KR20090111037A - 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오연료의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 목질계 바이오매스로부터 당화액을 준비하는 단계, 상기 당화액에 효소를 투입하여 발효 저해물질을 중합시키는 단계, 상기 중합된 발효 저해물질을 당화액으로부터 침전시키는 침전 형성 단계, 상기 침전을 제거하는 단계 및 상기 침전이 제거된 당화액을 발효하는 단계를 포함하는 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 의한 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법은 무독성 전처리 과정을 거치며 당의 손실 없이 발효 수율을 높일 수 있다.
바이오매스, 바이오 알코올, 발효, 전처리

Description

목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법{Method for pretreating lignocellulosic biomass and method for manufacturing bio-fuel using the same}
본 발명은 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 독성이 있어 미생물의 생장 및 발효를 억제하는 화합물들을 효율적으로 제거하고, 바이오 연료의 생산량을 증대시킬 수 있는 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법에 관한 것이다.
최근 화석 연료의 고갈 현상 및 나날이 증대되는 온실 효과로 인해, 대체 에너지나 비석유계 에너지 공급원에 대한 요구가 커지고 있는 실정이다. 이에 따라 이산화탄소의 배출량을 감소시키며 화석 연료에 대한 대안이 될 수 있는 목질계 바이오매스(lignocellulosic biomass)로부터 제조된 에탄올 및 부탄올과 같은 알코올 액체 연료에 대한 관심이 커지고 있다.
목질계 바이오매스는 풍부하고 재생 가능한 자원이며, 발효 기질(substrate for fermentation)로써 큰 잠재력을 가지고 있다. 목질계 바이오매스는 크게 셀룰 로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌으로 구성되며, 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스는 산, 염기 및 증기 등을 이용한 가수분해 방법에 의해 5탄당 및 6탄당 등 발효 가능 당으로 분해될 수 있다.
그러나 상기 목질계 바이오매스의 가수분해 전처리 과정 중에 푸란(furan), 약산(weak acids), 및 다양한 페놀계 화합물과 같은 미생물의 생장 및 발효를 저해하는 독성물질 들이 동시에 생성되며, 이로 인하여 알코올의 생산 효율이 떨어지는 문제점이 있다.
그러므로, 높은 수율의 제품을 얻기 위하여 발효 전에 가수분해물의 해독, 즉 발효 저해물질들(inhibitory compounds)의 제거가 필요하다.
종래에 상기 발효 저해물질의 제거를 위해 사용된 해독 방법으로는 석회 처리(lime treatment), 이온 교환 수지, 증발, 활성탄(activated-charcoal)을 이용한 흡착법 또는 생물학적 처리 방법 등이 있다.
이러한 방법들은 발효 저해물질의 제거 효율이 높지 않으며 발효 저해물질의 종류에 따라 서로 다른 제거 효율을 나타낸다. 그리고, 발효 저해물질을 제거하기 위해 제시된 기존의 흡착법의 경우 해독 과정 중에 당 성분까지 제거되어 발효 수율이 떨어지는 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안한 것으로서, 전처리 과정 중에서 미생물 생장 및 발효를 저해하는 발효 저해물질들을 효율적으로 제거함과 동시에 전처리 과정 중 당의 손실이 없는 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법을 제공함을 목적으로 한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 특징에 따른 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법은 목질계 바이오매스로부터 당화액을 준비하는 단계, 상기 당화액에 효소를 투입하여 발효 저해물질을 중합시키는 단계, 상기 중합된 발효 저해물질을 당화액으로부터 침전시키는 침전 형성 단계, 상기 침전을 제거하는 단계 및 상기 침전이 제거된 당화액을 발효하는 단계를 포함한다.
상기 효소는 과산화효소(peroxidase)을 포함한다. 상기 과산화효소의 투여량은 1 내지 20 U/mL의 범위이다.
상기 효소는 상기 당화액 내의 페놀계 화합물과 반응하여 상기 페놀계 화합물을 중합시키는 것을 특징으로 한다.
상기 페놀계 화합물은 쿠마르산, 페룰산, 4-하이드록시벤조산 및 바닐산 등 으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 산이다.
상기 중합된 페놀계 화합물의 분자량은 500 내지 2500이다.
상기 중합 단계는 5 내지 10의 pH 조건 하에서 진행된다.
상기 중합 단계에서 과산화수소를 더 첨가할 수 있다.
상기 과산화수소는 페놀계 화합물에 대하여 0.25 내지 2.0 몰 비율(H2O2의 몰수/페놀계 화합물의 몰수)이 되도록 투입되는 것을 특징으로 한다.
상기 침전 형성 단계는 pH 3 이하의 산성화 조건을 만들거나 백반(alum)이나 고분자 응집제의 첨가에 의해 진행된다.
상기 침전물의 제거는 중력 침강, 원심분리, 막 등을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
상기 발효는 효모, 클로스트리디움, 대장균 및 기타 바이오 알코올을 생산할 수 있는 모든 미생물을 상기 당화액에 투입함으로써 이루어질 수 있으며, 발효시 투입되는 구체적인 미생물의 종류에 따라 생산되는 바이오 연료의 종류가 달라지게 된다.
본 발명에 의한 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법은 전처리 과정 중에 생성되는 미생물 생장 및 발효를 저해하는 화합물들을 효율적으로 제거할 수 있다. 또한 전처리 과정 중에 당의 손실이 없어 생산 효율을 높일 수 있다.
또한 본 발명에 의한 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법은 친환경적이며 무독성이다.
본 발명에 의해 제조된 바이오 연료는 기존에 비해 독성 화합물의 농도가 낮고, 생산성이 높다.
이하 본 발명의 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법을 보다 상세히 설명하기로 한다.
바이오 연료, 특히 바이오 알코올은 목질계 바이오매스를 전처리하여 생성된 가수분해물인 당화액을 발효시켜 제조된다. 상기 가수분해물, 즉 당화액 내에는 발효가 가능한 당이 포함되어 있다. 상기 당화액에 미생물을 투입하여 당화액을 발효시킴으로써 바이오 연료를 생산한다. 구체적으로 생산되는 바이오 연료의 종류는 미생물의 종류에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 클로스트리디움 베이어린키를 사용하여 바이오 부탄올을 제조하나, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용한 상기 목질계 바이오매스의 구성 성분에는 셀룰로오스가 33 내지 51중량%, 헤미셀룰로오스가 19 내지 34 중량%, 리그닌이 21 내지 32 중량%, 재가 0 내지 2 중량%, 기타 성분이 나머지로 포함된다. 전처리 과정에서 상기 셀룰로오스 및 상기 헤미셀룰로오스 성분은 글루코오스(glucose), 갈락토오스(galactose), 만노스(mannose), 램노스(rhamnose), 자일로스(xylose) 및 아라비노스(arabinose)를 포함하는 5탄당 또는 6탄당으로 가수분해 된다. 당 성분 이외 에도 가수분해로 인해 푸란(furan), 하이드록시메틸푸르푸랄(HMF), 푸르푸랄(furfural), 약산 등의 비페놀계 화합물들이 생성된다. 상기 리그닌 성분은 가수분해될 경우 페룰산(ferulic acid), 쿠마르산(coumaric acid), 벤조산(benzoic acid), 시링산(syringic acid), 바닐산(vanilic acid), 바릴린(valilin), 4-하이드록시벤조산(4-hydroxybenzoic acid), 4-하이드록시벤즈알데하이드(4-hydroxybenzaldehyde), 시링알데하이드(syringaldehyde) 등의 페놀계 화합물들이 생성된다.
상술한 목질계 바이오매스의 가수분해로 생성된 화합물들 중 발효 저해물질들은 미생물 생장 및 미생물을 이용한 바이오 알코올의 제조 수율을 떨어뜨리는 작용을 한다. 섬유질이 풍부한 농업용 바이오매스(agricultural biomass)의 가수분해물에 포함된 발효저해 물질들은 미생물 생장 및 클로스트리디움 베이어린키(clostridium beijerinckii)를 이용한 아세톤-부탄올-에탄올(ABE)의 제조에 상당한 영향을 준다.
상기 발효 저해물질에 대하여 미생물 생장 결과와 부탄올 제조량을 분석한 결과를 도 1 및 도 2를 참조하여 설명한다.
도 1은 각 페놀계 화합물의 종류에 따른 클로스트리디움 베이어린키의 생장 결과를 보여주는 그래프이며, 도 2는 각 페놀계 화합물의 종류에 따른 부탄올 제조량을 나타내는 그래프이다.
먼저 도 1을 참조하면, 가로축은 각종 발효 저해물질들(inhibitors)이 1g/L씩 첨가된 경우들을 나타내며, 세로축은 클로스트리디움 베이어린키의 생장 결과를 나타내는 건조 미생물 중량(dry cell weight)을 나타낸다. 상기 발효저해 물질들로는 쿠마르산(coumaric acid), 페룰산(ferulic acid), 4-하이드록시벤조산(4-HBA), 바닐산(vanilic acid), 시링알데하이드(syringaldehyde) 및 하이드록시메틸푸르푸랄(HMF)을 사용하였다. 가장 좌측의 대조군(control)은 발효저해 물질을 전혀 포함하지 않는 경우이다. 각 경우의 미생물 생장 결과를 비교할 때, 시링알데하이드 및 하이드록시메틸푸르푸랄의 경우 대조군과 유사한 미생물 생장 결과를 보여 독성이 없음을 알 수 있다. 반면, 쿠마르산, 페룰산, 4-하이드록시벤조산 및 바닐산의 경우에 미생물 생장이 가장 저해된 것을 알 수 있다.
다음으로 도 2를 참조하면, 대조군, 시링알데하이드 및 하이드록시메틸푸르푸랄의 경우에는 부탄올 농도가 높게 나타났지만, 쿠마르산, 페룰산, 4-하이드록시벤조산 및 바닐산의 경우에는 앞서 도 1에서 설명한 바와 같이 당화액 내 미생물의 생장을 억제하여 부탄올의 생성을 저해한다.
이와 같이 발효저해 물질로 작용하는 상기의 페놀계 화합물들은 생물학적 막에 영향을 주어 미토콘드리아 막의 전기화학적 전위를 변형시킨다. 그러므로, ABE 발효를 위해서 페놀계 화합물들은 목질계 가수분해물로부터 반드시 제거되어야 한다.
종래의 연구 보고들에서는 목질계 가수분해물에서 발견되는 각 종류의 발효 저해물질에 대한 효소 반응 특성에 대해 다룬 사례가 거의 없으며, 효모균에서 생기는 과산화효소(peroxidase originated in fungi)를 사용한 가수분해물의 해독 및 상기 과산화효소의 ABE 발효에 대한 응용에 대해서는 아직 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 당화액 내의 페놀계 화합물들을 제거하기 위해 효소를 투입하여 페놀계 화합물들을 중합시키는 효소 중합 방법(enzymatic polymerization method)을 사용한다. 페놀은 과산화효소(peroxidase)에 의해 산화되어 페녹시 라디칼(phenoxy radicals)을 생성하며, 상기 페녹시 라디칼은 다른 종류의 기질 분자들(substrate molecules)인 페놀계 화합물들과 결합하여 2량체(dimeric), 저중합체(oligomeric), 및 고분자 중합체(polymeric) 화합물들을 포함하는 중합체를 형성한다. 상기 효소 중합 반응으로 생성되는 상기 중합체의 분자량은 500 내지 2500이다.
과산화효소를 첨가하여 페놀계 화합물들을 중합시키는 중합 단계에서, 당화액의 pH는 5 내지 10이어야 한다. 상기 당화액의 pH가 5보다 작을 경우 효소반응이 잘 일어나지 않아 페놀계 화합물들의 침전이 일어나지 않는 문제점이 있고, 10보다 큰 경우에도 동일한 문제점이 있다.
상기 당화액 내에 첨가되는 상기 과산화효소의 투여량은 1 내지 20 U/mL이다. 상기 과산화효소의 투여량이 1 U/mL보다 작은 경우 효소의 양이 적어 페놀계 화합물의 중합이 제대로 되지 않아 침전이 발생하지 않는 문제점이 있고, 20 U/mL보다 큰 경우 과도한 효소 사용량에 따른 운전비용이 증가되는 문제점이 있다.
상기 중합 단계에서 과산화수소를 더 첨가하는데, 이는 페놀계 화합물을 더 많이 중합시켜 침전시키기 위해서는 과산화효소를 계속 산화시킬 필요가 있기 때문이다.
상기 과산화수소의 투입량은 페놀계 화합물에 대하여 0.25 내지 2.0 몰 비 율(H2O2의 몰수/페놀계 화합물의 몰수)이 되도록 한다. 상기 과산화수소의 투입량이 0.25 몰 비율보다 작을 경우 과산화효소가 충분히 산화되지 못해 효소 반응이 잘 일어나지 못하게 되는 문제점이 있고, 2.0 몰 비율보다 클 경우 적정량을 초과하는 과산화수소가 과산화효소를 비활성화 시키는 문제점이 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명에 따른 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법을 더욱 상세하게 설명하나, 하기 실시예는 본 발명을 보다 더 구체적으로 설명하기 위한 예시적인 것으로서, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
본 발명은 목질계 가수분해물에서 발견되는 페놀계 화합물들의 해독을 촉진하기 위하여 과산화효소(peroxidase)를 이용한 것이며, pH, 효소 투여량, 및 페놀계 화합물에 대한 과산화수소의 비율에 따라 페놀계 화합물들의 제거 효율 및 바이오 연료의 생산성을 측정하였다. 각 페놀계 화합물의 독성을 평가하였으며, 무독화된 당화액을 클로스트리디움 베이어린키(clostridium beijerinckii)를 이용한 부탄올 제조의 기질로서 사용하였다.
재료 및 제조 방법
코프리누스 시네리우스 과산화효소( Coprinus cinerius peroxidase ; CiP )의 준비
과산화효소 생산 균주(peroxidase-producing strain)로 C. Cinerius IFO 8371를 사용하였다. 과산화효소의 제조를 위해 사용된 배지 조성은 글루코스 30 g/L, 펩톰(peptome) 5 g/L 및 효모 추출물 3 g/L 등이 포함되었다.
최종적으로 정제된 CiP를 페놀계 발효 저해물질의 중합반응 (polymerization of phenolics)에 사용하기 전에 20,000 U/mL 정도의 농도로 농축하였다.
효소 해독화 과정( Enzymatic detoxification procedure )
20 mL 용량의 시험관 내에서 10 mL의 페놀계 화합물(농도: 1 g/L) 및 5㎕의 CiP를 각각 투입하였다. 그러나, 다른 일 실시예에서는 CiP를 1㎕ ~ 10㎕의 범위 내에서 투입할 수 있다. 상기 페놀계 화합물로는 파라 쿠마르산(p-coumaric acid), 페룰산(ferulic acid), 4-하이드록시벤조산(4-hydroxybenzoic acid; 4-HBA), 및 바닐산(vanilic acid)을 선정하였으며, 각각에 대하여 CiP를 이용한 효소 해독화 반응이 수행되었다. 해독화 반응의 pH 조절을 위해 1M 질산(HNO3) 및 1M 수산화암모늄(NH4OH)을 사용하였다. 각 시험관에 과산화수소를 첨가하면서 반응이 개시되었다. 각 시험관 내의 반응 혼합물은 상온에서 1시간 동안 교반기로 혼합되었다. 반응 생성물을 제거하기 위하여, 산성화(acidification) 및 침전(precipitation) 과정이 진행되었다. 효소 반응 용액을 5M의 질산으로 pH 2.0으로 산성화시켜 침전물을 생성시켰으며, 생성된 침전물은 10분 동안 4,500 rpm의 속 도로 원심분리하여 제거하였다. 침전물을 제거한 상청액(supernatant)은 부탄올 생산 배지에 넣어 부탄올 발효를 위해 사용하였다.
부탄올 제조를 위한 미생물 및 발효( Microorganism and fermentation for butanol production )
부탄올 발효를 위해 포자상태의 현탁액(spore suspension)으로 있는 클로스트리디움 베이어린키 NCIMB 8052에 섭씨 80도에서 10분 동안 열(heat shock)을 가하였다. 그 후 RCM 배지(Reinforced Clostridial Medium) 내에서 섭씨 37도의 온도에서 9시간 동안 배양 후 CAB 배지에서 하루 동안 37도의 온도에서 하룻밤 동안 배양하였다. 상기 배양액을 회분식 배양기에 접종하여 부탄올 발효를 진행하였다. 부탄올 제조 배지는 리터당 30 g의 글루코스, 4 g의 효모 추출물, 1 g의 트립톤(tryptone), 1.5 g의 인산칼륨(KH2PO4), 0.5 g의 아스파라긴(asparagines), 0.1 g의 황산마그네슘(MgSO4·7H2O), 0.1 g의 황산망간(MnSO4·7H2O), 0.015 g의 황산철(FeSO4·7H2O), 0.1 g의 염화나트륨, 2 g의 낙산염(butyrate), 0.25 g의 시스테인(cystein) 및 1 mL의 0.2% 레사주린(resazurin)을 포함하였다. 초기 pH는 1 N 수산화칼륨(KOH)으로 6.0으로 조정되었다. 회분식 배양(batch culture)의 경우, 125 mL의 시료병(serum bottle)에 30 mL의 배지를 넣고 배지의 5%에 해당하는 양을 배양액(preculture)로 접종한 후 회전 교반기에서 섭씨 37도의 온도 및 180 rpm의 회전 속도로 배양하였다. 접종 후에, 상기 배양액에는 아르곤 기체를 주입하여 혐 기성 조건을 유지하였다. 발효 과정 중에, 주기적으로 시료를 채취하여 미생물의 생장(growth determination) 및 부탄올 농도 분석을 수행하였다.
분석 방법( Analytic methods )
페놀계 화합물들의 농도는 280 nm에서 작동되는 다이오드-배열 검출기가 있는 애질런트 모델 1100 액체 크로마토그래프(Agilent model 1100 liquid chromatograph with diode-array detector)로 측정하였으며, Zorbax XDB-C18 컬럼(150×0.3 mm, 3.5㎛)을 사용하였다.
미생물 생장은 600 nm에서의 흡수와 관련된 스펙트로포토미터(UVmini-1240, SHIMAZU)로 검정 곡선(calibration curve) 및 미생물 건조 중량(dry cell weight)을 사용하여 측정되었다.
부탄올 농도는 불꽃 이온화 검출기(flame ionized detector)가 설치된 가스 크로마토그래피(Agilent technology 6890N Network GC system)로 분석하였으며, HP-INNOWax column(30 m×250㎛×0.25㎛, Agilent Technologies)을 사용하였다.
반응 생성물의 분자량은 굴절률 검출기(refractive index detector)가 설치된 겔 침투 크로마토그래피(gel permeation chromatography; GPC)로 측정하였다.
[측정결과]
효소 반응( Enzyme reaction )
네 종류의 페놀계 화합물들, 파라 쿠마르산(p-coumaric acid), 페룰 산(ferulic acid), 4-하이드록시벤조산(4-hydroxybenzoic acid; 4-HBA), 및 바닐산(vanilic acid)를 목질계 바이오매스의 전처리, 가수분해 과정에서 생성된 모델 화합물들로 사용하였다. 각 화합물에 대해 pH, 효소 투여량 및 과산화수소의 몰 비율(H2O2/substrate molar ratio)의 영향을 제거 효율 값으로 비교 분석하였다. 제거 효율은 제거된 페놀계 화합물 농도를 페놀계 화합물의 초기 농도로 나눈 값으로 정의하였다.
1 g/L의 페놀계 화합물, 20 U/mL의 효소 및 과산화수소를 첨가한 후어 최적의 pH를 조사한 결과, 각 페놀계 화합물에 대한 최적의 반응 pH는 5.0 내지 10.0의 범위였다.
파라 쿠마르산, 페룰산 및 바닐산의 경우 기질에 대한 과산화수소의 몰 비율이 1:1이었고, 4-HBA의 경우 1:1.25였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 파라 쿠마르산, 페룰산 및 바닐산의 경우 최적 pH의 범위가 6.0 내지 9.0으로 넓게 나타났다. 그러나, 4-HBA의 제거 효율은 pH가 6.0에서 10.0으로 증가함에 따라 점진적으로 감소하였다.
페놀계 화합물들을 제거하기 위한 효소의 최소 투여량을 측정하였다. 효소 투여량은 2 내지 100 U/mL의 범위 내에서 측정되었는데, 기질에 대한 과산화수소의 비율은 1:1(단, 4-HBA의 경우는 1:1.25), 페놀계 화합물의 농도는 1 g/L, pH는 6.0으로 고정하였다. 도 4에서 보는 바와 같이 파라 쿠마르산, 페룰산 및 바닐산의 경우, 단지 2 U/mL의 효소 만으로도 제거 효율은 거의 100%이었다. 이러한 결과는 단지 1 U의 효소만으로도 5 mg의 페놀계 화합물을 완벽히 제거할 수 있음을 나타낸다. 그러나, 4-HBA의 경우 20 U/mL정도의 효소를 사용하여야 97%의 제거 효율을 얻을 수 있었다. 최적의 효소 투여량을 이상의 효소를 사용하더라도 그 이상의 효율은 나타내지 않았다.
페놀계 화합물들의 제거에 있어서 과산화수소의 영향을 평가하기 위해, 기질에 대한 과산화수소의 비율이 0.25 내지 2.0의 몰 비율(H2O2/substrate molar ration)이 되도록 1 g/L의 페놀계 화합물들에 각각 투입하였으며, 효소 투여량은 20 U/mL, pH는 6.0으로 하였다. 도 5에서 보는 바와 같이, 과산화수소의 몰 비율의 증가에 따라 제거 효율이 증가함을 알 수 있다. 구체적으로, 파라 쿠마르산의 경우 0.5까지, 페룰산 및 바닐산의 경우 1.0까지, 4-HBA의 경우 1.25까지 몰 비율이 증가함에 따라 각각 제거 효율이 증가하였다.
파라 쿠마르산, 페룰산 및 바닐산의 제거 효율은 몰 비율이 1.0일 때 거의 100%를 나타내며, 몰 비율이 2.0으로 증가하더라도 제거 효율은 감소하지 않았다. 반면, 4-HBA의 경우, 몰 비율이 1.25에서 97%의 제거 효율을 보였으나 몰 비율이 증가함에 따라 제거 효율이 점진적으로 감소하여 몰 비율이 2.0일 때는 80%를 나타내었다. 이는 과산화수소의 초과 투여로 효소의 불활성화가 일어났기 때문으로 해석된다.
반응으로 생성된 중합체의 분자량은 하기 표 1에 정리하였다.
화합물 Mn (수평균분자량) Mw (중량평균분자량) Pd (다분산도)
파라 쿠마르산 477 528 1.107
페룰산 560 611 1.091
4-HBA 550 580 1.055
바닐산 1,322 2,123 1.606
상기의 모델 페놀계 화합물들(파라 쿠마르산, 페룰산, 바닐산 및 4-HBA)의 과산화효소 촉매 반응은 분자량이 528 내지 2,123인 저중합체(올리고머)를 형성하였다. 이러한 결과는 파라 쿠마르산, 페룰산 및 4-HBA의 경우 반응 생성물이 삼량체(trimer) 또는 사량체(tetramer)이고, 바닐산의 경우 반응 생성물이 사량체 이상의 저중합체임을 나타낸다. 바닐산의 경우에서 중합도가 크게 나타나는 이유는 다른 화합물보다 물에 대한 용해도가 커서 중합도가 증가한 것으로 볼 수 있다.
부탄올 발효를 위해 해독화된 용액의 독성 평가( Toxicity evaluation of detoxified solution for butanol fermentation )
페놀계 화합물들의 독성을 평가하기 위해, 1 g/L의 파라 쿠마르산, 페룰산, 4-HBA 및 바닐산을 각각 포함하는 배지에서의 클로스트리디움 베이어린키의 생장 및 부탄올 생성 농도를 측정하였다.
도 6은 각 페놀계 화합물 종류 및 효소 처리 여부에 따라 클로스트리디움 베이어린키 NCIMB 8052의 생장 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6에 도시된 바와 같이, 테스트된 모든 페놀계 화합물들은 클로스트리디움 베이어린키의 생장에 독성을 나타냈다. 도 6에서 (A)는 페놀계 화합물이 첨가되지 않은 대조군, (B)는 파라 쿠마르산이 첨가된 경우, (C)는 페룰산이 첨가된 경우, (D)는 4-HBA이 첨가된 경우 및 (E)는 바닐산이 첨가된 경우에 있어서 각각 효소 처리를 한 경우(enzyme treated)와 효소 처리를 하지 않은 경우(no enzyme treated)를 나타낸다. 도 6의 세로축은 미생물 건조 중량(g/L)으로, 미생물 건조 중량이 클수록 미생물 생장이 저해 받지 않는 것을 나타낸다.
페놀계 화합물들 중 파라 쿠마르산(B)이 가장 독성이 크게 나타났으며, 미생물 생장을 74% 저해하였다. 페룰산(C)은 70%, 4-HBA(D)은 66%, 그리고 바닐산(E)은 64%씩 각각 미생물 생장을 저해하였다.
도 7은 각 페놀계 화합물의 종류 및 효소 처리 여부에 따라 클로스트리디움 베이어린키 NCIMB 8052을 이용한 부탄올 생성 농도를 보여주는 그래프이다. 도 7에서 (A)는 페놀계 화합물이 첨가되지 않은 대조군, (B)는 파라 쿠마르산이 첨가된 경우, (C)는 페룰산이 첨가된 경우, (D)는 4-HBA이 첨가된 경우 및 (E)는 바닐산이 첨가된 경우에 있어서 각각 효소 처리를 한 경우(enzyme treated)와 효소 처리를 하지 않은 경우(no enzyme treated)를 나타낸다.
도 7에서 보는 바와 같이, (B) 내지 (E)의 경우 각 페놀계 산의 존재 하에서 효소가 첨가되지 않으면 발효 과정 동안 클로스트리디움 베이어린키에 의해 부탄올이 거의 생성되지 않는 것을 알 수 있다.
본 발명의 실시예에서 테스트된 페놀계 화합물들은 미생물 생장을 64% 내지 74% 저해하는 반면, 클로스트리디움 베이어린키에 의한 부탄올의 생성은 완전히 저해하였다. 상기 페놀계 화합물들의 존재 하에서 발효가 진행되는 경우, 부탄올로의 생물전환(bioconversion)을 위한 전구체로 발효체에 첨가된 부티르산(butyric acid)이 완전히 클로스트리디움 베이어린키에 의해 활용되지 않는다는 것이 관찰되었다. 이 결과로부터 페놀계 산은 용매생성단계(solventogenic phase)에서 용매 제조에 참여하는 알데하이드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase) 및 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)와 같은 효소의 분비(enzyme secretion)를 저해함을 알 수 있다.
효소 처리된 당화액의 독성 평가를 위해 위하여 클로스트리디움 베이어린키을 이용한 발효 실험을 진행하였으나 클로스트리디움 베이어린키의 생장 및 부탄올 생성은 전혀 이루어 지지 않았다. 이는 상기 효소 처리된 발효액에 존재하는 저중합된(oligomerized) 반응 생성물 때문으로 유추되며, 저중합된 반응 생성물의 저해 정도는 단량체 페놀계 화합물들의 저해 정도보다 훨씬 큼을 알 수 있다. 그러므로, 본 발명에서는 상기 반응 생성물들을 침전시켜 모델당화액으로부터 제거하였다. 반응 생성물의 침전은 용액을 pH 3이하로 산성화(acidification)시키거나 alum, 고분자 응집제 등을 첨가하여 이루어졌으며, 침전물은 중력침강, 원심분리 등의 방법에 의해 제거하였다.
침전(precipitation)에 의해 해독된 모델 당화액의 독성 평가를 위해 부탄올 발효용 배지에 첨가하여 추가 발효실험을 진행하였다.
도 6 및 도 7을 참조하면, 본 발명에 의한 바이오 알코올의 제조 방법에 따라 목질계 바이오매스를 효소로 전처리하여 페놀계 화합물을 제거한 후 당화액을 발효시킨 경우, 클로스트리디움 베이어린키의 생장 정도 및 부탄올 생성 농도가 현저하게 향상되었음을 알 수 있다. 특히, 부탄올 생성 농도는 독성 물질인 페놀계 화합물이 포함되지 않은 대조군의 경우(A)와 유사할 정도로 급격히 증가하였음을 알 수 있다. 또한 독성 물질인 반응 생성물을 함유하는 당화액은 색깔을 띠는데, 본 발명의 제조 방법으로 전처리를 할 경우 유색 침전물이 생성되면서 상기 당화액은 무색으로 바뀌는 것을 확인할 수 있다.
본 발명은 부탄올 발효에 대해 심각한 저해 요인인 페놀계 화합물들을 제거하여 해독하기 위해 전처리 과정에서 효소를 사용하며, 상기 효소로는 과산화효소가 포함된다.
특히, 효소 반응에 의해 생성된 가용성 반응물들에 의한 잔류 독성을 완전히 제거하는 것은 어려우나, 본 발명에서는 산성화 및 원심 분리 과정을 거쳐 완전히 해독된 당화액을 얻을 수 있다.
목질계 바이오매스 가수분해물의 해독을 위해 화학적, 물리적 및 생물학적 처리 방법을 포함한 다양한 방법들이 제시되어 왔다. 해독 방법의 선택은 반드시 가수분해물의 성분을 고려한 후에 이루어져야 한다. 게다가, 저해 물질의 종류에 따른 해독 방법의 특성이 고려되어야 한다.
본 발명에서는 부탄올 발효의 주요 저해 물질인 페놀계 화합물들을 효소로 전처리함으로써 제거하였다.
본 발명에 의해 처리된 전처리 당화액은 효모, 클로스트리디움, 대장균 등 바이오 알코올을 생산할 수 있는 모든 미생물을 이용한 발효에 적용할 수 있으며 이를 통해 바이오 연료를 제조할 수 있다.
이상과 같이 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
도 1은 각 페놀계 화합물의 종류에 따른 클로스트리디움 베이어린키의 생장 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 각 페놀계 화합물의 종류에 따른 부탄올 생성 농도를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 연료의 제조 방법에서 pH 조건에 따른 페놀계 화합물의 제거 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 목질계 바이오매스 전처리 방법에서 효소 투여량 조건에 따른 각 페놀계 화합물의 제거 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 목질계 바이오매스 전처리 방법에서 페놀계 화합물에 대한 과산화수소의 몰비에 따른 각 페놀계 화합물의 제거 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 각 페놀계 화합물 종류 및 효소 처리 여부에 따라 클로스트리디움 베이어린키의 생장 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 각 페놀계 화합물의 종류 및 효소 처리 여부에 따라 클로스트리디움 베이어린키를 이용한 부탄올 생성 농도를 보여주는 그래프이다.

Claims (13)

  1. 목질계 바이오매스로부터 당화액을 준비하는 단계;
    상기 당화액에 효소를 투입하여 발효 저해물질을 중합시키는 단계;
    상기 중합된 발효 저해물질을 당화액으로부터 침전시키는 침전 형성 단계;
    상기 침전을 제거하는 단계; 및
    상기 침전이 제거된 당화액을 발효하는 단계;
    를 포함하는 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 효소는 과산화효소(peroxidase)인 것을 특징으로 하는 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 효소는 상기 당화액 내의 페놀계 화합물과 반응하여 상기 페놀계 화합물을 중합시키는 것을 특징으로 하는 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 페놀계 화합물은 쿠마르산, 페룰산, 4-하이드록시벤조산 및 바닐산 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 산인 것을 특징으로 하는 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 중합된 발효 저해물질의 분자량은 500 내지 2500인 것을 특징으로 하는 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 중합 단계는 5 내지 10의 pH 조건 하에서 진행되는 것을 특징으로 하는 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 과산화효소의 투여량은 1 내지 20 U/mL인 것을 특징으로 하는 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 중합 단계에서 과산화수소를 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 과산화수소는 페놀계 화합물에 대하여 0.25 내지 2.0 몰 비율(H2O2의 몰수/페놀계 화합물의 몰수)이 되도록 투입되는 것을 특징으로 하는 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 침전 형성 단계는 pH 3 이하의 산성 분위기 하에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 침전 형성 단계는 백반(alum) 또는 고분자 응집제을 투입하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 침전 제거 단계는 중력 침강 또는 원심 분리의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 발효는 효모, 클로스트리디움 및 대장균으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 미생물을 상기 당화액에 투입함으로써 이루어는 것을 특징으로 하는 목질계 바이오매스 전처리 방법 및 이를 이용한 바이오 연료의 제조 방법.
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