KR20090094814A - 암의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양을 영상화하고 포유류의 암을 치료하기 위한 펩타이드,폴리펩타이드, 항체 및 소분자를 개시하고 있다. 본 발명의 방법은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 물질을 인간과 같은 포유류에게 투여하는 단계를 포함하며, 본 발명의 물질은 종양세포와 특이적으로 결합하고 방사능 표지가 되거나 세포사제와 같은 치료적 표지가 될 수 있다.
암, 펩타이드, 폴리펩타이드, 소분자, 항체, HSP

Description

암의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING AND DIAGNOSING CANCERS}
본 발명은 암의 치료 및 진단방법에 관한 것이다.
2002년에 미국에서의 전체 사망자 중 22.8%가 암에 의한 것이었으며 이는 전체 사망원인 중 두 번째를 차지한다. 사망에 이르는 암의 대표적인 4가지 형태는 폐 또는 기관지암, 유방암, 대장 또는 직장암 및 전립선암이다. 2005년에는 폐암이 암으로 인한 남성 사망의 31%를, 여성 사망의 27%를 차지할 것으로 보인다. 암으로 인한 여성 사망의 두 번째 원인인 유방암은 15%의 여성 암 사망의 원인을 제공할 것으로 보이고, 전립선암은 남성 암 사망의 10%를 차지할 것으로 보인다. 대장암은 남녀 암 사망 원인의 10%를 차지할 것으로 보인다.
암 진단
상기 기술된 각각의 치명적 암들은 전이가 시작되기 전에 검출된다면 잠재적으로 치료가 가능하다. 외과적 절제에 가능한 방사능 치료 또는 보조적 화학치료를 추가하는 것이 여전히 적절한 경우에 대한 주요 치료방법이다. 가끔 위험이 상승 중인 환자들에게서 관례적인 스크리닝에 의해 초기 진단이 이루어지기도 한다. 스크리닝 과정은 대장암과 유방암의 진단에 있어서 각각 대장내시경과 맘모그래피(mammography)를 포함한다. 맘모그래피는 여성의 치밀 유방(dense breast)에서의 손상 검출이 어렵기 때문에 아직은 불완전한 검사이다. 전립선암 스크리닝은 DRE(digital rectal examination)와 PSA(blood prostate specific antigen) 레벨의 측정으로 구성된다. DRE만을 이용한 경우 민감도는 약 50%이나, DRE 및 PSA 레벨 측정을 조합할 경우 민감도는 훨씬 더 상승한다. 그러나 전립선암을 조기 진단하는 것이 환자의 생명을 구할지 여부는 논란의 여지가 있다. 폐암의 스크리닝을 위한 일상적인 가슴 X 레이는 확실히 효과적임이 증명되지 않았다. 최근의 연구가 가슴 CT 스캔이 초기 폐암의 진단에 효과적인 스크리닝 방법인지에 대해 초점을 맞추고 있으나, 높은 빈도의 우연한 발견 후 이어지는 검사로 인해 비용 대 효과의 문제가 있다. 2-[18F] FDG(fluoro-2-deoxy-D-glucose) 및 PET(positron emission tomography) 스캐닝(FDG-PET 스캐닝)은 폐 및 유방에서의 초기 악성 종양의 검출에 있어 손상부위이 크기가 유방에서는 2 cm, 폐에서는 1 cm가 넘을 때만 민감도를 가진다. 또한 초기 전립선암을 진단하는데 있어서 민감도와 특이성이 낮다. 대장에서의 FDG의 활성은 정상적으로 증가될 수 있기 때문에, PET는 초기 대장암을 스크리닝하는 좋은 방법이 아니다. 이러한 진단 시험의 제약 때문에, 환자의 병력과 신체검사가 암 진단의 가장 중요한 요소로 남아있다.
일단 암이 진단되고 나면, 암의 단계가 결정되어야 한다. 근처의 조직으로 침투했는지와 림프 노드나 체내의 다른 멀리 떨어진 곳으로 퍼졌는지 여부는 종양의 크기와 범위로 결정한다. 치료방법이 효과적인지는 암의 어떤 단계에서 진단이 이루어졌는지에 따라 좌우된다. 만약 암의 발견이 비교적 초기단계에서 이루어졌다면, 환자는 치료를 받을수 있고 대개 필수적으로 외과적 수술이 행해진다. 좀 더 진행된 암에 있어서, 치료는 환자의 일상생활의 질(quality of life)에 최적화되어 실시되며 외과적 수술은 종종 치료에 이르지 못한 체 사망을 야기시킨다.
신티그라피 (Scintigraphy) 연구는 암의 단계를 결정하는 효과적인 진단수단이 되었다. 99m-테크네튬으로 라벨링된 이인산(diphosphonate) 화합물을 이용한 골 스캐닝이 폐암, 유방암, 전립선암, 직장암 및 다른 다양한 암에서 뼈로의 전이를 검출하는 데에 전통적으로 사용되어왔다. 골 스캔의 민감도는 80-90% 또는 그 이상인 것으로 생각되어왔으나, 이러한 비율은 한가지 암에 국한된 소규모 연구로부터 추정된 것이다. 골 스캔만의 특이성은 높지 않고 임상적 정보와 보충적인 방사선자료에 의해 특이성을 높여야만 한다. FDG-PET 스캐닝은 암의 단계를 결정하는 중요한 도구로서 역할을 한다. 골 전이를 검출하는 이의 민감도는 골 스캐닝의 그것과 거의 동일하며, 그 특이성은 훨씬 높다. 뿐만 아니라 PET 스캐닝은 림프 노드, 간, 아드레날린, 폐 및 흉벽과 같은 연성 기관에서의 전이를 검출할 수 있다. 불행하게도 PET 스캐닝은 미국에서 널리 이용되지 못한다. 인구밀도가 높은 지역에서만 PET를 보유하고 운용할 예산을 가지고 있다. 미국의 많은 지역들이 트럭으로 운송되는 이동식 PET유닛에 의존하고 있다. 지방의 몇몇 환자들은 PET 스캔을 이용하기 위해 수 시간을 이동하고 숙박비를 지불해야 한다. SPECT(Single-Photon Emission Computed Tomography) 능력을 가진 보다 전통적인 감마 카메라는 PET 스캐너보다 더 저렴하고 더 쉽게 작동할 수 있어 보다 널리 사용되고 있다. FDG와 유사한 민감도와 특이성으로 암의 검출과 진행단계 결정을 할 수 있는 단일 광량자 방사 방사성 트레이서(single photon emitting radiotracer)는 SPECT 감마 카메라를 이용하여 이미지화될 수 있고 PET 센터를 사용할 비용이 없는 지역사회에 큰 이점이 있다. 이는 미국의 지방이나 준 지방 지역뿐 아니라 PET 센터가 없는 전 세계 모든 지역에 도움이 될 수 있다. 이는 암세포에 비교적 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 99m-테크네튬과 같은 단일 광량자 방사 분자를 이용함으로서 달성될 수 있다: 이러한 분자들에 대한 필요성이 최근 대두된다.
암 치료
최근의 암 치료는 방사선, 화학 및 생물학적 치료를 포함한다. 형태, 단계, 위치 및 환자의 건강상태에 따라 1개 또는 둘이상의 이들 암에 대한 치료는 아래의 진단방법을 이용한다. 암 치료에 있어서 생물학적 치료의 역할은 암 치료 연구에 있어서 가장 빠르게 발전하는 분야일 것이다. 암 치료에서 또 다른 발전중인 분야는 암의 성장과 전이를 구속하는 합성 소분자 물질이다. 생물학적 치료 및 소분자 물질 치료 모두의 이점과 결점은 하기에 서술되었다.
암에 대한 생물학적 치료는 전형적으로 암 환자의 항암 면역반응을 유도하는 과정을 포함한다. 그러나 암세포는 비정상적인 증식을 함에도 불구하고 환자의 면역체계에 의해 “자기 자신”으로 인식되기 때문에 이는 어려운 방법이다. 지난 20년 간 암과 싸우기 위한 생물학적 시료를 이용하는 몇몇 전략들이 발전되어왔다. 인터루킨 2(IL-2) 및 인터페론 알파(IFN-α)와 같은 사이토카인이 환자의 면역 체계를 활성화시킴으로써 광범위한 암에 대해 사용된다. 이들 치료방법은 심각한 부작용을 일으킬 수 있으며, 암세포에 대한 특이적 면역반응에 초점을 거의 맞추지 못한다. 한편, 아렘투주맵(alemtuzumab, Campath) 및 리툭시맵(rituximab, Rituxan)같은 모노클로날 항체는 이들과 다른 모노클로날 항체가 암세포 뿐 아니라 암과 관련된 세포 형태를 타겟으로 삼고 있음에도 불구하고 특정 형태의 암(예를 들어 B세포 백혈병)에 대해 사용될 경우 방사선 치료 및 화학치료에 대한 효과적인 보조적 치료임이 입증되었다. 전체 세포 개체군 또는 세포주의 부분적 또는 완전한 손실(예를 들어 아렘투주맵이 환자에게 투여됐을 때의 모든 림프구의 손실)은 문제를 일으키며 이러한 치료의 효용을 제한하는 부작용을 일으킨다. 최근에서야 종양 특이적 항원(TSA; 예를 들어 트라스투주맵(trastuzumab), 헤르셉틴(Herceptin))을 경유하여 암세포를 특이적으로 타겟으로 삼는 모노클로날 항체가 암세포에 대한 임상의들의 무기로 자리잡았다. 펩타이드, 폴리펩타이드 및 항체를 포함하면서 정상세포와 암세포를 구분할 수 있는 생물학적 치료는 중요한 치료상 이점을 제공할 것이다.
암세포와 결합하고 이를 억제하는 소분자 약제는 암 치료에 있어서 또 다른 새로운 선택이 될 수 있다. 엘로티닙(erlotinib) 및 게피티닙(gefitinib)(비소세포성 폐암(non small cell lung cancer)의 치료를 위한 EGFR 티로신 키나아제 억제 자)과 같은 약제들은 암세포를 특이적으로 타겟으로 하여 억제하는 소분자물질의 제 1 세대이다. 선택적인 결합 및 억제 특성을 설계하기 위해 컴퓨터 모델링을 사용하면서 소분자 항암제의 연구 및 개발은 지난 십년간 비약적으로 발전하여 많은 상품이 시장에 출시되었다. 소분자 물질의 동정 및 합성을 위한 앞으로의 노력은 효율적이고 특이적인 암 치료의 전망을 공한다.
본 발명은 암의 진단과 단계의 결정, 암 치료에 대한 환자의 반응성의 관찰 및 암 환자의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 정상적인 세포보다 암세포에 대하여 더 높은 친화도로 결합하는 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 및 소분자(예를 들어 본 발명의 물질)의 발견에 기초하여 이루어졌다. 본 발명의 조성물 및 방법은 라벨링되거나 라벨링되지 않은 본 발명의 물질이 암세포에 특이적으로 결합하도록 하는 서열목록 1-14서열에 나타난 결합 서열의 구획을 진단 및 치료 목적으로 사용함을 그 특징으로 한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 본 발명의 물질은 HSP70(heat shock protein 70) 단백질로부터 유래된 서열목록 15서열의 에피토프에 결합한다. 특별한 구현예에 따르면 본 발명에서 개시된 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 및 소분자는 정상 조직보다 폐암, 대장암, 유방암 및 전립선암의 암세포에 더 높은 친화도로 결합한다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 천연의 변성되지 않은 형태의 HSP70 단백질 패밀리(예를 들어 HSP70, HSC71, GRP78 및 모르탈린)에 결합하는 물질(예를 들면 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 및 소분자)을 특징으로 한다. 본 발명의 구현예에 따르면, 상기 물질은 암세포(예를 들어 인간 종양세포)에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면 상기 물질은 정상적인 세포(예를 들어 비-암세포)보다 암세포에 더 강한 친화도로 결합한다. 또 다른 구현예에 따르면, 상기 은 서열목록 1-14서열 중 하나 또는 그 이상의 서열과 최소 90%의 일치를 보이는 아미노산 서열을 포함하는 결합부위를 가진다. 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 은 항체(예를 들어, 다이아바디, 양특이성 항체(bi-specific antibody), Fab(fragment antigen binding) 절편, F(ab)2 분자, scFv(single chain Fv) 분자, 직렬 scFv 분자, 모노클로날 항체(mAbs), 폴리클로날 항체 및 항체 융합 단백질)이다. 또 다른 구현예에 따르면, 상기 항체는 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체 또는 자연발생적 항체일 수 있으며, IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE 아이소타입 중 하나일 수 있다. 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 은 공유결합을 통해 직접, 또는 전하 상호작용(예를 들어 이온결합, 소수성 결합, 수소 결합 또는 반데르 발스 힘)을 통해 간접적으로 검출 가능한 라벨(예를 들어 방사성 표지(예를 들어 테크네튬-99m, 아이오다인-123, 아이오다인-131 또는 인듐-111), 형광표지(예를 들어 플루오루포어(fluorophore)), 효소 표지, 중금속(예를 들어 이완금속), 비색형 표지 또는 자기공명 표지), 치료적 또는 세포독성 또는 킬레이트 에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 은 서열목록 1-14서열들 중 하나 또는 그 이상의 서열과 최소 80%, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 일치를 보이는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에 의하면, 본 발명의 은 DYWDTSWPLLLF(서열목록 11서열)의 서열을 가지는 결합부위를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 은 암조직(예를 들어 유방암, 전립선암, 대장암 또는 폐암)을 타겟으로 삼는다. 또 다른 구현예는 PEG화(PEGylation), 크로스링크 또는 다른 화학적 변형에 의해 변형된 본 발명의 을 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 은 약학적으로 허용가능한 어너(earner) 또는 첨가제와 함께 정제화 될 수 있다.
본 발명의 두 번째 양태에 따르면, 본 발명의 방법은 암을 이미지화 하거나 진단하기 위해 본 발명의 첫 번째 양태의 (예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 및 소분자)를 사용한다. 본 발명의 구현예에 따르면, 상기 은 종양 또는 인간 환자나 그들로부터 인비보(in vivo) 또는 인비트로(in vitro)에서 채취한 시료의 종양세포 함유 부위를 이미지화하기 위해 사용된다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 방법은 인비보에서 포유류로부터, 또는 인비트로에서 환자에게서 채취한 생물학적 시료로부터 종양을 검출하기 위해 사용된다. 바람직하게는 이들 방법은 (a) 검출 가능하도록 표지된 본 발명의 (예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)으로서 서열목록 1-14 서열 중 하나 또는 그 이상의 서열을 가지는 하나 또는 그 이상의 결합 부위를 포함하는 (또는 서열목록 1-14 서열 중 하나 또는 그 이상의 서열과 최소 80%, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 일치를 보이는 아미노산 서열을 가지는 분자)을 제공하는 단계; (b) 상기 을 환자에게 투여(예를 들어 정맥 투여)하거나 환자로부터 채취한 생물학적 시료에 접촉시키는 단계; (c) 상기 시료가 암 조직에 결합하도록 하고 결합하지 않은 시료가 체내나 시료 내에서 제거되도록 하는 단계; 및 (d) 종양 또는 종양 함유 부위의 이미지를 얻거나 표지된 의 암세포에의 결합을 검출함으로써 암을 진단하는 단계를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기와 같이 얻어진 이미지는 체내의 초기 암의 위치를 보여주기 위해 또는 몸 전체에서의 암의 전이를 검출하기 위해 몸 전체를 포함하는 이미지일 수 있다. 또는 상기 이미지는 몸의 일부 부위 내에서의 종양조직의 크기나 범위를 더 잘 알아보기 위해 몸의 일부(예를 들어 두경부, 흉강, 가슴 또는 복부)만의 이미지일 수도 있다. 바람직하게는 상기 이미지는 감마 신티그래피로부터 얻은 것이다.
본 발명의 세 번째 양태에 따르면, 본 발명의 방법은 본 발명의 (예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 및 소분자)을 인비보에서 포유류의 암(예를 들어 종양)을 치료하기 위하여 사용하는 것을 특징으로 한다. 바람직한 구현예는 다음의 단계를 포함한다: (a) 검출 가능하도록 표지된 진단학적 유효량의 분자를 투여하는 단계로서 상기 분자는 서열목록 1-14서열을 가지는 펩타이드 중의 하나를 가지는 분자(또는 서열목록 1-14 서열 중 하나 또는 그 이상의 서열과 최소 80%, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 99% 또는 100%의 일치를 보이는 아미노산 서열을 가지는 분자)인 것을 특징으로 하는 단계; 및 (b) 포유류의 조직에 결합한 분자의 검출 가능한 표지의 존재를 검출하는 단계로서 주변보다 표지의 양이 많으면 포유류에 종양이 있음을 암시한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 유방암에 걸린 것으로 의심되는 인간 환자를 대상으로 하며, 상기 조직은 유방 조직이다. 또 다른 바람직한 구현예에 따르면 상기 방법은 전립선암에 걸린 것으로 의심되는 인간 환자를 대상으로 하며, 상기 조직은 전립선 조직이다. 또 다른 바람직한 구현예에 따르면 상기 방법은 대장암에 걸린 것으로 의심되는 인간 환자를 대상으로 하며, 상기 조직은 대장 조직이다. 또 다른 바람직한 구현예에 따르면 상기 방법은 전립선암에 걸린 것으로 의심되는 인간 환자를 대상으로 하며, 상기 조직은 전립선 조직이다. 또 다른 바람직한 구현예에 따르면 상기 방법은 폐암 또는 기관지암에 걸린 것으로 의심되는 인간 환자를 대상으로 하며, 상기 조직은 폐 또는 기관지 조직이다. 바람직하게는, 검출 가능한 표지가 된 펩타이드는 방사성핵종(radionuclide)(예를 들어 테크네튬-99m)에 결합되어 있으며, 검출 단계는 방사성 이미지(예를 들어 감마 신티그래피)로 완성된다.
본 발명의 네 번째 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 첫 번째 양태의 펩타이드(예를 들어 서열목록 1-14 서열 중 하나 또는 그 이상의 서열과 최소 80%, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 일치를 보이는 아미노산 서열을 가지는 하나 또는 그 이상의 펩타이드)를 암세포에 친화도를 가지는 항체를 만드는데 사용한다. 항체는 재조합되어 만들어질 수 있으며, 인비보에서 포유류의 암(예를 들어 종양)의 검출 및 치료를 위한 진단용 또는 치료용으로 각각 정제될 수 있다. 본 발명의 항체는 천연의변성되지 않은 형태의 HSP70 단백질 패밀리(예를 들어HSP70, HSC71, GRP78 및 모르탈린)와 결합하는 하나 또는 그 이상의 결합 부위를 가진다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 서열목록 15서열 (GIPPAPRGVPQIEVTF: HSP70의 아미노산 463-478)의 서열과 최소 90%, 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 99% 또는 100%의 동일성을 가지는 HSP70 단백질의 에피토프에 결합할 수 있는 하나 또는 그 이상의 결합부위를 가진다. 바람직하게는, 본 발명의 항체의 적어도 하나의 결합부위는 서열목록 1-14서열 중 하나 또는 그 이상의 서열에서 선택된 아미노산 서열을 가진다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체의 결합부위는 아미노산 서열 DYWDTSWPLLLF(서열목록 11서열)를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 재조합항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 자연발생적 항체일 수 있다. IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE 아이소타입 중 하나일 수 있다. 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 다이아바디, 양특이성 항체(bi-specific antibody), Fab(fragment antigen binding) 절편, F(ab’)2 분자, scFv(single chain Fv) 분자, 직렬 scFv 분자, 모노클로날 항체(mAbs), 폴리클로날 항체 및 항체 융합 단백질일 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE에서 선택된 아이소타입 중 하나일 수도 있다.
본 발명의 다섯 번째 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 항체를 이용하여 암세포의 숫자 또는 악성을 처리, 고정, 억제 또는 감소시키는 것 또는 종양의 크기를 처리, 고정, 억제 또는 감소시키는 것과 같은 종양 상태의 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 본 발명의 항체로서 서열목록 1-14 서열 중 하나 또는 그 이상의 서열을 가지는 적어도 하나의 결합 부위를 포함하는 항체(또는 서열목록 1-14 서열과 최소 80%, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 일치를 보이는 아미노산 서열을 가지는 항체)의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 또한 서열목록 15서열과 최소 90%, 바람직하게는 95%, 보다 바람직하게는 99% 또는 100%의 일치를 보이는 아미노산 서열을 가지는 결합부위를 포함하는 항체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 유방암, 전립선암, 대장암 또는 폐나 기관지암에 걸린 환자를 대상으로 한다. 바람직하게는 항체는 검출 가능한 표지, 세포독성 또는 치료적 또는 킬레이트 에 직접적으로 결합(예를 들어 공유결합 또는 링커 모이어티를 경유하여)하거나 전하 상호작용을 통해 간접적으로 결합한다.
본 발명의 여섯 번째 양태에 따르면, 본 발명의 방법은 소분자가 서열목록 15서열의 아미노산 서열 또는 서열목록 15서열의 아미노산 서열과 최소 90% 일치를 보이는 서열과 높은 친화도로 결합하는지 여부를 결정한다. 이 방법은 또한 암세포에만 결합하고 정상세포에는 결합하지 않는 소분자를 스크리닝하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일곱 번째 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 진단 및 치료적 구현예에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 본 발명의 (예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)으로서 서열목록 1-14 서열(또는 서열목록 1-14서열과 최소 80%, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 일치를 보이는 아미노산 서열)을 가지는 , 검출 가능한 표지, 치료적 , 킬레이팅 또는 링커 모이어티를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트의 각각의 구성(펩타이드, 폴리펩타이드 또는 항체 및 검출가능한 표지, 치료적 , 킬레이팅 또는 링커 모이어티)은 키트 내에서 분리되어 포장된다. 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트는 미리 계산된 양(예를 들어 대상체의 암을 진단 또는 치료하는데 충분한 양)의 검출가능한 표지, 치료적 , 킬레이팅 또는 링커 모이어티을 포함한다. 및 검출가능한 표지, 치료적 , 킬레이팅 또는 링커 모이어티는 장기간 저장을 위해 동결 건조될 수 있다. 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 항체 및 검출가능한 표지, 치료적 , 킬레이팅 또는 링커 모이어티는 살균 컨테이너에 밀봉될 수 있다. 상기 키트는 바람직하게 키트와 그 구성물을 사용하기 위한 설명서를 포함한다. 예를 들어, 사용 전에 Tc-99m- 과산화테크네슘(pertechnetate)은 핵 의학 시설 및 병원 방사성약국에 등장 살균 식염수와 함께 있는 Tc/Mo 제네레이터로부터 녹여서 분리될 수 있다. 그리고 키트에 포함된 펩타이드는 Tc-99m-과산화테크네슘과 환원제 하에서 결합되어 선택된 Tc-99m-과산화테크네슘의 양을 감소시킴으로써 원하는 Tc-99m- 펩타이드 콘쥬게이트를 얻을 수 있다. 환원제의 예는 염화 주석(stannous chloride) 및 나트륨 다이싸이오나이트(sodium dithionite)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 금속 킬레이트 의 예는 이미노카르복시 및 폴리아미노카르보닐 반응기, DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid), DOTA(1, 4,7,10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraacetic acid)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어“약”은 인용된 값의 ±10% 값을 나타낸다.
본 명세서에서 용어“투여” 또는 “투약”은 본 발명의 조성물(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)를 포우류(예를 들어 인간)에 주입하는 것을 의미하며, 그 방법은 전신투여, 구강투여, 정맥내투여, 복강내 투여 또는 근육내 투여이다. 바람직한 투여방법은 예를 들어 치료 조성물의 성분, 잠재적 또는 실재적 발병부위(예를 들어 폐암, 유방암, 대장암 또는 전립선암의 위치), 발병의 정도와 같은 다양한 요인에 따라 좌우된다.
본 명세서에서 용어“아날로그(analog)”란 해당 분자와 다르지만 구조적, 기능적, 및/또는 화학적으로 연관된 분자를 말한다. 아날로그는 본질적 특징, 기능 또는 기준 분자의 구조를 유지한다. 가장 바람직하게는, 아날로그는 기준분자가 가지는 적어도 하나의 생물학적 기능을 가진다. 일반적으로 차이점은 제한적이기 때문에 기준 분자와 아날로그는 전체적으로 구조나 서열이 비슷하다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드 아날로그 및 이들의 기준 펩타이드 또는 기준 폴리펩타이드는 한 개 또는 그 이상의 치환, 첨가 및/또는 삭제와 이들 간의 조합에 의해 아미노산 서열이 다를 수 있다. 치환되거나 삽입된 아미노산 잔기는 자연계의 아미노산일 수도 있고 아닐수도 있다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 아날로그는 대립형질변형(allelic variant)과 같이 자연적으로 발생한 것일 수 있고 혹은 자연적으로 발생하지 않는 것으로 알려진 변이일 수 있다. 자연적으로 발생하지 않는 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 아날로그는 합성, 변형 또는 돌연변이 생성기술에 의해 만들어질 수 있다.
본 명세서에서 용어“항체”란 서열목록 1-14서열 중 하나 또는 그 이상의 서열을 가지는 (또는 서열목록 1-14인 서열 중 하나 또는 그 이상의 서열과 최소 90%, 95% 또는 99%의 일치를 보이는 아미노산 서열을 가지는 항체(예를 들어 서열목록 1-14 서열을 가지는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되거나 삭제될 수 있다)) 재조합, 합성 또는 자연계의 항체의 일부분 또는 전부를 말하며, 상기 열은 상보성 결정 부위에 존재한다. 용어“항체”는 HSP 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 어떠한 폴리펩타이드도 포함하며, 여기에는 예를 들어 온전한 항체, 키메라항체, 다이아바디, 양특이성 항체, Fab 절편, F(ab)2 분자, scFv(single chain Fv) 분자, 직렬 scFv 분자 및 항체 융합 단백질을 포함한다. 완전하고 온전한 항체는 뮤린(murine) mAb와 같은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라항체, 인간화 항체 및 인간 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는 둘 또는 그 이상의 포유류 종 또는 하나의 포유류 종에서 유래한 폴리펩타이드 서열일 수 있다. 상기 항체는 합성되어진 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 항체는 인간 항체로부터 유래한 구조부위 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 “인간화(humanized)된 것”일 수 있으며, 이는 하나 또는 그 이상의 부위(예를 들어 다양한 부위의 하나 또는 그 이상의 CDR 내부)에 비-인간 잔기를 포함함을 말한다. 본 발명의 항체는 에피토프의 HSP70 단백질에 대한 증가된 특이성 및 친화도를 제공하며, 증가된 조직 반감기를 가진다.
일반적으로, 본 발명의 키메라 항체는 비-인간 포유류(예를 들어 마우스, 레빗 또는 고트)로부터 재조합된 결합 서열과 인간 항체로부터 유래한 고정 부위 서열로 구성된다.
항체의 생산, 온전한 항체, Fab 절편, scFv절편 및 F(ab)2 절편과 같은 항체 절편의 단백질 구조의 생산 및 이러한 분자를 인코딩하는 유전자 서열의 구성은 이미 알려져 있으며 예를 들어 Harlow et al. ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. N.Y. (1988) 및 Harlow et al. USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL. Cold Spring Harbor Press (1999)에 개시되어 있고 본 명세서에서 참고문헌으로서 삽입되었다.
본 명세서에서 용어“킬레이트 ”이란 단일 금속 원자와 다중 화학 결합을 이루는 분자를 말한다. 결합을 형성하기에 앞서, 킬레이트 은 한 쌍 이상의 비공유 전자쌍을 가진다. 결합은 금속 원자와 전자쌍을 공유함으로써 형성된다. 킬레이트 은 예를 들어, 이미노디카르복실 그룹 또는 폴리아미노폴리디카르복실 그룹을 포함한다. 킬레이트 은 Liu et al. Bioconjugate Chem 12(4):653. (2001) : Alter et al. U.S.P.N. 5.753,627 및 PCT 공개번호 WO 91/01144(이들은 본 명세서에서 참고문헌으로서 삽입되었다)에 개시된 방법을 사용하여 본 발명의 (예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)과 결합할 수 있다. 본 발명의 은 결합한 킬레이트 에 통해 검출 가능한 표지와 복합체를 이룰 수 있어 결과적으로 간접적으로 표지될 수 있다. 이와 유사하게, 세포독성 또는 치료적 은 킬레이트 그룹을 경유하여 본 발명의 과 결합할 수 있다.
본 명세서에서 용어“상보성 결정 부위”또는“CDR”이란 항체가 특정 에피토프에 결합할 수 있게 해주는 과가변성(hypervariable)부위인 항체의 아미노산 또는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 말한다(Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Ed. U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 완전한 항체에는 항체의 가변(variable) 부위에 3개의 무거운 사슬과 3개의 가벼운 사슬의 CDR(또는 CDR 부위)가 있다. 항체 결합부위를 형성하는 가변부위는 가변부위에 포함된 비교적 보존된 프레임워크 부위(FR)에 의해 정렬되었다. CDR 및 FR 잔기들은 Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest National Institutes of Health. Bethesda, Md. (1987) 및 (1991)의 표준 서열 정의에 의해 설명된다.
본 명세서에서 용어“결합된”은 공유결합이나 비공유적 분자간 상호작용에 의해 첫 번째 분자가 두 번째 분자에 결합하는 특성을 말한다.
본 명세서에서 용어 “세포독성 시료”는 자연발생적이거나, 변형되었거나 또는 합성된 화합물로써 종양세포에 독성을 나타내는 것을 말한다. 이러한 시료는 종양을 치료하거나 세포증식 또는 세포 숫자 초반응성과 관련된 다른 증상이나 질병을 치료하는데 유용하다. 세포독성 물질은 알킬화 , 항생제, 대사길항물질, 튜불린 억제제, 토포이소머라제 I 및 II 억제제, 호르몬 작용제 또는 길항제, 또는 면역조절물질(Immunomodulator)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 세포독성 물질은 빛이나 적외선(Photofrin. IR dyes: Nat Biotechnol 19(4):327-331 (2001))이 다른 기계적 경로를 통하여 작동되어 활성화 될 경우 세포독성을 띄거나, 혹은 보충적인 강화 이 될 수도 있다.
본 명세서에서 용어 “검출 가능한 시료”란 본 발명의 (예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)에 결합되었을때 이 검출되도록 하는 모든 형태의 표지를 말한다. 검출 가능한 표지는 독성 또는 비독성일 수 있고, 하나 또는 그 이상의 하기의 특징을 제한 없이 가질 수 있다: 형광(Kiefer et al. WO 9740055), 색깔, 독성(예를 들어 방사능, 예를 들어 감마-방사 방사성핵종, 오거(Auger)-방사 방사성핵종, 베타-방사 방사성핵종, 알파-방사 방사성핵종 또는 양전자-방사 방사성핵종), 방사능과민성 또는 광과민성. 검출 가능한 표지는 본 발명의 에 직접적으로 결합하거나(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 항체의 잔기에 결합하거나 혹은 소분자에 화학 결합을 함으로써) 또는 본 발명의 에, 예를 들어 에 결합(예를 들어 공유결합 또는 간접적 결합을 통해)한 킬레이트기와 복합체를 이룸으로써, 간접적으로 결합할 수 있다. 검출 가능한 표지는 두 번째 분자에 의해 특이적으로 결합되는 능력에 의해 본 발명의 과 간접적으로 결합할 수 있다. 이와 같이 간접적으로 결합하는 표지의 예로 바이오틴 라벨(biotin label)이 있는데, 이는 두 번째 분자인 스트렙타비딘(streptavidin)과 특이적으로 결합할 수 있다. 두 번째 분자는 중성자 포획(예를 들어 Kahl et al. Proc Natl Acad Sci USA 87:7265-7269 (1990)에 서술된 붕소 케이지)이 가능한 부분에 결합할 수도 있다.
검출 가능한 표지는 중원소나 Gd3 +, Fe3 +, Mn3 + 또는 Cr2 +(Invest Radiol 33(10):752-761(1998))와 같은 회토류 이온(rare earth ions)에서 유래된 금속 이온일 수도 있다. 바람직한 방사성 검출가능 표지는 본 발명의 아날로그에 존재하는 D- 또는 L-Tyr 또는 D- 또는 L-4-아미노 페놀 잔기와 결합할 수 있는 방사성 요오드 표지(예를 들어 122I, 123I, 124I, 125I 또는 131I)를 포함한다. 바람직한 비-방사성 검출 가능 표지는 아미노산 잔기의 N-말단과 결합할 수 있는 많은 알려진 염색을 포함한다.
세포에 독성을 띌 수 있는 검출 가능한 표지의 바람직한 예는 리신(ricin), 디프테리아 톡신(diptheria toxin) 및 방사성 검출 가능 표지(예를 들어 122I, 123I, 124I, 125I, 131I, 177Lu, 64Cu, 67Cu, 153Sm, 166Ho, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi, 225Ac, 67Ga, 68Ga, 75Br, 76Br, 77Br, 177 mSn, 47Sc, 109Pm, 89Sr, 159Gd, 149Pm, 142Pr, 111Ag, 165Dy, 213Bi, 111In, 114 mIn, 201Ti, 195 mPt, 193Pt, 86Y 및 90Y)를 포함한다. 이들 화합물 및 본 명세서에서 서술된 다른 화합물들은 본 발명의 (예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자) 또는 그 아날로그와 직접적으로 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 독성인 검출 표지도 화학 치료적 (예를 들어 캠프토세신(camptothecin), 호모 캠프토세신, 5-플루오로우라실,아드리아마이신(adriamycin)) 또는 방사성 민감제(예를 들어 탁솔, 겜시타빈(gemcitabine), 플루오로피리미딘, 메트로니토질 또는 디옥시사이티딘 아날로그인 2',2' 디플루오로- 2'-디옥시사이티딘(dFdCyd))가 될 수 있다.
검출 가능한 표지는 본 발명의 (예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)과 결합했을 때 신호 변환장치에 의해 검출될 수 있는 신호를 방출한다. 검출 가능한 표지가 방사성 핵종인 경우와 같은 몇몇 경우에, 검출 가능한 표지는 신호를 자발적으로 방출할 수 있다.
검출 가능한 표지가 이완 금속인 경우와 같은 다른 경우에는 검출 가능한 표지는 외부의 자극의 결과로서 신호를 방출한다. 신호의 예들은 감마선, 엑스선, 가시광선, 적외선 에너지 및 전파를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 신호 변환장치의 예로써 SPECT/CT 장치를 포함하는 감마 카메라, PET 스캐너, 플루오리미터(fluorimeter) 및 자기공명영상(MRI)기계를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에서 용어“진단학적 유효량”은 검출 가능하도록 표지된 본 발명의 (예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)의 투여량으로써, 포유류 내부에 투여된 경우 포유류 외부의 신호 변환 장치(예를 들어 감마 신티그래피에서 이용되는 감마 카메라)에 의해 검출되기에 충분한 양이나 약리학적 효과를 나타내기엔 불충분한 양을 말한다.
본 명세서에서 용어“에피토프”는 항체나 항체의 일부분이 특이적으로 결합하는 항원 분자의 부위를 말한다. 에피토프는 고유의 상태에서 단백질 폴딩에 의해 가깝게 붙어있는 단백질 항원 분자의 다른 부위의 잔기로부터 형성된 3차원적 서열에 의해 형성되거나, 또는 변성된 형태의 단백질이나 펩타이드의 선형 서열로부터 형성될 수 있다. 본 명세서에서 용어“에피토프”는 또한 3차원적 에피토프가 아닌 HSC 70 단백질 패밀리(HSP70, GRP78 및 HSC71)로부터 만들어진 에피토프를 의미하기도 한다. 바람직한 에피토프는 면역원(예를 들어 항체, 항체 절편 또는 면역원 융합 단배질)에 결합했을 때 암의 증식이나 전이를 억제하는 것들이다.
본 명세서에서 용어“열충격단백질”또는“HSP”는 세포적 혹은 환경적 스트레스(예를 들어 갑작스런 온도 상승이나 글루코스의 결핍)에 노출되었을 때 세포에서 분비되는 단백질을 의미한다. 열충격단백질의 패밀리는 막 사이의 단백질 이동에 관여하는 HSP70 단백질을 포함한다. HSP70 단백질은 일반적으로 암세포에서 증가한다. HSP70 및 HSP 패밀리의 예는 미국 등록특허 제5,627.039호 및 미국출원 제20030211102호 및 제20060270622호에 개시되어 있으며 본 명세서에서 참고문헌으로서 삽입되었다.
본 명세서에서 용어“인간화 항체”는 인간의 프레임워크 부위와 하나 또는 그 이상의 비-인간(예를 들어 마우스 또는 래빗) CDR을 포함하는 키메라 항체 타입을 말한다. CDR을 공급하는 비-인간 항체는 “공여자”로 불리고 프레임워크를 제공하는 인간 항체는 “수용자”로 불린다. 불변 부위는 존재할 필요가 없으나, 만약 존재한다면 인간 항체의 불변 부위와 실질적으로 동일(예를 들어 최소 85-90%, 바람직하게는 95% 이상의 동일성)해야 한다. 따라서, 인간화 항체의 모든 부위는, CDR을 제외하고, 자연적 인간 항체의 상응하는 부위의 서열과 실질적으로 동일해야 한다.
본 명세서에서 용어“영상화 ”은 포유류(예를 들어 인간)같은 생명체에 투여됐을 때 대상체의 내부 구조의 시각화를 가능하게 하거나, 대상체의 조직 또는 기관의 기능에 관한 측정을 가능하게 하는 조성물을 말한다. 영상화 의 예는 본 발명의 (예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)과 직접적으로 또는 간접적으로 결합할 수 있는 FDG를 포함한다.
본 명세서에서 용어“링커 모이어티”는 본 발명의 (예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)을 킬레이트 에 결합시키는 아미노산 서열을 말한다.
본 명세서에서 용어“종양(neoplasm)”은 과도한 세포분열의 결과로 비정상적 성장을 하는 어떠한 조직 또는 그 조직의 세포를 말한다. 종양은 양성일수도 악성일수도 있다. 종양의 예는 폐 또는 기관지 암종, 직장 암종, 유방 암종 또는 전립선 압종을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어“펩타이드”는 5개 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 의미한다. “펩타이드”는 보통 펩타이드 또는 올리고펩타이드로 불리는 짧은 사슬과, 약 100개의 잔기를 가지는 긴 사슬 및 펩타이드 결합이나 변형된 펩타이드 결합으로 서로 연결된 고리형 또는 가지형 펩타이드를 모두 가리킨다. 펩타이드는 유전자로부터 인코딩된 20개의 아미노산 이외의 아미노산(예를 들어 자연발생적이지 않은 아미노산) 및 펩타이드 결합 이외의 결합(예를 들어 N-치환 글라이신 펩토이드(peptoid) 결합)을 포함할 수 있다. “펩타이드”는 자연적 과정에 의해 또는 당업계에 알려진 화학적 변형 기술에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함한다. 변형은 펩타이드 백본(backbone), 아미노산 곁사슬, 아미노 또는 카르복시기 말단을 포함하는 펩타이드 서열의 어느 위치에서도 일어날 수 있다.
본 명세서에서 아미노산 잔기를 나타내기 위해 사용된 기호는 당업계에서 통상적으로 사용되는 약자이다. 다소 흔치 않은 약자는 각각 2-아미노-부티릭 에시드, 아미노 발레릭 에시드d, 베타-아미노프로피오닉 에시드, 호모세린, 노르루신, 노르밸린, (2,3 또는 4)3-피리딜-알라닌, 1,4-다이아미노부티릭 에시드 및 1.3-다이아미노프로피오닉 에시드를 나타내는 Abu, Ava, β-Ala, hSer, NIe, Nva, Pal, Dab, 및 Dap 이다. 본 발명의 모든 양태에 있어서, 아미노산은 D- 또는 L- 형태로 표시되지 않은 경우 아미노산은 D- 또는 L- 형태 어느 것도 될 수 있다.
본 명세서에서 용어“환원제”는 다른 화합물에 전자를 공여함으로써 이를 환원시키고 스스로는 산화되는 화합물을 말한다. 환원제의 예로는 리튬 알루미늄 하이드라이드(LiAlH4), 발생기의 수소, 소듐 아말감, 소듐 보로하이드라이드(NaBH4), 주석이온, 아황산 화합물, 하이드라진(Wolff-Kishner 반응), 아연-수은 아말감, 다이이소부틸알루미늄 하이드라이드(DIBAH), 린들라 촉매 및 옥살산(C2H2O4)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 “특이적으로 결합”한다고 함은 본 발명의 (예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)이 타겟(예를 들어 유방암세포, 전립선 암세포, 대장암 세포, 또는 폐암 세포와 같은 종양세포)이 인 비보(in vivo)에 존재하든 인비트로(in vitro) 샘플(예를 들어 종양 세포를 포함하는 생물학적 시료)에 존재하든 이를 인식하고 결합하되, 타겟이 아닌 세포(에를 들어 비-종양 세포)를 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 것을 말한다. 바람직한 본 발명의 은 암세포(유방암세포, 전립선 암세포, 대장암 세포, 또는 폐암 세포)에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 본 발명의 은 비-종양 세포보다 종양 세포에 2, 5, 10, 20, 100, 또는 1000배의 친화도로 결합한다. 또한, 본 발명의 은 서열목록 15의 서열을 가지는 HSP70 에피토프에 10-6 이하의 해리상수로, 보다 바람직하게는 10-7, 10-8 , 10-9 , 10-10 , 10-11 또는 10-12 이하의 해리상수로, 가장 바람직하게는 10-13, 10-14 또는 10-15 이하의 해리상수로 결합한다.
본 명세서에서 용어“실질적 서열 동일성”또는 “실질적으로 동일한”은 기준 아미노산 서열과 최소 50%, 바람직하게는 60%, 70%, 75% 또는 80%, 보다 바람직하게는 85%, 90% 또는 95%, 가장 바람직하게는 99%의 동일성을 가지는 펩타이드 또는 폴리펩타이드(항체 또는 항체 절편 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다)를 말한다. 비교 서열의 길이는 최소 5개 아미노산, 바람직하게는 최소 10개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 최소 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 또는 350개의 연속적인 아미노산, 가장 바람직하게는 전체 아미노산 서열의 길이이다. 바람직하게는 본 발명의 펩타이드의 서열은 기준 서열(예를 들어 서열목록 1-14서열인 하나 또는 둘 이상의 펩타이드)과 최소 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99%의 동일성을 가진다. 서열 동일성은 전형적으로 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 또는 이것에 특화된 디폴트 파라미터를 사용하여 측정될 수 있다(Altschul et al. J Mol Biol 215:403-410 (1990): 및 Tatiana et al. FEMS Microbiol Lett 174:247-250 (1999)). 이 소프트웨어 프로그램은 다양한 치환, 삭제 및 다른 변형의 정도를 정함으로써 유사한 서열을 매치시킬 수 있다. 보존적 치환은 전형적으로 다음의 그룹 내에서의 치환을 포함한다: 글라이신, 알라닌, 밸린, 이소루신, 루신; 이스파르틱 에시드, 글루타믹 에시드, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 쓰레오닌; 라이신, 알기닌; 및 페닐알라닌, 티로신.
본 명세서에서 용어“치료제”는 암의 검출, 진단 또는 치료를 위해 사용되는 것으로 당업계에 알려진 모든 화합물을 포함한다. 이들 화합물은 자연 발생적인 것일 수도 있고, 변형되거나 합성된 것일 수도 있다. 치료제는 예를 들어 세포증식 억제제 및/또는 세포 독성제를 포함하는 항종양제일 수 있다. 항종양제는 알킬레이트 , 항생제, 호르몬 작용제 또는 길항제, 튜불린 억제제, 토포이소머라제 I 및 II 억제제, 항-(anti-) 또는 전(-pro-) 세포사 (apoptotic agent), 면역조절물질(Immunomodulator)일 수 있다. 항종양제는 다른 기계적 경로로 작용할 수 있으며, 또는 항종양제는 보충적 강화제일 수 있다.
본 명세서에서 용어“치료적 유효량”은 포유류 체내에 투여되었을 때 약리학적 효과를 나타내기에 충분한 본 발명의 (예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)의 투여량을 말한다. 예를 들어, 암이나 종양을 치료함에 있어서, “치료적 유효량”은 임상적으로 중요한 효과 즉, 종양의 크기나 암세포의 증식을 고정 또는 감소시키거나, 통계적으로 본 발명의 과 함께 본 발명의 방법을 이용한 치료를 받은 환자의 생존율을 그렇지 않은 환자와 비교하여 의미있는 향상을 보이는 효과를 나타내기에 충분한 양이다
본 명세서에서 용어“암의 치료, 안정화 또는 억제”는 종양의 크기 또는 암세포의 숫자를 감소시키거나, 종양의 크기 증가 또는 암세포의 증식을 둔화 또는 억제하거나, 암치료 후 재발시까지의 무질환 생존 기간을 연장시키거나, 초기 또는 이후의 종양 또는 다른 암의 발생을 막거나, 종양 또는 다른 암과 관련된 다양한 증상을 감소시키는 것을 말한다. 바람직한 구현예에 따르면, 어떠한 표준적 분석기(예를 들어 캐스페이스(caspase) 분석, TUNEL 및 DNA 절편 분석, 세포 투과성 분석 및 아넥신 V 분석)를 이용하여 측정하여도 치료후 생존한 종양 또는 암세포의 백분율은 초기의 종양 또는 암세포의 숫자보다 최소 20, 40, 60, 80, 또는 100% 더 낮다. 바람직하게는, 본 발명의 의 투여로 인한 종양 또는 암세포의 감소는비-종양 또는 비-암세포의 감소보다 최소 2, 5, 10, 20 또는 50배 더 높다. 바람직하게는, 본 발명의 방법으로 인해 종양의 크기나 암세포의 숫자는 표준적인 방법으로 측정했을 때 20, 40, 60, 80 또는 100% 감소한다. 바람직하게는, 치료를 받은 대상체의 최소 20, 40, 60, 80, 90 또는 95%가 완치되어 종양이나 암이 사라졌음을 보인다. 바람직하게는, 종양 또는 암은 재발되지 않거나 최소 5, 10, 15 또는 20년 간 재발되지 않는다.
본 발명의 다른 특성이나 이점은 이하의 상세한 설명, 그 바람직한 구현예 및 청구범위를 통해 명확해진다.
본 발명은 암의 진단 및 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 암세포는 어떠한 막결합 물질(예를 들어 HSP70(HSP72로도 알려짐), HSC70(HSP73으로도 알려짐), Grp78(BiP로 알려짐), 모르탈린, HSP60 및 HSC71과 같은 HSP 70 패밀리의 단백질)을 비-암세포보다 높은 레벨로 분비한고 결론내렸다. 그 결과, 이들 분자는 암 특이적인 치료제 및 진단제를 발견하는 유용한 타겟이 되었고, 이로 인해 세포독성제의 검출 및/또는 암세포에의 타겟팅을 촉진시키고 주변의 정상세포에 대한 독성을 제거 또는 감소시킨다. 암세포의 분자들을 차별적으로 표시하려는 이전의 노력들은 치료제 또는 진단제에 의해 타겟팅 될 수 있는 유용한 에피토프의 동정에 실패하였다. 본 발명의 조성물 및 방법은 HSP70 단백질 패밀리를 차별적으로 발현하는 암세포로 유도되는 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)를 이용한다. 상기 물질은 암세포의 진단 및 검출에 사용되거나, 상기 물질에 검출 가능한 표지 또는 치료/세포독성제를 포함시키도록 변형하여 암세포의 아폽토시스 또는 세포괴사를 유도하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 물질은 GIPPAPRGVPQIEVTF(서열목록 제15서열)로 정의된 에피토프 또는 상기 정의된 에피토프와 최소 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 가지는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 상기 에피토프는 HSP70 패밀리 단백질(예를 들어 HSP70의 463-478 아미노산)에 존재한다. 특히, 본 발명의 물질은 단독으로 혹은 다른 폴리펩타이드 서열의 일부로서의(예를 들어 암세포에 나타난 폴리펩타이드의 일부) HSP70 에피토프에 결합한다. 바람직하게는, 본 발명의 물질은 HSP70 단백질이 천연 형태로서 암세포 상에 나타난 경우 HSP70 에피토프와 결합한다. 따라서, 본 발명의 물질이 정의된 에피토프에 결합하는 데에 있어서 HSP70 단백질의 변성은 필수적인 것이 아니다. 본 발명의 방법과 물질이 함께 이용될 경우 방관자 독성(bystander toxicity)을 감소시키는 암 치료제 및 진단제의 직접적인 타겟팅을 제공한다.
본 발명의 물질은 의학적 암 영상화 분야에 기여한다. 영상화 분자는 본 발명의 물질에 접합될 수 있고, 영상화 물질이 투여된 포유류의 체내에 암세포의 존재를 확인하는 영상을 얻는데 이용될 수 있다. 한편, 본 발명의 물질에 접합된 영상화 분자는 포유류에서 채취한 생물학적 시료에 접촉될 수 있으며, 이 시료는 시료 내의 암세포에 영상화 물질을 결합시키기 위해 스크리닝 된다. 본 발명의 물질을 통하여 암세포에 결합한 영상화 물질로부터 방출되는 신호를 통해 포유류 또는 포유류로부터 채취한 생물학적 시료에 암세포가 있는지 여부를 확인한다. 본 발명의 영상화 물질은 인비보(in vivo)에서 사용된 경우 몸 전체의 영상화에 쓰일 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 영상화제는 환자의 암 단계를 결정하는데 사용됨으로써 이후의 적절한 치료 방법을 찾아내는데 도움이 된다. 나아가, 본 발명의 영상화제는 하기의 치료에 대한 암 조직의 반응을 검출하는데 사용될 수 있다. 때때로, 이전에 암에 걸렸던 조직이 성공적인 치료에도 불구하고 방사능 촬영 영상(예를 들어 CT 스캔)에 남아있을 수 있다. 이러한 경우에, 본 발명의 영상화 물질은 치료되지 않은 조직 덩어리로부터 성공적으로 치료된 조직을 구분하는데 사용될 수 있다; 본 발명의 영상화제를 투여한 후 조직으로부터 신호의 방출이 없는 경우 조직이 성공적으로 치료되었음을 의미한다. 본 발명은 PET 및 SPECT를 사용하여 더 저렴하고 폭넓게 이용될 수 있는 종양의 영상화가 가능하게 한다.
본 발명의 펩타이드나 폴리펩타이드 물질의 합성
암세포를 타겟팅 할 수 있는 본 발명의 펩타이드 및 폴리펩타이드 물질은 고상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis(SPPS))을 이용한 커프링에 의해 합성되어질 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 펩타이드를 형성하기 위한 기질로서 이용되는 아미노산은 펩타이드 내로 결합되기 전에 Fmoc로 보호된다(Chan. W. C. 및 White, P. D. FMOC Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach. Oxford University Press. New York (2003); 본 명세서에서 참고문헌으로서 삽입되었다). 아미노산들을 결합시켜 본 발명에서 개시된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 형성하는 표준적인 커플링 기술은 당업계에 잘 알려져있다(Chan and White, supra). 예를 들어, 폴라아마이드-링크(polyamide-Rink) 레진은 당업계에 공지된 화학적 프로토콜(Chan and White, supra)을 이용하여 폴리아마이드 레진에 Fmoc-Rink를 로딩시킴으로써 제조된다. 당업계에 공지된 기술을 사용하여, 피페리딘을 이용하여 레진의 N-말단 아민으로부터 Fmoc를 제거한 후 레진에 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 첫 번째 아미노산을 결합시킨다. 일단 결합이 완료되면, 레진을 세척하고 결합된 아미노산으로부터 피페리딘을 이용하여 Fmoc를 제거한다. 레진을 다시 세척한 후, 서열의 다음 아미노산을 이미 결합된 아미노산과 당업계에 공지된 기술에 의해 결합시킨다. 이러한 과정을 원하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 형성될 때까지 반복한다. 마지막 아미노산의 결합 후에 Fmoc 그룹을 피페리딘을 이용하여 제거한다. 말단의 아민은 유리 아민으로 남을 수 있고, 혹은 당업계에 공지된 기술(Chan and White, supra)을 이용하여 아세틸화될 수 있다. 펩타이드 혹은 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 기술(Chan and White, supra)을 이용하여 TFA(trifluoroacetic acid), 트리이소프로필실란(triisopropylsilane) 및 물을 이용하여 레진으로부터 잘려질 수 있다. 잘려진 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 여과를 통해 잔기로부터 분리된다. TFA는 전형적으로 증발되어 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 디에틸 에테르로 침전시킨다. 전형적으로, 마지막 펩타이드 또는 폴리펩타이드 산물은 HPLC를 이용하여 당업계에 공지된 기술(Chan and White, supra)에 따라 정제된다. 질량 스펙트로메트리가 원하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 얻어졌는지를 확인하기 위해 사용된다. 본 발명에서 개시된 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 Applied Biosystems ABI 433 A 펩타이드 합성기와 같은 잘 알려지고 상업적으로 이용 가능한 합성기를 사용한 자동화된 고상 합성법을 통해 쉽게 만들어질 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 물질은 천연 재료로부터 분리되거나, 재조합적으로 만들어지거나, 당업계에 공지된 다른 기술을 이용하여 합성될 수 있다.
본 발명의 소분자
본 발명은 또한 HSP70 패밀리 단백질을 드러내는 암세포에 서열목록 제15인 서열을 가지는 에피토프(혹은 상기 에피토프와 최소 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 가지는 에피토프)에 특이적으로 결합할 수 있는 능력에 기초하여 진단적 혹은 치료적 기능을 하는 소분자에 관한 것이다. 본 발명의 소분자는 표지되거나, 진단적 혹은 치료적 링커, 마커, 세포독성제 또는 암의 진단과 치료를 목적으로 한 본 발명의 다른 구현예와 융합될 수 있다.
HSP70 단백질에 결합하는 소분자의 스크리닝 방법
본 발명은 후보 소분자 물질의 HSP70 패밀리 단백질(특히 서열목록 제 15의서열)에 결합하는 능력을 HTS(high throughput screening)하는 방법에 관한 것이다. 후보 소분자 물질은 또한 암세포에 결합하는 능력, 성장을 억제하는 능력 또는 전이 가능성을 낮추는 능력에 대해서 스크리닝될 것이다. 일반적으로, 후보 소분자 물질은 본 발명의 물질로 부합되기 위해서는 타겟 서열과 10-6 이하의 해리상수로 결합해야 한다.
펩타이드, 폴리펩타이드, 파지 또는 융합분자, 또는 이들의 라이브러리, 또는 서열목록 제15인 서열의 에피토프를 인코딩하는 핵산분자, 또는 서열목록 제15인 서열과 최소 90%의 동일성을 가지는 서열은 HTS 결합 분석 및 방법에 이용될 것이다. 일반적으로, 형광 및 발광에 기초한 분석(예를 들어 ELISA 및 측색분석(colorimetric assay))이 서열목록 제 15 서열의 에피토프를 인코딩하는 단일 또는 다중 타겟 물질에 접촉한 소분자의 결합 친화도를 측정하는데 이용된다. 첫 번째 스크리닝에서 소분자를 동정한 경우, 소분자의 결합 친화도와 결합능력을 두 번째의 별도 HTS 분석을 통해 더 세밀하게 분석하는 것이 필요하다. 이 과정은 예를 들어 결합 친화도의 명확한 결정을 위해 소분자를 서열목록 제15서열의 다양한 에피토프와 접촉시킴으로써 완료될 수 있다. HTS 방법론에 대한 토론은 Verkman. "Drug discovery in academia." Am J Physiol Cell Physiol 286. C465-C474 (2004) 및 Dove. "Screening for content-the evolution of high throughput," Nat Biotechnol 21 :859-864 (2003)에 소개되었다. 유용한 소분자 물질의 발견을 위한 HTS 스크리닝 방법의 예는 미국 특허 제7,279,286호 및 제 7,276,346호에 소개되어있고 본 명세서에서 참고문헌으로서 삽입되었다.
HTS 스크리닝을 거친 후보 소분자는 결합 친화도 또는 암세포 성장억제 능력을 향상시키기 위해 하기에 서술된 설계대로 추가적으로 변형될 수 잇다.
소분자 설계
본 발명의 소분자는 합리적 설계의 원칙에 따라 만들어질 수 있다. 컴퓨터 모델링 기술이 선택된 분자의 3차원적 원자구조의 시각화 및 HSP70 패밀리 단백질과 반응하는 새로운 화합물의 설계를 가능하게 한다. 3차원 구조는 전형적으로 엑스-레이 결정분석 데이터 또는 선택된 분자나 에피토프의 NMR 데이터를 통해 만들어진다. 컴퓨터 그래픽 시스템은 후보 소분자 물질이 HSP 70 패밀리 단백질 또는 에피토프에 어떻게 결합하는지를 예측할 수 있게 하고, 또한 소분자 및 타겟 단백질 구조에 실험적 조작을 가하여 완벽한 결합을 할 수 있게끔 한다. 분자-단백질 양쪽 혹은 한쪽에 작은 변화가 생겼을 때 이들 간 상호작용이 어떤 영향을 받을 것인지에 대한 예측은 분자 기계 소프트웨어 및 고성능 컴퓨터를 이용하여 결정될 수 있다. 분자 모형 시스템의 예로 CHARMm 및 QUANTA 프로그램(Polygen Corporation, Waltham, Mass)이 있다. CHARMm은 에너지 최소화 및 분자 역학 기능을 수행하고, QUANTA는 구조, 그래픽 모형 및 분자 구조 분석을 수행한다. QUANTA는 쌍방향의 구조, 변형, 시각화 및 분자 행동 분석을 가능하게 한다. 소분자 동정에 사용될 수 있는 또 다른 모델링 프로그램은 DOCK (Kuntz Laboratory, UCSF)이다.
HSP70 패밀리 단백질의 형태적, 구조적 특질은 당업계에 공지되었다(Bork et al, "An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins," Proc Natl Acad Sci USA 89(16):7290-4 (1992); Bukau et al, "The Hsp70 and HspβO chaperone machines," Cell 92(3):351-66 (1998); Misselwitz et al, "J proteins catalytically activate Hsp70 molecules to trap a wide range of peptide sequences," MoI Cell 2(5):593-603 (1998), Osipiuk et al, "Structure of a new crystal form of human Hsp70 ATPase domain," Acta Crystallogr D Biol Crystallogr . (Pt 5): 1105-7 (1999); Sondermann et al. "Structure of a Bag/Hsc70 complex: convergent functional evolution of Hsp70 nucleotide exchange factors," Science 291(5508):1553-7 (2001); 및 Tutar, "Key residues involved in Hsp70 regulatory activity and affect of co- chaperones on mechanism of action," Protein Pept Lett 13(7):693-8 (2006)). 이러한 지식은 HSP70 단백질에 결합할 수 있는 소분자를 설계하는데 사용될 수 있다.
소분자의 합성
본 발명의 소분자는 유기 또는 무기 화합물일 수 있으며 핵산일 수도 있다. HSP70 단백질 또는 에피토프에의 특이적 결합은 알맞은 공간적 장소 및 전하를 가지는 화학 그룹이 소분자 내에 존재함으로서 이루어질 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 화합물은 수소결합 공여자 및 수용자 사이트가 타겟분자 또는 에피토프와 상보적으로 나열되도록 설계된다. 물질이 타겟 분자나 에피토프에 결합하므로써 유도되고 안정화되는 특이적 형상이 될 때, 화학적 사이드 그룹이 수소 결합 수여자 및 공여자가 알맞은 공간적 나열을 하도록 물질이 형성된다. 이온 결합 및 반데르발스 상호 작용과 같은 추가적인 결합력도 본 발명의 소분자를 합성할 때 고려될 수 있다. 원하는 형태의 형성 가능성은 분자 자동화 프로그램의 사용에 의해 정교하게 되고 최적화 될 수 있다.
유기 분자는 단단하게 설계될 수도 있고, 또는 수소결합 그룹이 가장자리 또는 평평한 부분에 오도록 설계될 수도 있어, 상보적 사이트와 상호작용을 할 수 있다. Rebek, Science 235, 1478-1484 (1987) 및 Rebek. et al. J Am Chem Soc 109, 2426- 2431 (1987)에서는 이러한 연구 및 단백질의 부위에 화합물이 결합하는 메카니즘을 요약하였다.
합성 방법은 당업자가 HSP70 패밀리 단백질 또는 에피토프의 마이너 그루브의 작용기와 반응하는 소분자를 만들 때 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 조성물의 제조
본 발명은 서열목록 제1-14 서열 중 하나 또는 둘 이상의 서열을 포함하는 항체 조성물을 제공한다. 추가적으로, 본 발명은 서열목록 제 15 서열의 에피토프로서, 천연의 변성되지 않은 에피토프와 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 재조합된 것일 수도 있으며(예를 들어 키메라 도는 인간화 항체), 합성 또는 천연의 항체일 수도 있다. 본 발명은 완전한 항체, 다이아바디, 양특이성 항체, Fab 절편, F(ab)2 분자, scFv(single chain Fv) 분자, 직렬 scFv 분자 또는 항체 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE 아이소타입을 포함한다. 본 발명의 항체는 하나 또는 그 이상의 CDR부위 또는 서열목록 제15서열의 에피토프 또는 상기 에피토프와 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 가지는 서열과 결합하는 펩타이드를 포함한다. 본 발명의 항체는 서열목록 제 15서열 또는 서열목록 제 15서열과 최소 90%의 서열 동일성을 가지는 서열과 10-6 이하의 해리상수로, 보다 바람직하게는 10-7, 10-8 , 10-9 , 10-10 , 10-11 또는 10-12 이하의 해리상수로, 가장 바람직하게는 10-13, 10-14 또는 10-15 이하의 해리상수로 결합한다.
많은 항체들 또는 이들의 절편은 고정 부위 및 가변 부위 모두에서 결합 특이성 또는 작동 기능의 상실 없이도 중요하지 않은 아미노산 치환, 첨가 또는 삭제가 일어날 수 있다. 보통 이러한 변형이 가해지는 항체는 기준 항체와 실질적인 서열 동일성을 보인다. 종종, 변이된 항체는 기준 항체와 비교할 때 동일한 특이성과 증가된 친화도를 가진다. 파지-디스플레이 기술(Phage-display technology)은 이러한 항체를 선택하는 데 있어서 강력한 수단을 제공한다(Dower et al. WO 91/17271; McCafferty et al. WO 92/01047; 및 Huse. WO 92/06204, 본 명세서에서 참고문헌으로서 삽입됨).
항체 절편
본 발명의 또다른 구현예에 의하면, 본 발명의 물질은 본 명세서에서 서술된 온전한 항체의 절편이다. 항체 절편은 분리된 가변부위 중쇄, 가변부위 경쇄, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc 및 Fv를 포함한다. 절편은 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 분리를 통해 만들어질 수 있다. 예를 들어, F(ab') 2 절편은 IgG 분자를 pH 3.0-3.5에서 표준적인 방법에 의해 펩신을 이용하여 단백질 가수분해를 함으로써 얻을 수 있다(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Pubs, N. Y. (1988)). Fab 절편은 F(ab') 2 절편의 제한적 환원으로부터, 혹은 전체 항체를 환원제 하에서 파파인(papain)으로 분해시킴으로써 얻을 수 있다. 절편은 DNA 재조합 기술에 의해서도 만들어질 수 있다. 선택된 절편들을 코딩하는 핵산의 조각은 전체 코딩 서열을 제한효소로 자르거나, 디노보 합성(de novo synthesis)을 통해서 만들어진다. 종종 절편들은 파지가 코팅된 융합 단백질의 형태로 발현된다. 이러한 형태의 발현은 항체의 친화도를 강화하는 데에 유리하다.
인간화 항체
본 발명은 나아가 하나 또는 그 이상의 CDR(complementary determining region)이 비-인간 항체의 서열에서 유래되고, 또한 하나 또는 그 이상의, 바람직하게는 모든 CDR이 서열목록 제 15서열의 HSP70 에피토프 또는 상기 서열과 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 가지는 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간화 항체를 제공한다.
인간화 항체는 실질적으로 인간 항체(수용자 항체로 불림)로부터 유래된 불변 프레임 워크 부위를 포함할 뿐 아니라, 경우에 따라서는 인간 항체로부터 유래한 가변부위의 대부분을 포함하기도 한다. 하나 또는 그 이상의 CDR은 마우스 항체와 같은 비-인간 항체에서 공급된다. 항체의 불변 부위는 존재할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 인간화 항체는 비-인간 항체에 비해 인간에 대한 치료 또는 진단적 이용에 있어서 몇몇 유리한 점을 가진다. 이들 이점은 아래와 같다:
1) 인간의 면역체계는 인간화된 항체의 불변 부위를 외부 물질로 인식하지 않으므로, 주입된 항체는 마우스 항체나 일부 외부물질이 포함된 키메라 항체에 비해 항체반응이 적다;
2) 인간화 항체의 작동부분(effector portion)은 인간으로부터 유래하였기 때문에, 인간의 다른 면역 체계와 상호작용이 더 잘 일어난다; 또한
3) 주입된 마우스 항체는 인간 순환계에서의 반감기가 인간의 항체에 비해 훨씬 짧은 것으로 보고되었다(Shaw et al. J Immunol 138:4534-4538 (1987)). 주입된 인간화 항체는 자연발생적 인간 항체와 실질적으로 동일한 반감기를 가지므로 소량의 작은 절편의 투여만 하는 것이 가능하다.
하나 또는 그 이상의 마우스 CDR을 인간의 가변 도메인 프레임워크에 치환시키면 인간의 가변 도메인 프레임워크가 CDR이 유래된 마우스 가변 프레임워크를 동일하거나 유사한 형태로 적응시키는 경우 올바른 입체적 특성을 유지하게 된다. 이는 CDR이 유래된 뮤린(murine) 가변부와 높은 서열 동일성을 가지는 인간 항체로부터 유래된 인간 가변부를 채용함으로써 가능하다. 가변부의 중쇄 및 경쇄는 동일하거나 다른 인간 항체 서열에서 유래할 수 있다. 인간 항체 서열은 자연발생적 인간 항체의 서열일 수 있으며, 또는 몇몇 인간 항체의 연속적 서열일 수도 있다(Kettleborough et al. Protein Engineering A:113 (1991); Kolbinger et al. Protein Engineering 6:971 (1993)).
적합한 인간 항체 서열은 컴퓨터 마우스 가변부위와 인간의 알려진 항체의 서열 간의 비교분석을 통해 결정한다. 비교는 중괘 및 경쇄가 별개로 이루어지지만 각각의 원리는 동일하다.
키메라 및 인간화 항체 및 항체 절편의 제조방법은 미국 등록특허 제4,816,567호, 제 5,530,101호, 제5,622,701호, 제5,800,815호, 제5,874,540호, 제5,914,110호, 제5,928,904호, 제6,210,670호, 제6,677,436호 및 제7,067,313호와 미국 출원 2002/0031508, 2004/0265311 및 2005/0226876에 서술되어 있다. 더 나아가 항체절편의 제조방법은 미국 등록특허 제6,331,415호, 제6,818,216호 및 제7,067,313호에 기재되어 있다.
본 발명의 진단제 또는 치료제
본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 및 소분자)는 킬레이트 화합물과 결합하여 본 명세서에서 개시하는 방법에 따라 암을 검출, 진단 또는 치료하는 데 사용되는 진단제 또는 치료제로 사용될 수 있다. 진단제 또는 치료제는 선택된 킬레이트제에 따라서 다양한 방법으로 만들어질 수 있다. 또한, 본 발명의 물질은 형광 분자로 표지되어 본 발명을 진단 또는 치료에 응용하는 것을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 및 소분자)은 이들의 N-말단 잔기의 유리 아미노기와 카르복시기 또는 활성 에스터기와 같은 킬레이트제의 적합한 작용기와의 반응을 통해 서로 결합하여 콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 예를 들어, 에틸렌 사슬 상의 카르복실기가 활성화됨으로써 콘쥬게이트는 킬레이트제인 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)를 접합시킬 수 있다. 이러한 타입의 EDTA 유도체의 합성은 Arya et al. Bioconjugate Chemistry. 2:323 (1991)에 의해 보고되었는데, 4개의 카르복실기가 t-부틸기에 의해 블록되는 반면 에틸렌 사슬상의 카르복실기는 아미노기와 자유롭게 반응할 수 있어 콘쥬게이트를 형성하게 된다.
콘쥬게이트는 단백질계인 금속 킬레이트제를 포함할 수 있는데, 이는 고상 펩타이드 합성에 적당하다. 이러한 경우에, 킬레이트제는 위에서 서술한 EDTA 경우와 같은 방법으로, 혹은 펩타이드의 C-말단으로부터 킬레이트의 N-말단으로 인 토 토(in toto)상에서 합성하여 더 편리하게 킬레이트제를 본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 및 소분자)과 결합시킬 수 있다.
콘쥬게이트는 나아가 본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 및 소분자)의 타겟팅 기능이나 킬레이트의 금속 결합기능에 영향을 미치지 않은 채 본 발명의 물질을 킬레이트제와 결합시키는 링커 모이어티를 포함시킬 수 있다. 적합한 링크 그룹은 본 발명의 물질과 킬레이트제를 결합시키기 위한 반응기를 가지는 아미노산 사슬 및 알킬 사슬을 포함한다. 아미노산 사슬은 킬레이트제가 단백질계인 경우 고상 기술에 의해 콘쥬게이트가 인 토토에서 합성될 수 있으므로 바람직한 링크 그룹이다
알킬 사슬 링크 그룹은 본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 항체)의 N-말단의 아미노기와 카르복실기나 활성화된 에스터와 같은 알킬사슬의 첫 번째 작용기가 반응하여 콘쥬게이트와 결합될 수 있다. 이후 킬레이트제는 알킬사슬의 두 번째 작용기와 반응함으로써 알킬 체인에 결합하여 콘쥬게이트의 형성을 완료한다. 알킬 사슬 상의 두 번째 작용기는 킬레이트제의 작용기와 잘 반응하되 본 발명의 물질의 N-말단 잔기와는 반응하지 않는 치환기 중에서 선택한다. 예를 들어, 킬레이트제가 카르복실기 또는 활성 에스터와 같은 작용기와 결합할 때, 알킬 사슬의 두 번째 작용기는 아미노기일 수 있다. 콘쥬게이트의 형성에서 원치 않는 화합물의 형성을 피하기 위해 작용기의 보호 및 탈보호가 필요할 수 있다. 보호 및 탈보호는 유기 합성분야에서의 통상의 보호기, 시약 및 프로토콜을 이용하여 달성될 수 있다. 특히, 보호 및 탈보호 기술은 상술한 고상 펩타이드 합성에서 사용될 수 있다.
알킬 사슬 이외에 또 다른 화학적 링크 그룹은 PEG(polyethylene glycol)로서, 상술한 알킬 사슬과 동일한 과정으로 콘쥬게이트를 만드는 작용을 한다. 본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 및 소분자)은 반감기의 향상 및 투여 빈도의 감소를 위해 PEG화 될 수 있다. 링크그룹은 킬레이트제에 먼저 결합하고 이후 본 발명의 물질에 결합할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 및 소분자)의 약동학적, 면역원적, 진단적 및/또는 치료적 특성을 향상시키기 위한 본 발명의 물질의 크로스 링크를 포함한다. 크로스 링크는 본 발명의 물질의 적합한 부위(예를 들어 1차 아민, 설피드릴)에 두 개의 분자가 공유결합으로 결합하는 과정을 포함한다. 본 발명의 구현예에 따르면, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 물질은 서로 크로스 링크된다. 또는 크로스 링크된 물질들은 헵텐-수송단백질 콘쥬게이트, 항체-효소 콘쥬게이트, 항체-톡신 콘쥬게이트(이뮤노톡신) 및 그밖의 다른 본 발명의 표지된 물질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 및 소분자)-킬레이트제 콘쥬게이트는 진단적 또는 치료적 유용성이 있는 금속과 복합체를 형성할 수 있다. 적합한 금속으로는 예를 들어 다양한 형태(예를 들어 99 mTcO3 +, 99 mTcO2 +, ReO3 + 및 ReO2 +)의 테크네튬 및 레늄과 같은 방사성 핵종을 포함한다. 물질-킬레이트제 콘쥬게이트 내에 금속을 결합시키는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 실시될 수 있다. 금속이 테크네튬-99m일 경우, 다음의 일반적 과정이 테크네튬 복합체를 만드는데 이용될 수 있다. 에탄올과 같은 액체 알코올에 콘쥬게이트를 용해시킴으로써 물질-킬레이트제 콘쥬게이트 용액을 만든다. 이러한 용액은 산소를 제거하기 위해 기체제거가 되고 티올(thiol) 보호기가 수산화나트륨과 같은 적합한 에 의해 제거 된다. 이후 아세트산(pH 6.0-6.5)과 같은 유기산에 의해 중화가 된다. 표지 단계에 있어서, 몰리브덴 합성기에서 얻은 과량의 소듐 퍼테크네테이트을 테크네튬을 환원시킬 수 있는 양 만큼의 환원제와 함께 콘쥬게이트 용액에 첨가한 후 가열한다. 표지된 콘쥬게이트는 오염물인 99 mTcO4 - 및 아교질의 99 mTcO2 로부터 크로마토그래피를 통해(예를 들어C- 18 Sep Pak 카트리지를 이용하여)분리할 수 있다.
또 다른 방법에 의하면, 표지는 트랜스킬레이션 반응을 통해 이루어질 수 있다. 테크네튬 원은 적당한 리간드와 결합한 테크네튬 용액으로, 이는 리간드와 선택된 킬레이트제와의 교체를 촉진한다. 트랜스킬레이션을 위한 적당한 리간드는 타타르산, 시트르산 및 헵타 글루콘산을 포함한다. 여기서 적합한 환원제로는 소듐 디티오나이트(sodium dithionite)이다. 콘쥬게이트는 상술한 방법에 의해 표지될 수도 있고, 혹은 킬레이터 자체가 표지되어 실질적으로 본 발명의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 항체와 결합하므로써 콘쥬게이트를 형성할 수도 있다; 이는 기표지 리간드 방법(prelabeled ligand method)이라 불린다.
본 발명의 콘쥬게이트를 표지하는 또다른 방법은 물질-킬레이트제 콘쥬게이트를 금속 킬레이트화에 의해 끊어지는 결합을 통해 고상 지지체에 고정시키는 것을 포함한다. 이는 킬레이터가 하나의 컴플렉싱 원자에 의해 지지체의 작용기와 결합함으로써 이루어진다. 바람직하게는 결합 황 원자는 말레이미드와 같은 황 보호기와 함께 작용하는 지지체와 결합한다.
진단적 또는 치료적으로 유용한 금속으로 표지된 경우, 본 발명의 물질-킬레이트제 콘쥬게이트는 진단 영상 분야의 당업자에 공지된 과정을 통해서 종양(예를 들어, 폐암, 유방암, 대장암 및 전립선암)을 검출하는 데에 사용될 수 있다. 테크네튬-99m과 같이 방사성 핵종으로 표지된 콘쥬게이트의 경우 살린 등장액과 같은 약제학적으로 허용 가능한 용액에 포함되어, 혹은 본 명세서에서 개시하는 다른 방법에 의해 포유류에 정맥내 주사로써 투여될 수 있다. 표지된 콘쥬게이트의 적당한 투여량은 선택한 콘쥬게이트의 특성에 의해 정해지는데, 즉 빠르게 제거되는 콘쥬게이트는 느리게 제거되는 것보다 다량을 투여할 수 있다. 종양을 영상화하는데 허용 가능한 일회 투여량은 70 kg 의 개인당 약 5-40 mCi 이다. 인비보에서의 분포 및 위치는 투여 후 적당한 시간(비-타겟 조직에서의 제거율에 대한 타겟 사이트의 축적율에 따라 대개 30 분에서 180분 사이)이 경과한 뒤 본 명세서에서 개시한 표준적인 방법에 의해 추적할 수 있다.
본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 및 소분자)은 형광 검출을 위해 당업계에 공지된 기술(Lohse et al. Bioconj Chem 8:503-509 (1997))을 이용하여 로다민, 플루오레세인과 같은 형광체로 표지할 수 있다. 당업계에 공지된 기술을 통해, 본 발명의 암 타겟팅 물질은 방사능 금속 또는 이완 금속으로 표지할 수 있다. 이는 물질을 방사능 금속 또는 이완 금속을 킬레이트화하는 금속 킬레이트제와 결합시킴으로서 이루어진다. 킬레이트제의 예로써 이니노카르복시 반응기, 폴리아미노카르보닐 반응기, DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid) 또는 DOTA(1, 4,7,10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraacetic acid)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 킬레이트제는 자신의 아미노산 측쇄가 암 타겟팅 물질과 직접적으로 결합함으로써 결합할 수 있다. 한편, 중개 아미노산 서열 또는 링커 모이어티가 암 타겟팅 물질와 킬레이트제를 결합시킬 수도 있다.
본 발명의 치료제 또는 세포독성제
본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 및 소분자)은 상기 물질을 어떠한 알려진 세포독성 또는 치료적 모이어티와 결합하더라도 만들어질 수 있다. 본 발명의 물질과 결합할 수 있는 치료제 또는 세포독성제는 예를 들어 다음과 같은 항종양제를 포함한다: 아시비신(Acivicin); 아클라루비신(Aclarubicin); 아코다졸하이드로클로라이드(Acodazole Hydrochloride); 아크로닌(Acronine); 아도젤레신(Adozelesin); 아드리아마이신(Adriamycin); 알데스루킨(Aldesleukin); 알트레타민(Altretamine); 암보마이신(Ambomycin); A.만탄트론 아세테이트 (A.metantrone Acetate); 아미노글루테티미드(Aminoglutethimide); 암사크린(Amsacrine); 아나스트로졸(Anastrozole); 안트라마이신(Anthramycin); 아스파라기나아제(Asparaginase); 아스페를린(Asperlin); 아자시티딘(Azacitidine); 아제테파(Azetepa); 아조토마이신(Azotomycin); 바티마스태트(Batimastat); 벤조데파(Benzodepa); 비칼루타미이드(Bicalutamide); 비산트렌 하이드로클로라이드(Bisantrene Hydrochloride); 비스나파이드 디메실레이트(Bisnafide Dimesylate); 비젤레신(Bizelesin); 블레오마이신 설페이트(Bleomycin Sulfate); 브레퀴나르 소듐(Brequinar Sodium); 브로피리민(Bropirimine); 부설판(Busulfan); 카치노마이신(Cactinomycin); 칼루스테론(Calusterone); 캄토테신(Camptothecin); 카라세마이드(Caracemide); 카르베티머(Carbetimer); 카보플라틴(Carboplatin); 카르무스틴(Carmustine); 카루비신 하이드로클로라이드(Carubicin Hydrochloride); 카르젤레신(Carzelesin); 세데핀골(Cedefingol); 클로람부실(Chlorambucil); 시롤레마이신(Cirolemycin); 시스플라탄(Cisplatin); 클라드리빈(Cladribine); 콤브레테스타틴 A-4(Combretestatin A-4); 크리스나톨 메실레이트(Crisnatol Mesylate); 사이클로포스파마이드(Cyclophosphamide); 사이타라빈(Cytarabine); 다카르베진(Dacarbazine); DACA (N- [2- (Dimethyl- amino) ethyl] acridine-4-carboxamide); 닥티노마이신(Dactinomycm); 다노루비신 하이드로 클로라이드(Daunorubicin Hydrochloride); 다노마이신(Daunomycin); 데시타빈(Decitabine); 덱소르매플라틴(Dexormaplatin); 데자구아닌(Dezaguanine); 데자구아닌 메실레이트(Dezaguanine Mesylate); 다이아지퀀(Diaziquone); 도세탁셀(Docetaxel); 돌라사틴(Dolasatins); 독소루비신(Doxorubicin); 독소루비신 하이드로클로라이드(Doxorubicin Hydrochloride); 드롤록시펜(Droloxifene); 드롤록시펜 시트레이트(Droloxifene Citrate); 드로모스타놀론 프로피오네이트((Dromostanolone Propionate); 두아조마이신(Duazomycin); 에다트렉세이트(Edatrexate); 엘프로니틴 하이드로클로라이드(Eflornithine Hydrochloride); 엘립티신(Ellipticine); 엘사미트루신(Elsamitrucin); 엔로플라틴(Enloplatin); 엔프로메이트(Enpromate); 에피프로피딘(Epipropidine); 에피루비신 하이드로클로라이드(Epirubicin Hydrochloride); 에르불로졸(Erbulozole); 에소루비신 하이드로클로라이드(Esorubicin Hydrochloride); 에스트라무스틴(Estramustine); 에스트라무스틴 포스페이트 소듐(Estramustine Phosphate Sodium); 에타니다졸 에티오나이즈드 오일 I 131(Etanidazole Ethiodized Oil I 131); 에토포사이드(Etoposide); 에토포사이드 포스페이트(Etoposide Phosphate); 에토프린(Etoprine); 파드로졸 하이드로클로라이드(Fadrozole Hydrochloride); 파자라빈(Fazarabine); 펜레티나이드(Fenretinide); 플록수리딘(Floxuridine); 플루다라빈 포스페이트(Fludarabine Phosphate); 플루오로우라실(Fluorouracil); 5-FdUMP; 플루로시타빈(Flurocitabine); 포스퀴돈(Fosquidone); 포스트리에신 소듐(Fostriecin Sodium); 젬시타빈(Gemcitabine); 젬시다빈 하이드로클로라이드(Gemcitabine Hydrochloride); 골드 AU198(Gold Au) 198; 호모켐토테신(Homocamptothecin); 하이드록시유리아(Hydroxyurea); 이다루비신 하이드로클로라이드(Idarubicin Hydrochloride); 아이포스파마이드(Ifosfamide); 일모포신(Ilmofosine); 인터페론 알파-2a(Interferon Alfa-2a); 인터페론 알파 -2b(Interferon Alfa- 2b); 인터페론 알파-nl(Interferon Alfa-nl); 인터페론 알파-n3(Interferon Alfa-n3); 인터페론 베타-I a(Interferon Beta-I a);인터페론 감마-I b(Interferon Gamma-I b); 아이프로플라틴(Iproplatin); 아이리노테칸 하이드로클로라이드(Irinotecan Hydrochloride); 란레오타이드 아세테이트(Lanreotide Acetate); 레트로졸(Letrozole); 레우프롤라이드아세테이트(Leuprolide Acetate); 리아로졸 하이드로클로라이드(Liarozole Hydrochloride); 로메트렉솔 소듐(Lometrexol Sodium); 로무스틴(Lomustine); 로소잔트론 하이드로클로라이드(Losoxantrone Hydrochloride); 마소프로콜(Masoprocol); 메이탄신(Maytansine); 메클로레타민 하이드로클로라이드(Mechlorethamine Hydrochloride); 메게스트롤 아세테이트(Megestrol Acetate); 멜렌게스트롤 아세테이트(Melengestrol Acetate); 멜팔란(Melphalan); 메노가릴(Menogaril); 머켑토퓨린(Mercaptopurine); 메토트렉세이트(Methotrexate); 메토트렉세이트 소듐(Methotrexate Sodium); 메토프린(Metoprine); 메튜레데파(Meturedepa); 마이틴도마이드(Mitindomide); 마이토카신(Mitocarcin); 마이토크로민(Mitocromin); 마이토길린(Mitogillin); 마이토말신(Mitomalcin); 마이토마신(Mitomycin); 마이토스퍼(Mitosper); 마이토테인(Mitotane); 마이토잔트론 하이드로클로라이드(Mitoxantrone Hydrochloride); 마이코페놀릭 엑시드(Mycophenolic Acid); 노코다졸(Nocodazole);노갈라마이신( Nogalamycin); 오마플라틴(Ormaplatin); 옥시수란(Oxisuran); 파클리탁셀(Paclitaxel); 페가스파가제(Pegaspargase); 펠리오마이신(Peliomycin); 펜타뮤스틴(Pentamustine); 페플로이신설페이트(PeploycinSulfate); 퍼포스파마이드(Perfosfamide); 파이포브로만(Pipobroman); 파이포설판(Piposulfan); 파이로잔트론 하이드로클로라이드(Piroxantrone Hydrochloride); 플리카마이신(Plicamycin); 플로메스테인(Plomestane); 포파이머 소듐(Porfimer Sodium); 포파이로마이신( Porfiromycin); 프레드니뮤수틴(Prednimustine); 프로카바진 하이드로클로라이드(Procarbazine Hydrochloride); 퓨로마이신(Puromycin); 퓨로로마이신 하이드로클로라이드(Puromycin Hydrochloride); 파이라조퓨린(Pyrazofurin); 리조신(Rhizoxin); 리조신 D(Rhizoxin D); 리보프린(Riboprine); 로글레티마이드(Rogletimide); 사핀졸(Safingol); 사핀졸 하이드로클로라이드(Safingol Hydrochloride); 세뮤스틴(Semustine); 심트라젠(Simtrazene); 스파포세이트 소듐( Sparfosate Sodium); 스파소마이신(Sparsomycin); 스파이로저마늄 하이드로클로라이드(Spirogermanium Hydrochloride); 스파이로뮤스틴(Spiromustine); 스파이로플라틴(Spiroplatin); 스트렙토니그린(Streptonigrin); 스트렙토조신(Streptozocin); 스트론튬 클로라이드 Sr89(Strontium Chloride Sr 89); 술로페너(Sulofenur); 탈리소마이신(Talisomycin); 탁세인(Taxane); 택소이드(Taxoid); 테코갈란 소듐(Tecogalan Sodium); 테가퍼(Tegafur); 텔로잔트론 하이드로클로라이드(Teloxantrone Hydrochloride; 테모포핀(Temoporfin); 테니포사이드(Teniposide); 테록시론(Teroxirone); 테스토락톤(Testolactone); 티아미프린(Thiamiprine); 티오구아닌(Thioguanine); 티오테파(Thiotepa); 티미탁(Thymitaq); 티아조퓨린(Tiazofurin); 티라파자민(Tirapazamine); 토뮤덱스(Tomudex); TOP53; 토포테칸 하이드로클로라이드(Topotecan Hydrochloride); 토레미펜 사이트레이트(Toremifene Citrate); 트레스톨론 아세테이트(Trestolone Acetate); 트리시리빈 포스페이트(Triciribine Phosphate); 트리메트렉세이트(Trimetrexate); 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트(Trimetrexate Glucuronate); 트립토렐린(Triptorelin); 튜불로졸 하이드로클로라이드(Tubulozole Hydrochloride); 우라실 머스타드(Uracil Mustard); 유레데파(Uredepa); 바프레오타이드(Vapreotide); 버테포핀(Verteporfin); 빈블라느틴(Vinblastine); 빈블라스틴 설페이트(Vinblastine Sulfate); 빈크리스틴( Vincristine); 빈크리스틴 설페이트(Vincristine Sulfate); 빈데신(Vindesine);빈데신 설페이트(Vindesine Sulfate); 비네피딘 설페이트(Vinepidine Sulfate); 빈글리시네이트 설페이트(Vinglycinate Sulfate); 빈루로신 설페이트(Vinleurosine Sulfate); 비노렐빈 타트레이트(Vinorelbine Tartrate); 빈로시딘 설페이트(Vinrosidine Sulfate); 빈조리딘 설페이트(Vinzolidine Sulfate); 보로졸( Vorozole); 제니플라딘(Zeniplatin); 지노스타틴(Zinostatin); 조루비신 하이드로클로라이드(Zorubicin Hydrochloride); 2-클로로데옥시아데노신 (2-Chlorodeoxyadenosine); 2'데옥시포마이신(2'Deoxyformycin); 9-아미노캠토테신(9-aminocamptothecin); 랄티트레스드(raltitrexed); N-프로파길-5.8-다이데자폴릭 엑시드(N-propargyl-5.8-dideazafolic acid); 2클로로-2'-아라비노-플루오로-2'데옥시아데노신(2chloro-2'-arabino-fluoro-2'-deoxyadenosine); 2-클로로-2'-데옥시아디노신(2-chloro-2'-deoxyadenosine); 아니소마이신(anisomycin); 트라이코스타틴 A(trichostatin A); hPRL-G129R; CEP-751; 리노마이드(linomide); 설퍼 머스타드(sulfur mustard); 나이트로젠 머스타드(메클로 에타마인)(nitrogen mustard (mechlor ethamine)); 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide); 멜팔란(melphalan); 클로라부실(chlorambucil); 아이포스파마이드(ifosfamide); 부설판( busulfan); N-메틸-N나이트로소유리아(N-methyl-Nnitrosourea, MNU); N,N1-비스(2-클로로에틸)-N-나이트로소유리아(BCNU)(N, N1 -Bis (2-chloroethyl)-N- nitrosourea (BCNU)); N-(2-클로로에틸)-N'사이클로헥실-N-나이트로소유리아(CCNU)(N- (2-chloroethyl)-N' cyclohexyl-N-nitrosourea (CCNU)); N-(2-클로로에틸)-N'-(트랜스-4-메틸사이클로헥실-N-나이트로소유리아(N-(2- chloroethyl)-N'- (trans-4-methylcyclohexyl-N-nitrosourea, MeCCNU); N-(2-클로로에틸)-N'-(다이에틸)에틸포스포네이트-N-나이트로소유리아(포테뮤스틴)(N- (2- chloroethyl)-N'- (diethyl) ethylphosphonate-N-nitrosourea (fotemustine)); 스트렙토조토신(streptozotocin); 다이카바진(DTIC)(diacarbazine(DTIC)); 마이토조로마이드(mitozolomide); 테모조로마이드(temozolomide); 티오테파(thiotepa); 마이토마이신 C(mitomycin C); AZQ; 아도제레신(adozelesin); 시스플라딘(Cisplatin); 카보플라틴(Carboplatin); 오마플라틴(Ormaplatin); 옥사리플라딘(Oxaliplatin); Cl- 973; DWA 2114R; JM216; JM335; 비스(플라튬)(Bis (platinum)); 토뮤덱스(tomudex); 아자시티딘(azacitidine); 사이타라빈(cytarabine); 젬시타빈(gemcitabine); 6-머켑토퓨린(6-Mercaptopurine); 6-티오구아닌(6-Thioguanine); 하이포잔틴(Hypoxanthine); 테니포사이드 9-아미노 켐토테신(teniposide 9-amino camptothecin); 토포테칸(Topotecan); CPT-I l; 독소루비신(Doxorubicin); 다우노마이신(Daunomycin); 에피루비신(Epirubicin); 다루비신(darubicin); 마이토잔프론(mitoxantrone); 로소잔트론(losoxantrone); 닥티노마이신(엑티노마이신 D)(Dactinomycin (Actinomycin D)); 암사크린(amsacrine); 피라조로아크리딘(pyrazoloacridine); 올-트랜스 레티놀(all-trans retinol); 14-하이드록시-레트로-레티놀(14-hydroxy-retro-retinol); 올-트랜스 레티놀릭 엑시드(all-trans retinoic acid); N-(4-하이드록시페닐)레티나마이드(N- (4- Hydroxyphenyl) retinamide); 13-시스 레티놀릭 엑시드(13-cis retinoic acid); 3-메틸 TTNEB(3-Methyl TTNEB); 9-시스 레티노익 엑시드(9-cis retinoic acid); 플루다라빈(2-F-아라-AMP)(fludarabine (2-F-ara-AMP)); or 2-클로로데옥시아데노신(2-Cda)(2-chlorodeoxyadenosine (2-Cda)).
그 밖의 항종양 조성물은 20-파이-1,25 다이하이드록시비타민 D3(20-pi-l ,25 dihydroxyvitamin D3); 5-에티닐우라실(5-ethynyluracil); 아비라테론(abiraterone); 아크라루비신(aclarubicin); 아실풀빈(acylfulvene); 아데시페놀adecypenol); 아도제레신(adozelesin); 알데스루킨(aldesleukin); ALL-TK안타고니스트(ALL-TK antagonists); 알트레트아민(altretamine); 암바무스틴(ambamustine); 아미독스(amidox); 아미포스틴(amifostine); 아미노레불리닉 엑시드(aminolevulinic acid); 암루비신(amrubicin); 암사크린(amsacrine); 아나그레라이드(anagrelide); 아나스트로졸(anastrozole); 안드로그레포라이드(andrographolide); 엔지오제네시스 인히비터(angiogenesis inhibitors); 안타고니스트 D(antagonist D); 안타고니스트 G( antagonist G); 안타레릭스(antarelix); 안티-도살라이징 모르포제네틱 프로테인-1( anti-dorsalizing morphogenetic protein- 1) ; 안티안드로겐(antiandrogen); 프로스타틱 카시노마(prostatic carcinoma); 안티에스트로겐(antiestrogen); 안티네오플라스톤(antineoplaston); 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotides); 아피디콜린 글리시네이트(aphidicolin glycinate); 에이폽토시스 진 모듈레이터(apoptosis gene modulators); 에이폽토시스 레귤레이터(apoptosis regulators); 아퓨리닉 엑시드(apurinic acid); 아라-CDP-DL-PTBA(ara-CDP- DL-PTBA); 아지니네디아미네이즈(argininedeaminase); 아술라크린(asulacrine); 아타메스테인(atamestane); 아트리뮤스틴(atrimustine); 아시나느타틴 1(axinastatin 1); 아시나스타틴 2(axinastatin 2); 아시나느타틴 3(axinastatin 3); 아자세트론(azasetron); 아자톡신(azatoxin); 아타티로신(azatyrosine); 바카틴 III 데리바티브(baccatin III derivatives); 발라놀(balanol); 바티마스텟(batimastat); BCPJABL안타고니스트(BCPJABL antagonists); 벤조클로린(benzochlorins); 벤조일스타우로스포린(benzoylstaurosporine); 베타 락탐 데리버티브(beta lactam derivatives); 베타- 알레틴(beta-alethine); 베타클라마이신 B(betaclamycin B); 베투리닉 엑시드(betulinic acid); bFGF 인히비터(bFGF inhibitor); 비칼루타마이드(bicalutamide); 비잔트렌(bisantrene); 비사지리디닐스퍼민(bisaziridinylspermine); 비스나파이드(bisnafide); 비스트라틴 A(bistratene A); 비제레신(bizelesin); 브레플레이트(breflate); 블레오아미신 A2(bleomycin A2); 블레오마이신 B2(bleomycin B2); 브로피리민(bropirimine): 뷰도티테인(budotitane); 뷰티오닌 솔포시민(buthionine sulfoximine); 칼시포트리올(calcipotriol); 칼포스틴 C(calphostin C); 캠토테신 데리버티브(e.g.. 10-하이드록시- 캠토테신)(camptothecin derivatives (e.g.. 10-hydroxy- camptothecin)); 카나리폭스 Il-2(canarypox IL-2); 카페시타빈(capecitabine); 카복사마이드-아미노-트리아졸(carboxamide-amino-triazole); 카복시아미도트리아졸(carboxyamidotriazole); CaRest M3; CARN 700; 카틸리지 드라이브드 인히비터(cartilage derived inhibitor); 카제레신(carzelesin); 카세인 키나제 인히비터(ICOS)casein kinase inhibitors (ICOS); 카스타노스퍼민(castanospermine); 세크로핀 B(cecropin B); 세트로렐릭스(cetrorelix); 클로린(chlorins); 클로로퀴녹살린 설포나마이드(chloroquinoxaline sulfonamide); 시카프로스트(cicaprost); 시스-포피린(cis-porphyrin); 클라드리빈(cladribine); 클로미펜 아날로그(clomifene analogues); 클로트리마졸(clotrimazole); 콜리스마이신 A(collismycin A); 콜리스마이신 B(collismycin B); 콤브레타스타틴 A4(combretastatin A4); 콤브레타스타틴 아날로그(combretastatin analogue); 코나제닌(conagenin); 크라베시딘 816(crambescidin 816); 크리스나톨(crisnatol); 크립토피신 8(cryptophycin 8); 크립토피신 A 데리버티브(cryptophycin A derivatives); 큐라신 A(curacin A); 사이클로펜탄쓰라퀴논(cyclopentanthraquinones); 사이클로플라탐(cycloplatam); 사이페마이신(cypemycin); 사이타라빈 옥포스페이트(cytarabine ocfosfate); 사이톨리틱 팩터(cytolytic factor); 사이토스타틴(cytostatin); 다크리시맵(dacliximab); 데시타빈(decitabine); 디하이드로다이뎀닌 B(dehydrodidemnin B); 2'데옥시코포마이신(DCF)(2'deoxycoformycin (DCF)); 데스로렐린(deslorelin); 덱시포스파마이드(dexifosfamide); 덱스라조세인(dexrazoxane); 덱스베라파밀(dexverapamil); 다이아지큐원(diaziquone); 다이뎀닌 B(didemnin B); 다이독스(didox); 다이에틸노스페민(diethylnorspermine); 다이하이드로-5-아자시티딘(dihydro-5-azacytidine); 다이하이드로탁솔,9-(dihydrotaxol, 9-); 다이옥사마이신(dioxamycin); 다이페닐 스파이로뮤스틴(diphenyl spiromustine); 디스코데몰라이드(discodermolide); 도코사놀(docosanol); 도라세트론(dolasetron); 독시플루리딘(doxifluridine); 드롤록시펜(droloxifene); 드로나비놀(dronabinol); 듀오카마이신 SA(duocarmycin SA); 에브셀렌(ebselen); 에코뮤스틴(ecomustine); 에델포신(edelfosine); 에드레콜로맵(edrecolomab); 에플로니틴(eflornithine); 엘레민(elemene); 에미테퍼(emitefur); 에피루비신(epirubicin); 에포틸론(A. R = H; B, R = Me)(epothilones (A. R = H; B, R = Me)); 에피틸론(epithilones); 에프리스테라이드(epristeride); 에스트라뮤스틴 아날로그(estramustine analogue); 에스트로겐 아고니스트(estrogen agonists); 에스트로겐 안타고니스트(estrogen antagonists); 에타니다졸(etanidazole); 에토포사이드(etoposide); 에토포사이드 4'-포스페이트(에토포스)(etoposide 4'-phosphate (etopofos)); 엑세메스테인(exemestane); 파드로졸(fadrozole); 파자라빈(fazarabine); 펜레티나이드(fenretinide); 필그라스팀(filgrastim); 피나스테라이드(finasteride); 플라보피리돌(flavopiridol); 플레제라느틴(flezelastine); 플루아느테론(fluasterone); 플루다라빈(fludarabine); 플루오로다우노루니신 하이드로클로라이드(fluorodaunorunicin hydrochloride); 포페니멕스(forfenimex); 포메스테인( formestane); 포스트리에신(fostriecin); 포테뮤스틴(fotemustine); 가돌리늄 텍사피린(gadolinium texaphyrin); 갈륨 나이트레이트(gallium nitrate); 갈록시타빈( galocitabine); 가니렉릭스(ganirelix); 젤라티네이즈 인히비터(gelatinase inhibitors); 젬시타빈(gemcitabine); 글루타티온 인히비터(glutathione inhibitors); 헵설팜(hepsulfam); 헤레굴린(heregulin); 헥사메틸렌 비스아세트아마이드(hexamethylene bisacetamide); 호모해링토닌(HTT)(homoharringtonine (HHT)); 하이퍼리신(hypericin); 이반드로닉 엑시드(ibandronic acid); 아이다루비신(idarubicin); 아이독시펜(idoxifene); 아이드라맨톤(idramantone): 일모포신(ilmofosine); 일모스탯(ilomastat); 아이미다조아크리돈(imidazoacridones); 아이미퀴몹(imiquimod): 이뮤노스티뮬런트 펩타이드(immunostimulant peptides); 인슐린 유사 성장인자-1 수용체 억제자(insulin-like growth factor- 1 receptor inhibitor); 인터페론 아고니스트(interferon agonists); 인터페론(interferons); 인터루킨(interleukins); 아이오벤귄(iobenguane); 아이오도독소루비신(iododoxorubicin); 아이포미아놀,4-(ipomeanol, 4-); 아이리노테칸(irinotecan); 이로플락트(iroplact): 이소글라딘(irsogladine); 이소벤가졸(isobengazole); 이소호모할리콘드린 B(isohomohalicondrin B); 이타세트론(itasetron); 자스플라키놀라이드(jasplakinolide); 카할라라이드 F(kahalalide F); 라멜라린-N 트리아세테이트(lamellarin-N triacetate); 란레오타이드(lanreotide); 레이나마이신(leinamycin); 레노그라스팀(lenograstim); 렌티난 설페이트(lentinan sulfate); 렙톨스타틴(leptolstatin); 레트로졸(letrozole); 루케미아 인히비팅 팩터(leukemia inhibiting factor); 루코사이트 알파 인터페론(leukocyte alpha interferon); 류프롤라이드 + 에스트로겐 + 프로게스테론(leuprolide + estrogen + progesterone); 류프로렐린(leuprorelin); 레바미솔(levamisole); 리아로졸(liarozole); 리니어 폴리아민 아날로그(linear polyamine analogue); 리포필릭 다이사카라이드 펩타이드(lipophilic disaccharide peptide); 리포필릭 플라티움 콤파운드(lipophilic platinum compounds); 리소클린아마이드 7(lissoclinamide 7); 로바플라틴(lobaplatin); 롬브리신(lombricine); 로메트렉솔(lometrexol); 로니다민(lonidamine); 로소잔트론(losoxantrone); 로바스타틴(lovastatin); 록소리빈(loxoribine); 러토테칸(lurtotecan); 루테티움 텍사피린(lutetium texaphyrin); 라이소필린(lysofylline); 라이틱 펩타이드(lytic peptides); 메이탄신(maytansine); 만노스타틴 A(mannostatin A); 마리마스텟(marimastat); 마소프로코 마스핀(masoprocoh maspin); 마트릴신 인히비터(matrilysin inhibitors); 메트릭스 메탈로프로틴에이즈 인히비터(matrix metalloproteinase inhibitors); 메노가릴(menogaril); 알너바론(rnerbarone); 메테렐린(meterelin); 메티오니나제(methioninase); 메토클로프라마이드(metoclopramide); MIF인히비터(MIF inhibitor); 이페프리스톤(ifepristone); 밀테포신(miltefosine); 미리모스팀(mirimostim); 불일치 이중가닥 RNA(mismatched double stranded RNA); 마이트라신(mithracin); 마이토구아존(mitoguazone); 마이토락톨(mitolactol); 마이토마이신 아날로그(mitomycin analogues); 마이토나파이드(mitonafide); 마이토탁신 섬유아세포 성장인자- 사포린(mitotoxin fibroblast growth factor- saporin); 마이토잔트론(mitoxantrone); 모파로텐(mofarotene); 몰그라모스팁(molgramostim); 모노클로날 안티바디(monoclonal antibody); 휴먼 코리오닉 고나도트로핀(human chorionic gonadotrophin); 모노포스포릴 리피드 A + 마이오박테리움 세포벽 sk(monophosphoryl lipid A + myobacterium cell wall sk); 모피다몰(mopidamol); 다중내성 유전자 억제자(multiple drug resistance gene inhibitor); 다중 종양 억제자 1- 기초 피료(multiple tumor suppressor 1- based therapy); 머스타드 안티캔서 에이전트(mustard anticancer agent); 마이캐퍼록사이드 B(mycaperoxide B); 마이코박테리아 세포벽 추출물(mycobacterial cell wall extract); 마이리아포론(myriaporone); N-아세틸디날린(N-acetyldinaline); N-서브스티튜티드 벤자마이드(N-substituted benzamides); 나파렐린(nafarelin); 나그레스팁(nagrestip); 날록손 + 펜타조신(naloxone + pentazocine); 나파빈(napavin); 나프터핀(naphterpin); 나토그라스팀(nartograstim); 네다플라틴(nedaplatin); 네모루비신(nemorubicin); 네리드로닉 엑시드(neridronic acid); 뉴트랄 엔도 펩티다제(neutral endopeptidase); 닐루타마이드(nilutamide); 나이사마이신(nisamycin); 나이트릭 옥사이드 모듈레이터(nitric oxide modulators); 나이트록사이드 안티옥시던트(nitroxide antioxidant); 나이트룰린(nitrullyn); 06-벤질구아닌(06-benzylguanine); 옥트레오타이드(octreotide); 오키세논(okicenone); 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides); 오나프리스톤(onapristone); 온단세트론(ondansetron); 오라신(oracin); 오랄 사이토킨 인듀서(oral cytokine inducer); 오마플라틴(ormaplatin); 오사테론(osaterone); 옥살리플라틴(oxaliplatin); 옥사유노마이신(oxaunomycin); 파클리탁셀 아날로그(paclitaxel analogues); 파클리탁셀 데리버티브(paclitaxel derivatives); 팔라우아민(palauamine); 팔마이토일리조신(palmitoylrhizoxin); 파미드로닉 엑시드(pamidronic acid); 파나자이트리올(panaxytriol); 파노마이펜(panomifene); 파라박틴(parabactin); 파젤립틴(pazelliptine); 페가스파가제(pegaspargase); 펠데신(peldesine); 펜토산 폴리설페이트 소듐(pentosan polysulfate sodium); 펜토스타틴(pentostatin); 펜트로졸(pentrozole); 퍼플루브론(perflubron); 퍼포스파마이드(perfosfamide); 페릴릴 알코올(perillyl alcohol); 페나지노마이신(phenazinomycin); 페닐아세테이트(phenylacetate); 포스파타제 인히비터(phosphatase inhibitors); 파이시바닐(picibanil); 파일로카핀 하이드로클로라이드(pilocarpine hydrochloride); 파이라루비신(pirarubicin); 파이리트렉심(piritrexim); 플라세틴 A(placetin A); 플라세틴 B(placetin B); 플라스미노젠 엑티베이터 인히비터(plasminogen activator inhibitor); 플라티넘 컴플렉스(platinum complex); 플라티넘 컴파운드(platinum compounds); 플라티넘- 트리아민 컴플렉스(platinum-triamine complex); 포도필로톡신(podophyllotoxin); 포파이머 소듐(porfimer sodium); 포파이로마이신(porfiromycin); 프로필 비스-아크리돈(propyl bis-acridone); 프로스타그란딘 J2(prostaglandin J2); 프로티아솜 인히비터(proteasome inhibitors); 단백질 A-기초 면역조절자(protein A-based immune modulator); 프로테인 키나제 C 인히비터(protein kinase C inhibitor); 프로테인 키나제 C 억제자(protein kinase C inhibitors); 프로테인 티로신 포스파타제 인히비터(protein tyrosine phosphatase inhibitors); 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 인히비터(purine nucleoside phosphorylase inhibitors); 퍼퓨린(purpurins); 피라졸로아크리딘(pyrazoloacridine); (피리독실레이티드 헤보글로빈 폴리옥시에틸렌 콘쥬게이트(pyridoxylated hemoglobin polyoxyethylene conjugate); raf 안타고니스트(raf antagonists); 랄티트렉시드(raltitrexed); 라모세트론(ramosetron); ras 파네실 프로테인 트랜스퍼라아제 인히비터(ras farnesyl protein transferase inhibitors); ras 인히비터(ras inhibitors); ras-GAP 인히비터(ras-GAP inhibitor); 레텔립틴 디메틸레이티드(retelliptine demethylated); 레니움 Re186 에티드로네이트(rhenium Re 186 etidronate); 리조신(rhizoxin); 리보자임(ribozymes); RII 레트마마이드(RII retmamide); 로글레티마이드(rogletimide); 로히투킨(rohitukine); 로머타이드(romurtide); 로퀴니멕스(roquinimex); 루비기논 B 1(rubiginone B 1); 루복실(ruboxyl); 사핀졸(safingol); 세인토핀(saintopin); SarCNU; 사코피톨 A(sarcophytol A); 사그라모스팀(sargramostim): Sdi 1 마이메틱스(Sdi 1 mimetics); 세뮤스틴(semustine); 세네센스 드라이브드 인히비터 1(senescence derived inhibitor 1); 센스 올리고뉴클레오타이드(sense oligonucleotides); 신호전환 억제자(signal transduction inhibitors); 신호전환 조절자(signal transduction modulators); 단쇄 항원 결합 단백질(single chain antigen binding protein); 사이조피란(sizofiran); 소부조세인(sobuzoxane); 소듐 보로캡테이트(sodium borocaptate); 소듐 페닐아세테이트(sodium phenylacetate); 솔베롤(solverol); 소마토메딘 바인딩 프로테인(somatomedin binding protein); 소네민(sonermin); 스포포식 엑시드(sparfosic acid); 스파카마이신 D(spicamycin D); 스파이로뮤스틴(spiromustine); 스플레노펜틴(splenopentin); 스폰지스타틴 1(spongistatin 1); 스쿠알라민(squalamine); 스템 셀 인히비너(stem cell inhibitor); 스템-셀 디비젼 인히비터(stem-cell division inhibitors); 스티피아마이드(stipiamide); 스트로멜신 인히비터(stromelysin inhibitors); 설프모신(sulfmosine); 슈퍼액티브 바소액티브 인테스티날 팹타이드 안타고니스트(superactive vasoactive intestinal peptide antagonist); 슈라디스타(suradista); 슈라민(suramin); 스와인소닌(swainsonine); 합성 글리고사미노글리칸(synthetic glycosaminoglycans); 탈뮤스틴(talhmustine); 타목시펜 메티오다이드(tamoxifen methiodide); 타우로머스틴(tauromustine); 타자로틴(tazarotene); 테모갈란 소듐(tecogalan sodium); 테가퍼(tegafur); 텔러가필리움(tellurapyrylium); 텔로머라제 인히비터(telomerase inhibitors); 테모포핀(temoporfin); 테모졸로마이드(temozolomide); 테니포사이드(teniposide); 테트라클로로데카옥사이드(tetrachlorodecaoxide); 테트라조민(tetrazomine); 탈리블라스틴(thaliblastine); 탈리도마이드(thalidomide); 티오코랄린(thiocoraline); 트롬보포에틴(thrombopoietin); 트롬보포에틴 마이메틱(thrombopoietin mimetic); 티말파신(thymalfasin); 티모포에틴 리셉터 아고니스트(thymopoietin receptor agonist); 티모트리난(thymotrinan); 타이로이드 스티뮬레이팅 호르몬(thyroid stimulating hormone); 틴 에틸 에티오퍼퓨린(tin ethyl etiopurpurin); 티라파자민(tirapazamine); 티타노신 다이클로라이드(titanocene dichloride); 토포테칸(topotecan); 탑센틴(topsentin); 토레미펜(toremifene); 토디포텐드 스템 셀 팩터(totipotent stem cell factor); 트랜슬레이션 인히비터(translation inhibitors); 트레티노인(tretinoin); 트리아세틸우리딘(triacetyluridine); 트리시리빈(triciribine); 트리메트렉세이트(trimetrexate); 트립토렐린(triptorelin); 트로피세트론(tropisetron); 튜로스테라이드(turosteride); 티로신 키나제 인히비터(tyrosine kinase inhibitors); 티포스틴( tyrphostins); UBC 인히비터(UBC inhibitors); 우베니멕스(ubenimex); 유로제니탈 사이너스-유래 성장억제인자(urogenital sinus-derived growth inhibitory factor); 유로키나아제 리셉터 안타고니스트 (urokinase receptor antagonists); 바프레오타이드(vapreotide); 바리올린 B(variolin B); 벡터 시스템(vector system); 에리쓰로사이트 진 테라피(erythrocyte gene therapy); 벨라레졸 (velaresol); 베라민(veramine); 베르딘(verdins); 베르테포핌(verteporim); 비노렐빈(vinorelbine); 빈살틴(vinxaltine); 바이탁신(vitaxin); 보로졸(vorozole); 자노테론(zanoterone); 제니플라틴(zeniplatin); 지라스코브(zilascorb); 및 지노스타틴 스티말라머(zinostatin stimalamer)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 물질을 피리트렉심 이소사이오네이트(piritrexim isothionate)와 같은 항증식제와 결합시킴으로서 만들어질 수도 있다. 또는 본 발명의 물질은 시토글루사이드(sitogluside) 같은 항전립선비대제, 탐술로신 하이드로클로라이드(tamsulosin hydrochloride)같은 양성 전립선 비대증 치료제 또는 펜토몸(pentomone)같은 전립선 성장 억제자와 결합할 수도 있다.
본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)는 다음을 포함하는 방사능제와 결합할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다: 피브리노겐 123I; 플루디옥시글루코스 18F; 플루오로포다 18F; 인슐린 125I; 인슐린 131I; 로베구안 123I: 아이오디파마이드 소듐 131I; 아이오도안티피린 131I; 아이오도콜레스테롤 131I; 아이오도히푸레이트 소듐 123I; 아이오도히푸레이트 소듐 125I; 아이오도히푸레이트 소듐 131I; 아이오도피라세트 125I; 아이오도피라세트 131I; 아이오페타민 하이드로클로라이드 123I; 아이오메틴 125I; 아이오메틴 131I; 아이오탈라메이트 소듐 123I; 아이오탈라메이트 소듐 131I; 티로신 131I; 리오티로닌 125I; 리오티로닌 131I; 메리소프롤 아세테이트 197Hg; 메리소프롤 아세테이트 203Hg; 메리소프롤 197Hg; 셀레노메티오닌 73Se; 테크네튬 99 mTc 안티모니 트리설파이드 콜로이드; 테크네튬 99 mTc 비시세이트; 테크네튬 99 mTc 디소페닌; 테크네튬 99 mTc 에티드로네이트; 테크네튬 99 mTc 엑사메타자임; 테크네튬 99 mTc 퓨리포스민; 테크네튬 99 mTc 글루셉테이트; 테크네튬 99 mTc 리도페닌; 테크네튬 99 mTc 메브로페닌; 테크네튬 99 mTc 메드로네이트; 테크네튬 99 mTc 메드로네이트다이소듐; 테크네튬 99 mTc 메르티아타이드; 테크네튬 99 mTc 옥시드로네이트; 테크네튬 99 mTc 펜테테이트; 테크네튬 99 mTc 펜테테이트 칼슘 트리소듐; 테크네튬 99 mTc 세스타미비; 테크네튬 99 mTc 시보록자임; 테크네튬 99 mTc 숙시머; 테크네튬 99 mTc 설퍼콜로이드; 테크네튬 99 mTc 테보록사임; 테크네튬 99 mTc 테트로포스민; 테크네튬 99 mTc 티아타이드; 티록신 125I; 티록신 131I; 톨포비돈 131I; 트리올레인125I; 또는 트리올레인 131I.
본 발명의 치료제 또는 세포독성제는 추가적으로 항암 보충 강화제와 결합하는 본 발명의 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자를 포함할 수 있으며, 항암 보충 강화제는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다:
트리사이틀릭 항우울제(예를 들어 이미프라민, 데지프라민, 아미트립틸린, 클로미프라민, 트리미프라민, 독세핀, 노르트립틸린, 프로트립틸린, 아목사핀 및 마프로틸린); 비-트리사이클릭 항우울제(예를 들어 세르트랄린, 트라조돈 및 시탈로프람); Ca++ 길항제(예를 들어 베라파밀, 니페디핀, 니트렌디핀 및 카로베린); 칼모듈린 억제자(예를 들어 프레닐라민, 트리플루오로페라진 및 클로미프라민); 엠포테리신 B; 트리파라놀 아날로그(예를 들어 타목시펜); 항부정맥제(예를 들어 퀴니딘); 항고혈압제(예를 들어 레세르핀); 티올 고갈제(예를 들어 부티오닌 및 설폭시민) 및 크레마퍼 EL(Cremaphor EL)과 같은 다재내성(Multiple Drug Resistance) 환원제.
본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)는 과립구 콜로니 촉진인자(granulocyte colony stimulating factor)와 같은 사이토카인과 함께 투여할 수도 있다.
본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 및 소분자)은 또한 다음을 포함하는 항암 칵테일과 함께 투여될 수 있다:
겜시타빈(1000 mg/m2); 메토트렉세이트(15 gm/m2 i.v. + leuco. < 500 mg/m2 i.v. w/o leuco); 5-FU (500 mg/m2/day x 5일); FUDR (마우스는 100 mg/kg x 5 ; 인간은 0.6 mg/kg/day); FdUMP: 하이드록시우레아(인간은 35 mg/kg/일); 도세탁셀 (60-100 mg/m2); 디스코더몰라이드; 에포틸론; 빈크리스틴(1.4 mg/m2); 빈블라스틴(3.3-11.1 mg/m2 로 증가시키거나, 드물게는 18.5 mg/m2 까지 증가); 비노렐빈(30 mg/m2/주): 메타-pac; 이리노테칸(환자의 반응에 따라 50-150 mg/m2, 1x/주); SN-38 (이리노테칸보다 -100배 더 강력함); 10- OH 캄프토; 토포테칸(인간은 하루 1.5 mg/m2 , 마우스는 1 x iv LD10mice=75 mg/m2); 에토포사이드(100 mg/m2); 아드리아마이신; 플라보피리돌; Cis-Pt (인간은 100mg/m2); 카보-Pt (인간은 360 mg/m2); 블레오마이신(20 mg/m2): 미토마이신 C (20 mg/m2); 미트라마이신(30 sug/kg); 카페시타빈(2.5 g/m2 경구투여); 시타라빈(100 mg/m2/일); 2-Cl-2'디옥시아데노신; 플루다라빈-P04 (25 mg/m2/일, x 5일); 미톡산트론(12- 14 mg/m2): 미토졸로마이드(> 400 mg/m2): 펜토스타틴 또는 토무덱스.
본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)은 메토트렉세이트와 같은 대사길항물질과 함께 투여될 수 있다. 대사길항물질에는 아래의 화합물 및 이들의 유도체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다:
아자티오프린, 클라드리빈, 시타라빈, 다카르바진, 플루다라빈 포스페이트, 플루오로우라실, 젠시타빈 클로로하이드레이트, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토브로니톨, 마이토탄, 프로구아닐 클로로하이드레이트, 피리메타민, 랄티트렉스드, 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트, 우레탄, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트 등등. 보다 바람직하게는, X는 예를 들어 다음을 포함하는 엽산(folic acid) 타입 대사길항물질일 수 있다:
메트렉세이트, 프로구아닐 클로로하이드레이트, 피리메타님, 트리메토프림 또는 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트 또는 이들의 유도체.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)은 항종양제 중 안트라사이클린(anthracycline) 패밀리의 일종과 결합할 수 있는데, 여기에는 아래의 화합물이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다:
아클라루비신 클로로하이드레이트, 다우노루비신 클로로하이드레이트, 독소루비신 클로로하이드레이트, 에피루비신 클로로하이드레이트, 이다루비신 클로로하이드레이트, 피라루비신 또는 조루비신클로로하이드레이트, 캄프토테킨 또는 그 유도체 또는 10, 11 메틸렌디옥시캄프토테킨과 같은 관련화합물 또는 안사미토신 P3, 메이탄신, 2'-N-디메틸메이탄부틴 및 메이탄바이클리놀과 같은 메이탄시노이드 패밀리.
본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)은 진단 또는 치료 목적을 위해 변형되거나 표지될 수 있다. 방사능제, 형광물질, 중금속 또는 다른 물질들의 검출 가능한 표지가 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자에 결합할 수 있다. 물질에 단독, 이중 또는 다중 표지를 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 킬레이트기를 통해 아민 함유 사이드 그룹 또는 반응기와 결합한 90Y 과 결합을 한 하나 또는 그 이상의 잔기에 방사능 요오드화를 이용한 이중 표지를 함으로써 조합 표지를 만들 수 있다. 이는 광범위하게 분산된 작은 종양세포 덩어리를 확인하는 것과 같은 전문화된 진단에 유용할 수 있다.
본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자) 또는 이들의 아날로그는, 예를 들어, 펩타이드의 티로신 잔기를 할로겐화 함으로써 변형될 수 있다. 상기 할로겐은 불소, 염소, 브롬, 요오드 및 아스타틴을 포함한다. 할로겐이 예를 들어 18F, 75Br, 77Br, 122I, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I 또는 211At와 같은 방사성 동위원소인 경우, 이러한 할로겐화 된 본 발명의 물질은 검출 가능하도록 표지될 수 있다. 할로겐화 된 본 발명의 물질은 최소 하나의 아미노산과 공유 결합을 이루는 할로겐 원자를 가지며, 바람직하게는 D-Tyr 잔기를 가진다. 다른 적합한 검출 가능한 변형은 다른 화합물(예를 들어 플루오로크롬과 같은 플푸오레세인)이 아날로그, 특히 라이신을 포함하는 링커를 가진 아날로그의 라이신 잔기에 결합함으로써 이루어진다. 본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)에 방사능 표지를 하기 위한 방사성 동위원소는 본 발명의 물질 또는 이들의 아날로그 또는 적합한 반응기의 아미노산 잔기에 공유결합할 수 있는 모든 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성 동위원소는 베타 또는 감마 광선을 방출하는 동위원소들로부터 선택할 수 있다. 혹은 상기 물질은 킬레이트기를 포함하도록 변형될 수 있으며, 예를 들어 물질 내의 라이신 잔기(들)과 공유결합할 수 있다. 킬레이트기는 이후 갈륨, 인듐, 테크네튬, 이테르븀, 레늄 또는 탈륨과 같은 다양한 방사성 동위원소들(예를 들어 125I, 67Ga, 111IIn, 99mTc, 169Yb, 186Re)과 결합할 수 있다.
본 발명의 물질이 방사성 동위원소의 결합에 의해 변형되는 경우, 바람직하게 방사성 동위원소는 사용된 생물학적 물질과 동일하거나 더 긴 방사능 반감기를 가진다. 보다 바람직하게는, 방사성 동위원소는 할로겐 원소의 방사성 동위원소(예를 들어 불소, 염소, 브롬, 요오드 및 아스타틴의 방사성 동위원소)이고, 보다 더 바람직하게는 75Br, 76Br, 77Br, 122I, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I 또는 211At이다.
방사성 동위원소 금속을 포함하는 본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)은 방사선 영상 또는 방사능 치료에 유용하다. 바람직한 방사성 동위원소는 또한 9 mTc, 51Cr, 67Ga, 68Ga, 111In, 168Yb. 140La, 90Y, 88Y, 153Sm, 156Ho, 165Dy, 64Cu, 97Ru, 103Ru, 186Re, 188Re, 203Pb, 211Bi, 212Bi, 211Bi, 및 214Bi를 포함한다. 적합한 금속의 선택은 원하는 치료 또는 진단에의 적용에 따라 결정된다.
금속 원소를 포함하는 본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)은 치료 및/또는 진단제로써 유용하다. 검출 가능한 표지는 중원소의 금속 이온이거나 Gd3 +, Fe3 +, Mn3 + 또는 Cr2 + 와 같은 회토류 이온일 수 있다. 상자성 또는 초상자성 금속을 포함하는 콘쥬게이트는 MRI 영상화에 적용하는데 유용한 진단 물질이다. 펩타이드 물질에서 이용될 수 있는 상자성 금속은 크로뮴 (Ⅲ), 망간(Ⅱ), 철(Ⅱ), 철(Ⅲ), 코발트(Ⅱ), 니켈(Ⅱ). 구리(Ⅱ), 프라세오디뮴(Ⅲ), 네오디뮴(Ⅲ), 사마륨(Ⅲ), 가돌리늄(Ⅲ), 테르븀(Ⅲ), 디스프로슘(Ⅲ), 홀뮴(Ⅲ), 에르븀(Ⅲ) 및 이테르븀(Ⅲ)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 금속은 최소 10, 12, 15 또는 20 mM-1 sec-1 Z- 1 의 이완성(relaxivity)을 가지며, 여기서 Z는 상자성 금속의 농도이다. 킬레이트기는 검출 가능한 표지 또는 다른 분자를 본 발명의 물질과 간접적으로 결합시키는 데 이용된다. 킬레이트기는 예를 들어, 안정한 이중작용 킬레이터를 이용하여 본 발명의 물질을 방사능 표지와 결합시키거나, 본 발명의 물질의 말단 또는 내부에 있는 하나 또는 그 이상의 아미노산과 결합할 수 있다. 이들은 이소티오사이아네이트(isothiocyanate)β-Ala 또는 애드먼(Edman) 분해를 막는 적합한 비-α-아미노산 링커를 경유하여 결합할 수도 있다. 당업계에 알려진 킬레이터는 예를 들어, 이니노카르복시 반응기, 폴리아미노카르보닐 반응기, DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid) 및 DOTA(1, 4,7,10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraacetic acid)을 포함한다. 일반적인 방법은 Liu et al. Bioconjugate Chem 12(4):653.(2001); Cheng et al. WO 89/12631 ; Kieffer et al. WO 93/121 12; Albert et al. 미국공개 제5,753,627호; 및 WO 91/01144에 개시되어 있으며, 이들은 본 명세서에서 참고문헌으로써 삽입되었다.
본 발명의 약제학적 조성물
본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)는 치료 또는 진단 목적으로 환자에게 투여하기 위해 또는 인 비트로에서의 진단 목적으로 정제될 수 있다. 치료제 또는 세포독성제와 결합되었을 때, 본 발명의 물질에 의한 특이적 타겟팅은 종양을 선택적으로 파괴하게끔 한다. 예를 들어, 본 발명의 물질은 폐, 유방, 전립선 및 대장의 종양을 타겟팅하여 파괴한다. 본 발명의 물질은 인간과 같은 포유류 대상체에 직접적으로, 혹은 다른 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 당업계에 알려진 염과 조합되어 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 비독성 산 첨가 염 또는 제약 산업에서 널리 사용되는 금속 복합체를 포함할 수 있다. 산 첨가 염의 예로는 아세틱, 락틱, 파모익, 말레익, 시트릭, 아스코르빅, 숙시닉, 벤조익, 팔미틱, 수베릭, 살리실릭, 타타릭, 메탄설포닉, 톨루엔설포닉 또는 트리플루오로아세틱산 등과 같은 유기산; 타닉산 또는 카르복시메틸 셀룰로오스 등과 같은 폴리머산; 및 하이드로클로릭산, 하이드로브로믹산, 설퍼릭산, 포스포릭산 등과 같은 무기산이 있다. 금속 복합체는 아연, 철 등을 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체의 한 예는 생리식염수이다. 다른 생리학적으로 허용 가능한 담체 및 그들의 정제는 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences.(18판); ed. A. Gennaro, (1990); Mack Publishing Company, Easton. PA.에서 서술되어 있다.
본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)의 치료적 유효량에 대한 약제학적 정제, 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염은 구강, 비경구(예를 들어 근육내, 복강내, 정맥내 또는 피하내 주사를 하거나 흡입, 피내, 안구 드롭 도는 임플란트), 비강, 질내, 직장 또는 국부적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 투여할 수 있다. 정제를 제조하는 당업계에 잘 알려진 방법은 Remington's Pharmaceutical Sciences (18판), ed. A. Gennaro, (1990). Mack Publishing Company. Easton. PA.에서 서술되어 있다. 구강 투여를 목적으로 한 본 발명의 물질은 약제학적 조성물을 생산하는 당업계에 알려진 어떠한 공지된 방법에 의해서도 고체 또는 액체형태로서 생산될 수 있다. 본 발명의 물질을 포함하는 조성물은 더 맛좋은 생산품을 만들기 위해 선택적으로 감미료, 조미료, 색소, 향 및/또는 보존제를 함유할 수 있다. 경구 투여를 위한 고체 복용형태는 캡슐, 정제, 알약, 파우더 및 과립을 포함한다. 이러한 고체 형태에 있어서, 물질은 최소 하나의 불활성인 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 여기에는 예를 들어, 칼슘 카보네이트, 소듐 카보네이트, 락토오스, 수크로스, 전분, 칼슘 포스페이트, 소듐 포스페이트 또는 카올린같은 불활성 희석액이 포함될 수 있다. 결합물질, 완충물질 및/또는 윤활제(예를 들어 마그네슘 스티어레이트)도 사용될 수 있다. 정제 및 알약은 추가적으로 장용제피(enteric coating)가 될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 복용 형태는 약제학적으로 허용 가능한 에멀젼, 용액, 현탄액, 시럽 및 연성 젤라틴 캡슐을 포함한다. 이들 형태는 당업계에서 흔히 쓰이는 물 또는 오일 배지와 같은 불활성 희석액을 포함한다. 이들 불활성 희석액 외에도, 조성물은 본 발명의 물질을 포함하는 조성물은 습윤제, 유화제 및 부유제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 물질을 포함하는 조성물의 비경구 투여를 위한 정제는 액상 살균 용매 또는 비액상 용매, 현탄액 또는 에멀젼을 포함한다. 적합한 용액의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 야채오일, 젤라틴, 수소화 나프탈렌 및 에틸 올레이트 같은 주입 가능한 유기 에스터를 포함한다. 이러한 정제는 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 생체적합적, 생분해성 락타이드 폴리머, 락타이드/글리콜라이드 코폴리머 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머가 조성물의 분비를 조절하는 데에 사용될 수 있다. 본 발명의 물질을 포함하는 조성물의 다른 가능한 비경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 코폴리머 입자, 삼투압 펌프, 매몰식 주입 시스템 및 리포좀을 포함한다.
액상 정제는 예를 들어, 박테리아 함유 필터를 이용하여 여과하거나, 살균제를 조성물에 혼합하거나 또는 조성물에 빛을 쬐거나 가열함으로써 살균시킬 수 있다. 또는 살균 고체조성물의 형태로 생산되어 사용 직전에 살균수나 다른 주입 가능한 살균 배지에 용해될 수도 있다.
직장 또는 질내 투여를 위한 본 발명의 물질을 포함하는 조성물은 바람직하게는 코카 버터나 좌약 왁스 등의 첨가제를 포함하는 좌약이다. 비강 또는 설하 투여를 위한 조성물은 당업계에 알려진 표준 첨가제와 함께 만들어질 수 있다. 흡입을 위한 조성물은 예를 들어 락토오스 등의 첨가제를 포함하거나, 또는 예를 들어, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트 및 디옥시콜레이트를 함유하는 액상 솔루션이거나, 또는 비강내 드랍(drop) 또는 스프레이 또는 젤 형태의 투여를 위한 오일 솔루션일 수 있다. 조성물 내의 활성성분의 양은 다양할 수 있다. 당업자는 정확한 개인별 투여량이 다양한 요소(예를 드렁 투여되는 펩타이드, 투여 시간, 투여 경로, 정제의 특성, 분비율, 대상체의 상태 및 연령, 체중, 건강, 환자의 성)에 의해 조정될 수 있음을 인식할 것이다. 뿐만 아니라, 물질이 타겟팅한 증상의 심각성도 투여량을 정하는 기준이 될 것이다. 일반적으로, 매일 O.1 μg/체중kg - 100 mg/체중kg의 투여량이 단일 투여되거나 또는 다중 투여로 나뉘어진다. 바람직하게는, 일반적인 투여량 범위는 하루 250μg/체중kg-5.0 mg/체중kg 이다. 투여경로에 따라 효율성이 다르기 때문에 필요한 투여량은 다양하다. 예를 들어, 경구 투여는 일반적으로 정맥내 투여에 비하여 높은 투여량을 필요로한다. 이러한 투여량은 최적화를 위해 당업계에 잘 알려진 표준적인 경험에 의해서 조절될 수 있다. 일반적으로, 명확한 약제학적 유효량은 주치의에 의해서 상기의 요인들을 고려하여 결정될 것이다.
본 발명의 물질(예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)은 지속적인 방출 조성물에서 투여될 수 있는데, 이는 예를 들어 미국 등록 제5,672,659 a호 및 미국 등록 제5,595,760호에 서술되어 있다. 즉각적 또는 지속적 방출 조성물의 사용은 치료되는 증상의 형태에 좌우된다. 만약 증상이 급성 또는 과급성 이상인 경우 즉각적 방출 조성물이 바람직하다. 한편, 꾸준한 장기 치료에 있어서는 지속적 방출이 바람직하다.
본 발명은 다음의 실시예에 의해 상세하게 설명되지만, 이는 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예 1: 베타 이미터(Beta Emitter)로 표지된 종양 결합 펩타이드의 치료적 효과
이트륨으로 표지된 펩타이드를 이종이식된 종양을 가진 래빗에서의 잠재적 치료 가치를 시험할 목적으로 제작하였다. 펩타이드는 C-말단 부분에 DOTA같은 짧은 링커서열(gly-gly-gly-ser)을 경유하여 킬레이트기에 결합시켰다. 90-YC13을 상업적으로 구입하였다. 90-Y를 암모늄 아세테이트 완충액에서 pH ~4.5로 펩타이드-DOTA 용액과 반응시켜 펩타이드 복합체를 표지하였다. 종양함유 래빗은 2 mg/ml 의 폐암세포 현탄액으로부터 1.0 ml를 피하 주입하여 만들었다. 종양을 약 2주동안 자라게 했다. 종양함유 동물들은 실험군 및 대조군으로서 임의로 추출하였다. 펩타이드를 각 동물마다 꼬리혈관 주입을 통해 투여했다. 5마리 동물들에 90-Y-펩타이드를 5 mCi/kg로 1회 투여했고, 5마리 동물들은 90-Y-펩타이드를 10 mCi/kg로 1회 투여했으며,대조군인 5마리 동물들에 표지되지 않은 펩타이드(8 nmol/kg)를 등몰(equimolar)로 1회 투여했다. 각각의 종양의 부피는 가장 긴 3개의 지름 dl, d2 및 d3을 측정하는 양각기를 이용하여 타원체 공식 V= (π/6) (dl *d2*d3) 에 따라 계산하였다. 각 동물들의 종양의 부피는 각 동물에서의 개개의 종양 부피의 합으로써 계산하였다. 종양의 부피는 3-4일 마다 측정하였다. 최초 부피로 표준화된 종양 부피는 시간에 따라 플롯화하였다.
대조군은 종양의 부피가 2cc가 되거나 괴저성이 되면 사망하였다; 이 기간은 펩타이드 주입 후 약 10일이 걸렸다. 5 mCi/kg를 주입한 군중 한 마리는 주입 3주후 완치되었고 다른 네 마리는 대조군에 비해 1주일정도 성장 지연을 보였다. 10 mCi/kg를 주입한 군 중 네 마리는 주입 7주후에 완치되었고 8개월간의 관찰 기간 동안 재발은 없었다. 한 마리는 성장의 지연을 보였으나, 종양이 2cc 부피가 되거나 괴저성이 되면 사망할 것이다.
실시예 2: 감마 이미터(Gamma Emitter)로 표지된 종양 결합 펩타이드의 진단적 이용을 시험하기 위한 인간 실험
3b 또는 4기 폐암 진단을 받은 15명의 환자를 참여시켰다. 18세 미만의 환자 또는 이만부는 제외시켰다. 참가자의 평균 연령은 60세이다. 각각의 피실험자에 대해 18-FDG의 10-13 mCi를 투여한 후 골하부터 피근까지의 PET 및 비-대조 CT 이미징을 하는 표준 임상 프로토콜에 따라 PET/CT 이미징을 실시하였다. PET 이미징 후 1주에서 2주 사이에, 방사성 약품으로서 방사능 표지가 된 펩타이드를 이용하여 신티그래픽 영상을 얻었다. 방사성 약품을 펩타이드-gly-gly-gly-ser-DTPA를 111In 클로라이드와 반응시킴으로써 제조하였다. 각각의 피실험자에게 111In이 표지된 펩타이드 5 mCi를 정맥내 투여하였다. 피실험자의 전후 전신 평면 이미지를 방사성표지 펩타이드 투여 후 24시간 및 48시간 경과시에 촬영하였다. 흉부 및 복부의 SPECT 이미징도 방사성표지 펩타이드 투여 후 24시간 및 48시간 경과시에 촬영하였다. 중 에너지 분광기를 이용하여 SPECT/CT 카메라에서 신티그래픽 이미지를 얻었다. 두 명의 방사선 기사가 각각의 피실험자의 PET/CT를 판독하고 다른 두명의 방사선 기사가 각각의 피실험자의 PET/CT를 판독하였다; 각 팀의 방사선 기사들은 다른 팀의 결과를 몰랐다. 위치, 크기 및 PET에 의해 수집된 방사성 트레이서의 비정상적 집중의 정도는 SPECT 이미징과 비교하였다. PET 및 SPECT 이미징 결과 사이의 일치 정도를 학인하기 위해 Cohen's kappa 실험을 이용하였다.
15명의 피실험자로부터, PET 및 SPECT 이미징에 의해 수집된 방사능 트레이서의 40개의 비정상적 집중이 관찰되었다. 각각의 결과에 따르면 약 9명의 환자가 3b 단계에 있었다. 48시간째에 얻은 SPECT 이미지를 PET이미지와 비교하여 Cohen's kappa 비율이 0.85로 계산되었다. 24시간째에 얻은 SPECT 이미지를 PET이미지와 비교했을 때 Cohen's kappa 비율은 0.8로 계산되었다. 해부적 부위, 기관의 위치 및 손상의 크기에 있어서 모두 일치하였다. 대략적인 암의 단계를 비교함에 있어서, 두 이미징 원리의 Cohen's kappa의 비율은 0.95로 계산되었다.
실시예 3: 암 결합 펩타이드 및 에피토프의 동정
암 결합 펩타이드의 선택
암세포에 대한 패닝의 최종 라운드 후, 증폭되지 않은 12mer 파지 풀로부터 24개 클론 및 증폭되지 않은 7mer 파지 풀로부터 13개 클론을 시퀀싱하였다. 도 2는 가장 보존성이 높은 서열을 나타낸다.
암 결합 펩타이드의 세포 내재화
암세포에 결합하는 12mer를 플루오레세인(PanF)으로 표지하고 폐암 (NCI-H460), 전립선암(DU- 145), 및 섬유아세포(CCD- 1070Sk)를 배양하는 데에 사용하였다. 형광 현미경에 의해 폐암 및 전립선암이 세포 내로 들어갔음을 확인하였으나, 섬유아세포는 그렇지 않았다.
리틱 펩타이드 서열과 접합된 암 결합 펩타이드의 세포독성
4개의 잔기의 링커(PanL)를 통해 리틱 펩타이드 서열과 접합된 암 결합 12mer를 합성하여 폐암, 전립선암, 비-악성 전립선 상피세포 및 섬유아세포에서의 다양한 세포독성 활성을 시험하였다. 2.5 μM의 농도의 펩타이드를 각각의 암세포에 투여한 경우, 투여량에 따른 세포사의 증가를 관찰하였다. 비악성 세포주에서는 세포사의 정도가 적었다.
인 비트로 세포독성: 리신-A와의 결합
각 세포형태의 사망비율을 도 5에 나타냈다. 폐암(50%) 및 전립선암(32%)의 경우에 섬유아세포(16%)보다 세포사가 더 많이 관찰되었다. 결합하지 않은 리신-A 서브유닛을 각각의 세포와 함께 배양하였고, 어떠한 세포사도 관찰되지 않았다.
펩타이드 타겟의 동정
바이오틴(DYWDTSWPLLLFGGGSK; 서열목록 제12서열; PanB)에 결합한 암 결합 펩타이드를 친화도 포획 기술에 이용하여 암-선택 펩타이드가 결합하는 분자 타겟을 분리하고 동정하였다. 친화도 크로마토그래피에 의해 포획된 종들을 용출시키고, 이를 SDS PAGE를 이용하여 더 정제하였다. 7OkD에 해당하는 단일의 두드러진 밴드가 쿠마시 블루 염색 결과 나타났다(도 6). 밴드는 잘려져서 다중으로 관련된 종을 밝히는 질량 스펙트로메트리 분석을 위해 사용되었다. 동정된 타겟들 중에 몇몇은 HSP A5; 스트레스-70 단백질, 미토콘드리아 전구체; 열 충격 종 71 kDa 단백질의 아이소폼 1 및 열 충격 70 kDa 단백질 1을 포함하는 HSP70 패밀리였다. 또한 단백질 다이설파이드 이소머라제 A4 전구체가 동정되었다. 이들 단백질 중 다수가 암세포에서 일어나는 것으로 알려진 펴진 단백질 반응(unfolded protein response)에 관련되어 있었다.
펩타이드의 Hsc71 의 선택된 에피토프에의 결합
방사능 표지된 PanC의 표지되지 않은 PanC에 대한 비율이 증가할수록 더 높 은 레벨의 방사능 표지된 펩타이드 PanC가 바이오틴-결합 에피토프(GIPPAPRGVPQIEVTF; 서열목록 제15서열)에 결합하는 것을 관찰하였다(도 8). 표지된 PanC의 농도가 20 nM로 고정된 반면, 표지되지 않은 PanC가 표지된 펩타이드의 결합을 막기 위해 첨가되었다. 표지/비표지 비율이 0.1%가 되자 뜨거운 PanC의 후보 에피토프들에의 결합이 포화되었다.
Hsc71 의 에피토프는 펩타이드가 Hsp70 에 결합하는 것을 방해한다.
다양한 농도의 Hsc71의 합성 에피토프(GIPPAPRGVPQIEVTF; 서열목록 제 15서열)를 일정량의 PanC와 함께 Hsp70 코팅된 웰에 첨가하여 상기 에피토프가 PanC에 결합함에 있어 Hsp70과 경쟁하는지를 알아보았다. 상기 에피토프는 PanC가 Hsp70과 결합하는 것을 농도 의존적으로 억제하였으며, 이는 PanC에 대한 결합에 있어 에피토프와 Hsp70이 경쟁한다는 사실과 일치한다(도 8). 비교해보면, 에피토프는 PanC의 알부민에 대한 결합을 모든 농도에서 동일하게 억제하는데, 이는 에피토프와 알부민 사이에는 특이적 결합 경쟁이 없음을 뜻한다. 종합하면, 이들 결과는 Hsp70에 PanC가 결합하는 것은 선택된 에피토프에의 결합에 의해 특이적으로 매개된다는 것을 암시한다.
재료 및 방법
세포배양
모든 세포들은 American Type Culture Collection (Manassas. VA)에서 구입 하였다. 각가그이 세포는 37℃, 5% CO2 에서 배양하였다. COLO 320DM (대장암) 및 NCI-H460(폐암)은 RPMI 1640 배지에서 1.5g/L 소듐 바이카보네이트, 4.5g/L 글루코스, 1OmM HEPES 및 1.OmM 소듐 피루베이트를 함유하고 10% 우태아혈청을 공급받도록 조정하여 2mM L- 글루타민과 함께 배양하였다. DU- 145 (전립선암) 및 CCD- 1070Sk (섬유아세포)는 MEM(minimum essential medium)(Eagle)에서 2mM L-글루타민 및 Earle's BSS와 함께 1.5g/L 소듐 바이카보네이트, 0.1mM 비 필수 아미노산 및 1.OmM 소듐 피루베이트를 함유하고 10% 우태아혈청을 공급받도록 조정하여 배양하였다. Hs 578T(유방암)은 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 4mM L-글루타민과 함께 1.5g/L 소듐 바이카보네이트, 4.5 g/L 글루코스를 함유하고 0.01mg/ml 우 인슐린 및 10% 우태아혈청을 공급받도록 조정하여 배양하였다. RWPE-I(비 암 전립선 상피세포)는 무 케라티노사이트-혈청 배지에서 5 ng/ml 인간 재조합 EGF 및 0.05mg/mL 우 뇌하수체 추출물을 공급하여 배양하였다.
암세포 결합 펩타이드의 선별
파지 디스플레이 라이브러리(Ph.D.- 12 및 Ph. D. -7, New England Biolabs. Ipswich. MA)를 다양한 종류의 암 세포에 대하여 연속적으로 패닝하였다. 각각의 암 세포 종류에 대한 패닝 이후, 암세포에 결합한 클론들을 수집하여 증폭시켰고; 증폭된 클론들을 정상 섬유아세포에 대하여 패닝 하였다. 정상 섬유아세포에 대하여 패닝을 한 후, 결합하지 않은 클론들을 수집하고 다음 종류의 암 세포에 대하 여 패닝하였다(도 1). 이러한 방법으로, 클론들은 정상 섬유아세포와 결합하지 않고 다양한 타입의 암세포에 결합할 수 있는 능력에 따라 선별되었다. 12mer 라이브러리에 있어서, 패닝에 사용된 세포의 순서는 1)대장암 후 섬유아세포, 2)전립선암 후 섬유아세포, 3) 폐암 후 섬유아세포, 4)유방암 후 섬유아세포, 5)대장암 후 섬유아세포 및 6)전립선암 후 섬유아세포이다. 7mer 라이브러리에 있어서, 패닝에 사용된 세포의 순서는 1)유방암 후 섬유아세포, 2) 폐암 후 섬유아세포, 3)전립선암 후 섬유아세포 및 4)대장암이다. 더 상세한 설명은 하기에 기재하였다.
종양세포들을 트립신화시켜 pH 7.4에서 PBS에 부유시켰다. 세포 현탄액은 mL당 106개의 세포의 농도로 희석시켰다. 파지 라이브러리의 일부를 1.5mL 에펜도르프 튜브에서 세포 현탄액에 첨가시킨 후 23℃에서 60분간 흔들면서 배양하였다. 배양 후, 세포 현탄액을 18K rpm으로 10분간 원심분리하였다. 세포 펠렛이 암세포에서 유래된 것일 경우, 상청액은 버렸다. 펠렛을 PBS로 세 번 세척한 후, 세포 라이시스 용액(tris 25 mM. pH 7.5, 0.5% triton X-IOO)에서 배양하였다. 라이시스 혼합물을 초기 대수기의 E. coli(ER2738) 배양액 20 mL에 첨가하고 Ph.D. 라이브러리 키트(New England Biolabs)의 생산자의 설명서에 따라 파지 증폭을 하였다. 만약 펠렛이 정상 섬유아세포에서 유래한 것일 경우, 상청액(결합하지 않은 파지를 함유하는)은 보관하여 다음번 암세포에 대한 이후의 패닝에 사용하였다.
암세포에 대한 패닝의 최종 라운드 후, 세포들을 침전시키고, PBS로 세 번 세척한 후 파쇄하였다. 파지를 함유한 파쇄 혼합물을 제조자의 설명서에 따라 아가 플레이트 상에서 타이터링 하였다. Ph.D.-12 라이브러리의 경우, 24개 플라크를 DNA 시퀀싱을 위해 선별하였다. Ph.D.-7 라이브러리의 경우, 15개 플라크가 선별되었다. 연속적인 결합 서열은 도 2에 나타냈다.
펩타이드의 합성
펩타이드는 표준 FMOC 보호 반응을 사용하여 합성하였다. 인 비보 연구에 있어서, 암세포에 결합하는 12개 잔기의 펩타이드 서열과 4개의 잔기의 링커서열을 플루로포어 또는 세포독성제로 표지하였다. 서열 DYWDTSWPLLLFGGGSK (서열목록 제12서열 12; PanF)(플루레세인)-아마이드는 인 비트로의 세포 내재화 연구에 사용된다. 인 비트로에서의 세포사 연구에 있어서, 펩타이드는 C-말단, 다음의 세포 용해 서열과 함께 만들어진다: DYWDTSWPLLLFGGGS(KFAKFAK)3 (PanL;서열목록 제 13서열). 펩타이드 서열 DYWDTSWPLLLFGGGC (PanC; 서열목록 제 14서열)은 이후의 리신-A와의 콘쥬게이션 및 99m-테크네튬에 의한 방사성 표지를 위해 합성하였다. 펩타이드 DYWDTSWPLLLFGGGSK-바이오틴 (서열목록 제 12서열: PanB)은 암 항원 분리를 위해 합성하였다.
세포 내재화
NCI-H640, DU-145 및 CCD-1070Sk는 상술한 바와 같이 배양하였다. 세포는 6웰 플레이트에서 커버슬립 위에서 배양하였다. 25 μM 용액의 펩타이드 DYWDTSWPLLLGGGSK-플루레세인 (PanF; 서열목록 제 12서열)이 MEM(modified Eagle's medium)에서 만들어졌다. 세포배양 배지는 1.6 mL 의 펩타이드 함유 배지로 교체되었고, 세포들을 펩타이드와 함께 37℃에서 한시간 동안 배양하였다. 배지는 제거되고 세포들을 PBS로 세 번 세척하였다. PBS에 2mL의 포름알데히드를 첨가하고, 플레이트를 15분간 얼음에 보관하였다. 세포들을 PBS로 세 번 세척하고 증류수로 행궜다. 커버 클립은 DAPI 함유 배지로 고정시키고 Olympus BX51 형광 현미경 및 가진과 방사 파장이 490 과 520 nm인 DP70 디지털 카메라로 관찰하였다.
용해 펩타이드에 접합된 암 결합 펩타이드의 세포독성
서열 NCI-H640, DU-145 및 CCD-1070Sk를 상술한 바대로 배양액에서 배양하였다. 세포들은 10% FBS를 함유한 배양 배지에서 트립신화시키고 부유시켰다. 세포들을 5분간 1,000 rpm으로 원심분리시켰다. 상청액은 제거하고 세포들을 다시 FBS 없는 1ml 배지에서 부유시켰다. 세포 현탄액은 20,000 세포/75μL의 농도로 희석시켰다. 적절하게 희석된 펩타이드 용액(PanL) 25 μL를 세포시료에 첨가하여 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 또는 lOμM의 다양한 농도를 만들었다. 각각의 시료는 3배를 만들었다. 세포 현탄액은 96 웰 플레이트로 옮겨져서 다양한 농도의 PanL 하에서 37℃에서 2시간을 배양하였다. 각각의 세포 형태에 따른 6개의 시료는 펩타이드를 포함하지 않는다. 분석 플레이트를 배양기로부터 제거하고, 라이시스 용액(트리스 25mM, pH 7.5, 0.5% 트리톤 X-100) 2μL를 3개의 세포 형태의 시료에 펩타이드 없이 첨가하여 최대 LDH 분비 양성대조군으로 하였다. 각 시료에 서의 LDH 분비는 각 웰에 lOOμl의 CytoTox-ONE Reagent(Roche Applied Science)을 첨가한 뒤 플레이트 쉐이커로 30초간 혼합하여 측정하였다. 시료들은 22℃에서 10분간 배양하였다. 반응은 스톱 용액 50μl(CytoTox-ONE™ Reagent가 100μl첨가됨)를 각각의 웰에 첨가함으로써 종료되었다.
각 웰마다 53Onm의 여기 파장 및 620nm의 방사 파장(Cytofluor 4000)을 이용하여 형광성을 측정하였다. CytoTox-ONE 분석은 죽은 세포의 양과 정비례하는 형광 산물의 양을 보여준다(상관계수 = 0.99, 데이터는 없음). 죽은 세포의 숫자는 아래의 공식을 이용해 계산할 수 있다.
P = 펩타이드 처리된 세포의 웰에서 LDH 분비; C = 펩타이드 비처리된 세포의 웰에서 LDH 분비; 및 M = 라이시스 용액에서 처리된 웰에서의 LDH 분비.
상기 공식은 CytoTox-ONE 산물의 증가와 사멸 세포의 개수가 선형관계에 있다는 가정에 기초하며, C는 y-절편이고, M은 100% 세포사에 기인한다.
인 비트로 세포독성: 리신-A와의 결합
펩타이드 PanC (DYWDTSWPLLLFGGGC;서열목록 제14서열)은 리신-A 서브유닛(Sigma-Aldrich)과 결합한다. 리신-A는 제조자로부터 용액상태로 입수할 수 있다. 0.1M PBS/20% 글리세롤로 완충액 교체를 할 수 있다. 리신-A를 1:10 몰비율로 상온에서 30분간 NHS-PECV 말레이미드 크로스 링커(Pierce, Rockford, IL)와 결합시켰다. 유도체화 리신-A는 0.1M PBS/20% 글리세롤을 용해 완충액으로 이용하여 P4 컬럼에서 정제하였다. 유도체화 리신-A는 P12S와 1:1 몰비율로 결합시켜 상온에서 2시간 동안 반응시켰다.
NCI-H640, DU- 145 및 CCD-1070Sk를 상술한 바 대로 배양하였다. 세포들은 10% FBS를 함유한 배양 배지에서 트립신화시키고 부유시켰다. 세포들을 5분간 1,000 rpm으로 원심분리시켰다. 상층액을 제거하고 세포들을 다시 FBS 없는 1ml 배지에서 부유시켰다. 세포 현탄액은 20,000 세포/75μL의 농도로 희석시켰다. 적절하게 희석된 펩타이드-리신A 콘쥬게이트 25 μL를 세포시료에 첨가하여 1μM의 농도를 만들었다. 각각의 시료는 3배를 만들었다. 세포 현탄액은 96 웰 플레이트로 옮겨져서 펩타이드-리신A 콘쥬게이트 하에서 37℃에서 2시간을 배양하였다. 죽은 세포의 비율(도 5)은 상기와 같이 계산하였다. 암세포 항원의 동정
NCI-H460 세포를 상기와 같이 배양하여 109개 세포를 생성하였다. CNM 단백질 추출 키트(BioChain, Hayward, CA)를 세포막 단백질 추출을 위해 사용하였다. 제조자의 설명서와 달리 세포질 파편에서 미토콘드리아를 그대로 두었다; 그렇지 않으면 추출물이 제조자 의도대로 기능할 것이기 때문이다. 세포막 단백질 함유 부분은 합쳐져서 -80℃에서 보관하였다. 고정된 뉴트라비딘 컬럼은 pH 7.2의 TBS에서 고정 뉴트라비딘 컬럼 비드를 부유시키고 결과로써 얻어진 젤 혼합물을 Nanosep 3K 스핀 컬럼 (Pall Corporation, East Hills. NY)으로 200μL를 파이펫팅 함으로써 만들었다. 컬럼은 여러 튜브들에 놓여졌고, 1,250 xg로 30-60초 간 컬럼 마개를 열고 원심분리하기 전에 500 μl 의 TBS를 각각의 스핀 컬럼에 첨가하였다. 바닥 플러그를 각각의 컬럼에 끼웠다.
비오틴화된 펩타이드(PanB)는 lOOμg/mL으로 만들었다; 500μL 용액을 스핀 컬럼에 첨가하였다. 컬럼들을 상온에서 30분간 부드럽게 흔들어주며 배양하였다. 수집용 튜브의 컬럼은 1250 xg로 60초간 원심분리시켜 결합하지 않은 PanB를 제거하였다. 스핀 컬럼은 비오틴 블러킹을 위해 분리된 튜브로 옮겼다. 비오틴 블러킹 용액(lOOμg/mL) 250μL를 각각의 스핀 컬럼에 첨가하였다. 컬럼은 캡을 씌워 3-5회 뒤집어준 후 상온에서 5분간 배양하였다. 각각의 컬럼의 상부 스크류 캡을 제거하고 컬럼을 1250 xg로 30-60초간 원심분리시키기 위해 수집튜브에 위치시켰다. TBS (pH 2.2) 500μL를 각각의 스핀 컵에 첨가하였다. 상부 스크류 캡을 다시 끼우고 3-5회 뒤집어 주었다. 상부 스크류 캡을 제거하였다. 컬럼을 수집 튜브에 위치시킨 후 1250 xg로 30-60초간 원심분리하였다. 컬럼은 바닥 플러그를 끼우기 전에 두 번 더 TBS 500μL로 세척하였다.
세포막 단백질 혼합물을 상온으로 해동시킨 후 스핀 컬럼에 첨가하여 부드럽게 흔들면서 40℃에서 4시간동안 배양했다. 상부 캡과 바닥 플러그를 각각의 컬럼으로부터 제거하였다. 컬럼들을 수집튜브에 위치시킨 후 1250 xg로 60초간 원심분리하였다. 컬럼들을 세척을 위해 분리된 튜브로 옮겼다. 컬럼을 TBS에서 4번 세척하였다. 각각의 세척이 끝날 때 마다, 세척 완충액은 페기물로써 수집튜브에 수집되었다. 이후 1250 xg로 30-60초간 원심분리를 하였다. 스핀 컬럼은 포획한 막 단백질의 용해를 위해 새로운 수집튜브로 옮겼다. 단백질은 용해 완충액(0.2 M 글리신-HCl, pH 2.2)에 의해 배양 컬럼에 용해되었고, 이후 1250 xg로 30-60초간 원심분리를 하였다. 용해액의 pH를 중화시켰고 완충액 교환을 하여 pH 7.2의 TBS에 단백질이 용해되었다. 단백질 용해액은 ID SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(PAGE)을 이용하여 더 정제한 후, 쿠마시 블루 염색을 실시하였다. 7OkD(도 6) 위치에 나타난 두드러진 밴드는 잘라내어 University of Massachusetts Medical School의 단백질 시퀀싱 기관에 기탁하였다. 단백질은 질량 스펙트로메트리를 이용하여 동정하였다.
펩타이드 PanC 에 대한 방사능 표지
PanC(3M)의 2μL 분취량을 0.25M 암모늄 아세테이트 40 μl, pH 8.7의 15μL 타타르산 완충액, 100 mM 소듐 타타산 하에서 4 μL 염화주석, 및 99m-Tc 과산화테크네슘(pertechnetate)과 혼합하였다. 혼합물은 95℃에서 25분간 가열되었다. Sep-Pak으로 QC를 하였고 언제나 90% 이상이었다. 소량의 분취물도 방사선 특성을 조사하기 위해 Waters 600 HPLC에 주입하였다. 절편들은 수집되어 감마 측정기(Perkin-Elmer Wallac Wizard 1470)에 의해 판독되었다.
Hsc71 의 선별된 에피토프에 대한 단백질의 결합
암세포 항원의 특정한 에피토프와 어떠한 합성 펩타이드 PanC가 결합할 수 있는지를 예측하기 위해, 4개의 HSP70 패밀리의 아미노산 서열을 상업적 소프트웨어를 이용하여 나열하였고, 보존적 부위가 동정되었다. 4개의 단백질의 보존 부위 중 가장 긴 부위는 Hsc71의 463-478 아미노산 부분(GIPPAPRGVPQIEVTF; 서열목록 제 15서열)이다. 이 부위는 두 번째로 긴 보존 부위보다 78% 더 길다. 이 후보 에피토프는 N-말단에 결합하는 비오틴을 통해 표준적인 FMOC 반응을 함으로써 합성 할 수 있다.
방사능 표지가 된 PanC가 후보 에피토프에 결합하는지를 시험하기 위해 lOOμM의 비오틴화된 에피토프가 표지화된 펩타이드 PanC와 표지화되지 않은 펩타이드 PanC간의 비율을 다양하게 하여 pH 7.2, 150μL PBS에서 배양하였다. 2시간 배양 후, 혼합물은 뉴트라비딘 비드(Pierce, Rockford IL)와 결합하여 비오틴 접합 에피토프 및 결합할 가능성이 있는 다른 모든 펩타이드 PanC를 고정화시킨다. 비드들은 결합하지 않은 펩타이드를 제거하기 위해 PBS로 세번 세척하였다.
Hsc71 및 Hsp70 의 에피토프 간의 결합 경쟁
경쟁적 결합의 연구는 PanC의 다양한 HSP70 패밀리에 대한 결합이 PanC의 에피토프 GIPPAPRGVPQIEVTF (서열목록 제 15서열)에 대한 결합을 매개로 한다는 것을 밝히기 위해 실시되었다. HSP70 또는 BSA(대조군)으로 각각의 웰을 코팅하고, lOOμL 의 PBS를 웰당 0.5μg를 첨가한 뒤 밤새 4℃에서 배양함으로써 96 웰 플레이트를 준비하였다. 다음날 각각의 웰을 PBS로 3번 세척하였다. 99m-Tc 표지된 PanC, 0.1 μCi, 및 다양한 농도의 합성 에피토프를 pH 7.4인 150μL부피의 PBS와 혼합하여 각각의 웰에 첨가하고 상온에서 한 시간동안 배양하였다. 배양이 끝나고 각각의 웰을 PBS로 3회 세척하였다. 결합한 PanC는 pH 2.8의 글리신 트리스 HCl 완충액에서 각각의 웰로부터 용출된 후 감마 측정기에 의해 카운트되어 단편적인 결합을 측정하였다.
실시예 4: 암 치료에 있어서 키메라 항체의 이용
에피토프 GIPPAPRGVPQIEVTF(서열목록 제15서열)에 대한 항체는 본 명세서에서 서술한 방법 또는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 만들어질 수 있다. 추가적인 세부적 프로토콜은 Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology. 5th ed. 또는 Harlow and Lane Antibodies A Laboratory Manual에 개시되어 있다. 본 발명의 항체는 더 변형되어 본 명세서에서 서술한 하나 또는 그 이상의 치료제 또는 세포독성제를 포함할 수 있으며, 환자의 암을 치료하는 능력을 시험할 수 있다.
3b 또는 4단계의 비소세포 폐암에 걸린 15명의 환자가 1기 임상시험에 참가하였다. 환자들은 125mg/m2. 250mg/m2 또는 375mg/m2 의 주당 1회의 정맥내 항체 주입을 4주간 받았다. 혼자들은 주입으로 인한 부작용이 없는지 관찰되었다. 6개월간 완전 혈구 측정, 간기능 검사 및 대사 특징에 대해 매주 모니터링 하였다.
종양 반응은 PET 및 CT 영상화를 이용하여 0, 1, 2, 3 및 6개월째에 종양 크기 및 대사를 비교함으로써 측정하였다. 생존율은 Kaplan-Meier분석에 의해 12개월 동안 관찰하였다
다른 구현예
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌과 특허 출원들은, 각각의 공개문헌과 특허 출원이 참조로서 특정적으로 그리고 개별적으로 본 명세서에 참조로서 삽입된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 특정 구현예로서 설명되었으나, 추가적인 변형예가 가능하며, 본 출원은, 본 발명의 기본적 사상을 따르고 본 발명이 속하는 기술분야에서의 공지된 또는 통상적인 실시에 속하는 본 명세서 기재의 변형예를 포함하는 본 발명의 어떠한 변형, 용도, 응용예도 포함하는 것으로 해석된다.
도 1은 다양한 종류의 암에 결합하지만 정상 섬유아세포에는 결합하지 않는 파지 클론을 선택하기 위해 파지 라이브러리를 다양한 타입의 암세포 및 섬유아세포에 대해 패닝하는 알고리즘을 보여주는 표이다. 고리형 알고리즘은 다중 반복을 위해 순환된다.
도 2는 암 결합 파지 펩타이드의 일치 서열을 보여주는 표이다. 암세포에 대한 마지막 패닝 후, 증폭되지 않은 파지 풀(pool)은 일치 서열을 위해 분석되었다. 24 클론이 12mer 풀로부터 선택되었으며, 13 클론이 7mer 풀로부터 선택되었다.
도 3a-c는 PanF 형태의 펩타이드를 이용한 세포 내재화 연구 결과를 나타내는 마이크로그래프이다.
암세포인 NCI-H460(도 3a), DU-145(도 3b) 및 섬유아세포 CCD-1070Sk(도 3c)를 형광 표지된 펩타이드(녹색)와 함께 배양하였다. 의미 있는 내재화가 암세포에서 관찰되었으나 섬유아세포에서는 그렇지 않았다. 세포핵은 DAPI(파란색)로 시각화되었다. 의미 있는 내재화가 암세포에서 관찰되었으나 섬유아세포에서는 그렇지 않았다.
도 4는 세포를 PanL과 함께 배양함으로써 유발된 세포 독성 퍼센트를 보여주는 그래프이다. 전립선암, 폐암, 비악성 전립선 상피 및 섬유아세포로 구성된 세포 배양이 DYWDTSWPLLLFGGGS (KFAKFAK)3 (PanL; 서열목록 제13)의 존재하에 이루어졌다. 종양세포의 경우 투여량에 따라 세포사(cell death)가 증가함을 확인하였다. 비악성 세포는 더 낮은 민감도를 보였다.
도 5는 리신 A 서브유닛과 접합된 암 결합 펩타이드(PanC)가 죽인 세포의 비율을 보여주는 그래프이다. 리신 접합체의 농도는 100OnM이다.
도 6은 암의 친화 포획의 용출액에 대한 폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동 사진이다. 펩타이드 결합 타겟은 쿠마시 블루로 염색하였다. 레인 2는 표준 분자량의 래더이다. 레인 5는 7OkD의 질량을 나타내는 하나의 현저한 밴드를 보여준다.
도 7은 방사능 표지가 된 PanC가 에피토프에 결합하는 것을 보여준다. 이 실험은 에피토프를 20 nM 의 표지된 PanC와 함께 배양함으로써 실시하였다. 표지된 PanC의 결합을 저해시키도록 표지되지 않은 PanC의 배양액 투여량을 증가시킨다.
도 8은 Hsc71 에피토프가 펩타이드와 Hsp 70간의 결합을 방해하는 것을 보여주는 그래프이다. 방사능 표지된 PanC를 Hsp70으로 코팅된 웰 및 BSA로 코팅된 웰(대 조군)에 다양한 농도의 Hsc71의 에피토프(GIPPAPRGVPQIEVTF; 서열목록 제15서열)의 존재 하에 첨가한다. PanC의 농도는 일정하다. 에피토프는 PanC가 Hsp70 에 결합하는 것을 농도 의존적으로 방해하지만, PanC가 BSA에 결합하는 것을 대부분의농도에서 거의 동일하게 억제하며, 이는 에피토프와 BSA 간이 아닌 에피토프와 Hsp70 간 특이적 결합 경쟁을 하는 사실과 일치한다.
<110> SquiCor et al. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING AND DIAGNOSING CANCERS <130> 50477/002WO2 <150> US 60/850,542 <151> 2006-10-10 <160> 15 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Ile Phe Val Trp Pro Tyr 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Leu Trp Val Ile Pro Gln 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Leu Trp Val Gln Pro Leu 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Thr Phe Ser Thr Leu Val Trp 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys Val Trp Thr Ile Pro Arg 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Pro Pro Gln Phe Tyr Asn 1 5 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Tyr Trp Asp Thr Ser Trp Pro Leu Leu Leu Phe 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Leu Cys Thr Arg Ala Trp Cys Tyr Gln Ser Pro Thr 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ala Pro Trp His Leu Ser Ser Gln Val Ser Arg Thr 1 5 10 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Cys Pro Gly Thr Pro Trp Asn Gln Cys 1 5 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 11 Asp Tyr Trp Asp Thr Ser Trp Pro Leu Leu Leu Phe 1 5 10 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 12 Asp Tyr Trp Asp Thr Ser Trp Pro Leu Leu Leu Phe Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Lys <210> 13 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 13 Asp Tyr Trp Asp Thr Ser Trp Pro Leu Leu Leu Phe Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Lys Phe Ala Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Phe Ala Lys Lys Phe 20 25 30 Ala Lys Phe Ala Lys 35 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 14 Asp Tyr Trp Asp Thr Ser Trp Pro Leu Leu Leu Phe Gly Gly Gly Cys 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 15 Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe 1 5 10 15

Claims (86)

  1. 서열목록 제1-14 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열목록 제15서열의 서열과 최소 90%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 HSP 70(heat shock protein 70) 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 펩타이드는 천연의 비변성 형태의 상기 HSP 70(heat shock protein 70) 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 HSP 70(heat shock protein 70) 단백질은 GRP78, 모르탈린(mortalin) 및 HSC71에서 선택된 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 하나 또는 그 이상의 검출 가능한 표지, 치료제, 킬레이트제 또는 링커 모이어티를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 펩타이드는 상기 검출 가능한 표지에 간접적으로 결합된 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 펩타이드는 상기 검출 가능한 표지에 직접적으로 결합된 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  9. 제 6 항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 방사능 물질, 형광 물질 또는 중금속인 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 방사능 물질은 상기 펩타이드의 아미노산에 결합된 요오드, 아스타틴 또는 브롬 표지인 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 방사능 물질은 테크네튬(technetium)-99m인 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  12. 제 6 항에 있어서, 상기 치료제는 세포독성제인 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 세포독성제는 알킬화제, 항생제, 항종양제, 대사길항물질, 항증식제, 튜불린 억제제, 토포이소머라아제 I 및 II 억제제, 성장인자, 호르몬 작용제 또는 길항제, 아폽토시스제, 면역조절물질) 또는 방사능 물질인 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 세포독성제는 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 캄토테신(camptothecin), 호모캄토테신(homocamptothecin), 사이오콜치신(thiocolchicine), 콜치신(colchicine), 콤브레타스타틴(combretastatin), 콤브레타스틴(combretastin) A-4, 포도필로톡신(podophyllotoxin), 리족신(rhizoxin), 리족신-d, 돌리스타틴(dolistatin), 탁솔(taxol), 파클리탁솔(paclitaxol), CC 1065, 안사미토신(ansamitocin) p3 및 마이탄시노이드(maytansinoid) 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  15. 제 6 항에 있어서, 상기 킬레이트제는 이니노카르복시 반응기, 폴리아미노카르보닐 반응기, DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid) 또는 DOTA(1, 4,7,10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraacetic acid)인 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 종양세포에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 펩타이드는 상기 종양세포에 의해 발현된 HSP(heat shock protein)70 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 종양세포는 폐, 유방, 대장 또는 전립선의 종양 세포인 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드.
  20. 다음의 단계를 포함하는 인 비보(in vivo)에서 인간의 종양세포 함유 부위를 영상화하는 방법:
    (a) 상기 인간에게 서열목록 제1-14서열 중 어느 하나의 아미노산 서열 및 검출 가능한 표지를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 물질을 투여하는 단계;
    (b) 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드 물질을 결합하게 하고, 결합하지 않은 펩타이드 또는 폴리펩타이드 물질을 환자의 체내로부터 제거하는 단계; 및
    (c) 상기 종양세포 함유 부위의 영상을 얻는 단계.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 부위는 유방인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20 항에 있어서, 상기 부위는 전립선인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 20 항에 있어서, 상기 부위는 위장관인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 20 항에 있어서, 상기 부위는 간인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 20 항에 있어서, 상기 부위는 폐인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 20 항에 있어서, 상기 부위는 전신이고 영상화는 암전이의 검출을 위한 것임을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 20 항에 있어서, 상기 영상은 신티그래피(scintigraphy)를 이용하여 얻은 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 20 항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 방사능 핵종(radionuclide)인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 방사능 핵종은 테크네튬(technetium)-99m인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 다음의 단계를 포함하는 인간의 암 진단 방법;
    (a) 서열목록 제1-14서열 중 어느 하나의 아미노산 서열 및 검출 가능한 표지를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 물질을 인간에 투여하거나 인간으로부터 채취한 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드 물질의 상기 인간의 세포에의 결합을 검출함으로써 상기 인간의 암을 진단하는 단계.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 대장암, 폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 인간의 암을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 제 6 항의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인간에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 치료제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 대장암, 폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 인간의 암을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 제 1 항의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 및 세포독성제를 인코딩하는 핵산 분자를 인간에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 세포독성제 및 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 단일 폴리펩타이드 사슬로 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 34 항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 대장암, 폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 서열목록 제1-14서열로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 가변부위를 포함하는 항체.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 항체는 HSP70, HSP71, GRP78, 모르탈린(mortalin), 또는 HSC71에 대하여 10-7 M 이하의 해리상수로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  39. 제 37 항에 있어서, 상기 가변부위는 면역글로불린 중쇄에 존재하는 것을 특징으로 하는 항체.
  40. 제 37 항에 있어서, 상기 가변부위는 면역글로불린 경쇄에 존재하는 것을 특징으로 하는 항체.
  41. 제 37 항에 있어서, 상기 항체는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  42. 제 37 항에 있어서, 상기 항체는 재조합 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  43. 제 37 항에 있어서, 상기 항체는 서열목록 제15서열의 서열과 최소 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  44. 제 37 항에 있어서, 상기 항체는 HSP70 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  45. 제 37 항에 있어서, 상기 서열은 연속적인 것을 특징으로 하는 항체.
  46. 제 39 항에 있어서, 상기 중쇄는 IgG, IgA, IgM, IgD, 및 IgE 아이소타입 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체.
  47. 제 37 항 또는 제 39 항에 있어서, 상기 항체는 상기 가변 부위 밖의 결합위치에서 서열목록 제15서열과 최소 90%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 에피토프와 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  48. 제 37 항에 있어서, 상기 항체는 하나 또는 그 이상의 검출 가능한 표지, 치료제, 킬레이트제 또는 링커 모이어티를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  49. 제 48 항에 있어서, 상기 항체는 상기 검출 가능한 표지에 간접적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  50. 제 48 항에 있어서, 상기 항체는 상기 검출 가능한 표지에 직접적으로 결합 하는 것을 특징으로 하는 항체
  51. 제 48 항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 방사성물질, 형광물질 또는 중금속인 것을 특징으로 하는 항체
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 방사성물질은 상기 항체의 아미노산에 결합된 요오드, 아스타틴 또는 브롬 표지인 것을 특징으로 하는 항체
  53. 제 51 항에 있어서, 상기 방사성물질은 테크네튬(technetium)-99m인 것을 특징으로 하는 항체.
  54. 제 48 항에 있어서, 상기 치료제는 세포 독성제인 것을 특징으로 하는 항체.
  55. 제 12 항에 있어서, 상기 세포 독성제는 알킬화제, 항생제, 항종양제, 대사길항물질, 항증식제, 튜불린 억제제, 토포이소머라제 I 및 II 억제제, 성장인자, 호르몬 작용제 또는 길항제, 아폽토시스제(apoptotic agent), 면역조절물질(Immunomodulator) 또는 방사성물질인 것을 특징으로 하는 항체.
  56. 제 54 항에 있어서, 상기 세포 독성제는 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 캄토테신(camptothecin), 호모캄토테신(homocamptothecin), 사이오콜치신(thiocolchicine), 콜치신(colchicine), 콤브레타스타틴(combretastatin), 콤브레타스틴(combretastin) A-4, 포도필로톡신(podophyllotoxin), 리족신(rhizoxin), 리족신-d, 돌리스타틴(dolistatin), 탁솔(taxol), 파클리탁솔(paclitaxol), CC 1065, 안사미토신(ansamitocin) p3 및 마이탄시노이드(maytansinoid) 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 항체.
  57. 제 48 항에 있어서, 상기 킬레이트제는 이니노카르복시 반응기, 폴리아미노카르보닐 반응기, DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid) 또는 DOTA(1, 4,7,10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraacetic acid)인 것을 특징으로 하는 항체.
  58. 제 37 항에 있어서, 상기 항체는 약제학적으로 허용 가능한 수송체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  59. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 종양세포에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  60. 제 59 항에 있어서, 상기 항체는 상기 종양세포에 의해 발현된 HSP(heat shock protein)70 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  61. 제 59 항에 있어서, 상기 종양세포는 폐, 유방, 대장 또는 전립선의 종양 세포인 것을 특징으로 하는 항체.
  62. 제 37 항에 있어서, 상기 항체는 다이아바디, 양특이성 항체, Fab 절편, F(ab)2 분자, scFv(single chain Fv) 분자, 직렬 scFv 분자 또는 항체 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 항체.
  63. 다음의 단계를 포함하는 인 비보(in vivo)에서 인간의 종양세포 함유 부위를 영상화하는 방법;
    (a) 상기 인간에게 서열목록 1-14 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 항체 및 검출 가능한 표지를 투여하는 단계;
    (b) 상기 항체를 결합하게 하고, 결합하지 않은 항체를 환자의 체내에서 제거하는 단계; 및
    (c) 상기 종양세포 함유 부위의 영상을 얻는 단계.
  64. 제 63 항에 있어서, 상기 부위는 유방인 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 63 항에 있어서, 상기 부위는 전립선인 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 63 항에 있어서, 상기 부위는 위장관(gastrointestinal tract)인 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 63 항에 있어서, 상기 부위는 간인 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 63 항에 있어서, 상기 부위는 폐인 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 63 항에 있어서, 상기 부위는 전신(entire body)이고 영상화의 목적은 암전이의 검출인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 63 항에 있어서, 상기 영상은 신티그래피(scintigraphy)를 이용하여 얻은 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 63 항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 방사성 핵종(radionuclide)인 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 71 항에 있어서, 상기 방사성 핵종(radionuclide)은 테크네튬(technetium)-99m인 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 다음의 단계를 포함하는 인간의 암 진단 방법;
    (a) 상기 인간에 서열목록 1-14서열 중 어느 하나의 아미노산 서열 및 검출 가능한 표지를 포함하는 항체를 인간에게 투여하거나 인간에서 채취한 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 항체의 상기 인간의 세포에의 결합을 검출함으로써 상기 인간의 암을 진단하는 단계.
  74. 제 73 항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 대장암, 폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 인간의 암을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 제 48 항의 항체를 인간에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항체는 치료제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제 75 항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 대장암, 폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 인간의 암을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 세포 독성제를 인코딩하는 핵산 분자 및 제 37 항 또는 제 39 항의 항체를 인간에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제 77 항에 있어서, 상기 세포 독성제 및 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 단일 폴리펩타이드 사슬로서 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제 77 항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 대장암, 폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 서열목록 제1-14서열 중 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 재조합적으로 발현하는 단계를 포함하며, 상기 아미노산 서열은 서열목록 제15서열과 최소 90%의 서열 동일성을 가지는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체의 제조방법.
  81. 다음의 단계를 포함하는 항체 합성 방법:
    (a) 포유류에 서열목록 15의 서열과 최소 90%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 주입하는 단계;
    (b) 상기 포유류로부터 복수(ascites)를 수집하는 단계; 및
    (c) 상기 복수로부터 상기 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 정제하는 단계.
  82. 제 81 항에 있어서, 상기 항체는 원래의 변형되지 않은 형태의 HSP70(heat shock protein 70) 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제 81 항에 있어서, 상기 방법은 상기 포유류에 상기 펩타이드를 연속적으로 주입하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 다음의 단계를 포함하는 소분자가 암세포에 특이적으로 결합할 수 있는지를 결정하는 방법:
    (a) 상기 소분자를 서열목록 제15서열과 최소 90%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 폴리펩타이드, 파지(phage) 또는 융합 분자와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 펩타이드, 폴리펩타이드, 파지 또는 융합 분자에 대한 상기 소분자의 결합 친화도를 결정하는 단계로서, 상기 소분자가 상기 펩타이드, 폴리펩타이드, 파지 또는 융합 분자와 10-7 이하의 해리상수로 결합하는 경우 상기 소분자는 상기 암세포에 특이적으로 결합할 수 있다고 판단한다.
  85. 제 84 항의 방법으로 동정된 소분자를 암세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 소분자가 암세포에 특이적으로 결합할 수 있는지를 결정하는 방법으로서, 상기 소분자가 상기 암세포에만 결합하고 정상세포에 결합하지 않는 경우 상기 소분자는 상기 암세포에 특이적으로 결합할 수 있다고 판단한다.
  86. 다음을 포함하는 키트:
    (a) 서열목록 1-14서열 중 하나 또는 둘 이상의 서열과 최소 90%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 항체; 및
    (b) 하나 또는 둘 이상의 검출 가능한 표지, 치료제, 킬레이트제 또는 링커 모이어티.
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