KR20090132264A

KR20090132264A - 항암용 조성물

Info

Publication number: KR20090132264A
Application number: KR1020080058448A
Authority: KR
Inventors: 문애리; 김명옥; 황진선
Original assignee: 덕성여자대학교 산학협력단
Priority date: 2008-06-20
Filing date: 2008-06-20
Publication date: 2009-12-30
Also published as: KR101024171B1

Abstract

본 발명은 항암용 조성물, 보다 상세하게는 Ras 단백질의 하부 신호전달 경로에 관여하는 플로틸린 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 항암용 조성물은 암 증상의 예방, 치료 및 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

Ras, 플로틸린, 신호전달, 아폽토시스

Description

항암용 조성물{Anticancer Composition}

본 발명은 항암용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 플로틸린(flotillin) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

Ras 단백질은 세포가 성장하고 분화하는데 중요한 역할을 하는 21 kDa 크기의 단백질로서, 구아닌 뉴클레오타이드와 결합하여 구아노신 트리포스페이트(GTP)를 구아노신 다이포스페이트(GDP)로 가수분해하는 작용을 한다. 이와 같이 Ras 단백질은 세포 내의 특이적인 GTPase 회로를 조절하는 분자 스위치로 작용하므로 세포 신호전달계에서 매우 중요한 역할을 한다(Bourne, H. R., Sanders, D. A., McCormick, F., Nature, 1991, 349, 117).

암을 유발하는 대사경로는 다양하며, 그 중 하나는 비정상적으로 많은 'ras' 유전자의 단백질 산물이 활성화됨으로써 유발된다. 암 전이의 약 30% 정도가 비정상적으로 활성화된 Ras 단백질의 신호전달 경로에 의해 세포가 악성 표현형으로 변 화됨으로써 일어나는 것이라 추정된다. 인체에서 발생하는 몇몇 암 세포는 Ras 단백질의 12번째 아미노산 위치에서 돌연변이가 생긴 것이 관찰되는데, 이 돌연변이로 인해 Ras 단백질 고유의 GTPase 효소 활성이 저해되면 GTP가 계속적으로 결합되어 있는 상태가 되므로 비정상적인 성장 신호가 지속적으로 전달되게 된다. 이러한 신호 전달체계의 이상으로 발암성이 유발되는 것으로 보고되어 있다. 실제로 이들 발암성을 갖는 ras 유전자는 췌장암, 방광암, 폐암 및 피부암 등과 밀접하게 관련이 있는 것으로 알려져 있다(Bos, J. L., Cancer Res., 49, 4682, 1989).

Ras 유전자군에는 N-Ras (Neuroblastoma-Ras), H-Ras (Harvey-Ras) 및 K-Ras (Kirsten-Ras)의 3가지가 있고, 이들은 모두 189개의 아미노산으로 된 분자량 21 kDa의 단백질을 코딩한다. 상기 3가지 형태의 Ras 단백질은 아미노-말단의 85개 아미노산 서열은 동일하고 중간의 80개 아미노산 서열은 85% 상동성(homology)을 보이나 카르복시-말단의 서열은 상동성이 매우 낮다. Ras 단백질들은 조직 특이적으로 발생 과정에서 다르게 발현되며, 이들은 카르복시-말단 부위에 지방이 결합됨으로써 세포막에 부착된다. H-Ras 단백질에서 Cys¹⁸⁶에 파네실화(farnesylation)된 후 Cys¹⁸¹과 Cys¹⁸⁴에 팔미토일화(palmitoylation)가 일어나고, N-Ras 단백질은 Cys¹⁸¹ 한 곳에만 팔미토일화 부위를 갖고 있다고 알려져 있다. 다양한 카르복시-말단 서열로 인한 다른 세포막 부착성의 차이가 H-Ras, N-Ras, K-Ras 단백질에 의한 차별적인 세포활성 원인의 중요한 요인일 것으로 생각된다.

앞선 연구에서, 본 발명자들은 암전이 활성에 있어서 Ras 신호 전달 경로의 역할을 규명하기 위해 H-Ras 선택적 신호전달 경로와 N-Ras 선택적 신호전달 경로가 MCF10A 세포의 침윤성 및 이동성에 미치는 분자적 기전을 연구한 결과, H-Ras는 침윤성과 이동성을 유도하는 데 반해 N-Ras는 전혀 유도하지 않음을 밝혀낸 바 있다(Int. J. Cancer, 85:176-181, 2000; Cancer Res., 63:5454-5461, 2003). 이러한 결과는 MCF10A 세포에서 H-Ras 선택적인 신호전달 경로와 N-Ras 선택적인 신호전달 경로가 서로 다른 생물학적 전이 활성을 나타낸다는 것을 의미한다. 또한, Ras 신호전달 경로의 하위 신호 분자에 관한 선행연구에서는 H-Ras에 의해 p38 MAPK가 선택적으로 활성화되고, 이는 MMP-2의 발현에 영향을 미친다는 것이 보고된 바 있다(Cancer Res. 63:5454-5461, 2003). 그러나, 이러한 Ras 유전자의 암의 침윤성 및 전이성 조절에 관여하는 하위 신호전달 경로의 단백질에 대해서는 알려진 바가 많지 않다.

본 발명은 상기와 같은 Ras 신호전달 경로의 하위 단백질 중에서 암의 전이 및 침윤에 관여하는 특정 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 대한 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플로틸린 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 대한 억제제를 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

상기 억제제는 플로틸린 단백질에 특이적으로 결합하여 그 활성을 억제하거나, 플로틸린 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이로부터 전사된 mRNA 핵산의 발현을 특이적으로 억제하는 물질들을 제한없이 포함할 수 있으며, 플로틸린 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 예컨대 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일쇄 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체(chimeric antibody) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics), 또는 플로틸린 유전자에 특이적으로 결합하는 핵산 분자, 예컨대 플로틸린 유전자에 상보적으로 결합하는 siRNA 분자를 포함하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 플로틸린 단백질은 플로틸린 1 단백질인 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 플로틸린 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 가지는 것 이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 암은 일반적인 암 질환을 제한없이 포함하며, 바람직하게는 유방암, 위암, 결장암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 등과 같은 질환을 포함한다.

본 발명의 항암용 조성물은 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체로는 부형제 또는 희석제는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 등의 1종 이상 선택될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 바람직하게는 주사용으로 투여되며, 일례로 종양세포 또는 종양세포를 포함하는 개체에 1회 종양세포내 주사(imtrotumoral imjection)로 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여량은 투여 대상체의 상태, 질병의 종류, 병용되는 약물에 따라 달리 적용하는 것이 바람직하고, 이러한 투여량은 전임상 및 임상 1상을 통하여 결정될 수 있다.

본 명세서에 있어서, "항체"는 항원을 특이적으로 결합시키고 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 그의 단편으로부터의 골격 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 면역글로불린 유전자에는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역(constant region) 유전자, 및 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자가 포함된다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되며, 이것은 다시 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE의 면역글로불린 클래스를 정의한다. 천연적으로 존재하는 면역글로불린은 두개의 동일한 경쇄(약 24 kD) 및 두개의 동일한 중쇄(약 55 또는 70 kD)가 테트라머 (tetramer)를 형성하는 공통의 구조를 갖는다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 가변(V) 영역으로 공지되어 있으며, 각각의 쇄의 나머지의 더욱 보존된 불변(C) 영역으로부터 구별될 수 있다. 경쇄의 가변 영역 내에는 J 영역으로 공지된 C-말단 부분이 있다. 중쇄의 가변 영역 내에는 J 영역 이외에도 D 영역이 있다. 면역글로불린에서 아미노산 서열 변이의 대부분은 항원 결합에 직접적으로 관련되는 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역(complementary determining region, CDR)으로 공지된 V 영역 내의 3개의 별개의 위치로 제한된다. 아미노-말단으로부터 진행하여 이들 영역은 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지정된다. CDR은 더욱 보존된 골격 영역 (FR)에 의해서 제자리에 유지된다. 아미노-말단으로부터 진행하여 이들 영역은 각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 지정된다.

예시적인 면역글로불린의 구조적 유니트는 테트라머를 포함한다. 각각의 테트라머는 두개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 N-말단은 항원 인식을 주로 책임지는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 규정한다. 가변성 경쇄(VL) 및 가변성 중쇄(VH)라는 용어는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 의미한다.

항체는, 예를 들어 완전 면역글로불린으로서, 또는 다양한 펩티다제에 의한 분해에 의해서 생산된 잘-특정화된 다수의 단편으로 존재한다. 따라서, 예를 들어 펩신은 힌지(hinge) 영역에서 디설파이드 결합 아래에서 항체를 분해하여 그 자체가 디설파이드 결합에 의해서 VH-CH1에 경쇄 연결되는 Fab의 다이머인 F(ab)'²를 생성시킨다. F(ab)'₂는 온화한 조건 하에서 환원되어 힌지 영역에서 디설파이드 결합을 파괴시킴으로써 F(ab)'₂ 다이머를 Fab' 모노머로 전환시킬 수 있다. Fab' 모노머는 본질적으로 힌지 영역의 일부분을 갖는 Fab이다(Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993) 참조). 다양한 항체 단편은 완전 항체의 분해와 관련하여 규정되지만, 당업자라면 이러한 단편이 화학적으로, 또는 재조합 DNA 방법에 의해서 새로 합성될 수도 있음을 인식할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명에서 사용된 것으로 용어 항체는 또한 전체 항체의 변형에 의해서 생산된 항체 단편, 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 새로 합성된 것, 또는 파아지 디스플레이 라이브러리(phage display library)를 사용하여 동정된 것들을 포함한다(McCafferty et al., Nature, 348, 552-554, 1990 참조).

모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 제조를 위해서는 본 기술분야에서 공지된 어떠한 기술이라도 사용될 수 있다(Kohler ＆ Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975; Kozbor et al., Immunology Today, 4, 72, 1983; Cole et al., 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 1985 참조). "모노클로날" 항체는 단 일 클론으로부터 유도된 항체를 의미한다. 단일쇄 항체의 생산을 위한 기술(미국 특허 제 4,946,778호 참조)이 폴리펩티드를 생산하는데 적합할 수 있다. 또한, 유전자 도입 마우스(transgenic mice), 또는 그밖의 다른 포유동물과 같은 그밖의 유기체를 사용하여 인간화 항체를 발현시킬 수도 있다. 다른 한편으로, 파아지 디스플레이 기술을 사용하여 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 헤테로머성 Fab 단편을 동정할 수도 있다(McCafferty et al., Nature, 348, 552-554, 1990; Marks et al., Biotechnology, 10, 779-783, 1992) 참조).

"키메라 항체"는 (a) 불변 영역 또는 그의 일부분이 항원 결합 영역(가변 영역)과 상이하거나 변형된 클래스, 효과기(effector) 작용기 및/또는 종의 불변 영역, 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예를 들어 효소, 독소, 호르몬, 성장인자, 약물 등에 연결되도록 변형, 치환 또는 교환되거나; (b) 가변 영역 또는 그의 일부분이 상이하거나 변형된 항원 특이성을 갖는 가변 영역에 의해서 변형, 치환 또는 교환된 항체 분자이다.

"인간화 항체"는 인간에 대한 면역원성은 낮으면서 비-인간 항체의 반응성을 보유하는 항체이다. 이것은, 예를 들어 비-인간 CDR 영역을 보유시키고 항체의 나머지 부분들을 그들의 인간 대응물(counterpart)로 치환시킴으로써 수득될 수 있다(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44, 65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239, 1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28, 489-498, 1991; Padlan, Molec. Immun., 31(3), 169-217, 1994 참조).

"펩티도모방체" 및 "모방체"라는 용어는 천연적이거나 비-천연적으로 존재하는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 구조 및 기능적 특징을 갖는 합성 화학적 화합물을 의미한다. 펩티드 상동체는 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 약물로서 약제산업에서 통상적으로 사용된다. 이들 유형의 비-펩티드 화합물을 "펩티드 모방체" 또는 "펩티도모방체"라 부른다(Fauchere, J. Adv. Drug Res., 15:29, 1986; Veber and Freidinger TINS, p. 392, 1985; 및 Evans et al. J. Med. Chem. 30, 1229, 1987 참조). 치료에 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체를 사용하여 동등하거나 증진된 치료적 또는 예방적 효과를 제공할 수 있다. 일반적으로, 펩티도모방체는 관심있는 폴리펩티드에서 확인되는 것과 같은 패러다임(paradigm) 폴리펩티드(즉, 생물학적 또는 약물학적 활성을 갖는 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하지만, 예를 들어 -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH- (시스 및 트랜스), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- 및 -CH₂SO- 등과 같은 결합에 의해 임의로 치환된 하나 또는 그 이상의 펩티드 결합을 갖는다. 이러한 모방체는 온전히 아미노산의 합성, 비-천연 상동체로 구성될 수 있거나, 부분적으로는 천연 펩티드 아미노산이고 부분적으로는 아미노산의 비-천연 상동체인 키메라 분자이다. 모방체는 또한 천연 아미노산 보존적 치환을 이러한 치환이 모방체의 구조 및/또는 활성을 실질적으로 변화시키지 않은 한 어떠한 양으로도 포함할 수 있다. 예를 들어, 모방체 조성물이 관심있는 폴리펩티드의 적어도 하나의 결합 또는 효소적 활성을 수반할 수 있다면 이것도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

"siRNA"는 간섭을 야기시킬 수 있으며, 세포, 예를 들어 인간 세포를 포함하는 포유동물 세포, 및 신체, 예를 들어 인간을 포함하는 포유동물 신체에서 특정 유전자의 전사후 무증상(post-transcriptional silencing)을 야기시킬 수 있는 작은 간섭성 RNA를 의미한다. RNA 간섭 현상은 다양한 문헌에 개시되어 있다(Bass, Nature 411, 428-29, 2001; Elbahir et al., Nature 411, 494-98, 2001; Fire et al., Nature 391, 806-11, 1998; 및 WO 01/75164 참조). siRNA는 일반적으로 100개 보다 적은 염기쌍을 가지며, 예를 들어 약 30 bp 또는 그 보다 더 짧을 수 있으며, 상보적 DNA 가닥 또는 합성 방법을 사용하는 것을 포함하여 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서 만들 수 있다. 예시적인 siRNA는 29 bp, 25 bp, 22 bp, 21 bp, 20 bp, 15 bp, 10 bp, 5 bp 또는 대략 그 정도이거나 그들 사이의 정수까지의 bp를 가질 수 있다. 최적의 억제성 siRNA를 디자인하기 위한 도구에는 DNA엔진 인코포레이티드(DNAengine Inc.; Seattle, WA) 및 앰비온, 인코포레이티드(Ambion, Inc.; Austin, TX)로부터 입수가능한 것들이 포함된다.

한가지 RNAi 기술은 그 안에 센스 및 안티센스 서열이 공여체 및 수용체 스플라이싱(splicing) 영역에 의해 적절한 스플라이싱 배향에서 인트론 서열의 측면에 있는 영역에 배치되는 유전자 콘스트럭트(construct)를 사용한다. 다른 한편으로, 다양한 길이의 스페이서(spacer) 서열을 사용하여 콘스트럭트 내에서 서열의 자체-상보성 영역을 분리시킬 수도 있다. 유전자 작제물 전사의 과정 중에, 인트론 서열은 제거되어 센스 및 안티센스 서열 및 스플라이스 접합서열(splice junction sequence)이 결합하여 이중-나선 RNA를 형성할 수 있도록 한다. 그후, 선택된 리보뉴클레아제는 이중-나선 RNA에 결합하여 이것을 절단시킴으로써 특정한 mRNA 유전자 서열의 분해를 유도하는 사건들의 단계를 개시시키고, 특정 유전자를 무증상화시킬 수 있다.

"핵산"은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 단일나선 또는 이중나선 형태인 그의 폴리머를 의미한다. 이 용어에는 합성, 천연적으로 존재 및 비-천연적으로 존재하며, 참조 핵산과 유사한 결합특성을 가지며, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 공지의 뉴클레오티드 상동체 또는 변형된 골격구조 잔기 또는 결합을 함유하는 핵산이 포함된다. 이러한 상동체의 예에는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)가 포함되나, 제한되지는 않는다.

달리 언급되지 않는 한, 특정의 핵산 서열은 또한 내재적으로, 그의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 변성 코돈 치환) 및 상보적 서열 등을 포함한다. 구체적으로, 변성 코돈 치환은 하나 또는 그 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세번째 위치가 혼합된-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴으로써 이루어질 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19, 5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260, 2605-2608, 1985; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8, 91-98, 1994 참조). 용어 "핵산"은 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본 발명에서 아미노산 잔기의 폴리머를 언급함에 있어서 상호교환적으로 사용된다. 이 용어들은 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연적으로 존재하는 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 폴리머, 및 천연적으로 존재하는 아미노산 폴리머 및 비-천연적으로 존재하는 아미노산 폴리머에 적용된다.

용어 "아미노산"은 천연적 존재 및 합성 아미노산, 및 천연적으로 존재하는 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 상동체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 천연적으로 존재하는 아미노산은 유전자 코드에 의해서 코딩된 것, 및 후에 변형된 이들 아미노산, 예를 들어 하이드록시프롤린, 감마-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린 등을 포함한다. 아미노산 상동체는 천연적으로 존재하는 아미노산과 동일한 기본 화학구조, 즉 수소, 카르복시기, 아미노기 및 R기, 예를 들어 호모세린, 노르루이신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄에 결합된 알파 탄소를 갖는 화합물을 의미한다. 이러한 상동체는 변형된 R기(예를 들어, 노르루이신) 또는 변형된 펩티드 골격 구조를 갖지만, 천연적으로 존재하는 아미노산과 동일한 기본 화학구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학구조와는 상이한 구조를 갖지만, 천연적으로 존재하는 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 의미한다.

"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 양쪽 모두에 적용될 수 있다. 특정의 핵산 서열에 관하여, 보존적으로 변형된 변이체는 필수적으로 동일한 서열에 대한 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하거나, 그에 대한 아미노산 서열을 코딩하지 않는 이들 핵산을 의미한다. 유전자 코드의 변성으로 인하여, 기능적으로 동일한 다수의 핵산이 소정의 단백질을 코딩한다. 예 를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 모두가 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 하나의 코돈에 의해서 명시된 모든 위치에서 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변화시키지 않으면서 기술된 상응하는 코돈 중의 어떤 것으로도 변화될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 한가지 종인 "무증상 변이(silent variation)"이다. 여기에서 폴리펩티드를 코딩하는 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 무증상 변이를 또한 기술하는 것이다. 당업자들은 핵산 내의 각각의 코돈(통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)을 변형시켜 기능적으로 동일한 분자를 수득할 수 있음을 인식할 수 있을 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 무증상 변이는 각각의 기술된 서열에 내재하는 것이다.

아미노산 서열과 관련하여, 당업자는 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 비율의 아미노산을 변화시키거나, 부가하거나 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 각각의 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체"이며, 여기에서 변화는 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 제공한다는 것을 인식할 수 있을 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 본 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체(interspecies homolog) 및 대립인자에 추가되며, 이들을 제외시키지 않는다.

다음의 8가지 그룹 각각은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:

1) 알라닌 (A), 글리신 (G);

2) 아스파르트산 (D), 글루타민산 (E);

3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);

4) 아르기닌 (R), 라이신 (K);

5) 이소루이신 (I), 루이신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);

6) 페닐알라닌 (f), 티로신 (Y), 트립토판 (W);

7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및

8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M)

두개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 것은 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드에 대해 야기된 항체와 면역학적으로 교차 반응성이 있다는 것을 의미한다. 따라서, 폴리펩티드는 일반적으로, 예를 들어 두개의 펩티드가 단지 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우에 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 두개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지적은 두개의 분자 또는 그들의 보체가 후술하는 바와 같이 절박한 조건 하에서 서로에 대해 하이브리드(hybrid)화하는 것이다. 두개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지적은 동일한 프라이머를 사용하여 서열을 증폭시킬 수 있다는 것이다.

용어 "아폽토시스(apoptosis) 유도제"는 세포 유형에 접촉하는 경우에 적어도 하나의 세포 유형에서 아폽토시스를 유도하거나 촉진시키는 화합물을 의미한다. 예시적인 아폽토시스-유도제에는 예를 들어 SMAC, Bax, Bik, Bok, Bim, Bak, Bid, Noxa, Puma, Hrk, 또는 Bad; BH3, p53, TRAIL 리간드, Fadd, Myc 및 Mekk1, 신호 인식 입자 72 kD (SRP72), 카스파제-8, Bid, B 림프 티로신 키나아제 (BLK), 피루베이트 키나아제와 유사한 유전자 생성물, M2 이소자임(LOC148283), 글리코겐 신타아제 키나아제 3 알파(GSK3A), 가상 단백질 FLJ32312 (FLJ32312), 미토젠-활성화 단백질 키나아제 10 (MAPK10), TCF4; 전사인자 4, v-abl 아벨슨 쥐 백혈병 바이러스 종양유전자 상동체 2(arg, 아벨슨-관련 유전자)(ABL2), v-ros 조류 UR2 육종 바이러스 종양유전자 상동체 1 (ROS1) 및 v-myc 조류 골수세포종증 바이러스 종양유전자 상동체와 같은 효능제 또는 모방체; 및 26S 프로테아좀 억제제, c-플립(flip), NFκB 경로, IAP 족 구성원(예를 들어, XIAP, cIAP1, cIAP2, NAIP, MLIAP/리빈(Livin), 서바이빈(survivin)), 프로테아좀 경로 구성원(예를 들어, E1, E2 및 E3); 키나아제 PI3, Akt1, 2 및 3, Rip, Nik; CD40; Bcl2 족 구성원(예를 들어, Bcl2, Bcl-x1, A1, Mcl1), 유비퀴틴 컨쥬가제(conjugase) UbcH10, 오스테오프로테그린, 플렉신 B1 (PLXNB1), SET 도메인-함유 단백질 7 (SET7), 미토젠-활성화 단백질 키나아제 키나아제 키나아제 5 (MAP3K5), STE20-유사 키나아제(JIK), MAP 키나아제-상호작용성 세린/트레오닌 키나아제 1(MKNK1), 추정 소포체 다중통과 막횡단 단백질(RFT1), 5-키나아제, I형, 감마 (PIP5K1C), 미토젠-활성화 단백질 키나아제-활성화 단백질 키나아제 2 (MAPKAPK2), 미토젠-활성화 단백질 키나아제 키나아제 5 (MAP2K5), 사이클린-의존성 키나아제 6 (CDK6), 액티빈 A 수용체 II형-유사 1 (ACVRL1), 가드너-라쉬드 고양이 육종 바이러스(v-fgr) 종양유전자 상동체 (FGR), 가상 단백질 FLJ21802 (FLJ21802), 근육, 골격, 수용체 티로신 키나아제(MUSK), 염색체 20 오픈 리딩 프레임 88 (C20orf88), 벤즈이미다졸에 의해서 억 제되지 않는 출아 1 (효모 상동체)(BUB1), 리보솜 단백질 S6 키나아제, 90kD, 폴리펩티드 5 (RPS6KA5), v-yes-1 야마구찌 육종 바이러스 관련 종양유전자 상동체(LYN), 미토젠-활성화 단백질 키나아제 7 (MAPK7) 및 v-akt 쥐 흉선종 바이러스 종양유전자 상동체 1 (AKT1), PAK1 (예를 들어, 이하의 P21(CDKN1A)-활성화 키나아제 1, PAKA, P65-PAK, P68-PAK, 알파-PAK, MUK2, PAK1B (p21 활성화 키나아제 1B), P21/Cdc42/Rac1-활성화 키나아제 1 (효모 Ste20-관련), Cdc42/Rac 효과기 키나아제 PAK-A, 단백질 키나아제 MUK2 중의 어떤 것을 포함), nsurf, stk12 (예를 들어, 세린/트레오닌 키나아제 12, 오로라(aurora)-관련 키나아제 2, 오로라/IPL1-유사 키나아제 2, AIK2, ARK2, AIM-1 및 AIMI을 포함), 아폽토시스 신호-조절 키나아제 1 (Ask1), TLK1 (예를 들어, 기탁번호 NM_012290), NLK (예를 들어, 기탁번호 NM_016231), GRAF (예를 들어, 기탁번호 NM_015071), GCK (예를 들어, 기탁번호 NM_000162), ERK5 (예를 들어, 기탁번호 NM_002749), FGR (예를 들어, 기탁번호 NM_005248), ACVRL1 (예를 들어, 기탁번호 NM_000020), MEKK5 (예를 들어, 기탁번호 NM_002757), PIP5KIC (예를 들어, 기탁번호 XM_047620), MAPKAPK2 (예를 들어, 기탁번호 NM_004759), RFT1 (예를 들어, 기탁번호 NM_052859), MKNK1 (예를 들어, 기탁번호 NM_003684), PLXNB1 (예를 들어, 기탁번호 NM_002673)과 같은 길항제 또는 억제제가 포함된다. 다른 예시적인 아폽토시스 유도제에는 예를 들어, DR5 및 DR4 발현 및/또는 안정성을 증진시키는 약제, 카스파제 활성 또는 안정성을 증진시키는 약제, 및 DNA 손상반응을 유도하거나 증진시키는 약제가 포함된다. 상기 리스트의 효능제 또는 모방체에는 유전자 생성물 그 자체가 포함되며, 예를 들어 p53 은 p53 효능제이다. 길항제에는 활성을 직접적으로 억제하는 약제, 및 표적분자 mRNA (예를 들어, siRNA) 또는 단백질의 발현 또는 안정성을 감소시킴으로써 활성을 간접적으로 억제하는 약제가 포함된다.

단백질의 "발현을 방지하거나 감소시키는" 약제는 예를 들어, 결합하여 자극을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 발현을 감소, 방지 또는 지연시키는 화합물을 의미한다. 단백질의 발현은 적어도, 예를 들어 5％, 10％, 25％, 50％, 75％, 90％, 95％ 또는 100％까지 감소될 수 있다.

플로틸린 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 대한 억제제를 포함하는 본 발명의 항암용 조성물은 암 증상의 예방, 치료 및/또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험 재료

1. 시약

실험에 사용한 화학약품 및 배지는 하기 회사에서 구입하여 사용하였다.

(1) 시그마 사(Sigma Chemical Co., St.Louis,Mo,USA)

EGF (Epidermal Growth Factor), 콜레라 내독소, 히드로코르티손, 암포테리신 B (Amphotericin B), 트리판 블루, 글리세롤, DTT, EDTA (Ethylene Diamine Tetracetic Acid), 트리즈마 베이스(Trizma base), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), 아크릴아미드/비스-아크릴아미드, 나트륨 비설페이트(Sodium bisulfate), 암모늄 퍼설페이트(A㎜onium persulfate), 트윈 20, BSA (Bovine Serum Albumin), 브로모페놀 블루, 항-β-액틴 항체, 트리톤 X-100, PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), HEPES, 우레아(Urea), 티오 우레아, DTT, CHAPS, 암모늄 설페이트, 암모늄 비카보네이트, 클로로포름, 이소프로필 알코올, DEPC 용해수.

(2) Gibco BRL 사(Grand Island, NY, USA)

DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F12), 인슐린, 말 혈청, 송아지 혈청, P-S (Penicillin-Streptomycin), T-E (Trypsin-EDTA), L-글루타민, PBS (Phosphate Buffered Saline), 나트륨 비카보네이트.

(3) 바이오라드(BioRad) 사

트리톤 X-100, TEMED (N,N,N,N'-tetra-methyl ethylenediamine), 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue) G-250

4) 아머샴 바이오사이언스(Amersham Biosciences)

IPG 버퍼, IPG 스트립(3-10NL pH gradient), 건조 스트립 커버 오일(Dry strip cover oil), IAA (iodoacetamide)

5) 덕산종합과학

에탄올, NaCl, 글리신, Na₂HPO₄,KH₂PO₄, 아세트산, 메탄올, MgCl₂, 수크로오스, KCl, 인산

6) 기타

프로테아제 억제제 칵테일(Roche, Germany), BCA 단백질 분석 시약(Pierce, USA), 니트로셀룰로오스막, 무지개 크기 마커, X-선 필름(Kodark), TCA, 머캅토에탄올, 아세톤, 시퀀싱 등급 변형 트립신(Promega), MgCl₂ (Takara), DNTP (Takara), Taq 중합효소(Clontech), 트리졸(Invitrogen), 수퍼스크립트 Ⅲ First-strand (Invitrogen), 항-카베올린-1 항체(BD sciences), 항-H-ras 항체(Santa cruz), 항-N-ras 항체(Santa cruz), 항-플로틸린-1 항체(BD sciences), 항-사이토케라틴(cytokeratin) 7 항체(Chemicon international), 항-VDCA/porin 항체(abcam), 항-TCP1 항체(ABR), 항-Gβ1 항체(Santa cruz).

2. 실험 기자재

분광광도계(Beckman, DU650), 초원심분리기(Beckman instrument, LE-80), 초원심분리기 SW-41 Ti 로터(Beckman instrument, Palo Alto, USA), 폴리-알로머 초원심분리기 튜브(Beckman instrument, Palo Alto, USA), 초음파기(Sonicator, Branson ultrasonic corporation, Danbury, USA, Sonifier 150), 항온조 순환기(water bath circulator, 존샘, JS-WBP-170P), 미세원심분리기(Vision, VS- 15000), 디지털 건조 오븐(존샘, JS-OV,100), 원심분리기(한일, MF600R), 미니셀 키트(Novex Xcell Ⅱ, E19001), 볼텍스 믹서(Vision, KMC1300V), 디지털 항온 배양기(존샘, JS-IN-180), 미세원심분리기(한일, MICRO17R), 파워서플라이(Biorad, Power PAC 300), pH 측정기(Orion, model 420A), 열판(Corning), 전기 저울(electronic balances, OHAUS), 초저온냉동고(deep freezer, 일신), 자동 CO₂ 항온 배양기(존샘,CO2-AT-100), 원심분리기(Eppendrof), 혈구계산기(hemacytometer,superior), 전기영동 이미지 분석 시스템(Vilber Lourmat), 겔 카세트(Invitrogen), PCR 열 순환기(Takara biomedicals), SL-20 DNA 이미지 판독기(DNA Image visualizer, Seoulin Scientific Co., Ltd.), MultiPhor^TM (GE Healthcare), 재팽창 트레이(Re-swelling tray, GE Healthcare), 농도구배 형성기(Gradient former, Bio-Rad, Model 385), 오비탈 교반기(Orbital shaker), Protean Ⅱ xi 멀티셀(Bio-Rad), 멀티카세팅 챔버(Bio-Rad), 스캐너(Bio-Rad, GS800), 이미지 마스터 플래티늄 5 (GE Healthcare), 스피드 백(Speed Vac, Heto), Voyager DE-PRO MALDI-TOF 매쓰 분광광도계(Biosystems).

세포주 및 배양조건

1. MCF10A 세포

MCF10A 세포(Soule HD, et al., Cancer Res. 50, 60756086, 1990 참조)는 5% 말 혈청, 0.5 ㎍/㎖ 히드로코르티손, 10 ㎍/㎖ 인슐린, 20 ng/㎖ EGF, 0.1 ㎍/㎖ 콜레라 내독소, 100 units/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 0.5 ㎍/㎖ 암포테리신 B를 첨가한 DMEM/F12 배지를 사용하여 5% CO₂를 함유한 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다.

2. H- Ras MCF10A 세포 및 N- Ras MCF10A 세포

H-Ras 세포는 침습성의 특징을 나타내는 등 암세포의 성질을 가지고 있으나 N-Ras 세포는 이동성 및 침습성을 가지고 있지 않은 세포로서(Moon et al., 2000), H-Ras MCF10A 및 N-Ras MCF10A 세포는 코딩되는 아미노산의 12번째 단백질이 Gly에서 Asp로 바뀐 H-Ras (pBW 1413)와 변이 N-Ras (pBW 1775)가 들어간 레트로소날 벡터(retronal vector)를 정상 MCF10A 세포에 형질도입하여 제조하였다(Soule HD, et al., Cancer Res. 50, 60756086, 1990 참조). 이들 세포는 MCF10A 세포와 동일한 조건 하에서 배양하였다.

실시예 1. 2차원 전기영동 (2- DE ) 샘플의 제조

<1-1> 리피드 래프트(lipid raft)의 제조

2차원 전기영동을 하기 위한 리피드 래프트의 제조 방법은 Bae 등의 논문을 참고하였다(Bae TJ, et al, Proteomics 4, 113, 2004). 구체적으로, MCF10A, H-Ras MCF10A 및 N-Ras MCF10A 세포를 150 ㎜ 배양 접시(90 plates 또는 300 ㎕)에 90% 컨플루언스(confluence)로 자랐을 때, 혈청이 제거된 배지로 17시간동안 단식(starvation)시켰다. 차가운 1X PBS, 1/2X PBS, 1/4 PBS로 세척한 후, 스크레이 퍼(scrapper)로 세포를 긁어서 15 ㎖ 튜브에 담은 후, 1,200 rpm에서 5분동안 원심분리하여 펠렛(pellet)만 남기고 제거하였다. 300 ㎕ 펠렛에 1% 트리톤 X-100 용해 버퍼(1% Triton X-100, 25 mM HEPES-HCl pH 6.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 프로테아제 억제제 칵테일1 tab) 700 ㎕를 넣고 재부유하였다. 초음파기를 이용하여 30 스트록 초음파처리한 후 4℃에서 30분동안 배양시켰다. 혼합 파쇄물(mix lysate)과 동일한 부피(1㎖)의 80% 수크로오스 쿠션 용액(Sucrose cushion: 80%, 30%, 5% (W/V) sucrose, 25 mM HEPES-HCl pH 6.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA)을 최종 40% 수크로오스 농도구배로 넣고, SW 41 로터 12 ㎖ 폴리-알로머 초원심분리기 튜브에 옮겼다. 그 위에 30% 수크로오스 쿠션 용액 6.5 ㎖, 5% 수크로오스 쿠션 용액 3.5 ㎖을 넣어 수크로오스 농도구배를 만들었다. SW 41 로터를 이용하여 4℃에서 39,000 rpm으로 20시간동안 원심분리하였다. 30%와 5% 사이에 리피드 래프트층이 생겼는데 이 층을 1 ㎖씩 분획하여 12개의 분획을 만들었다. 분리된 리피드 래프트층을 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 리피드 래프트 마커인 카베올린(caveolin)-1의 발현을 관찰하였다. 그 결과, 12개의 분획 중에서 4-7번 분획에서 21 kDa 크기의 카베올린-1이 발현하는 것을 확인하였다(도 1). 상기 4-7번 분획을 이후의 실험에 사용하였다.

<1-2> 리피드 래프트 분획의 세척

리피드 래프트 분획을 15 ㎖ 튜브에 모은 후, 세척 버퍼(25 mM HEPES-HCl pH 6.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF) 10 ㎖로 희석하여 4℃에서 25,000 rpm으로 30분간 원심분리하였다. 펠렛만 남기고 상층액을 버린 후, 펠렛 2-DE용 용해 버퍼(9 M 우레아, 2 M 티오 우레아, 100 mM DTT, 2% CHAPS, 2% IPG 버퍼, 1 mM EDTA, 프로테아제 억제제 칵테일 1 tab) 150 ㎕ 넣고 초음파 처리한 후 4℃에서 30분동안 배양하였다. Bradford의 방법을 이용하여 리피드 래프트를 정량하였다(Bradford et al., Anal. Biochem. 72, 248-254, 1976; Zor and Selinger et al., Anal. Biochem. 236, 302-8, 1995).

<1-3> TCA/아세톤 침전

샘플 100 ㎕와 차가운 TCA 버퍼(10% TCA, 아세톤 내의 0.07% 머캅토에탄올) 400 ㎕ (샘플 : TCA 버퍼 = 1 : 4)를 첨가하여 -20℃에서 1시간 방치(20분에 한번씩 볼텍싱)하였고, 4℃에서 14,000 rpm으로 5 내지 10분동안 원심분리하였다. 차가운 아세톤 1 ㎖를 첨가하고 5 내지 10 스트록 초음파 처리하였다. 4℃에서 14,000 rpm으로 5 내지 10분 정도 원심분리하여 상층액을 버리고 펠렛만 남겼다. 그 후 2-DE용 용해 버퍼 50 내지 60 ㎕ 정도를 넣어 펠렛을 용해시켰다. Bradford 방법으로 리피드 래프트를 정량하였다.

실시예 2. 2차원 전기영동(2- DE )

<2-1> 등전초점(Isoelectric Focusing, IEF)

<2-1-1> IPG 겔 스트립의 재수화(18 ㎝ IPG 스트립, pH 3-10NL)

최종 부피가 400 ㎕이 되도록 재수화 버퍼(8 M 우레아, 2% CHAPS, 0.5% IPG 버퍼(pH 3-10NL), 0.002% 브로모페놀 블루, 100 mM DTT)로 농도가 800 ㎍가 되도록 샘플을 희석한 후, 샘플을 재팽창 트레이에 (+)극 부분부터 아래로 벽면을 따라 골 고루 채웠다. 18 ㎝ IPG 스트립을 사용 직전에 -10℃에서 꺼내어 스트립의 테이프를 핀셋으로 벗겨내고 gel-side-down 되도록 하여 서서히 거품이 생기지 않도록 덮어 씌웠다. 수평을 유지하고, 그 위에 커버 유체 오일(cover fluid oil)을 2.5 ㎖ 정도 덮어 샘플의 증발을 방지한 후 14시간동안 겔에 샘플이 흡수되도록 실온에서 방치하였다.

<2-1-2> IPG 스트립의 IEF

재수화된 스트립을 gel-side-up 되도록 하여 홀더에 놓은 후, 종이 심지(paper wick)를 3차 증류수에 적당히 적신 후 겔이 닿도록 올려놓고, 그 위에 전극을 올려놓아 전류가 흐르도록 하였다. 홀더에 커버 유체 오일을 한 레인 당 7-8 ㎖ 정도가 되도록 총 108 ㎖를 채웠다. IEF의 조건은 3,500 V부터 총 80,000 총 전압 시간(total voltage hour, Vh)(300 Vh at 100V, 600Vh at 600V, 1,000Vh at 1,000V, 2,000Vh at 2,000V,total 80,000Vh at 35,000V)이 되도록 IEF를 수행하였다. 이때, IEF 하는 동안에는 20℃를 유지하였다.

<2-2> 2차 전기영동

<2-2-1> 스트립 평행화(Strip equilibration)

IEF가 끝난 후 스트립 홀더에서 스트립을 꺼내어 핀셋으로 겔이 없는 부분을 잡고 오일을 제거하기 위해 3차 증류수로 세척하였다. 평행화 튜브에 1% DTT가 포함된 평행화 버퍼(50 mM Tris pH 8.8, 6 M 우레아 30% 글리세롤, 2% SDS, 0.002% 브로모페놀 블루)를 10 ㎖ 넣고 교반기 위에서 10분동안 평행화하였다. 버퍼를 제거한 후, 2.5% IAA (iodoacetamide)가 포함된 평행화 버퍼 10 ㎖를 넣고 10분동안 평행화하였다.

<2-2-2> 2차원 겔 전기영동

두 번의 평행화를 끝낸 후, 평행화 튜브에서 스트립을 빼내어 3차 증류수로 평행화 튜브를 제거하였다. 9-17% 농도구배의 SDS-PAGE 겔 위에 올려놓은 후 겔과 스트립 사이에 바울이 형성되지 않도록 조심스럽게 밀어 넣었다. 종이를 5 ㎜ 크기로 잘라 단백질 표준 마커 15 ㎕를 로딩(loading)한 후 스트립과 마찬가지로 겔 위에 올려놓았다. 아가로즈 실링 용액(1X SDS 전기영동 버퍼, 1.5 M, 0.5% 아가로즈, 0.002% 브로모페놀 블루)을 이용하여 스트립 부분을 완전히 실링하였다. 온도를 10℃로 유지하면서 40 mA/겔로 전기영동하였다.

<2-2-3> 시각화(쿠마시 블루 염색)

고정 용액(40% (v/v) 메탄올과 5% (v/v) 증류수 내의 인산) 200 ㎖을 넣어 분리된 단백질을 고정시킨 후, 고정 용액을 버리고 쿠마시 블루 G-250 염색 용액(17% (w/v) 암모늄 설페이트, 3% (v/v) 인산, 34% (v/v) 메탄올, 0.1% (w/v) 증류수 내의 쿠마시 블루 G-250)을 200 ㎖ 정도 넣고 밤새 방치하였다. 쿠마시 블루 G-250 염색 용액을 제거한 후, 증류수로 4시간정도(3회 이상) 세척하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

<2-3> 이미지 분석

도 2에 나타난 결과를 이미지 마스터 플래티늄 5 이미지 분석 프로그램을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 577개의 단백질이 전이성 HRas MCF10A와 비전이성 MCF10A 및 N-Ras MCF10A 세포에서 확인되었다. 그 중 35개의 스폿(spot)이 전이성 H-Ras MCF10A 세포에서 증가하는 경향을 보였다(도 3).

<2-4> MALDI-TOF, MALDI-TOF/TOF-MS 분석 및 펩티드 매쓰 핑거프린팅(fingerprinting)

H-Ras에서 증가된 35개의 스폿에 대해 MALDI-TOF, MALDI-TOF/TOF-MS 분석을 수행하였다(Shevchenko A, et al., Anal Chem. 68(5), 8508, 1996 참조). 트립틱 펩티드는 조 등의 방법을 참고하였다(Cho SY, et al., Proteomics. 2(9), 110413, 2002). 매쓰 분석은 Voyager DE-PRO MALDI-TOF 매쓰 분광광도계로 분석하였다. 단백질은 MS-Fit (http://prospector.ucsf.edu), MASCOT (http://www.Matrixscience.com/searsh_form_select.html), ProFound (http://29.85.19.192/profound_bin/WebProFound.exe)을 이용하여 펩티드 매쓰 맵을 확인하였고, Swiss-Prot (version 44.1)와 GenBank에서 단백질 데이터베이스를 찾았다. MS 분석 후 선별된 28개의 스폿에 대한 MALDITOF/TOFMS 분석을 수행하였으며, 그 결과 24개의 단백질을 확인하였다(표 1). 도 4a 및 도 4b는 MALDITOF/TOFMS 분석으로 확인된 24개의 단백질의 스폿 이미지를 확대한 것이다. 확대한 스폿 이미지를 통하여 24개의 단백질이 MCF10A 및 NRas MCF10A 세포에 비해 HRas MCF10A 세포에서 단백질의 발현이 증가되는 것을 확인하였다(표 1).

실시예 3. 웨스턴 블롯 분석

100 ㎜ 배양 접시에 세포를 키운 후 혈청이 제거된 배지에서 24시간동안 단식시켰다. 차가운 PBS로 세척한 후, 용해 버퍼(0.5% 트리톤 X-100, 0.15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 25 mM NaF, 20 mM EDTA, 1 mM DTT, 프로테아제 억제제 칵테일을 포함하는 1 mM Na₃PO₄) 500 ㎕를 넣어 세포를 떼어내었고, 1.5 ㎖ 튜브로 옮겨 26GX 주사바늘로 분쇄한 세포와 리피드 래프트 분획을 준비하였다. Bradford법을 이용하여 단백질을 정량(Beckman, DU650)한 후, 동량의 단백질을 12% SDS-PAGE에 전기영동하였다. 전기영동 후 전개된 단백질을 모세관 현상을 이용하여 PVDF 막으로 옮겨서 5% 탈지유로 블로킹하였다. 항-카베올린-1 항체, 항-H-ras 항체, 항-N-ras 항체, 항-플로틸린-1 항체, 항-사이토케라틴 7 항체를 부착시켜 하루 동안 반응시켰다. PBST로 세척한 다음 2차 항체를 붙여준 후 개선된 화학발광(Enhanced chemiluminescence, ECL) 검출 시스템(Amersham-Pharmacia, Buckinghamshire, UK)을 이용하여 1분 동안 반응시켰다. 이후 X-선 필름에 노출시켜 단백질의 발현 정도를 관찰하였다. 그 결과, 5가지 단백질 중에서 사이토케라틴 7은 발현 정도의 차이가 나타나지 않은 반면, 플로틸린-1은 MCF10A와 NRas MCF10A에 비해 HRas MCF10A 세포에서 증가하는 것을 확인하였다(도 5).

실시예 4. RT - PCR

세포를 6웰 배양 접시에서 혈청이 제거된 배지로 17시간동안 절식시킨 후 차가운 PBS로 세척하였다. 세포에 Trizol 500 ㎕을 첨가하여 RNA를 추출한 후 미세튜브에 옮겨 볼텍싱하였고, 실온에서 5분동안 배양시켰다. 반응 후 클로로포름 200 ㎕를 첨가하여 섞은 후 실온에서 2분동안 배양시켰다. 4℃에서 12,000 rpm으로 15분동안 원심분리한 후, 페놀/클로로포름층을 제외하고 투명한 상층액을 새 튜브에 옮겼다. 상층액에 이소프로필 알코올 0.5 ㎖을 첨가하여 볼텍싱한 후 실온에서 10분동안 배양하였고, 4℃에서 12,000 rpm으로 15분동안 원심분리하였다. 펠렛만 남기고 상층액을 버린 후, 펠렛을 세척 버퍼(에탄올 75%, 0.1% DEPC 용해수 25%) 1 ㎖을 첨가하고 섞어주었다. 4℃에서 8,000 rpm으로 5분동안 원심분리하였고, 상층액을 버린 후 펠렛을 공기중에서 건조시켰다. 펠렛을 0.1% DEPC 용해수 15 ㎕로 용해시켰다. 1.2% 아가로즈 겔로 전기영동하여 RNA를 확인하였다.

RNA 확인 후 정량하여 cDNA를 합성하였다. 구체적으로, 4 ㎍ 총 RNA와 Oligo dT 1 ㎕, 2.5 mM dNTP 1 ㎕를 넣고 65℃에서 5분동안 반응한 후, 1분동안 얼음에 방치하였다. 그런 다음 10X RT 버퍼 2 ㎕, 0.1M DTT 2 ㎕, RNAse out 1 ㎕, RT-Superscript Ⅲ 1 ㎕, 25 mM MgCl₂ 4 ㎕를 첨가하여 50℃에서 60분간, 75℃에서 15분간 반응시켰다. 합성된 cDNA를 PCR로 증폭(10X PCR buffer 1 ㎕, 25 mM MgCl₂ 1 ㎕, 2.5 mM DNTP 1 ㎕, primer Forward 1 ㎕, primer Reverse 1 ㎕, cDNA 1 ㎕, Taq 중합효소 0.5 ㎕, 0.1% DEPC 3.5)하였으며, 이때 PCR 조건은 94℃ 5분, 35 사이클(94℃ 30초, 55℃ 45초, 72℃ 45초), 72℃ 7분이었으며, 증폭된 PCR 생성물은 1.2% 아가로즈 겔로 전기영동하여 확인하였다. 어닐링 온도와 예상되는 생성물의 크기 및 프라이머 서열은 표 2에 나타내었다.

스폿 번호	이름	예상 크기 (bp)	어닐링 온도(℃)	염기서열	서열번호
11	G 단백질 b1	203	55	전방: cag act cca ggc ttc tcg tc	3
				후방: gtt ccc ctc acg agt ttt ca	4
19	TCP 1	271	55	전방: ggt gca acc atc ctg aag tt	5
				후방: ggc aat ctc ttc cca gtt ca	6
22	KRT 7	259	55	전방: agg aga gcg agc aga tca ag	7
				후방: aag tcc tcc acc aca tcc tg	8
24	por	233	55	전방: cag tgc caa atc aaa gct tg	9
				후방: ttg cag aaa tgg aag cag tg	10
32	플로틸린-1	190	55	전방: aag cct tcc agc tgt acc aa	11
				후방: tct ggc agg cga gtt aga at	12

그 결과, 사이토케라틴 7은 MCF10A, HRas MCF10A 및 NRas MCF10A 세포에서 모두 같은 레벨로 증폭되었다. 그러나, 플로틸린-1은 HRas MCF10A 세포에서 두 세포에 비해 더 많이 증폭되었음을 확인하였다. 따라서, 전이성 HRas MCF10A 세포에서 전이와 연관성이 있는 플로틸린-1 유전자가 과발현되는 것을 확인하였다(도 6).

실시예 5. 플로틸린 siRNA 를 이용한 H- Ras 세포의 침윤성 및 이동성 변화

<5-1> 플로틸린-1의 억제

플로틸린-1의 siRNA는 서열번호 13으로 기재되는 염기서열을 가지며, 인비트로젠(Invitrogen, carlsbad, CA) 사에 의뢰하여 합성하였다. 이때 Stealth RNAi (Invitrogen)를 음성 대조군으로 사용하였다. 형질전환은 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 이용하여 수행하였다. 구체적으로, 6-웰 플레이트에 세포를 1.5X 10⁵ 세포/웰의 농도로 도말하여 50% 컨플루언트하게 배양한 후 PBS로 2회 세척하여 혈청을 제거하였다. 이후 플로틸린-1에 대한 siRNA 또는 음성 대조군과 리포펙타민 2000 혼합액을 넣고 6시간동안 배양한 후 MCF10A 세포 배양용 완전 배지(complete media)(5% 말 혈청, 0.5 ㎍/㎖ 히드로코르티손, 10 ㎍/㎖ 인슐린, 20 ng/㎖ EGF, 0.1 ㎍/㎖ 콜레라 독소, 100 units/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 0.5 ㎍/㎖ 암포테리신 B를 포함하는 DMEM/F12 배지)로 교체해주었고, 다시 18시간 이상 배양하였다.

<5-2> 면역블롯 분석

면역블롯 분석으로 siRNA 처리에 의한 녹다운(knockdown) 효과를 확인하였다. 구체적으로, 형질전환된 세포에 용해 버퍼(50 mM Tris.Cl pH 6.8, 2% SDS, 1 mM EDTA, 100 mM DTT, 프로테아제 억제제) 0.25 ㎖ 넣어 세포를 용해시켰고, 주사바늘을 이용하여 세포를 완전히 분쇄하였다. Bradford 방법을 이용하여 단백질을 정량하였다. 동량의 단백질을 5분동안 95℃ 이상으로 가열하고 다시 5분 동안 얼음에 넣어 냉각시킨 후 12% SDS-PAGE 겔에 100 V로 전기영동하였다. 이후, 분리된 단백질을 PVDF 막으로 옮겨서 5% 탈지유로 블로킹하였다. 항-플로틸린-1 항체를 부착시켜 4℃에서 하루동안 반응시키고 PBST로 세척하였다. 2차 항체를 결합시킨 후 ECL (Enhanced chemiluminescence) 검출 시스템(Armersham-Pharmacia Buckinghamshire, UK)을 이용하여 1분동안 반응시켰고, X-선 필름에 노출시켜 단백질의 발현 정도를 관찰하였다. 그 결과 siRNA에 의해 플로틸린-1이 녹다운된 것을 확인하였다(도 7의 A).

<5-3> 젤라틴 자이모그램(Zymogram)분석

문 등(Moon et al., Int. J. Cancer. 85, 176181, 2000)의 방법으로 수행하였다. 구체적으로, 플로틸린-1에 대한 siRNA로 형질전환시킨 세포를 혈청이 제거된 배지에서 48시간동안 배양한 후, 상층액을 취해 3000rpm으로 10분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 상등액만 취하여 BCA 시약(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 단백질을 정량하였다. 이를 위하여, 동량의 단백질에 4x 램나이(laemmmli) 샘플 버퍼(100 mM Tris-HCl, pH 6.8, 8%(w/v) SDS, 30% 글리세롤 (w/v), 8% (v/v) β-메르캅토에탄올, 0.04% (w/v) 브로모페놀 블루)를 넣고 15분간 실온에서 반응시킨 후, 1 ㎎/㎖의 젤라틴을 함유한 10% SDS-PAGE 겔에 100V로 약 1시간 30분가량 전기영동하였다. 겔을 꺼내어 2.5% Triton X-100으로 30분간 3회 세척하고, 다시 5 mM Tris-HCl로 15분간 세척한 후, 상기 버퍼로 37℃에서 하룻밤동안 반응시켰다. 다음날 0.5% 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250으로 염색하고, 10% 아세트산으로 탈색하였다. 이 때 전체적인 바탕은 푸른색을 나타내며, 흰색 부분이 젤라티나제(gelatinase)가 작용한 부분을 나타낸다. 그 결과, 플로틸린-1을 녹다운시키면 하류 단백질인 MMP-2가 감소하는 것을 확인하였다(도 7의 B).

<5-4> 시험관내 침윤성 분석

시험관내 침윤성 분석은 문 등의 기술한 방법의 방법(Moon et al., Int. J. Cancer. 85, 176181, 2000)에 따라 지름이 6.5 ㎜이고 기공(pore)의 크기가 8.0 ㎛인 24-웰 트랜스웰 유닛(transwell unit)을 사용하여 수행하였다. 먼저, 필터의 바깥쪽에 0.5 ㎎/㎖의 타입 I 콜라겐을 코팅하고 공기 중에서 1시간 정도 건조시켰다. 건조가 끝나면 안쪽 부분에 0.5 ㎎/㎖의 재구성된 기저막 물질(Matrigel)로 코팅하였다. 24-웰의 바닥에는 0.1%의 BSA를 함유한 배지를 600 ㎕ 넣고, 트랜스웰 안쪽에는 세포(5x10⁴)를 혈청이 제거된 배지 100 ㎕에 잘 혼합하여 넣었다. 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 17시간동안 배양한 후, 메탄올에 1분간 침지시켜 고정시켰다. 10분동안 헤마톡실린(hematoxylin)으로 세포막을 염색하였고, 다시 에오신(eosin)으로 4분동안 핵을 염색하였다. 필터 안쪽 부분을 면봉으로 닦아 남은 세포를 모두 제거하고 한 시간 가량 실온에서 건조시킨 후, 그 필터를 잘라내어 자일렌(xylene)에 넣어 불순물을 제거하였다. 이를 슬라이드 글라스에 놓고, 그 위에 카나다 발삼(Canada balsam) 한 방울을 떨어뜨린 후, 커버 글라스를 덮어 현미경으로 관찰하였다. 400배율 현미경으로 임의의 13곳에서 기공을 통과한 세포 수를 세어 평균을 내었다. 그 결과, 플로틸린-1에 대한 siRNA를 처리한 경우 기공을 통과한 세포의 수가 50% 정도 감소하였으며, 이로부터 형질전환 세포의 침윤성이 현저하게 줄어든 것을 확인하였다(도 7의 C).

<5-5> 트랜스웰을 이용한 시험관내 이동성 분석

지름이 6.5 ㎜이고 기공의 크기가 8.0 ㎛인 폴리카보네이트 필터를 갖는 24-웰 트랜스웰 유닛을 사용하여 시험관내 이동성 분석을 수행하였다. 구체적으로, 필터의 바깥 부분을 0.5 ㎎/㎖의 타입 I 콜라겐으로 코팅한 후 공기 중에서 1시간 동안 건조시켰고, 24-웰의 바닥에는 0.1%의 BSA를 함유한 배지 600 ㎕를 넣고, 트랜스웰의 안쪽에는 세포(5x10⁴)를 혈청이 제거된 배지 100 ㎕에 잘 혼합하여 넣었다. 이 후의 과정은 실시예 <5-4>에 개시된 것과 동일하게 수행하였다. 그 결과, 플로틸린-1에 대한 siRNA를 처리한 경우 기공을 통과한 세포의 수가 60% 정도 감소하였으며, 이로부터 형질전환 세포의 이동성이 현저하게 줄어든 것을 확인하였다(도 7의 D).

도 1은 침윤성 H-Ras MCF10A, 비침윤성 MCF10A 및 N-Ras MCF10A 세포로부터 분리한 리피드 래프트에서 카베올린-1 단백질이 발현되는 분획을 보여주는 웨스턴 블롯 사진이다.

도 2는 H-Ras MCF10A, MCF10A 및 N-Ras MCF10A 세포로부터 분리된 리피드 래프트 단백질의 2차원 전기영동 프로필을 보여주는 사진이다.

도 3은 각각의 2차원 전기영동에서 발현량에 차이가 나는 단백질에 대한 이미지 분석 데이터를 보여주는 그래프로서, (a,b)는 MCF10A; (c,d)는 H-Ras MCF10A; 및 (e,f)는 N-Ras MCF10A 세포를 나타낸다.

도 4a 및 도 4b는 MALDITOF/TOFMS 분석으로 확인된 24개의 단백질의 스폿 이미지를 확대한 것으로서, 각각 좌측부터 MCF10A, H-Ras MCF10A 및 N-Ras MCF10A 세포를 나타낸다.

도 5는 웨스턴 블롯 분석으로 플로틸린 및 사이토케라틴 7 단백질의 발현을 분석한 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.

도 6은 RT-PCR 분석으로 플로틸린-1 및 사이토케라틴 7 단백질의 발현을 분석한 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.

도 7은 플로틸린-1에 대한 siRNA를 이용한 H-Ras 세포의 침윤성 및 이동성 변화를 확인한 결과를 보여주는 것으로서, A 내지 D는 각각 웨스턴 블롯 분석, 자이모그램 분석, 침윤성 분석 및 이동성 분석 결과를 보여주는 전기영동 사진 또는 그래프를 나타낸 것이다.

<110> Duksung Women's University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Anticancer Composition <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 427 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Phe Phe Thr Cys Gly Pro Asn Glu Ala Met Val Val Ser Gly Phe 1 5 10 15 Cys Arg Ser Pro Pro Val Met Val Ala Gly Gly Arg Val Phe Val Leu 20 25 30 Pro Cys Ile Gln Gln Ile Gln Arg Ile Ser Leu Asn Thr Leu Thr Leu 35 40 45 Asn Val Lys Ser Glu Lys Val Tyr Thr Arg His Gly Val Pro Ile Ser 50 55 60 Val Thr Gly Ile Ala Gln Val Lys Ile Gln Gly Gln Asn Lys Glu Met 65 70 75 80 Leu Ala Ala Ala Cys Gln Met Phe Leu Gly Lys Thr Glu Ala Glu Ile 85 90 95 Ala His Ile Ala Leu Glu Thr Leu Glu Gly His Gln Arg Ala Ile Met 100 105 110 Ala His Met Thr Val Glu Glu Ile Tyr Lys Asp Arg Gln Lys Phe Ser 115 120 125 Glu Gln Val Phe Lys Val Ala Ser Ser Asp Leu Val Asn Met Gly Ile 130 135 140 Ser Val Val Ser Tyr Thr Leu Lys Asp Ile His Asp Asp Gln Asp Tyr 145 150 155 160 Leu His Ser Leu Gly Lys Ala Arg Thr Ala Gln Val Gln Lys Asp Ala 165 170 175 Arg Ile Gly Glu Ala Glu Ala Lys Arg Asp Ala Gly Ile Arg Glu Ala 180 185 190 Lys Ala Lys Gln Glu Lys Val Ser Ala Gln Tyr Leu Ser Glu Ile Glu 195 200 205 Met Ala Lys Ala Gln Arg Asp Tyr Glu Leu Lys Lys Ala Ala Tyr Asp 210 215 220 Ile Glu Val Asn Thr Arg Arg Ala Gln Ala Asp Leu Ala Tyr Gln Leu 225 230 235 240 Gln Val Ala Lys Thr Lys Gln Gln Ile Glu Glu Gln Arg Val Gln Val 245 250 255 Gln Val Val Glu Arg Ala Gln Gln Val Ala Val Gln Glu Gln Glu Ile 260 265 270 Ala Arg Arg Glu Lys Glu Leu Glu Ala Arg Val Arg Lys Pro Ala Glu 275 280 285 Ala Glu Arg Tyr Lys Leu Glu Arg Leu Ala Glu Ala Glu Lys Ser Gln 290 295 300 Leu Ile Met Gln Ala Glu Ala Glu Ala Ala Ser Val Arg Met Arg Gly 305 310 315 320 Glu Ala Glu Ala Phe Ala Ile Gly Ala Arg Ala Arg Ala Glu Ala Glu 325 330 335 Gln Met Ala Lys Lys Ala Glu Ala Phe Gln Leu Tyr Gln Glu Ala Ala 340 345 350 Gln Leu Asp Met Leu Leu Glu Lys Leu Pro Gln Val Ala Glu Glu Ile 355 360 365 Ser Gly Pro Leu Thr Ser Ala Asn Lys Ile Thr Leu Val Ser Ser Gly 370 375 380 Ser Gly Thr Met Gly Ala Ala Lys Val Thr Gly Glu Val Leu Asp Ile 385 390 395 400 Leu Thr Arg Leu Pro Glu Ser Val Glu Arg Leu Thr Gly Val Ser Ile 405 410 415 Ser Gln Val Asn His Lys Pro Leu Arg Thr Ala 420 425 <210> 2 <211> 704 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 aagctcacag ggccgaggcg gggcgaggtg ggggtgctta gtttgctgtg gggggcgggg 60 tcgcgtctgc agcagcaaca gggtgcggcc gggtggggaa cgcgggagcg gacccaggaa 120 ggctggtcgg ctaccggccc ctgctcggct tgcaggtccc tgcgcgcccc cgcccttccc 180 tagaccccag ccgggccgcc gccggtgtcc aggaagctcc agcctggacc atgtttttca 240 cctgtggccc aaatgaggcc atggtggtct ccgggttctg ccgaagcccc ccagtcatgg 300 tggctggagg acgagtcttt gtcctgccct gcacccagcc tcatagctga agttgcctga 360 atgatcctcc tgttgcatgt aatccactgg cctccctgag catgtccatt gacagtgagg 420 tcccacccct catctctcct tgccaaatag tttgtgcctt gtcttgaagg gggttgctcc 480 ccttgccaac ctcacactgc tatgattgcc aactccagtg gtcccatgtc agccttctga 540 tgatcccact ccaccccatc tcaacttatt taattcctaa ttaaatcaga ctgttggagc 600 ctgttgtcta gaatactttc ctgaccaaga ctgaaggatg tgctggaggt tttcaacttt 660 gctacccaaa taaattgcta taagtaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 704 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for G protein beta polypeptide 1 gene <400> 3 cagactccag gcttctcgtc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for G protein beta polypeptide 1 gene <400> 4 gttcccctca cgagttttca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for t-complex polypeptide 1 gene <400> 5 ggtgcaacca tcctgaagtt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for t-complex polypeptide 1 gene <400> 6 ggcaatctct tcccagttca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for kerotin 7 gene <400> 7 aggagagcga gcagatcaag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for kerotin 7 gene <400> 8 aagtcctcca ccacatcctg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for porin gene <400> 9 cagtgccaaa tcaaagcttg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for porin gene <400> 10 ttgcagaaat ggaagcagtg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for flotillin gene <400> 11 aagccttcca gctgtaccaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for flotillin gene <400> 12 tctggcaggc gagttagaat 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for flotillin-1 <220> <223> siRNA for flotillin-1 <400> 13 gcaucagugu gguuagcuat t 21

Claims

플로틸린 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 대한 억제제를 포함하는 항암용 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 플로틸린 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 유전자는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 억제제는 플로틸린 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
청구항 4에 있어서,

상기 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일쇄 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체 및 펩티도모방체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 억제제는 플로틸린 유전자에 상보적으로 결합하는 siRNA 분자인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 암은 일반적인 암 질환을 제한없이 포함하며, 바람직하게는 유방암, 위암, 결장암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,

아폽토시스 유도제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.