도별 항균성 조사
고체 배지 환경조건에서 균을 도말한 경우에서 제제별 및 농도별로 조성된 제제가 균에 접촉시 어느정도 항균성을 보유하는지를 검정코져 하였다.
그 결과로, 섬유유연제, 주방세제, 나노실버-I, 및 나노실버-II 을 대상으로 하여 이를 500배까지 희석하여도 항균성은 90% 이상이 있는 것으로 조사되었다[표 5, 도 13].
그리고, 본 발명의 은나노입자가 도입된 세제용 첨가제인 나노실버-II의 경우만을 대상으로 항균성을 검정한 결과도 500(Ag 함량, 25ppm)배 이상을 희석 처리한 경우에서도, 항균성은 동일한 것으로 조사 되었다[표 5, 도 13].
그러나, 상기 실시예 1과 동일하지 않은 방법으로 제조된 은나노입자[나노실버-I]를 실시예 1에 의하여 제조된 은나노입자[나노실버-II]와 비교하여 항균성을 조사한 경우에 항균성이 다르게 나타났으며, 이는 은나노입자의 제조 밥법에 따라 항균성은 다르게 나타나는 것임으로 볼 수 있으며, 은나노입자를 도입한 세제용 첨가제의 항균능이 우수함을 확인할 수 있었다.
표 5. 시판 제품과 은나노입자가 도입된 세제용 첨가제의 농도별 첨가 후 Bacillus sp. CK-1균의 항균성에 미치는 효과
항균효과 재료명 처리제제의 농도별 처리에 따른 항균효과*
원액 10배 100배 250배 500배 1,000배
대조구(3차 탈이온수) +++ NT NT NT NT NT
섬유유연제 (포프랑 아이키스)$ +++ +++ +++ +++ +++ -
섬유유연제 (포프랑 핑키로즈)$ +++ +++ +++ +++ +++ -
섬유유연제 (포프랑 그린부케)$ +++ +++ +++ +++ +++ -
주방세제 (맑은주방)$ +++ +++ +++ +++ +++ -
나노실버-I& +++ +++ +++ +++ +++ -
나노실버-II% +++ +++ +++ +++ +++ +++
* : +++ : 90%이상사멸, ++ : 50%이상 사멸, + : 10% 이상, - : 항균효과 없음, NT : 측정하지 않았음. $ : 섬유유연제[제품명: 포프랑 아이키스, 포프랑 그린부케, 포프랑 핑키로즈(주) 동양물산, 주방세제[제품명: 맑은주방, (주)동양물산], & : 나노실버-I[Ag 5,000ppm함유(w/v), White type, (주)나울], % : 나노실버-II [Ag 5,000ppm(w/v)함유, Brown type, (주)나울],
나) 제제별 및 농도별로 희석한 후 균을 첨가한 경우의 항균성 확인
상기한 실험에서 고체배지 내 직접균을 도말한 경우에서 제제별 및 농도별로 조성된 제제를 균에 접촉시 어느 정도 항균성을 보유하는지를 검정하여 본 결과, 섬유유연제, 주방세제, 나노실버-I, II 를 대상으로 하여 이를 500배까지 희석하여도 항균성은 90%이상을 나타내는 것으로 조사되었다[표 5].
따라서, 본 실험에서는 시험관내에 제제를 농도별로 조성한 상태에서 Bacillus sp. CK-1균을 3시간동안 직접 접촉시킨 경우에서의 항균성(사멸효과)을 추가로 검정하여 보았다[표 6].
결과로서, 대조구의 경우는 지속적으로 Bacillus sp. CK-1균은 성장이 이루어지는데 반하여, 전체 섬유유연제를 처리한 경우 원액을 처리한 경우에서는 항균 효과가 90%이상이 나타났으나, 10배에서 1,000배로 희석한 전체 처리구의 경우는 항균효과가 없는 것으로 조사되었다. 그리고, 같은 섬유유연제라 하더라도 포프랑 그린부케(주, 동양물산)의 경우는 원액에서도 항균효과는 50% 전후를 나타내어 항균효과는 다소 차이가 있는 것으로 조사되었다. 이는 아마도 섬유유연제를 제조함에 있어 최초 구성원료의 종류와 이들의 조성비가 항균성에 많은 차이를 나타내는 것으로 판단되었다.
그러나, 주방세제인 맑은주방(주, 동양물산)의 경우는 희석비율이 100배까지도 항균성이 90%이상을 나타내는 것으로 조사되어 역시 제제를 제조함에 있어 구성원료의 종류와 구성비가 항균성에 차이를 나타내게 하는 중요한 인자인 것으로 판단되었다.
이러한 결과는, 기본 판매제제의 구성원료별에 따라 항균성에 미치는 특성과 항균성을 억제하는 효과가 있는지를 원료별로 세부적인 항균성 효과를 추가적으로 판단할 필요가 있는 것으로 예상되었다.
그러나, 은나노입자가 도입된 나노실버-I 및 II 의 항균성을 확인하여 본 결과, 도입된 은나노입자의 제조방법이나 전체 농도처리구별로 달리하여 3 시간동안 Bacillus sp. CK-1균에 직접 접촉을 실시한 경우에 항균성은 90% 이상으로 나타나, 은나노입자를 도입한 경우는 Bacillus sp. CK-1균에 접촉시 지속적인 항균 효과를 나타내는 것으로 조사되었다.
표 6. Bacillus sp. CK-1균이 나노실버 제제별 및 농도별로 달리 조성한 처리구에 균을 직접 접촉시킨 후, 시간 경과에 따른 항균성 확인
항균효과 재료명 처리제제의 농도별 처리에 따른 항균효과*
원액 10배 100배 250배 500배 1,000배
대조구(3차 탈이온수) +++ NT NT NT NT NT
섬유유연제 (포프랑 아이키스)$ +++ + + + + +
섬유유연제 (포프랑 핑키로즈)$ +++ + + + + +
섬유유연제 (포프랑 그린부케)$ ++ + + + + +
주방세제 (맑은주방)$ +++ +++ +++ + + +
나노실버-I (5,000ppm)& +++ ++ ++ +++ +++ +++
나노실버-II(5,000ppm)% +++ ++ ++ +++ +++ +++
* : +++ : 90%이상사멸, ++ : 50%이상 사멸, + : 10% 이상, - : 항균효과 없음, NT: 측정하지 않았음. $ : 섬유유연제[제품명: 포프랑 아이키스, 포프랑 그린부케, 포프랑 핑키로즈, (주)동양물산], 주방세제[제품명 : 맑은주방, (주)동양물산], & : 나노실버-I[Ag 5,000ppm함유(w/v), White type, (주)나울], % : 나노실버-II [Ag 5,000ppm(w/v)함유, Brown type, (주)나울]
실험예 5. 합성항생제, 시판 제품 및 본 발명의 나노실버 - II 의 항균성 비교 확인
본 실험에서는 본 발명의 은나노입자가 도입된 세제용 첨가제(나노실버-II)를 이용한 웰빙형 세제 개발을 위해 시판 제품과, 시판 항균성 제제, 그리고, 시판 항충성 애견 샴푸를 대상으로 기초 항균성을 검정한 후, 여기에 본 발명에 의하여 제조된 은나노입자를 도입할 때 항균성을 얼마나 증폭시킬 수 있는지를 확인해 보았다.
그러나, 은나노입자를 도입하려는 제제의 항균성에 대한 결과를 객관적으로 판단하기 위하여 의학적 용도로 상용되고 있는 합성항생제를 비교구로 적용하여 항균성을 우선 검정하였다.
1. 재료 및 방법
가. 재료
1) 시판 제품: 섬유유연제(제품명: 아이키스, 그린부케, 포프랑 핑키로즈), 주방세제(제품명: 맑은주방)[이상 (주)동양물산, 한국]
2) 은나노입자 도입된 원료 소재 : 나노실버-I [Ag 5,000ppm(w/v)함유, Brown type, (주)나울, 한국, 실시예 1과 다른 방법에 준하여 제조], 나노실버-II[Ag 5,000ppm함유(w/v), White type, (주)나울, 한국, 실시예 1에 기재된 방법에 준하여 제조], Bioconversion 제제(NTS, 캐나다), 황산스트렙토마이신(종근당, 10%(w/v)용액, 한국), 항충성 애견샴푸(E사, 한국)]
3) 항균성 검정용 공시균주: Bacillus sp. CK-1, E.coli O157:K88ac
나. 방법
1) 검정용 균 및 균용액배양
표준균주로서는 Bacillus sp. CK-1와 E.coli O157:K88ac를 사용하였으며, 준비된 공시균들은 영양 육즙배지(Difco)에 각각 접종하여 37℃, 150rpm에서 18시간동안 진탕배양하여 이를 실험용 재료로 사용하였으며, 이 균 배양액은 필요할 경우 희석하므로서 균수를 조절하여 본 실험에 사용하였다
2) 항균성 검정용 제제의 조성 및 항균성 조사
제제별, 첨가농도별 항균성을 알아보기 위해 250 ㎖ 플라스크내 영양 육즙배지를 만들어 Bacillus sp. CK-1, E.coli O157:K88ac를 접종하여 37℃에 배양시키었다. 이들 각균들의 배양액은 1 x 107 cfu/㎖로 조정한 다음, 제제별로 각각의 농 도처리구를 조성하였다. 농도조성은 상기 제시된 재료를 원액(100%)와 3차 멸균수에, 10배(v/v), 100배, 250배, 500배 그리고 1,000배로 되게 첨가한 6개 처리구와 3차 멸균수만을 처리한 대조구을 두었다.
항균성 검정을 위하여 다음과 같이 실험하였다. 육즙고체배지에 Bacillus sp. CK-1, E.coli O157:K88ac 배양액 50㎕을 첨가하고 도말시켜 항균성 검정을 위한 재료로 사용하였으며, 항균성 확인을 위한 처리는 다음과 같이 실시하였다.
즉, 제제별 및 농도별로 조성된 희석용액에 의한 항균성 검정은 점적 방법으로 확인하였는데, 각 희석액을 20㎕씩 채취하여 육즙 한천배지에 도말하여 하루동안 배양시켜 나타난 제제를 농도별로 처리한 경우에 나타나는 균 성장저지환의 크기를 대조와 비교함으로서 항균성 경과를 확인하였다[표 7, 도 15].
가) 균도말 배지를 이용한 제제별 및 농도별 항균성 조사
본 실험에서는 고체 배지에 균을 도말한 경우에서 제제별 및 농도별로 조성된 제제가 균에 접촉시 어느 정도 항균성을 보유하는지를 확인하였다.
이를 위하여, 공시균인 Bacillus sp. CK-1과 E.coli O157:K88ac균 배양액을 고체 배지에 1회 도말한 후, 농도별로 희석한 제제를 점적하여 다음과 같은 방법으로 항균효과를 확인하였다.
즉, 육즙고체배지에 Bacillus sp. CK-1균과 E.coli O157:K88ac균 배양액을 50㎕씩을 정량 분취하여 이를 각각 다른 배지에 고르게 도말한 다음에 이를 재료로 사용하였으며, 항균성 확인을 위한 처리는 현재 판매되고 있는 제제를 농도별로 희석하여 준비한 처리구별로 점적한 후 대조구와 비교 확인하였다.
항균성 검정을 위한 점적은, 제제별로 희석한 용액을 20㎕씩 정량 채취한 후 이를 균이 도발된 육즙고체배지에 일정간격으로 점적하고, 37℃에서 24시간 배양시켜 항균효과로 기인하여 형성되는 균 성장저지환의 크기를 대조구와 비교함으로서 항균성 경과를 확인하였다[표 7].
나) 제제별 및 농도별로 조성한 액상배지 내에 접촉시킨 균의 항균성효과
본 실험에서는 항균성 검정을 위해 준비된 Bacillus sp. CK-1균과 E.coli O157:K88ac균이 액상배지내에서 직접 접촉하고 일정시간이 경과한 경우의 항균성을 검정하였다. 즉, 육즙영양액체배지에 제제를 농도별로 희석하고, 동일시간에 Bacillus sp. CK-1균과 E.coli O157:K88ac균을 각각 다른 시험관에 동일량(10㎕)을 첨가한 후 3시간과 24시간이 경과시의 항균성 효과를 검정하였으며, 역시 검정은 점적방법을 적용하였다. 육즙고체배지에 시간이 경과시 처리구별로 점적하여 이를 37℃에서 24시간 배양하였으며, 이때 형성되는 집락수를 검정하여 항균효과를 확인하였다[표 7].
[결과]
가) 균도말 배지를 이용한 제제별 및 농도별 항균성 조사
시판되는 각종 제제들과 본 발명의 은나노입자가 도입된 세제용 첨가제의 항균성을 Bacillus균과 대장균을 공시균으로 하여 항균스펙트럼을 검정함과 동시에, 본 발명에 의하여 제조된 은나노입자가 도입된 세제용 첨가제의 도입시 항균성을 얼마나 증폭시킬 수 있는지를 다각도로 비교 조사하였다[도 14].
그 결과, 우선 고체영양배지에 균을 도말한 후 제제별 및 농도별로 조성된 제제가 균에 접촉 시, Bacillus sp. CK-1균에서만 우선 어느 정도 항균성을 보유하는지를 우선 확인하였으며[표 7, 도 15], 3차 멸균수를 처리한 경우는 균은 지속적으로 성장이 이루어지나, 섬유유연제의 경우는 원액과 원액을 10배 되게 희석하여 처리한 경우에서는 90% 이상의 항균성을 나타냈다. 그러나, 같은 생활용품군중 주방세제의 경우는 원액에서 3차 멸균수를 이용하여 250배까지 희석하여 점적한 경우 항균 효과는 90%이상을 나타냄에 따라, 섬유유연제와 주방세제의 경우는 항균성에 25 배의 항균효과를 나타냄에 따라 이는 제제의 조성차이에 따른 효과로 판단되었다.
은나노입자가 도입된 세제용 첨가제의 경우 나노실버-I와 -II의 원액에서 100(Ag함유량 50ppm)배까지 항균성을 보유하고 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 섬유유연제와 주방세제 그리고 나노실버-I 및 II 만을 사용한 경우에서 Bacillus sp. CK-1균에 대한 항균성은 제제들을 원액 내지 250배 범위에서 90%이상의 항균성을 나타내었다. 그러나, 항곰팡이 효과가 탁월하다고 알려진 지방산으로 제조된 바이오컨버젼(Bioconversion)제제와 피레스린이라는 항충효과를 보유한 제제를 첨가하여 시판되는 항충성 애견샴푸의 경우는 항균효과가 없는 것으로 조사되었다. 이는 곰팡이와 해충(이, 진드기, 벼룩 등)의 방제에 있어 살충 및 항곰팡이 메카니즘과 본 발명에서 시도되고 있는 항균성과는 메카니즘이 전혀 다름에 기인하는 것으로 조사되었다.
나) 제제별 및 농도별로 조성한 액상배지 내에 접촉시킨 균의 시간경과별 항 균성 확인
본 실험에서는 항균성 검정을 위해 준비된 Bacillus sp. CK-1균과 E.coli O157:K88ac균이 액상배지내에서 직접 접촉하고 일정시간이 경과한 후의 항균성을 검정하였다.
즉, 육즙영양액체배지에 각 제제를 농도별로 희석한 후, 동일시간에 Bacillus sp. CK-1균과 그리고 E.coli O157:K88ac균을 각각 다른 시험관에 동일량을 첨가한 후 3시간과 24시간이 경과시의 항균성 효과를 검정하였으며, 역시 검정은 점적방법을 적용하여 항균성 효과를 조사하였다. 세균별 제제를 농도별로 희석하여 이들의 항균효과에 미치는 최적 시간을 확인하여 보았다.
그 결과, E.coli O157:K88ac균의 경우 3시간 경과시, 주방세제는 원액에서부터 250배 범위까지 항균성을 보유하고 있었으며, 섬유유연제는 원액을 제외하고는 항균성을 나타내지 않았다. 그러나, 나노실버-I 및 II의 경우는 3시간 이내에 항균성이 있는 것으로 조사되었으며, Bacillus sp. CK-1균의 경우는 3시간 경과시 균의 집락이 형성되지 않아 사멸된 것으로 판단되었다. 즉, 제제를 농도별로 다르게 조성한 후 처리한 경우에서 Bacillus sp. CK-1균에 대한 항균성이 E.coli O157:K88ac균보다 유의하게 높은 것으로 조사되었다[도 15].
상기 결과를 기초로 24 시간 경과시의 항균효과를 역시 동일한 방법으로 확인하여 본 결과, E.coli O157:K88ac균의 경우 Bioconversion제제와 항충성 애견샴푸의 경우는 10배의 고농도에서도 균이 생존하는 것으로 조사되어 항균 효과는 없은 것으로 조사되었으며, 주방세제의 경우는 250배 이하의 희석 농도에서 역시 항 균효과가 없는 것으로 조사되었다.
기타의 제제들은 농도차이는 있으나 항균성을 균에 접촉시간을 24시간 부여하는 기간 지속적인 항균효과를 나타냄에 따라 항균성은 90%이상을 나타냈다[도 16]. 반면, Bacillus sp. CK-1균의 경우는 24시간이 경과시 전체 실험구에서 90%이상의 항균성을 나타내는 것으로 조사되어 상기의 실험결과와 유사한 결과를 나타내었다.
표 7. 합성항생제와 기존 시판 제품 및 웰빙형 나노실버소재에 대한 항균성 검정
Figure 112008046130152-PAT00001
실험예 6. 은나노입자 첨가량에 따른 항균성 확인
1. 재료 및 방법
가. 재료
1) 생활용품 소재 : 포프랑 아이키스, 맑은주방[이상 (주)동양물산, 한국]
2) 은나노입자가 도입된 세제용 첨가제 : 나노실버-I [실시예 1과 다른 방법에 의하여 제조된 은나노입자 5,000ppm함유, Brown type, (주)나울, 한국], 나노실버-II [실시예 1의 방법에 의하여 제조된 은나노입자 5,000ppm함유, White type, (주)나울, 한국]
3) 항균성 검정용 공시균주: Bacillus sp. CK-1, E. coli O157:K88ac
나. 방법
1) 검정용 균 및 균용액배양
표준균주로서는 Bacillus sp. CK-1과 E.coli O157:K88ac균를 공시균주로 사용하였으며, 준비된 각 균들은 영양육즙배지(Difco)에 접종하여 37℃, 150rpm에서 18시간동안 각각 진탕배양하였다. 배양액을 필요할 경우 희석하여 균수를 조절하여 본 실험에 사용하였다
2) 나노실버 - II 를 투여한 제제들의 항균성 증강효과
본 실험에서는 시판 제제 자체의 항균성조사 결과를 기초로 여기에 나노실버-II를 25ppm과 50ppm으로 농도를 각각 다르게 첨가하였을 경우의 항균성 증강효과와, 항균에 미치는 시간 및 균종에 따른 항균력 차이를 동시에 조사하였다.
가) 나노실버 -I 단독처리에 의하여 항균성이 발현되는 시간조사
멸균한 시험관(2ml)에 3차 멸균수를 충진하고, 나노실버-I 및 II만을 농도별(25ppm 그리고 50ppm)로 다르게 조성한 후, 여기에 Bacillus sp. CK-1균을 투여 한 2개 처리구와 E. coli O157:K88ac균을 투여한 2개 처리구로 조성하여 이들의 항균성을 조사하였다. 항균성 조사는, 실험구에 균을 투여하는 것을 기점으로 1분, 3분, 5분, 10분, 20분 그리고 1시간, 3시간단위로 총 7개 구간으로 구분하여 시간경과별로 육즙한천배지에 점적하고, 이를 37℃의 조건에서 하루동안 배양하여 나노실버-II에 의한 E. coli O157:K88ac균과 Bacillus sp. CK-1균의 사멸시간과 더불어 균종간의 항균성 효과를 확인하였다.
나) 나노실버 - II 이 첨가된 시판 제제의 항균성 증강 효과 확인
상기 시판 제제를 원액 그대로 사용한 원액처리구와 3차 멸균수에 제제를 10배(v/v), 100배, 250배, 500배 그리고 1,000배로 조절한 희석한 후, 나노실버-II 를 25ppm과 50ppm으로 각각 투여하고, 여기에 Bacillus sp. CK-1배양액 또는 E.coli O157:K88ac균 10㎕를 동시에 첨가한 실험구를 조성하고, 최종 제제와 나노실버-II를 첨가한 경우에서, 시간경과별 항균성 증강 효과를 조사하였다.
다) 농도별 나노실버 - II 이 첨가된 시판 제제의 처리시 시간 경과에 따른 항균성 증가 효과 확인
(1) 나노실버 - II 25 ppm 첨가시의 항균성 검정
제제별, 첨가농도별 항균성을 알아보기 위한 전체 실험구는, Bacillus sp. CK-1와 E.coli O157:K88ac에 대하여 각각 다르게 실험구를 다르게 조성하였다. 최종 Bacillus sp. CK-1와 E. coli O157:K88ac배양액내 균수는 1 x 109 cfu/㎖로 조정한 다음, 제제별(섬유유연제, 주방세제 100배희석), 나노실버-II 농도를 25ppm, 50ppm로 첨가한 4개 제제에 대하여 항균성을 검정 하였다.
즉, 제제별 처리에 따른 항균효과를 검정하기 위하여 2ml 에펜도르프 튜브에 전체적으로 1,000㎕(v/v)의 볼륨으로 최종 조절되도록 조성하여 사용하였다. 대조구로는 3차 멸균수 950㎕를 에펜도르프 시험관에 충전시킨 후 여기에 미리 배양하여 준비한 Bacillus sp. CK-1 또는 E. coli O157:K88ac 배양액을 50㎕되게 첨가하여 사용하였다. 그리고, 3차 멸균수 물(950㎕)를 에펜도르프 시험관에 충전시킨 후 여기에 미리 배양하여 준비한 Bacillus sp. CK-1 또는 E. coli O157:K88ac 배양액을 50㎕되게 첨가하고, 단지 나노실버-II를 25ppm되게 첨가함으로서, 최종 판매 및 개발하고자 하는 제제에 나노실버-II를 첨가한 경우와의 항균성을 비교 검토하였다.
이에 대하여 처리구-1은 섬유유연제에 나노실버-II를 첨가시의 항균성 증강효과를 검정하기 위한 처리구의 조성은 다음과 같이 조성하였다.
즉, 섬유유연제로 사용하고 있는 제품인 아이키스(상품명)을 3차 멸균수에 100배(v/v)가 되도록 희석한 후 이를 에펜도르프 튜브관에 940㎕를 우선 충진시키고, 추가적으로 준비된 나노실버-II(5,000ppm)를 10㎕를 투여하여 교반하였고, 최종 Bacillus sp. CK-1 균배양액과 E. coli O157:K88ac균배양액을 각각 다른 실험구를 조성하여 여기에 50㎕를 투여하고, 추가적으로 섬유유연제에 나노실버-II를 투여하였을 때의 항균성검정을 위한 Bacillus sp. CK-1처리구와 E. coli O157:K88ac를 각각 준비하였다.
그리고, 균별로 각각 다르게 조성된 처리구-2는, 주방세제에 나노실버-II를 첨가한 경우에서의 항균성 효과 검정을 위한 조건은 섬유유연제와 동일하게 실시하였으나, 다만 제제만을 주방세제인 맑은주방(상품명)으로 대체하여 실시하였다.
전체 처리구별 항균성 결과는 다음과 같이 확인하였다. 즉, 제제별 및 나노실버농도별로 조성된 희석용액에 의한 항균성 검정은 시간 경과별에 따라 항균성 효과를 확인하였고, 점적 방법으로 실시하였다. 항균성 실험을 위한 샘플채취 시간은 0분, 1분, 3분, 5분, 10분, 20분, 1시간 그리고 최종 3시간으로 8개 시간단위로 세분하여 검정하였다.
(2) 나노실버 -I 50 ppm 첨가시의 항균성 검정
Bacillus sp. CK-1와 E. coli O157:K88ac에 대하여 제제별과 나노실버-I를 50ppm을 처리한 경우의 항균효과는 다음과 같이 조성하여 실시하였다.
최종 Bacillus sp. CK-1와 E.coli O157:K88ac배양액내 균수는 1x109 cfu/㎖로 조정한 다음, 제제별(섬유유연제, 주방세제 100배 희석), 나노실버-II (25ppm, 50ppm)로 첨가한 4개 제제에 대하여 항균성을 검정하였다. 즉, 제제별 처리에 따른 항균효과를 검정하기 위하여 2ml 에펜도르프 튜브에 전체적으로 1,000㎕(v/v)의 볼륨으로 최종 조절되도록 조성하여 사용하였다.
대조구로는 3차 멸균수 물(950㎕)를 에펜도르프 튜브관에 충전시킨 후 여기에 미리 배양하여 준비한 Bacillus sp. CK-1 또는 E.coli O157:K88ac 배양액을 50㎕되게 첨가하여 사용하였다. 그리고, 3차 멸균수 물(950㎕)를 에펜도르프 튜브관에 충전시킨 후 여기에 미리 배양하여 준비한 Bacillus sp. CK-1 또는 E. coli O157:K88ac 배양액을 50㎕되게 첨가하고, 나노실버를 50ppm첨가한 실험구를 설정하여 단지 나노실버-II를 50ppm되게 첨가함으로서, 최종 판매 및 개발하고져 하는 제제에 나노실버-II를 첨가한 경우와의 항균성을 비교 검토하였다.
처리구-1은 섬유유연제에 나노실버-II를 첨가시의 항균성 증강효과를 검정하기 위한 처리구의 조성은 다음과 같이 조성하였다. 즉, 우선 섬유유연제로 사용하고 있는 제품인 아이키스(상품명)를 3차 멸균수에 100배(v/v)가 되도록 희석한 후 이를 에펜도르프 튜브관에 930㎕를 우선 충진시키고, 추가적으로 준비된 나노실버-II(5,000ppm)를 20㎕를 투여하여 교반하였고, 최종 Bacillus sp. CK-1 균배양액과 E. coli O157:K88ac균배양액을 각각 다른 실험구를 조성하여 여기에 50㎕를 투여하고, 추가적으로 섬유유연제에 나노실버-I를 투여 하였을 때의 항균성검정을 위한 Bacillus sp. CK-1처리구와 E.coli O157:K88ac를 각각 준비하였다. 그리고, 균별로 각각 다르게 조성된 처리구-2는, 주방세제에 나노실버-II를 첨가한 경우에서의 항균성 효과 검정을 위한 조건은 섬유유연제와 동일하게 실시하였으나, 다만 제제만을 주방세제인 맑은주방(상품명)으로 대체하여 실시하였다.
[결과]
본 발명의 은나노입자가 도입된 세제용 첨가제(나노실버-II)를 시판 제제에 도입한 결과 시판 제제 자체보다 항균성이 향상 된다는 것을 상기한 실험 결과 확인하였으며, 이를 기초로 본 실험에서는 “나노실버-II”가 항균성을 보장 할 수 있는 최적 첨가량과 이에 따른 항균성 지속시간을 확인하였다[표 8 내지 11, 도 17].
시판 제제에 나노실버-II를 25ppm 첨가시의 항균성을 검정한 결과, 나노실버-II를 첨가하지 않은 대조구의 경우에서 E. coli O157:K88ac의 경우는 지속적으로 균수가 증가함에 비하여, 단지 나노실버-II를 25ppm 첨가한 경우에서는 대장균의 경우는 20분 경과시 사멸율 90% 이상, 30분 경과시 균의 집락이 나타나지 않아 100% 항균성이 있는 것으로 나타났다. 그러나, 50ppm의 나노실버-II를 첨가한 경우에서는 3분 이내에 99% 이상, 20 분 이내에 100%의 사멸효과를 나타냄으로서 나노실버-II의 농도가 항균성에 미치는 주요한 변수인 것으로 조사되었다.
균종류와 관련하여 제제별 및 나노실버-II 첨가량에 따른 항균성에 미치는 효과를 비교하여 본 결과, 첨가되는 농도에 상관없이 1분 이내에 90% 이상의 항균성이 있는 것으로 확인되었고, 시간이 경과할수록 항균성은 역시 더욱 증가하는 것으로 확인되었으며, 1시간 이내에 99%이상의 항균성을 나타내는 것으로 확인되었다.
대장균과 Bacillus sp. CK-1와의 균종류에 따른 항균효과로서, 25ppm을 첨가한 실험구에서 대장균이 Bacillus sp. CK-1에 비하여 나노실버-II의 첨가량 차이에 따라 항균성은 다소 약하게 나타나 30분 이상 경과시 100%의 사멸효과가, 50ppm의 나노실버-II를 첨가한 경우는 항균성이 20분 이내에 100%의 사멸 효과를 나타냈다.
표 8. 은나노입자(25ppm)를 포함하는 나노실버 제제를 Bacillus sp에 처리한 후 항 균성 증강효과 확인
시간경과별 항균효과 처리구 은나노입자(25ppm)첨가에 따른 항균효과
0분 1분 3분 5분 10분 20분 1시간 3시간
대조구 (3차멸균수+Bacillus sp . CK-1균) - - - - - - - -
처리구1 (섬유유연제+나노실버-II+Bacillus sp.CK-1균) ND +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
처리구 2 (주방세제+나노실버-II+Bacillus sp . CK-1균) ND ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
* : +++ : 90%이상사멸, ++ : 50%이상 사멸, + : 10% 이상, - : 항균효과 없음, ND: 검정하지 않았음.
표 9. 은나노입자(50ppm)를 포함하는 나노실버 제제를 Bacillus sp에 처리한 후 항균성 증강효과 확인
시간경과별 항균효과 처리구 은나노입자(50ppm)첨가에 따른 항균효과
0분 1분 3분 5분 10분 20분 1시간 3시간
대조구 (3차멸균수+Bacillus sp . CK-1균) - - - - - - - -
처리구1 (섬유유연제+나노실버-II+Bacillus sp. CK-1균) ND +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
처리구 2 (주방세제+나노실버-II+Bacillus sp . CK-1균) ND ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
+++ : 90%이상사멸, ++ : 50%이상 사멸, + : 10% 이상, - : 항균효과 없음, ND: 검정하지 않았음.
표 10. 은나노입자(25ppm)를 포함하는 나노실버 제제를 대장균에 처리한 후 시간 경과에 따른 항균성 증강효과 확인
시간경과별 항균효과 처리구 은나노입자(25ppm)첨가에 따른 항균효과
0분 1분 3분 5분 10분 20분 1시간 3시간
대조구 (3차멸균수+E. coli O157:K88ac균) - - - - - - - -
처리구 1 (섬유유연제+나노실버-II+E. coli O157:K88ac균) ND +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
처리구 2 (주방세제+나노실버-II+E. coli O157:K88ac균) ND ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++
+++: 90%이상사멸, ++ : 50%이상 사멸, + : 10% 이상, - : 항균효과 없음, ND: 검정하지 않았음.
표 11. 은나노입자(50ppm)를 포함하는 나노실버 제제를 대장균에 처리한 후 시간 경과에 따른 항균성 증강효과 확인
시간경과별 항균효과 처리구 은나노입자(50ppm)첨가에 따른 항균효과
0분 1분 3분 5분 10분 20분 1시간 3시간
대조구 (3차멸균수+E. coli O157:K88ac균) - - - - - - - -
처리구 1 (섬유유연제+나노실버-II+E. coli O157:K88ac균) ND +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
처리구 2 (주방세제+나노실버-II+E. coli O157:K88ac균) ND +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
+++ : 90%이상사멸, ++ : 50%이상 사멸, + : 10% 이상, - : 항균효과 없음, ND: 검정하지 않았음.
실험예 7. 나노실버-II을 도입한 제품의 세탁물 오염균에 대한 항균효과 검정
본 실험은 본 발명에 의하여 제조된 은나노입자가 도입된 세제용 첨가제(나노실버-II)가 수건, 세탁물 등에 오염된 미생물들의 사멸이 가능한지를 검정함과 동시에 실생활에 적용시 항균성 효과를 얻기 위한 최적사용량 및 적용시간을 정립하고자 실시되었다.
1. 재료 및 방법
가. 재료
1) 시판 제제: 포프랑 아이키스(섬유유연제), 맑은주방(주방용 세제)[이상 (주)동양물산, 한국]
2) 은나노입자 도입 원료 소재 : 나노실버-I (실시예 1에 준하지 않는 방법으로 제조된 은나노입자가 도입된 세제용 첨가제, Ag 5,000ppm함유, Brown type, (주)나울, 한국), 나노실버-II (실시예 1에 준하는 방법으로 제조된 은나노입자가 도입된 세제용 첨가제, Ag 5,000ppm함유, White type, (주)나울, 한국)
3) 항균성 검정용 공시균주: Bacillus sp. CK-1, E. coli O157:K88ac, 세탁물 분리 오염균
4) 오염 세탁물소재 : 상용 목욕용 수세미 타월, 상용수건
나. 방법
1) 검정용 균 및 균용액배양
표준균주로서는 Bacillus sp. CK-1과 E. coli O157:K88ac균를 공시균주로 사용하였으며, 준비된 각 균들은 영양육즙배지(Difco)에 접종하여 37℃, 150rpm에서 18시간동안 각각 진탕배양하였다. 이 균 배양액을 필요할 경우 희석하여 균수를 조절하여 사용하였다
2) 항균성 검정
가) 목욕용 상용 수세미 오염균의 사멸효과 확인
(1) 대장균과 Bacillus균에 대한 나노실버의 농도별 항균성 조사
일반 가정에서 장시간 목욕용으로 사용하고 있는 타월을 구입하여, 장기사용에 따라 존재하고 있는 오염균의 사멸효과를 검정하기 위한 실험조건은 다음과 같이 설정하였다.
배지조건으로서는, 멸균처리한 500㎖ 삼각플라스크내 영양 육즙배지 200ml 씩을 각각 분주하여 5개를 준비하였다. 실험구는 다음과 같이 조성하였으며, 우선 나노실버-II를 25ppm과 50ppm로 각각 처리하였을 때의 항균성을 먼저 조사하여 상 용 목욕용 타월에 존재하는 오염균에 대한 사멸효과를 미리 예측하였다.
육즙영양배지에 배양균만을 첨가한 후 처리구와의 비교를 위한 실험구-1(대조구)의 조성으로서, 200ml가 분주된 삼각플라스크에 대장균 배양액을 1ml를 첨가하는 조건으로 설정하였으며, 실험구-2(대조구)의 경우는 실험구-1과 동일한 조건으로 하였으나, 다만 Bacillus sp. CK-1균만을 1ml를 투여하였다. 그리고, 이를 37℃에서 24시간 배양한 후 제제 처리에 따른 균들의 생존수를 확인하였다.
대조구와 나노실버-II를 각 배지에 농도별로 투여시의 항균 효과를 비교하기 위한 실험구-3은, 배양액이 분주되어 있는 플라스크에 나노실버-II를 25ppm되게, 실험구-4는 나노실버-II를 50ppm되게 넣은 후 여기에 E. coli O157:K88ac균을 각각 1ml을 넣는 조건으로 하였다. 그리고, 실험구-5와 실험구-6의 경우는 실험구-3과 4와 동일하게 처리하였으나 다만 균을 Bacillus sp. CK-1균을 1ml씩을 넣는 것을 다르게 하였으며 기타 처리조건은 동일하게 실시하였다.
각 실험군에 따른 균들의 사멸율은, 일반배지에 균들을 첨가한 경우인 실험구-1과 실험구-2, 나노실버-II를 각 농도별 및 균별로 구별하여 첨가한 실험구-3 내지 실험구 6과 비교하였다.
즉, 시간 경과별 균의 사멸률과 생장에 따른 세균의 수치는, 각 실험군 조성 후 나노실버-II의 투입 후부터 시간경과시(제제 투여전, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간 그리고 18시간)의 배양액에서 균일하게 1ml씩을 분취한 후, 이를 단계희석하여 육즙고체영양배지에 동일량을 도말한 후 24시간, 37℃에서 배양하여 이때 생존하는 균 집락수를 계측하여 대조구와 비교 도출하였다.
(2) 목욕용 상용 수세미 오염균에 대한 사멸효과 확인
상기 실험 결과에서 영양육즙배지에 E. coli와 Bacillus균을 투여할 경우 균의 생장에 영향을 끼치지 않았음과 여기에 나노실버-II를 농도별로 투여시 항균효과가 뛰어남을 확인한 결과, 상용목욕타월에 존재하는 미지의 오염균에 대한 나노실버-II를 도입한 제품의 처리가 오염균에 대한 사멸효과 판단에 문제가 없다고 판단되어 다음과 같이 목욕용 상용 수세미 오염균에 대한 개발제제의 사멸효과 검정실험을 실시하였다.
오염균 사멸효과 실험을 위한 타월은 일반 가정에서 장기간(1년 이상) 목욕용으로 사용하고 있는 타월을 구입하였으며, 이들을 무균상태에서 동일한 크기(3cm x 1cm x 1cm)로 절단하여 시험절편으로 준비하였다.
각 항균성 효과를 확인을 위한 배지조건으로서는, 멸균처리한 500㎖ 삼각플라스크내 영양 육즙배지를 200ml 씩 각각 분주하여 9개 준비하였으며, 이를 위한 실험조건은 다음과 같다.
실험구-7(대조구)은 준비된 시험절편을 3차 멸균수에 10분 동안 충분히 세척하고 이를 생장측정용 배지에 투여하는 조건으로 조성하였다.
실험구-8은 시판 섬유유연제인 포프랑 아이키스를 100배 희석한 후 여기에 나노실버-I 25ppm, 그리고 실험구-9의 경우는 동일하게 희석한 포프랑 아이키스 희석액에 나노실버-II을 50ppm되게 첨가한 용액을 조성하였다. 실험구-10과 실험구-11의 경우는, 시판되는 주방세제 중 맑은주방을 멸균된 플라스크에 100배로 희석한 후, 여기에 나노실버-II 25ppm(실험구-10), 50ppm(실험구-11)을 첨가하고 10 분 동안 실험용 수세미 절편을 정체시키므로서 실험용 수세미절편에 존재하는 오염균의 사멸효과를 확인하였다.
대조구로서는 오염 절편 수세미만을, 3차 탈이온수에서 충분히 세척한 후 이를 나노실버-II 25ppm(실험구-12)과 50ppm(실험구-13)으로 조성된 배지에 침지한 후 3차 멸균수에 세척처리한 실험구로 정하였다.
전체 실험구(실험구 7 내지 실험구 13)는 오염 수세미절편에 대하여, 시판 제제와 나노실버-II이 첨가된 제제를 100배되게 희석하되 나노실버-II의 첨가량을 25ppm과 50ppm으로 조절한 각 용액 내에 시험용 수세미절편을 10분 동안 침지시킨 후, 이를 건져 3차 탈이온수에서 10분 동안 충분히 세척하여 실험용 절편에 잔존하는 제제를 완전히 제거시키는 과정을 완료한 후, 이를 생장측정용 배지에 투여하는 조건으로 실시하였다. 시간 경과별 항균성 검정을 위하여, 멸균 시험관튜브에 1,000㎕씩 담아 냉동실에 보관하였고, 우선 이중 50㎕을 정밀히 취하여 육즙고체영양배지에 점적하고 이를 도말한 후 37℃에서 24시간 배양시 형성되는 균 집락수를 확인하여, 대조구와 비교하여 항균성 결과를 도출하였다.
또한, 제제별 및 농도별로 조성된 희석용액에 의한 항균성 검정은 점적 방법으로 더불어 확인하였는데, 각 희석액을 20㎕씩 채취하여 육즙 한천배지에 일정간격으로 도말하여 하루동안 배양시켜 나타난 제제를 농도별로 처리한 경우에 나타나는 균 성장저지환의 크기를 대조와 비교함으로서 항균성 경과를 추가적으로 확인하였다.
(3) 장기간 상용수건에 존재하는 오염균에 대한 항균효과 확인
실험예 6의 결과에서 영양육즙배지에 E.coli와 Bacillus균을 투여할 경우 균의 생장에 영향을 끼치지 않았음과 상기한 결과에서 나노실버-II를 농도별로 투여시의 항균효과, 상용목욕타월에 존재하는 미지의 오염균에 대한 나노실버-II를 도입한 개발제제 처리가 오염균에 대하여 사멸효과 판단에 문제가 없다고 판단되어, 본 실험에서는 일반 가정에서 장시간 사용하고 있는 상용수건내에 잔존하는 오염균에 대한 개발제제의 사멸효과를 확인하였다.
오염균 사멸효과 실험을 위한 수건은 일반 가정에서 장기간(1년 이상) 목욕용으로 사용하고 있는 수건을 구입하였으며, 대조수건으로서는 멸균처리가 완료되어 백화점에서 판매되는 신선한 수건을 구입하여 사용하였다. 그리고, 이들을 무균상태에서 동일한 크기(3cm x 1cm x 1cm)로 절단하여 시험절편으로 준비하였다. 전체 실험에 따른 시험구는 총 13개 처리구로 정하여 실시하였다. 즉, 실험구-A는 영양육즙배지(LB 배지)에 대장균 1ml 투여함으로서 대장균의 생장을 확인한 대조구, 실험구-B는 LB배지에 바실러스 1ml 투여한 대조구, 실험구-C는 상용수건 절편을 3차 멸균수에서 10분간 세척 후 LB배지에 투여 잔존하는 오염균의 생존균을 확인하기 위한 배양 처리구로 하였다.
실험구-D는 상용수건 절편을 포프랑 아이리스 100배 용액에 10분간 침적 후 10분간 3차 멸균수에서 세척한 후 LB배지에 투여 잔존 오염균 배양처리구, 실험구-E는 대조수건 절편을 포프랑 아이리스 100배액에 10분간 침적하고 이를 3차 멸균수 로 10분간 충분히 세척한 후 LB배지에 투여함으로서 잔존 오염균이 배양되는지를 확인한 처리구, 실험구-F는 상용수건 절편을 포프랑 아이리스 100배액에 나노실버-II를 50ppm 되게 첨가한 용액에 10분간 침적한 후, 10분간 3차 멸균수로 세척하고 이를 LB배지에 투여하여 잔존하는 오염균을 측정한 처리구로 하였으며, 실험구-G의 경우는 대조수건 절편을 포프랑 아이리스 100배 용액에 10분간 침적 후 이를 3차 멸균수로 10분간 세척하고 LB배지에 투여 생존하는 오염균을 배양한 처리구, 실험구-H는 상용수건 절편을 맑은주방 100배액에 10분간 침적, 10분간 3차 멸균수에 세척하고 LB배지에 투여 생존하는 오염균을 배양한 처리구, 실험구-I는 대조수건 절편에 대하여 맑은주방 100배 희석한 용액에 10분간 침적하고 3차 멸균수로 세척한 후 LB배지에 투여 잔존하는 오염균을 배양한 처리구, 실험구-J는 상용수건 절편을 맑은주방 100배액에 나노실버-II를 50ppm 첨가한 용액을 조성한 후 10분간 침적, 3차멸균수로 세척한 후 LB배지에서 잔존하는 오염균을 배양한 처리구, 실험구-K는 대조수건 절편을 맑은주방 100배 액에 나노실버-II를 50ppm 첨가한 용액을 조성한 후 10분간 침적, 3차 멸균수로 세척한 후 LB배지에서 잔존하는 오염균을 배양한 처리구로 하였다.
제제별 상용수건 내에 존재하는 오염균에 대한 항균성 검정을 위하여, 제제 처리 직후를 0시간으로 하여, 1시간부터 8시간 경과시까지는 1시간 단위로, 그리고 16시간이 경과시를 최종으로 하여 총 9개 간격의 시간 경과시 시간별로 멸균 에펜도르프 시험관에 샘플을 1ml씩 정밀하게 채취하여, 이를 저온(4℃)에 보관하였고, 시간별 샘플의 채취가 완료되는 시점에서, 육즙고체배지에 매 시간별로 채취된 시 험구 A 내지 실험구 K의 샘플에서 20㎕씩을 정밀 채취하여 육즙 한천배지에 일정간격으로 점적하고 하루동안 배양시켜 나타나는 균 성장저지환의 크기를 대조와 비교함으로서 항균성 경과를 병행 확인함으로서, 상용 수세미와 상용수건의 경우의 항균성을 비교 검토하여 보았다.
(4) 나노실버 - II 농도별 첨가 개발제제가 배양된 오염균 사멸에 미치는 시간 확인
본 실험에서는 상용 수세미에서 분리한 오염균을 대상으로, 여기에 나노실버-II를 농도별로 다르게 처리한 경우 사멸효과를 각 농도별 및 시간별로 확인하기 위하여 수행되었으며, 이를 위한 실험조건은 다음과 같다.
대조구의 경우는 배양균을 3차 멸균수에 1ml 씩을 첨가한 처리구룰 설정하였으며, 배양된 오염균용액에 대하여 나노실버-II 처리구는 나노실버-II를 25ppm. 30ppm, 35ppm, 40ppm, 45ppm 그리고 50ppm이 되게 첨가한 처리구로 정하였으며, 항충성 개샴푸를 사용한 처리구는 항충성 개삼푸 원액을 3차 멸균수로 100배되게 희석한 후, 여기에 나노실버-II을 25ppm을 함유시킨 처리구와 50ppm 되게 첨가한 처리구로 하여 항균성 검정을 실시하였다.
그리고, 이러한 조성이 완료된 상태에서 오염균 배양액을 각각 다른 조성구에 동시에 1ml 씩을 첨가하고 이를 1시간부터 16시간 까지를 정하여 항균성 결과를 측정하였다.
항균성 측정은 점적방법과 시간 경과시 생존에 따른 균 집락수를 측정하는 방법을 병행하여 항균성 결과를 확인하였다. 즉, 농도별로 조성된 처리구에 균들을 첨가한 직후를 0시간으로 하여, 1시간부터 8 시간 경과시까지는 1시간 단위로, 그리고 16시간이 경과시를 최종으로 하여 총 9개 간격의 시간별로 멸균 에펜도르프 시험관에 샘플을 1ml씩 정밀하게 채취하여, 저온(4℃)에 보관하였다.
그리고, 시간별 샘플의 채취가 완료되는 시점에서, 육즙고체배지에 매 시간별로 채취된 샘플을 50 ㎕를 패트리 디시에 점적하고, 이를 도말한 후 37℃에서 24시간 배양함으로서 생성되는 균 집락수를 계측하여 대조구와 비교함으로서 나노실버-II 도입 제제의 처리가 항균성에 미치는 효과를 확인하였다.
또한, 항균성 검정을 점적 방법을 병행하여 확인하였는데, 제제 처리후 시간별로 채취된 샘플 20㎕씩 정밀 채취하여 육즙 한천배지에 일정간격으로 점적하고 하루동안 배양시켜 나타나는 균 성장저지환의 크기를 대조와 비교함으로서 항균성 경과를 병행 확인하였다.
[결과]
본 실험은 실험예 1 내지 실험예 6에서 기존 판매되고 있는 생활용품과 이들을 구성하고 있는 원재료 및 본 발명에 의하여 제조된 은나노입자가 도입된 세제용 첨가제 및 이들을 이용한 강력한 항균성을 보유토록 한 “웰빙형 생활용품”의 개발이 완료됨에 따라 최종 상기 결과를 도입한 제제를 제조하여 이들을 이용하여, 생활용품의 활용에 가장 기본적인 수건, 세탁물등에 오염된 미생물들의 사멸이 가능한지를 검정함과 동시에 실생활에 적용시 항균성 효과를 얻기 위한 사용 시간 등을 확인하였다.
가. 대장균과 Bacillus균에 대한 나노실버-II의 농도별 항균성 조사
일반 가정에서 장시간 목욕용으로 사용하고 있는 타월을 구입하여, 장기사용에 따라 존재하고 있는 오염균의 사멸효과를 검정하기 위한 실험에 앞서, 우선 대장균과 Bacillus균에 대한 나노실버-II의 농도별 항균성에 미치는 효과를 조사하였다. 이를 위하여, 영양육즙배지에 나노실버-II 만을 대상으로 25ppm과 50ppm가 되게 조성한 후, 여기에 배양하여 준비한 E. coli O157:K88ac균과 Bacillus sp. CK-1균을 첨가하고 배양하면서 시간별로 사멸되는 항균효과를 대조구와 비교하여 확인하여 보았다[표 12].
결과로서, 대조구의 경우 E. coli O157:K88ac와 Bacillus sp. CK-1균에 상관없이 지속적으로 세균은 증식하는 경향을 나타내었으나, 나노실버-II를 농도별로 처리한 경우에서는 나노실버-II를 처리한 직후인 0시간의 경우에서 생존에 따른 세균은 검출되지 않아 바로 사멸시키는 것으로 조사되었으며, 역시 시간이 장시간 경과되어도 콜로니는 나타나지 않아 지속적으로 항균성을 나타내는 것으로 조사되었다[표 12 및 13, 도 22 및 23].
나. 목욕용 상용 수세미 오염균에 대한 개발제제의 사멸효과 확인
일반 가정에서 장시간 목욕용으로 사용하고 있는 타월을 구입하여, 장기사용에 따라 존재하고 있는 오염균의 사멸효과를 검정하기 위한 실험 실시하였다.
이를 위하여, 목욕용으로 사용하고 있는 타월을 구입하여, 목욕용 타월을 장기 사용함에 따라 존재하고 있는 오염균의 사멸효과를 나노실버-II, 시판 섬유유연 제(포프랑 아이리스), 시판 주방용 세제(맑은주방)를 대상으로 하여, 여기에 나노실버-II를 25ppm과 50ppm이 함유되게 조성한 후 10분 동안 침적시키고, 이를 3차 탈이온수로 충분히 세척하여, 제제 처리후에 생존하는 세균을 육즙영양배지 내에서 배양하면서 시간별로 나타나는 균 집락수를 대조구(실험구-7)와 비교하여 항균효과로 확인하여 보았다.
그 결과로서, 3차 멸균수에 세척만 실시한 대조구인 실험구-7의 경우는, 오염균은 지속적으로 균이 성장하는 결과를 나타내었으나, 나머지 실험구(실험구 8 내지 실험구 13)의 경우는 제제를 침적처리한 10분동안 오염균은 사멸되고, 장시간 시간이 경과되더라도 더 이상의 균의 생장은 이루어지지 않았다. 이러한 결과는 개발제제들은 현장(가정)에서 사용 시, 최소 1분 내지 최대 10분만의 오염균과의 접촉을 시킬 경우 잔존하는 오염균의 사멸에 효과적일 것으로 판단되었다[표 12 및 13, 도 18]).
다. 장기간 상용수건에 존재하는 오염균에 대한 개발제제의 항균효과 확인
상기실험 결과에서 영양육즙배지에 E.coli와 Bacillus균을 투여할 경우 균의 생장에 영향을 끼치지 않았음과 여기에 나노실버-II를 농도별로 투여시의 항균효과와 그리고 상용목욕타월에 존재하는 미지의 오염균에 대한 나노실버-II를 도입한 개발제제 처리가 오염균에 대하여 사멸효과 판단에 문제가 없다고 판단되어 본 실험에서는 일반 가정에서 장시간 사용하고 있는 상용수건 내에 잔존하는 오염균에 대한 개발제제의 사멸효과를 확인하였다[표 14].
결과로서, 점적방법을 사용한 경우에서의 항균성 조사결과에서, E.coli O157:K88ac균과 Bacillus sp. CK-1균만을 투여한 실험구 A와 B 그리고 상용수건에 존재하는 오염균을 3차 멸균수에서만 세척한 경우에서의 세균들은 시간이 경과하면 할수록 세균의 수는 지속적으로 증가하여, 실험구-A와 B의 경우는 최초 투여시부터 상용수건의 경우는 6시간이 경과시 세균수는 최대로 성장하는 경향을 나타내었다.
그러나, 실험구 D 내지 실험구 K의 경우는 제제를 처리하기 전에 존재하는 오염균은 상용하는 수건과 대조수건의 경우 공히 샘플 50㎕당 10cfu의 균수를 나타내었으나, 제제를 10분 동안 처리한 경우에서는 1시간이 경과시부터는 어떠한 세균도 검출되지 않았으며, 장시간이 경과한 16시간 경과후에도 역시 동일한 결과를 나타냄으로서, 항균성 효과는 높은 것으로 조사되었다[표 14, 도 19].
이러한 결과는 나노실버-I를 도입한 경우나 도입하기 전의 섬유유연제와 주방세제도 동일한 경향을 나타내었는데, 이는 아마도, 상용수건의 경우와 대조구 수건에서 존재하는 오염균의 수치가 최초에 적음에 따라 전체적으로는 항균성이 우수한 것으로 나타났다고 판단되었고, 이는 결국 오염균의 수치가 많고 적음에 따른 항균성 차이는 있을 것으로 판단되어 이에 대한 세부적인 검토가 필요하다고 생각되었다.
라. 배양된 오염균에 대한 나노실버-II의 농도 및 개발제제 처리가 오염균 사멸에 미치는 농도 및 시간 확인
본 실험에서는 상용 수세미에서 분리한 오염균을 대상으로, 여기에 나노실버 -II를 농도별로 다르게 처리한 경우 사멸효과를 농도별 및 시간별 사멸효과를 확인하였다.
결과로서, 점적방법을 적용한 항균성 조사결과 대조구의 경우는 시간에 경과하더라도 균수는 감소가 없었는데, 나노실버-II를 25ppm에서 50ppm처리한 실험구에서는 시간별로는 대조구와 그리고 나노실버-II 처리구의 경우는 최초 0시간과 비교시 나노실버-II 첨가 제제와 오염균과의 접촉된 후 1시간 경과시 99%이상의 항균성이 있는 것으로 조사되었다[표 16, 도 22].
그러나, 이러한 점적방법은 항균성에 대한 정량성 평가에 문제가 있어, 세부적인 항균성을 제제 처리 후 생존하는 균 집락수를 비교함하여 조사하여 보았더니, 대조구의 경우는 최초의 경우는 840 개의 오염균의 균 집락수를 나타내었으나, 시간이 경과하면 균수는 지속적으로 증가하는 경향을 보였다[도 22].
그러나, 나노실버-II를 농도별로 처리한 경우, 최초 약 800개의 오염균 집락은 나노실버-II를 첨가한 제제가 접촉된 이후로 1시간이 경과되면 약 10개의 생존 집락수가, 3시간이 경과시는 대부분의 오염균은 사멸되었고 8시간 이후의 경우는 어떠한 집락도 나타나지 않아 나노실버-I를 첨가한 제제는 나노실버-II를 25ppm에서 50ppm범위로 처리시 농도에 상관없이 우수한 항균성을 나타내는 것으로 조사되었으며, 항균성은 지속적으로 유지되는 것으로 조사되었다.
표 12. 목욕용 상용 수세미 오염균에 대한 개발제제의 시간별 사멸효과
Figure 112008046130152-PAT00002
표 13. 목욕용 상용 수세미 오염균에 대한 개발제제의 시간별 사멸효과
Figure 112008046130152-PAT00003
표 14. 장기간 상용수건에 존재하는 오염균에 대한 개발제제의 시간경과별 항균 효과(점적방법 적용 실험)
Figure 112008046130152-PAT00004
표 15. 배양된 오염균에 대한 나노실버농도 및 개발제제 처리가 오염균 사멸에 미치는 농도 및 시간 확인(점적방법 적용 실험)
Figure 112008046130152-PAT00005
표 16. 배양된 오염균에 대한 나노실버농도 및 개발제제 처리가 오염균 사멸에 미치는 농도 및 시간 검정(생존균에 따른 집락수 조사)
Figure 112008046130152-PAT00006
도 1은 실시예 1에 의하여 제조된 은나노입자의 직경 분포를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에 의하여 제조된 은나노입자의 SEM 사진이다.
도 3은 은나노입자(5 ppm)의 대장균(E. coli O157:H7)에 대한 시간에 따른 병리학적 항균활성을 나타낸 사진이다[A:O157:H7ACH5(VT1), B:O157:H759(VT2), C:O157:H7670(VT1+VT2), D: VTe O138, E57(VTe). E: VT2 Cl- O157:H-, F:VT2 Cl-O157:H7). 1: 대조구, 2 : 처리 후 30 분, 3: 처리 후 1시간, 4: 처리 후 8 시간].
도 4는 은나노입자 처리 후 5분 내지 6 시간 경과 후 대장균(E. coli O157:H7)에 대한 항균활성을 나타낸 그래프이다[(A) : E.coli VT1 O157:H7(ACHT5), (B): E.coli VT2 O157:H7(O59),(C): E coli VT1+VT2 O157:H7(670),(D) E. coli VTe O138, E57(VTe), (E): E. coli VT2Cl-O157:H-, (F):E. coli VT2 Cl-O157:H7, -●- : control, -■- : 50ppm nano-silver, -▲-: 25ppm nano-silver, -▼- : 10ppm nano-silver, -◆-: 5ppm nano-silver, -◎-: 1ppm nano-silver].
도 5는 자돈 분변(설사)로부터 분리된 26 종의 대장균에 대한 다양한 농도의 은나노입자 처리 후 항균활성을 나타낸 그래프이다[은나노입자 처리 1 시간 후, 37 ℃].
도 6은 자돈과 닭의 분변으로부터 분리된 다양한 병원균(Escherichia coli, S. gallinarum, Bacillus cereus and Staphylococcus aureus)에 대한 농도(1ppm 내지 50ppm)에 따른 은나노입자 처리 후 항균활성을 나타낸 병리학적 현미경 사진들을 나타낸 것이다[A: photograph of SEM, B : photpgraph of TEM].
도 7은 은나노입자의 대장균(E.coli NCTC 9001) 세대별 지속 처리에 따른 항균활성을 나타낸 그래프이다[(A) 1 세대, (B) 5 세대, (C) 10 세대, -●- : 대조구, -■- : 50ppm 은나노입자, -▲-: 25ppm 은나노입자, -▼- :10ppm 은나노입자, -◆-: 5ppm 은나노입자, -◎-: 1 ppm 은나노입자].
도 8은 은나노입자의 대장균(E.coli O157:K88ac) 세대별 지속 처리에 따른 항균활성을 나타낸 그래프이다[(A) 1 세대, (B) 5 세대, (C) 10 세대, -●- : 대조구, -■- : 50ppm 은나노입자, -▲-: 25ppm 은나노입자, -▼- : 10ppm 은나노입자, -◆-: 5ppm 은나노입자, -◎-: 1ppm 은나노입자].
도 9는 은나노입자의 대장균((A) E.coli O157:K88ac, (B) E.coli O157:K88ac) 세대별 지속 처리에 따른 항균활성을 나타낸 그래프이다[-●- : 1 세대, -■- : 5 세대, -▲-: 10 세대].
도 10은 (A)약제 내성 플라스미드 DNA(tolerant plasmid DNA)가 도입된 대장균(E. coli Jm83)과, (B) 약제 내성 플라스미드 DNA가 도입되지 않은 대장균의 암피실린 농도가 50ug/ml인 배지에서의 생존율을 나타낸 사진이다.
도 11는 대장균(E.coli JM83)에 은나노입자 처리 후 1 시간과 24시간 경과된 경우의 항균활성을 나타낸 그래프이다[(A): CNTL-JM 87(without tolerant plasmid DNA) and (B) : AMP-JM87( with tolerant plasmid DNA), -●- : 대조구, -■- : 50ppm 은나노입자, -▲-: 25ppm 은나노입자, -▼- : 10ppm 은나노입자, -◆-: 5ppm 은나노입자].
도 12은 대장균(E.coli JM83)에 5ppm의 은나노입자 처리 후 1분과 12 시간 경과된 경우의 항균활성을 나타낸 그래프이다[A: CNTL-JM87(without tolerant plasmid DNA), B: AMP-JM87(with tolerant plasmid DNA), -●- : 대조구 , -■- : 5ppm 은나노입자].
도 13은 실험예 4에서 적용된 제제의 종류를 나타낸 사진이다[1 : 섬유유연제(제품명: 포프랑 아이키스, 주식회사 동양물산), 2 : 주방세제(제품명 : 맑은주방, 주식회사 동양물산), 3 : 섬유유연제(제품명 : 포프랑 그린부케, 주식회사 동양물산), 4 : 섬유유연제(제품명 : 포프랑 핑키로즈, 주식회사 동양물산), 5 : 나노실버-I(Ag 5,000ppm함유, Brown type, 주식회사 나울), 7 : 나노실버-II(Ag 5,000ppm함유, White Type, 주식회사 나울)].
도 14는 실험예 5에서 사용된 제제의 종류를 나타낸 사진이다[1 : 섬유유연제(제품명;아이키스), 2 : 주방세제(제품명: 맑은주방), 3 : 섬유유연제(제품명; 그린부케), 4 : 섬유유연제(제품명 : 포프랑 핑키로즈), 5 : 나노실버-I(Ag 함량 5,000ppm, Brown type, 주식회사 나울), 7 : 나노실버-II(Ag 함량 5,000ppm, White type), 8 : Bioconversion제제(NTS사, 캐나다), 9 : 황산스트렙토마이신10%(종근당, 한국), 10 : 항충성 애견샴푸(E사, 한국)].
도 15는 실험예 5의 결과로서, 합성항생제와 기존제품 및 웰빙형 나노실버소재에 대한 농도별 항균성 확인 결과를 나타낸 사진이다[섬유유연제[제품명 : 아이키스(1), 그린부케(3), 포프랑 핑키로즈(4), (주) 동양물산], 주방세제[제품명: 맑은주방(2), (주)동양물산], 나노실버-I[5, Ag 5,000ppm함유, w/v, White type, (주)나울], 나노실버-II [7, Ag 5,000ppm(w/v)함유, Brown type, (주)나울], Bioconversion제제(8, 100%, v/v, 전남대), 황산스트렙토마이신(9, 100%,w/w, 종근당), 항충성애견샴푸(10, 100%, v/v, E사, 한국)], x10 내지 x1,000 : 3차 탈이온수 대비 제제의 희석비율, A : Bacillus sp. CK-1, B : E.coli O157:K88ac]
도 16은 실험예 5에 사용된 제제의 종류별 및 농도별로 E.coli O157:K88ac(A)와 Bacillus sp. CK-1(B)균에 24시간 직접 접촉시의 균종에 따른 항균성 효과 확인 결과를 나타낸 사진이다[1 : 섬유유연제(제품명: 아이키스, 주식회사 동양물산), 2 : 주방세제(제품명 : 맑은주방, 주식회사 동양물산), 3 : 섬유유연제(제품명 : 그린부케, 주식회사 동양물산), 4 : 섬유유연제(제품명 : 포프랑 핑키로즈, 주식회사 동양물산), 5 : 나노실버-I(Ag 5,000ppm함유, Brown type, 주식회사 나울), 7 : 나노실버-II(Ag 5,000ppm함유, White Type, 주식회사 나울), 8 : Bioconversion제제(100%, v/v, 전남대), 9 : 황산스트렙토마이신( 100%,w/w, 종근당), 10 : 항충성애견샴푸(10, 100%, v/v, E사, 한국)], x10 내지 x1,000 : 3차 탈이온수 대비 제제의 희석비율].
도 17은 시판 제제에 은나노입자 첨가량(25ppm 및 50ppm)를 달리하여 첨가한 후 E. coli O157:K88ac균을 대상으로 첨가량에 따른 항균성 증강효과를 확인한 결과를 나타낸 사진이다[A : 대조구, B : 제제 접촉후 1분경과, C : 3분 경과후, D : 5분 경과후, E : 10분경과후, F : 20분경과후, G : 1시간 경과후, H : 3시간 경과후, 1: 3차멸균수+나노실버-II 25ppm+E. coli O157:K88ac균, 2:섬유유연제+나노실버-II 50ppm+E. coli O157:K88ac균, 3 : 주방세제+나노실버-II 25ppm+E. coli O157:K88ac균, 5: 3차멸균수+나노실버-II 50ppm+E. coli O157:K88ac균, 6 : 섬유유 연제+나노실버-II 50ppm+E. coli O157:K88ac균, 7 : 주방세제+나노실버-II 50ppm+E. coli O157:K88ac균].
도 18은 실험예 7에서 수행된 생활용품 중 수세미 오염균에 대한 개발제제의 사멸효과 확인실험을 디자인한 것이다.
도 19는 실험예 7에 의하여 수행된 활용품 중 상용수건 오염균에 대한 개발제제의 사멸효과 확인실험을 디자인한 것이다.
도 20은 실험예 7에 의하여 수행된 것으로 Bacillus균과 E.coli균에 대한 나노실버-II 의 농도별 항균성을 조사한 결과를 나타낸 사진이다[1 : LB 배지내 E.coli O157:K88ac배양액 1ml 첨가, 2 : LB 배지내Bacillus sp. CK-1배양액 1ml 첨가, 3 :LB 배지내 나노실버용액 25ppm 첨가 + E.coli O157:K88ac균용액 1ml 첨가, 4 : LB 배지내 나노실버용액 50ppm 첨가 + E.coli O157:K88ac균용액 1ml 첨가, 5 : LB 배지내 나노실버용액 25ppm 첨가 + Bacillus sp. CK-1 균용액 1ml 첨가, 6 :LB 배지내 나노실버용액 50ppm 첨가+Bacillus sp.CK-1 균용액 1ml 첨가].
도 21은 실험예 7에 의하여 수행된 것으로 E.coli균과 Bacillus 균에 대한 나노실버-II의 농도별 및 시간경과별 항균성 조사 결과를 나타낸 사진이다[1 : LB 배지내 E.coli O157:K88ac배양액 1ml 첨가, 2 : LB 배지내Bacillus sp. CK-1배양액 1ml 첨가, 3 :LB 배지내 나노실버-II 25ppm 첨가 + E.coli O157:K88ac균용액 1ml 첨가, 4 : LB 배지내 나노실버-II 50ppm 첨가 + E.coli O157:K88ac균용액 1ml 첨가, 5 : LB 배지내 나노실버-II 25ppm 첨가 + Bacillus sp. CK-1 균용액 1ml 첨가, 6 :LB 배지내 나노실버-II 50ppm 첨가+Bacillus sp. CK-1 균용액 1ml 첨가), 1- 6(시간) : 제제 처리방법(경과시간)].
도 22는 실험예 7에 의하여 수행된 것으로 배양된 오염균에 대한 나노실버농도 및 개발제제 처리가 오염균 사멸에 미치는 농도 및 시간을 확인한 결과를 나타낸 사진이다(생존균에 따른 콜로니 수치 조사)[(1 : Ag25ppm투여구, 2 : Ag 30ppm투여구, 3 : Ag 50ppm투여구, 4 : 항충성 개샴푸: 항충성 개샴푸원액을 3차멸균수로 100배되게 희석한 후, 나노실버-II 25ppm 내지 50ppm 되게 첨가), 0 시간 : 나노실버-II 투여전 균수, 1 내지 16시간 : 나노실버-II 를 투여후 경과시간)].

Claims (6)

1) 계면활성제 수용액에 질산은(AgNO3)을 적가하고 교반하여 환원시키는 단계,
2) 상기 1) 단계에서 얻어진 혼합용액에 수산화나트륨 수용액을 첨가하면서 pH를 7로 조정하는 단계,
3) 상기 2) 단계에서 얻어진 혼합용액에 상기 1) 단계에서 사용한 계면활성제와 아스코르브산을 첨가하는 단계,
4) 상기 3) 단계에서 얻어진 혼합용액에 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 pH를 7로 조절하는 단계,
5) 상기 4) 단계에서 pH가 조절된 혼합용액을 증발 및 건조시키는 단계
를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 은나노입자의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 1) 단계의 계면활성제 수용액은 농도가 0.1 내지 5 M 범위인 것을 특징으로 하는 은나노입자의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 1) 단계의 질산은(AgNO3)은 계면활성제 수용액 중 0.1 내지 5 중량% 범위로 포함되는 것을 특징으로 하는 은나노입자의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 3) 단계의 계면활성제는 상기 2) 단계에서 얻어진 혼합용액 중 0.1 내지 5 중량% 범위로 첨가하는 것을 특징으로 하는 은나노입자의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 3) 단계의 아스코르브산은 상기 2) 단계에서 얻어진 혼합용액 중 0.1 내지 5 중량% 범위로 첨가하는 것을 특징으로 하는 은나노입자의 제조방법.
청구항 1 내지 5 중에서 선택된 어느 한 항의 방법으로 제조된 것으로, 5 내지 100 ㎚ 범위의 직경을 갖는 은나노입자가 1 내지 100 ppm 범위로 포함된 것을 특징으로 하는 세제용 첨가제.
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