CN113332448B

CN113332448B - 肿瘤靶向多肽、制备方法及其应用

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Publication number: CN113332448B
Application number: CN202110609525.5A
Authority: CN
Inventors: 王富军; 赵健; 曹雪玮; 傅龙云; 张涛铸; 单含文; 杨旭中
Original assignee: Zhejiang Funuo Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Zhejiang Funuo Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2037-03-17
Also published as: CN113332448A; CN113336830B; CN108570108A; CN113332447B; CN113332447A; CN108570108B; CN113336830A

Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种肿瘤靶向多肽、制备方法及其应用。本发明公开了一种肿瘤靶向多肽。本发明的肿瘤靶向多肽专一性结合能力更好，从而减轻肿瘤治疗药物对正常细胞的影响，降低药物不良反应的发生，提高治疗效果。

Description

肿瘤靶向多肽、制备方法及其应用

本申请是在先申请(发明名称：肿瘤靶向多肽、制备方法及其应用、申请日：2017年03月17日、申请号：201710161670.5)的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及肿瘤靶向多肽、制备方法及其应用。

背景技术

肿瘤是当今世界严重影响人类健康和生命的三大疾病之一。在许多常见的肿瘤疾病中，如乳腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、表皮鳞癌、肾癌、头颈部恶性肿瘤、恶性胶质瘤等，往往都存在肿瘤细胞表面表皮生长因子受体(EGFR)异常过度表达的现象¹，并且EGFR的高表达常常与细胞增殖活动异常密切相关。在每个正常人体细胞的表面的EGFR的数量通常为4×10⁴到1×10⁵左右，而每个肿瘤细胞表面的EGFR则超过2×10⁶，是正常细胞的20-50倍²。由于EGFR介导的信号转导在肿瘤细胞的增殖、损伤修复、侵袭及新生血管形成等方面起重要作用，因此EGFR自然就成为了肿瘤诊断和治疗中特别关注的关键靶位点，成为肿瘤药物开发和临床治疗应用的一个重要方向³。

表皮生长因子受体家族的成员包括ErbB1/HER1/EGFR，ErbB2/HER2，ErbB3/HER3和ErbB4/HER4四种，同属于酪氨酸激酶类受体。人EGFR蛋白由1186个氨基酸残基的组成，相对分子量为17万道尔顿。整个受体蛋白由三部分组成：(1)胞外区，由氨基端的621个氨基酸残基构成，存在配体结合区；(2)跨膜区，由23个氨基酸残基组成的螺旋状疏水区结构深埋在细胞膜脂质双层中，将受体蛋白本身锚定在细胞膜上；(3)胞内区，由542个氨基酸残基构成，可进一步细分为3个亚区：近膜亚区，酪氨酸激酶亚区，羧基端亚区。

现已发现有多种表皮生长因子(EGF)类配体分子能与EGFR特异性的结合并发挥生物学效应。这些配体分子包括表皮生长因子(EGF)，转化生长因子(TGF-α)，双调蛋白(amphireguin，AR)、B-细胞素(beta-celluin，BTC)、肝素结合样表皮生长因子(HB-EGF)、表皮素(epiregulin，EPR)以及痘苗病毒来源的痘苗病毒生长因子(VGF)等。

与EGFR结合的这些配体分子，在空间结构上具有非常类似并保守的三维结构，即配体分子内部通过多肽链内二硫键的作用(Cys6–Cys20，Cys14–Cys31，Cys33–Cys42)而形成典型的三环状结构⁴。

研究发现，EGF与EGFR的专一性识别和结合过程基本代表了此类配体分子与受体的相互作用过程。EGF的三个环状结构在上、下、中三个部位与EGFR发生相互识别作用，并与之专一性结合，其中以C环的结构最深入EGFR蛋白分子的内部，在与EGFR识别和结合中发挥重要作用^5-6。

EGF类配体分子与EGFR结合后，能使表皮生长因子受体相互之间形成同源二聚体或异源二聚体，导致胞内酪氨酸激酶区的激活，彼此可将对方酪氨酸残基磷酸化，启动一系列级联反应，将信号传到细胞核内，最终引起一系列相关基因活化，导致肿瘤细胞增殖、凋亡抑制，促使肿瘤细胞转移并导致放、化疗耐受，在肿瘤发生发展过程中起重要作用。同样，由人工设计合成的，模仿EGF类生长因子与其受体专一性识别和结合的多肽分子，由于其可与EGFR进行类似的专一性识别和结合，而且这些专门设计的多肽的这种专一性的结合并不产生EGFR分子后续的信号传递作用⁷，因此，可以被用于在体内针对肿瘤细胞的药物靶向运输，进行肿瘤疾病的靶向治疗^8-9；或者是这种专一性多肽本身与体内生长因子竞争性的抢夺细胞表面的受体结合位点与之结合，从而抑制肿瘤细胞的生长，产生治疗的目的^10-11；或者是经放射性标记^12-13，荧光染料标记的多肽^14-15，在注射入体内后，由于其能够特异性的在肿瘤细胞表面聚集，从而可用于实体肿瘤的影像学诊断、标记和治疗^16-17。这种能在体内外与肿瘤细胞特异性识别结合的多肽被简称为肿瘤靶向肽。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为提供一种能够高效专一性识别和具有更强结合力的多肽结构，其能与肿瘤细胞表面大量过表达存在的表皮生长因子受体专一性结合，从而可被用于肿瘤细胞的标记性识别诊断，或竞争性与EGFR结合，或携带肿瘤治疗药物分子达到肿瘤细胞表面，发挥靶向性治疗作用。

为此，本发明一方面公开了，一种肿瘤靶向多肽，其包含氨基酸序列为YXGXR所示的第一序列和氨基酸序列为YXGXR所示的另一第二序列，所述第一序列与所述第二序列之间通过连接肽链接，其中Y表示酪氨酸或其衍生物；G表示甘氨酸或其衍生物；R表示精氨酸或其衍生物；X表示含侧链带脂肪类基团或/和羟基类基团或它们组合或其衍生物的氨基酸。

在一些实施方式中，所述连接肽包含形成α-螺旋的氨基酸序列，优选为所述连接肽包含刚性α-螺旋的结构，更优选所述连接肽包含氨基酸序列为HMAATT的序列。

在一些实施方式中，所述连接肽包含6个以上的氨基酸残基；或所述连接肽包含少于3个氨基酸残基；或所述连接肽由1个氨基酸残基组成；所述连接肽由组氨酸或其衍生物组成。

在一些实施方式中，所述肿瘤靶向多肽为氨基酸序列为SEQ ID NO.1-4或SEQ IDNO.8或SEQ ID NO.9中之一的多肽或其修饰衍生物；优选为如氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9的多肽。

在一些实施方式中，所述肿瘤靶向多肽可特异性结合EGFR家族任一成员，优选所述肿瘤靶向多肽可以与EGFR结合，其Kd小于50nM。

另一方面，本发明还公开了一种缀合物，其包含权利要求1所述肿瘤靶向多肽和一种活性成分，二者通过一种连接器(linker)缀合，其中所述活性成分为治疗成分，诊断成分，放射性同位素，放射性核素，毒素，或它们的组合物。

在一些实施方式中，所述连接器包含共价键连接或非共价键连接，优选所述共价键连接包含直接共价键，肽键，酯键，二硫键，酰胺键，酰亚胺键，磷酸二酯键，脲键，异氰酸酯键，或它们的组合。

在一些实施方式中，所述治疗成分包含细胞穿膜肽(CPP)，优选为所述细胞穿膜肽为SEQ ID NO.12氨基酸序列所示的多肽，来自HIV的反式激活蛋白TAT的氨基酸片段，EC-SOD来源的肝素结合域(HBD)的氨基酸片段，HBEGF来源的肝素结合域(HBD)的氨基酸片段，或它们的衍生物。

在一些实施方式中，所述缀合物包含氨基酸序列为SEQ ID NO.13-15中之一的多肽。

在一些实施方式中，所述治疗成分包含放射性治疗成分，化学治疗成分，抗体，酶，或它们的组合。

在一些实施方式中，所述放射性治疗成分包含放射性同位素，所示放射性同位素为碘-131，镥-177，钇-90，钐-153，磷-32，铯-131，钯-103，镭-223，碘-125，硼-10，锕-225，铋-213，镭-225，铅-212，钍-232，或它们的组合。

在一些实施方式中，所述化学治疗成分包含卡培他滨(capecitabine),顺铂(cisplatin),曲妥珠单抗(trastuzumab),氟维司群(fulvestrant),它莫西芬(tamoxifen),来曲唑(letrozole),依西美坦(exemestane),阿那曲唑(anastrozole),氨鲁米特(aminoglutethimide),睾内酯(testolactone),伏氯唑(vorozole),福美坦(formestane),法倔唑(fadrozole),来曲唑(letrozole),埃罗替尼(erlotinib),阿法替尼(lafatinib),达沙替尼(dasatinib),吉非替尼(gefitinib),伊马替尼(imatinib),pazopinib,拉帕替尼(lapatinib),舒尼替尼(sunitinib),尼罗替尼(nilotinib),索拉非尼(sorafenib),nab-紫杉醇(nab-palitaxel)，或衍生物或它们的组合物。

在一些实施方式中，所述诊断成分包含放射性诊断成分，荧光成分，量子点，或它们的组合物，其中所述放射性诊断成分包含氟-18，锝-99，钼-99，铷-82，锶-82，铊-201，或它们的组合物。

另一方面，本发明公开了一种编码本发明所述肿瘤靶向多肽的核酸序列。

另一方面，本发明公开了一种包含本发明所述多核苷酸分子的表达载体，优选所述表达载体可在细胞内表达。

另一方面，本发明公开了一种包含本发明所述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

另一方面，本发明公开了本发明所述肿瘤靶向多肽的制备方法，其包含培养本发明所述宿主细胞，制备所述肿瘤靶向多肽。

另一方面，本发明公开了一种药物组合物，其包含本发明所述缀合物和药学上可接受的载体。

在一些实施方式中，所述包含放射性治疗成分，放射性核酸，毒素，治疗成分，或化学治疗成分，或它们的组合。

另一方面，本发明公开了一种药物组合物，其包含本发明所述肿瘤靶向多肽和药学上可接受的载体。

另一方面，本发明公开了治疗带有肿瘤的生物个体的方法，包含给予此生物个体有效剂量的本发明所述缀合物；所述肿瘤包含表达至少一个EGFR家族成员的细胞。

在一些实施方式中，所述肿瘤为乳腺癌，结直肠癌，胰腺癌，头颈癌，黑色素瘤，卵巢癌，前列腺癌，非小细胞肺癌中之一。

在一些实施方式中，所述方法，还包含同时给予有效剂量的治疗性药物。

在一些实施方式中，所述生物个体为人类。

另一方面，本发明公开了一种溶液，其包含有效浓度的本发明所述缀合物，所述溶液为生物个体的血浆。

本发明通过对其中的与EGFR结合的S3模拟肽氨基酸序列结构进行人工突变改造优化，获得一种专一性结合能力更好的肿瘤靶向肽，其在与分子成像试剂(放射性同位素标记，荧光染料标记等)偶联后可被用于肿瘤的诊断分析；或者是与肿瘤治疗药物偶联后，制成肿瘤细胞靶向治疗药物，用于恶性肿瘤的靶向性治疗，从而减轻肿瘤治疗药物对正常细胞的影响，降低药物不良反应的发生，提高治疗效果；或直接利用其本身多肽结构能与靶位点(EGFR)高度亲和的特性，竞争性的结合并掩蔽EGFR位点，优势性地抑制肿瘤细胞的生长，从而起到肿瘤疾病治疗的目的。

附图说明

图1.ELBD序列与天然的其他序列的穿膜效率比较示意图。

图2.ELBD及突变体融合蛋白的穿膜效率比较示意图。

图3.EGFP-ELBD-HBD突变体重组蛋白穿膜效率的浓度与时间依赖性示意图。

图4.靶向肽ELBD的广谱性示意图。

图5.EGFP-ELBD-HBD突变体重组蛋白对人体细胞的选择性示意图。

图6.EGFP-S3-HBD重组蛋白和EGFP-ELBD-HBD重组蛋白各自对HeLa细胞表面的结合能力示意图。

图7重组蛋白TCS-ELBD-CPP对肿瘤细胞生长的抑制作用比较示意图。

图8重组蛋白MAP30-ELBD-CPP对正常细胞和肿瘤细胞生长的抑制作用比较多示意图。

具体实施方式

本发明将中国发明专利CN 201310170530.6及本文提及的参考文献的内容全文纳入本文中。

参考文献：

1.Yarden Y,Sliwkowski MX.Untangling the ErbB signalling network.NatRev Mol Cell Biol 2001；2:127e37.

2.Herbst RS,Shin DM.Monoclonal antibodies to target epidermal growthfactor receptor-positive tumors:a new paradigm for cancer therapy.Cancer2002；94:1593e611.

3.Yewale C,Baradia D,Vhora I,Patil S,Misra A.Epidermal growth factorreceptor targeting in cancer:a review of trends andstrategies.Biomaterials.2013；34(34):8690-707.

4.Prigent SA,Lemoine NR.The type 1(EGFR-related)family of growthfactor receptors and their ligands.Prog Growth Factor Res.1992；4(1):1-24.

5.Ogiso H,Ishitani R,Nureki O,Fukai S,Yamanaka M,Kim JH,Saito K,Sakamoto A,Inoue M,Shirouzu M,Yokoyama S.Crystal structure of the complex ofhuman epidermal growth factor and receptor extracellular domains.Cell.2002；110(6):775-87.

6.Nestor JJ Jr,Newman SR,DeLustro B,Todaro GJ,Schreiber AB.Asynthetic fragment of rat transforming growth factor alpha with receptorbinding and antigenic properties.Biochem Biophys Res Commun.1985；129(1):226-32.

7.Lin YZ,Ke XH,Tam JP.Growth inhibition by vaccinia virus growthfactor.J Biol Chem.1990；265(31):18884-90.

8.Ding Y,Tan W,Hu R,Chen W,Hou Y.Construction of a novel fusionprotein harboring mouse interferon gamma and epidermal growth factor receptorbinding domain and enhancement of its antitumor activity.Sci China C LifeSci.1997；40(3):293-300.

9.Lelle M,Kaloyanova S,Freide C,Theodoropoulou M,Musheev M,Niehrs C,Stalla G,Peneva K.Octreotide-Mediated Tumor-Targeted Drug Delivery via aCleavable Doxorubicin-Peptide Conjugate.Mol Pharm.2015；12(12):4290-300.

10.Eppstein DA,Marsh YV,Schryver BB,Bertics PJ.Inhibition ofepidermal growth factor/transforming growth factor-alpha-stimulated cellgrowth by a synthetic peptide.J Cell Physiol.1989；141(2):420-30.

11.Overholser J,Ambegaokar KH,Eze SM,Sanabria-Figueroa E,Nahta R,Bekaii-Saab T,Kaumaya PT.Anti-Tumor Effects of Peptide Therapeutic andPeptide Vaccine Antibody Co-targeting HER-1 and HER-2 in Esophageal Cancer(EC)and HER-1 and IGF-1R in Triple-Negative Breast Cancer(TNBC).Vaccines(Basel).2015；3(3):519-43.

12.Li F,Cheng T,Dong Q,Wei R,Zhang Z,Luo D,Ma X,Wang S,Gao Q,Ma D,ZhuX,Xi L.Evaluation of(99m)Tc-HYNIC-TMTP1 as a tumor-homing imaging agenttargeting metastasis with SPECT.Nucl Med Biol.2015；42(3):256-62.

13.M,/>J,Huhtala T,Lammi J,Sihto H,Weisell J,Joensuu H,Rosenthal-Aizman K,El-Andaloussi S,Langel U,/>A,Bergers G,LaakkonenP.Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors.MolCancer Ther.2014；13(4):996-1007.

14.Han C,Li Y,Sun M,Liu C,Ma X,Yang X,Yuan Y,Pan W.Small peptide-modified nanostructured lipid carriers distribution and targeting to EGFR-overexpressing tumor in vivo.Artif Cells Nanomed Biotechnol.2014；42(3):161-6.

15.Zhu S,Zhang J,Janjanam J,Bi J,Vegesna G,Tiwari A,Luo FT,Wei J,LiuH.Highly water-soluble,near-infrared emissive BODIPY polymeric dye bearingRGD peptide residues for cancer imaging.Anal Chim Acta.2013；758:138-44.

16.Jie LY,Cai LL,Wang LJ,Ying XY,Yu RS,Zhang MM,Du YZ.Actively-targeted LTVSPWY peptide-modified magnetic nanoparticles for tumorimaging.Int J Nanomedicine.2012；7:3981-9.

17.He X,Na MH,Kim JS,Lee GY,Park JY,Hoffman AS,Nam JO,Han SE,Sim GY,Oh YK,Kim IS,Lee BH.A novel peptide probe for imaging and targeted deliveryof liposomal doxorubicin to lung tumor.Mol Pharm.2011；8(2):430-8.

18.一种肿瘤细胞靶向性穿膜肽，中国专利申请号：CN 201310170530.6

在本文，术语“VGF第三环样人工模拟肽”(本文又称“S3模拟肽”)是指一类短肽序列，其具有与EGFR专一性结合的功能，可能具有或不具有促进细胞生长和分裂的功能，其空间结构与EGFR膜外结构域Domain III相匹配，可以与之专一性的结合，从而导致或不导致EGFR的二聚体化。一种代表性的VGF第三环样人工模拟肽的结构为分子内部具有2个Cys残基，氨基酸肽链内部折叠成环状结构，空间构象与第三环结构类似，匹配于EGFR的DomainIII结合区域，为其发挥生物活性所必须。这一环状结构中的Tyr、Gly、Arg以及C端的Leu为高度保守，这些保守氨基酸任何缺失或C端的包括Leu在的大段缺失突变，都可以导致受体结合活性的丧失。

“肿瘤靶向肽”为是指一类短肽序列，是对EGFR结合的S3模拟肽氨基酸序列结构进行人工突变改造优化，获得一种专一性结合能力更好的肿瘤靶向肽结构。可被用于肿瘤细胞的标记性识别诊断，或竞争性与EGFR结合，或携带肿瘤治疗药物分子达到肿瘤细胞表面，发挥靶向性治疗作用。

肿瘤靶向肽在与分子成像试剂(放射性同位素标记，荧光染料标记等)偶联后可被用于肿瘤的诊断分析；或者是与肿瘤治疗药物偶联后，制成肿瘤细胞靶向治疗药物，用于恶性肿瘤的靶向性治疗，从而减轻肿瘤治疗药物对正常细胞的影响，降低药物不良反应的发生，提高治疗效果；或直接利用其本身多肽结构能与靶位点(EGFR)高度亲和的特性，竞争性的结合并掩蔽EGFR位点，优势性地抑制肿瘤细胞的生长，从而起到肿瘤疾病治疗的目的。

“细胞穿膜肽”(cell penetrating peptides,CPPs)又称为蛋白转导域或膜转导肽,是一种由30个或者更少氨基酸组成的能够穿透细胞膜的多肽,所述具有细胞穿膜肽活性的CPPs包括但不局限于序列如但不局限为人免疫缺陷病毒转录激活因子TAT，单纯疱疹病毒I型VP22转录因子，果蝇同源触角蛋白(Antp)的Penetratin，Transportan，来源于人的穿膜肽如ARF，BagP，CytC，hCT，hLF，hClock，TCTP，NRTN，人工合成的由大T抗原核定位序列与不同疏水肽段组成的兼性分子MPG,MAP,Pep-1，从4个到15个不同长度的多聚精氨酸序列，SynB1，Polyomavirus Vpl，Bac，NF-KB，SV4OT antigen，HATF3，hCT，pVEC，Integrin，DPV6，S413PV，Poly-P，肝素结合域等中的一种，其中优选为TAT(其氨基酸序列为YGRKKRRQRRR)或EC-SOD羧基末端肝素结合域(其氨基酸序列为GPGLWERQAREHSERKKRRRESECKAA)或其变体，如中国专利CN201210587097.1、CN1049111所包含的细胞穿膜肽；最优选为HBEGF来源的HBEGF的肝素结合域，其氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示。

“连接肽”(linkers)是蛋白质中连接各功能结构域组分，使得组成该蛋白质分子的各功能结构域保持其活性构象，发挥其各自的生物学功能，为各功能结构域生物学活性的发挥提供协同、调节和变构作用，避免因电荷、空间位障等因素而导致蛋白质分子生物活性的丧失。通常，把连接肽分成弹性，刚性，可切割性三种形式。连接肽可具有多种二级结构状态来发挥其生物学功能，如α螺旋，β折叠链，卷曲/弯曲和转角。天然存在的连接肽中采用卷曲形式的占59％(Chen等，Adv Drug Deliv Rev.2012，doi:10.1016/j.addr.2012.09.039)。以卷曲形式存在的连接肽其具有一定的空间活动弹性，使得相连的两结构域可以相对自由活动。

“肿瘤细胞靶向性穿膜肽”为是指一类短肽序列，含有具有细胞穿膜肽活性的CPPs结构域和上述“肿瘤靶向肽”。

本文所述多肽，包括但不限于“肿瘤靶向肽”、“细胞穿膜肽”、“肿瘤细胞靶向性穿膜肽”，其修饰衍生物可采用现有技术领域常规方法对本发明所述的肿瘤靶向肽进行修饰。这些修饰方法包括对多肽氨基末端或者羧基末端的修饰、中间氨基酸残基的替换、侧链修饰等。例如，对肽链末端的修饰方法有N端的乙酰化和C末端的酰胺化修饰，从而对末端的氨基或羧基进行保护。肽链末端也可以连接不同长度的脂肪酸。PEG分子或者是进行糖基化修饰，从而增加多肽分子的相对分子量和空间位阻，提高其对多肽水解酶的稳定性，延长在体内循环系统的滞留时间。同时也可以通过替换个别易酶解的氨基酸残基，或者是将L-型氨基酸替换为D-型氨基酸来延长或改善多肽药物的半衰期。

“缀合物”是指一类短肽序列缀合物，所述肿瘤靶向多肽和活性成分，二者通过连接器(linker)缀合，其中所述活性成分包含治疗成分，或诊断成分，或放射性同位素，或放射性核素，或毒素，或它们的组合物。

多肽的合成

本发明所述多肽，包括但不限于“肿瘤靶向肽”、“细胞穿膜肽”、“肿瘤细胞靶向性穿膜肽”，可按照常规的多肽合成技术进行固相合成或液相合成或液固相合成。如采用多肽合成仪固相合成本发明所述“肿瘤靶向肽”、“肿瘤细胞靶向性穿膜肽”，并可进一步通过连接器，如3－马来酰亚胺丙酸N－羟基琥珀酰亚胺酯,使肿瘤细胞靶向性穿膜肽与抗癌药物包括但不限于阿霉素、多西紫杉醇、丝裂霉素、柔红霉素、卡铂、喜树碱、羟基喜树碱、长春新碱、博莱霉素、5-氟尿嘧啶、环磷酞胺、吉西他滨、甲氨蝶吟、卡培他滨、洛莫司汀、依托泊昔、卡培他滨(capecitabine),顺铂(cisplatin),曲妥珠单抗(trastuzumab),氟维司群(fulvestrant),它莫西芬(tamoxifen),来曲唑(letrozole),依西美坦(exemestane),阿那曲唑(anastrozole),氨鲁米特(aminoglutethimide),睾内酯(testolactone),伏氯唑(vorozole),福美坦(formestane),法倔唑(fadrozole),来曲唑(letrozole),埃罗替尼(erlotinib),阿法替尼(lafatinib),达沙替尼(dasatinib),吉非替尼(gefitinib),伊马替尼(imatinib),pazopinib,拉帕替尼(lapatinib),舒尼替尼(sunitinib),尼罗替尼(nilotinib),索拉非尼(sorafenib),nab-紫杉醇(nab-palitaxel)，或衍生物或它们的组合物形成共聚物，即可制备出靶向性抗癌药物。

以阿霉素为例，其具体过程为：二甲基甲酰胺分别溶解阿霉素和3－马来酰亚胺丙酸N－羟基琥珀酰亚胺，加入三乙胺调节pH值，室温搅拌反应2小时后倒入50ml乙醚中，析出的沉淀用无水乙醚洗2次，离心分离沉淀并真空干燥；取沉淀和本发明所述肿瘤细胞靶向性穿膜肽用二甲基甲酰胺溶解，并加入三乙胺，室温搅拌反应2小时后倒入10ml乙醚中，析出的沉淀用无水乙醚洗2次，离心分离沉淀，真空干燥后得到目标共聚物。

多肽或融合蛋白的表达

本发明包括编码本发明所述“肿瘤靶向肽”或肿瘤细胞靶向性穿膜肽或含其的融合蛋白的DNA以及含有这些DNA的载体、转化体。

本发明中，使用的术语“转化体”(transformant)，即带有异源DNA分子的宿主细胞。

本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明的肿瘤靶向肽”或肿瘤细胞靶向性穿膜肽或含其的融合蛋白的方法。通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。

用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，多核苷酸和/或载体可用于任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔网织红细胞)、大鼠、仓鼠(如CHO、NSO和幼仓鼠肾细胞)或小鼠细胞(如L细胞))、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)。有关适用于多种类型宿主细胞的适当载体的例子可参见例如Ausube等,Current Protocols in Molecular Biology.Greene Publishing Associatesand Wiley-Interscience(1992)和Sambrook et al.(1989)。可以使用含有这些多核苷酸的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、诊断试剂、疫苗和治疗剂的蛋白质。

已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。

含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3',5’-核酸外切活性除去突出的γ-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段。然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4DNA连接酶的存在下将平端区段与大摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段。然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。

多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上。启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子。其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA,UGA或UAG)。

如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括对真核细胞培养物而言的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。适当宿主的代表性例子包括但不限于：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾SF9细胞；动物细胞，如CHO,COS,NSO,293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。

为了有效地分离纯化或分泌目标蛋白，常常还可利用便于分离纯化的标签蛋白或标签多肽(Tag)。常用的有谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)、六聚组氨酸肽(His.Tag)、蛋白质A(protein A)和纤维素结合位点(cellulose binding domain)等。通过特殊性蛋白或多肽与目标蛋白构成融合蛋白的形式，表达后利用所述的标签蛋白或标签多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。如His.Tag与Ni-ChelatingSepharose柱特异性结合。所述的标签蛋白或标签多肽可以在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、肠激酶和Xa因子等，以获得目标蛋白。

本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因此，可以控制经基因改造的多肽的表达。另外，不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、翻译后加工和修饰(如磷酸化、裂解)蛋白质的机制。可以选择适当的细胞系以确保对表达的外源蛋白质进行合乎需要的修饰和加工。

通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法，即可将本发明的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。所述方法描述于多个标准的实验室手册中，如Davis等,Basic Methods In Molecular Biology(1986)。

编码本发明的所述融合蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体连接以在宿主中增殖。一般说来，可在沉淀物，如磷酸钙沉淀物或其与带电脂质的复合物中导入质粒载体。如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装，再转导至宿主细胞。

通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明的DNA重组载体的细胞。例如，可培养导入表达重组载体所得的细胞以产生所需多肽。收集并裂解细胞，使用如Southern，J.Mol.Biol.1975，98:503或Berent等，Biotech.1985，3:208所述的方法，检测其DNA内容物中DNA的存在。或者，使用抗体检测上清液中蛋白质的存在。

通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的所述融合蛋白较为有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷作用层析和凝集素层析。在一些实施方案中，可使用高效液相层析(HPLC)进行纯化。

在一些实施方案中，可使用上述的一种或多种层析方法纯化本发明的所述融合蛋白。在其它实施方案中，可使用下述的一种或多种层析柱纯化本发明的所述融合蛋白，所述层析柱有：Q Sepharose FF柱、SP Sepharose FF柱、Q Sepharose High Performance柱、Blue Sepharose FF柱、Blue柱、Phenyl Sepharose FF柱、DEAE Sepharose FF、Ni-Chelating Sepharose FF柱或Methyl柱等。

另外，可使用国际公开号WO00/44772(全文列入本文作为参考)中描述的方法纯化本发明的融合蛋白。本领域技术人员可以容易地改动其中所述的方法以用于纯化本发明的融合体蛋白。可以从包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞的原核或真核宿主经重组技术产生的产物中回收本发明的融合蛋白。

用途

本发明所示的缀合物作为活性成分可用以治疗各种由细胞增殖过度引起的疾病，如肿瘤，包括但不限于:骨癌类，包括:尤因肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤等；脑和CNS肿瘤，包括:听神经瘤、神经母细胞瘤、神经胶瘤和其他脑肿瘤，脊髓肿瘤、乳癌、结肠直肠癌、进展期结肠直肠腺癌；内分泌癌类，包括:肾上腺皮质癌、胰癌、脑垂体癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、胸腺癌、多发性内分泌肿瘤；胃肠癌类，包括:胃癌、食道癌、小肠癌、肝癌、肝外胆管癌、胃肠类癌性肿瘤、胆囊癌；泌尿生殖器癌类，包括:翠丸癌、阴茎癌、前列腺癌；妇科癌类，包括:子宫颈癌、卵巢癌、阴道癌、子宫/子宫内膜癌、阴部癌、妊娠滋养细胞肿瘤、输卵管癌、子宫肉瘤；头和颈部肿瘤类，包括:口腔癌、唇癌、唾腺癌、喉头癌、下咽癌、正咽癌、鼻癌、鼻窦癌、鼻咽癌；血癌类，包括:儿童白血病、急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、发状细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、血浆细胞性白血病；骨髓癌血液病症，包括:骨髓分化不良症候群、骨髓增生性病症、再生障碍性贫血、范可尼贫血、特发性巨球蛋白血症；肺癌类，包括:小细胞肺癌、非小细胞肺癌；淋巴癌类，包括:霍奇金病、非霍奇金氏淋巴瘤、皮肤型T-细胞淋巴瘤、周围T-细胞林巴瘤、AIDS相关性淋巴瘤；眼癌类，包括:视网膜母细胞瘤、葡萄膜黑色素瘤；皮肤癌类，包括:黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌、梅克尔细胞癌；软组织肉瘤类，例如:儿童软组织肉瘤、成人软组织肉瘤、卡波希肉瘤；泌尿系统癌症，包括:肾癌维尔姆斯肿瘤、膀肤癌、尿道癌或转移性细胞癌。

本发明所公开的融合蛋白，可以用来治疗的癌类首先为宫颈癌、乳腺癌、大肠癌、膀胱癌或肺癌。

可藉由本发明的融合蛋白加以治疗的优选肿瘤类为固态肿瘤和血液恶性疾病。

本文所使用的术语“肿瘤”一般是指广泛的以细胞的失控性异常生长为特征的病症。

所用的活性成分的有效剂量可随给药模式和待治疗疾病的严重程度而变化。对大部分大型哺乳动物而言，每天施以有效成分的总剂量约为0.01-1000mg。通常，成人临床给药量的范围为0.01-200mg/日，优选为0.05-100mg/日。

“有效剂量”或“治疗量”均是指足以产生疗效的量。有效量可分一或多次给药。通常，有效量足以缓和、改善、稳定、减慢或延迟疾病的进一步发展。

组合物

用于本发明或者含有本发明所述融合蛋白的组合物。通常，当本发明组合物用于上述用途时，所述融合蛋白可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制成不同给药途径的药物剂型，如片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、口服液、醑剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、注射剂、注射用无菌粉末、栓剂等。

“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。“药学上可接受的载体”是用于将本发明的融合体蛋白传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。

本发明的融合蛋白可经过口服、静脉内、肌内或皮下途径给药。

上述剂型中可经口服给药的剂型为：片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、醑剂。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖、白陶土、微粉硅胶、滑石粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、聚乙烯吡咯烷酮。而液态载体包括：无菌水、乙醇、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。在制备药物组合物的过程中通常使用的佐剂包括：调味剂、着色剂、防腐剂(如羟苯烷基丁酯、苯甲酸钠、山梨酸)和抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠和二丁基羟基甲苯)。

上述剂型中可用于注射途径给药的剂型包括：注射剂、注射用无菌粉末，它们是将药物与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合制成以供注射给药的形式。溶剂包括：无菌水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇。此外，还需加入抑菌剂(如苯甲醇、羟苯丁酯、硫柳汞)、等渗调节剂(如氯化钠、葡萄糖)、助悬剂(如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素)、增溶剂(吐温-80、卵磷酯)、抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠)和填充剂(如乳糖、甘露醇)。

从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是冻干粉针剂。优选静脉给药。

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明

本文中，序列如SEQ ID NO.1的多肽，被简称为ELBD或V16，其均代表同一多肽。

实施例1：表达载体的构建

A.EGFP-Tn-CPP系列表达载体构建

(1)EGFP-Tn-HBD系列突变表达载体的构建

在中国专利申请号为CN 201310170530.6的专利申请中，我们公开了一种肿瘤细胞靶向性穿膜肽，其特征在于含有具有细胞穿膜肽活性的CPPs结构域和具有靶向肿瘤细胞的VGF第三环样人工模拟肽结构域。为寻求更高的穿膜效率和靶向性，以此多肽结构为基础，根据不同的突变需求，以DNA人工固相合成方法合成两端带Bam HI和Sal I酶切位点的系列S3模拟肽样结构的突变核苷酸序列，特别列出的是如表一所示的的多肽序列(SEQ IDNO.1-11)。

表1人工合成的VGF第三环序列和部分突变体氨基酸序列

以EGFP-T0-HBD表达质粒(中国专利申请号：CN 201310170530.6，实施例1中的ESH)出发，同时将原有的EGFP-T0-HBD-pET28a表达载体用Bam HI与Sal I双酶切，并与合成的片段利用T4 DNA连接酶连接。

转化E.coli DH5α菌株，培养，回收重组质粒DNA，测序验证，即构建完成系列EGFP-Tn-HBD-pET28a表达载体，n＝1-12。其中对于V16，被特别命名为ELBD，构建的相应的表达载体为EGFP-ELBD-HBD-pET28a。

同时，构建其他天然生长因子来源的第三环序列相应的表达载体，EGFP-BTC-HBD-pET28a、EGFP-NGR2-β-HBD-pET28a、EGFP-HGR2-β-HBD-pET28a。

(2)EGFP-Tn-TAT系列突变表达载体的构建

采用DNA人工固相合成方法合成两端带Sal I和Xho I酶切位点的穿膜肽TAT核苷酸序列，分别插入到本实施例中已用Sal I+Xho I双酶切回收的EGFP-Tn-HBD-pET28a系列表达载体中，构建相应的带有TAT穿膜肽的EGFP-Tn-TAT-pET28a系列表达载体。

(3)EGFP-ELBD-H2表达载体的构建

以EGFP-ELBD-HBD-pET28a质粒为载体，人工固相合成两端带有Sal I和Xho I酶切位点的DNA序列，该序列经过E.coli密码子优化，并编码H2穿膜肽，其中H2是另一种人源性穿膜肽，来源于肝素类生长因子。将EGFP-Tn-HBD-pET28a表达载体用Sal I与Xho I双酶切，并与合成的此片段利用T4 DNA连接酶连接。

转化E.coli DH5α菌株，37℃过夜培养15h，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA，送DNA序列测序公司测序验证。

(4)EGFP-TAT表达载体的构建

采用DNA人工固相合成方法合成两端带Bam HI和Xho I酶切位点的DNA序列，该序列经过密码子优化，编码穿膜肽TAT。将此人工合成DNA片段插入到已用Bam HI+Xho I双酶切的EGFP-ELBD-HBD-pET28a表达载体中，转化E.coli DH5α菌株，37℃过夜培养15h，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA，送DNA序列测序公司测序验证。

B.不同抗肿瘤蛋白药物与ELBD-CPP重组表达载体构建

(1)TCS-ELBD-H2表达载体的构建

采用人工固相合成带有Bam HI和Xho I酶切位点的DNA引物，以已构建的质粒EGFP-ELBD-H2-pET28a中的ELBD-H2基因为模板进行PCR扩增，并添加酶切位点Bam HI和XhoI。

以EGFP-ELBD-H2-pET28a为模版，根据ELBD-H2基因序列，设计如下引物进行PCR扩增，正反向引物分别引入了Bam HI和Xho I酶切位点

引物1：5’-CGCGGATCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTT-3’

引物2：5’-CGCCTCGAGGTCTTTACCTTT-3’

PCR扩增反应条件：PCR扩增的反应条件为：先95℃，变性5min，然后95℃，变性45s，58℃复性30s，72℃延伸30s，循环33次，最后72℃，10min。

将扩增片段采用DNA片段回收试剂盒纯化，并以Bam HI和Xho I双酶切，回收片段。同时以BamHI和XhoI双酶切TCS-HBD-pET28b载体质粒，回收载体片段。并用T4 DNA连接酶进行连接。转化E.coli DH5α菌株，37℃过夜培养15h，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA，送DNA序列测序公司测序验证。。

(2)MAP30-ELBD-H2表达载体的构建

和上述TCS-ELBD-H2表达载体的构建实施例中描述的步骤类似。所用引物和PCR扩增条件如上所述。

合成带有Bam HI和Xho I酶切位点的引物，以原有的质粒EGFP-ELBD-H2-pET28a中的ELBD-H2基因为模板进行PCR扩增，并添加酶切位点Bam HI和Xho I。

将扩增片段采用DNA纯化试剂盒纯化，并以Bam HI和Xho I双酶切，回收片段。同时以Bam HI和Xho I双酶切MAP30-HBD-pET28b载体质粒，回收载体片段。并用T4 DNA连接酶进行连接。转化E.coli DH5α菌株，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA，送DNA序列测序公司测序验证。

实施例2：重组蛋白表达纯化

A.EGFP系列重组蛋白表达纯化

(1)EGFP-Tn-HBD系列重组蛋白表达纯化

①EGFP-Tn-HBD-pET28a质粒构建方案如实施例1中所述。从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有EGFP-Tn-HBD-pET28a质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。

②取此菌体培养液，以1％的接种量接入一定体积含一定浓度卡那霉素(10-50mg/L)的培养基中继续进行扩大培养，直至OD600约为0.5-1.0。

③将培养温度调整到15℃到20℃范围内，加入适量的IPTG(0.1-10MM)诱导目标蛋白表达，继续培养10-20h，500-1000rpm低速离心收集菌体。

④收集的菌体用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-8.5)重新悬浮，以一定功率(10-100w)进行超声破碎。在低温条件下(4-10℃)高速离心，弃上清，保留包涵体。

⑤使用1.0-0.5％的Triton洗涤包涵体10-60min。

⑥使用6M-8M尿素变性包涵体5-30min。

⑦透析复性，依次降低透析液中尿素含量直到透析液尿素浓度为0M。

根据上述步骤，分别表达纯化EGFP-Tn-HBD重组蛋白以及EGFP-ELBD-TAT重组蛋白。

(2)EGFP-ELBD-H2重组蛋白表达纯化

①EGFP-ELBD-H2-pET28a质粒构建方案如实施例1中所述。随后从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有EGFP-ELBD-H2-pET28a质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。

③将培养温度调整到15-20℃范围内，加入适量的IPTG(0.1-10mM)诱导目标蛋白表达，继续培养10-20h，500-1000rpm低速离心收集菌体。

④收集的菌体用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-8.5)重新悬浮，以一定功率(10-100w)进行超声破碎。在低温(4-10℃)条件下，高速离心(8000-13400rpm)收集含有目标蛋白的上清液。

⑤收集的上清液经过镍螯合亲和层析柱进行亲和层析分离。和大多数镍螯合亲和层析纯化目标蛋白的方法类似，采用带有不同浓度的咪唑缓冲液进行梯度洗脱(20mM咪唑洗脱、200mM咪唑洗脱)，收集不同浓度咪唑洗脱下的目标蛋白组分。

(3)EGFP-TAT重组蛋白表达纯化

①EGFP-TAT-pET28a质粒构建方案如实施例1中所述。从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有EGFP-TAT-pET28a质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。

③将培养温度调整到15-20℃范围内，加入适量的IPTG(0.1-10mM)诱导目标蛋白表达，继续培养10-20h，低速离心收集菌体。

④收集的菌体用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-8.5)重新悬浮，以一定功率(10-100w)进行超声破碎。在低温条件下高速离心收集含有目标蛋白的上清液。

⑤收集的上清液经过镍螯合亲和层析柱进行亲和层析分离。和大多数镍螯合亲和层析纯化目标蛋白的方法类似，采用带有不同浓度的咪唑缓冲液进行梯度洗脱(10mM咪唑洗脱、200mM咪唑洗脱、1M咪唑洗脱)，收集不同浓度咪唑洗脱下的目标蛋白组分。

(4)EGFP-ELBD-TAT重组蛋白表达纯化

①EGFP-ELBD-TAT-pET28a质粒构建方案如实施例1中所述。从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有EGFP-ELBD-TAT-pET28a质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。

④收集的菌体用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-8.5)重新悬浮，以一定功率(10-100w)进行超声破碎。在4-10℃低温条件下高速离心收集含有目标蛋白的上清液。

B.不同抗肿瘤蛋白与ELBD-CPP重组蛋白表达纯化

(1)TCS-ELBD-H2重组蛋白表达纯化

①TCS-ELBD-H2-pET28b质粒构建方案如实施例1中所述。从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有TCS-ELBD-H2-pET28b质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。

⑤收集的上清液经过镍螯合亲和层析柱进行亲和层析分离。和大多数镍螯合亲和层析纯化目标蛋白的方法类似，采用带有不同浓度的咪唑缓冲液进行梯度洗脱(20mM咪唑洗脱、50mM咪唑洗脱、200mM咪唑洗脱)，收集不同浓度咪唑洗脱下的目标蛋白组分。

(2)MAP30-ELBD-H2重组蛋白表达纯化

①MAP30-ELBD-H2-pET28b质粒构建方案如实施例1中所述。随后从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有MAP30-ELBD-H2-pET28b质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。

④收集的菌体用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-8.5)重新悬浮，以一定功率(10-100w)进行超声破碎。低温高速离心收集含有目标蛋白的上清液。

实施例3：突变体穿膜效率研究

A.突变体穿膜效率对比：

(1)带有穿膜肽HBD的EGFP-Tn重组蛋白的穿膜作用分析

采用2μM的重组蛋白样品浓度，将样品与体外培养的肿瘤细胞共孵育12h，以流式细胞检测术分析、比较观察各种EGFP-Tn-HBD重组蛋白对人乳腺癌细胞Bcap穿膜作用效果。同时与其他天然生长因子来源的第三环序列重组蛋白(EGFP-BTC-HBD、EGFP-NRG2-β-HBD、EGFP-HRG-β2-HBD)比较

以2μM的样品浓度，将多种重组突变体样品与体外培养的人乳腺癌细胞Bcap细胞共孵育12h，采用激光共聚焦技术分析、观察各突变体的穿膜效率。

结果发现，EGFP-ELBD-HBD对Bcap细胞的穿膜作用效果显著地高于其他天然生长因子来源的第三环序列重组蛋白(EGFP-BTC-HBD、EGFP-NGR2-β-HBD、EGFP-HGR2-β-HBD)，图1A为激光共聚焦结果，B为流式细胞仪检测结果，其中EGFP-ELBD-HBD标记为E-V16-H，EGFP-BTC-HBD标记为E-BTC-H，EGFP-NRG2-β-HBD标记为E-NRG2-β-H，EGFP-HRG-β2-HBD标记为E-HRG-β2-H。

结合Table 1的序列和激光共聚焦、流式细胞术实验所得的穿膜效率(图2)可以看出，putative成环的Cys位置和数量对穿膜结果有确切的影响作用。序列V16-9，V16-3，V16-2，和V16-1的穿膜效果都低于ELBD(V16)。与V16-3，V16-2相比，V16-1的效果更差，其与V16-9相当。这说明这三个Cys对突变体的三级结构有重大影响，都可能参与了这个结构域空间结构的成环过程，从而对穿膜效率产生一定的影响。从采用Zhang Lab的程序对ELBD的立体结构的计算机模拟分析的结果看，在所有能够成环的模拟结构中，只有C2-C10和C2-C26这两种可能的形式，没有C10-C26这种形式，说明C2有更大的可能性参与了成环的过程。而只有C2参与的成环过程更类似与天然的第三环结构，在环内包含了高度保守的氨基酸残基(Y-X-G-X-R)。

V16-6与ELBD(V16)相比，缺失了YTGIRCSH这段序列，而其穿膜大受影响，说明N端这段序列对保持ELBD(V16)高效穿膜协同性的重要性。也有可能是缺失了这段序列，导致了第二个Cys的缺失，从而影响了这个结构域的空间结构成环。因为依据计算机模建的结果，第二个Cys和第三个Cys之间是不太可能形成一个环状结构的，可能的原因是两个Cys之间紧靠有一段putatively形成α-螺旋结构的序列，造成两者间二硫键形成的困难。

从V16-10，V16-4和V16-5的结果可以看出，可能成环的中间区域的插入序列会直接影响环的大小和形状，以及重要保守氨基酸残基Y-X-G-X-R在空间的取向，从而导致穿膜效率的低下。尽管以往的研究文献中都证实EGF羧基末端区域的Leu47对EGF与EGFR的结合有重要作用，但在我们的突变研究结果中去除末端VVL的序列V16-8并没有对突变体的穿膜效应产生显著影响，暗示在ELBD-H的结构中，the flexible C-terminal tail并没有参与到与受体的结合过程，而对结构域结构有重要影响的Cys和与受体直接结合的Y-X-G-X-R序列才是关键因素，环中间的α-螺旋插入序列可能是起到保证其两侧Y-X-G-X-R序列的正确取向(optimal orientation)作用，使其有利于高效地与ErbB receptor结合部分识别和结合。同时，从上述结果，我们认为ELBD的序列可以优化为RCSHYTGIRCSHGIYTGIRCQH

(2)突变体穿膜作用的浓度和时间依赖性

采用不同浓度(0-2μM)EGFP-ELBD-HBD重组蛋白来进行蛋白浓度梯度和不同孵育时间(0-12h)的研究。从实验结果可以观察到，随着孵育时间的延长以及重组蛋白浓度的提高，重组蛋白EGFP-ELBD-HBD对人乳腺癌细胞Bcap细胞的穿膜效率有明显提高的趋势，证实该重组蛋白的穿膜效率具有浓度和时间依赖性(图3中A、B表明浓度依赖性、C表明时间依赖性)

B.靶向肽ELBD的广谱性研究：

为了考察其作为肿瘤靶向肽的普适性以及与穿膜肽联合应用的广谱性，我们将ELBD序列与HBD(一种来源于人EC-SOD肝素结合域的人源性穿膜肽，中国专利ZL200810044084.3)，TAT(HIV来源的穿膜肽)，HBP(肝素类生长因子中的肝素结合域序列，一种人源性穿膜肽)等多种穿膜肽(简称CPP)进行融合，获得的重组蛋白样品，以30μM的EGFP-TAT，2μM的E-ELBD-TAT，30μM的EGFP-HBD，2μM的EGFP-ELBD-HBD重组蛋白，在孵育12h后用流式细胞仪检测其对Bcap细胞的穿膜效率。

结果：证实ELBD序列作为靶向肽不仅能够大大提高HBD的穿膜效率，同时也对经典穿膜肽TAT有所提升，在HBP上也是类似的情况。说明ELBD对不同类型和来源的CPP都有协同提高靶向穿膜作用，证明ELBD序列在很大程度上能提升各种来源和序列穿膜肽的穿膜效率。(图4)

C.EGFP-ELBD-HBD重组蛋白对细胞的选择性

选用11种细胞来研究EGFP-ELBD-HBD重组蛋白的肿瘤靶向性特征。其中包括9种人体肿瘤细胞：HeLa(人宫颈癌细胞)、Bcap(人乳腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)，A357(人恶性黑素瘤)，T24(人膀胱癌细胞)，MGC-803(人胃癌细胞)，95D(人巨细胞肺癌细胞)，BxPC-3(人胰腺癌细胞)，5637(人膀胱癌细胞)，以及2种正常人体细胞：MRC-5(人胚肺成纤维细胞)，293T(人肾上皮细胞)。

选用重组蛋白的浓度为1μM，孵育12h。结果显示，EGFP-ELBD-HBD重组蛋白对MRC-5和293T两种正常细胞几乎没有明显穿膜；而对HeLa，Bcap，A549，T24，A357等癌细胞都有不同程度的穿膜(图5)。这种现象的产生可能是由于不同癌细胞表面的靶向受体分布不同，导致重组蛋白EGFP-ELBD-HBD对不同的癌细胞展现出不同的穿膜能力。但是对正常细胞来说，其膜受体，例如EGFR，表皮生长因子受体远低于癌细胞，而这一细胞间特性成为ELBD靶向肽具有肿瘤选择性的关键。

实施例4：突变体与肿瘤细胞表面结合能力的ELISA法分析

采用ELISA方法测定了穿膜效率相对较高的EGFP-S3-HBD(中国专利申请号CN201310170530.6)与EGFP-ELBD-HBD两种重组蛋白与人宫颈癌HeLa细胞表面的结合强度。

将人宫颈癌细胞以1x10³-1x10⁵个细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板中(以24h长满96孔板为实际操作浓度)，37℃培养24h后用PBS洗3次，每次15min。加入4℃预冷的0.1-0.25％戊二醛50μl/孔，于4℃固定细胞10-45min；将固定好的细胞用PBS洗3次，每次15min，用1％BSA/PBS溶液以200μl/孔于4℃封闭过夜；用PBST缓冲液(PBS中含有0.05％的Tween-20)洗3次，每次15min；将重组融合蛋白按照一定倍比稀释加入到96孔板中，50μl/孔，每个浓度设3个平行孔，37℃孵育2h；用PBST洗3次后，加入鼠抗His-tag单克隆抗体(l:1000-l:3000稀释)，50μl/孔，37℃温育2h；用PBST洗板3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗(1:800-1:2500稀释)，50μl/孔,37℃孵育2h；用PBST洗板5次，加入TMB底物显色液，100-200μl/孔，室温避光反应10-30min。以2mol/L的硫酸50μl/孔终止反应，立即在酶标仪上测定450nm处的吸光值。

从图6中可以看出，ELBD能够在更低的浓度下与HeLa细胞表面受体结合，表明ELBD序列更容易与癌细胞表面结合，而更容易结合细胞表面进一步促进了重组蛋白的穿膜效率。

实施例5：ELBD-CPP靶向穿膜肽对蛋白药物药理作用的改善：

TCS是一种来源于植物括楼块茎的具有抗肿瘤活性的药物蛋白，其具有核糖体失活蛋白(RIP)的活性，在体外无细胞系统中能够抑制蛋白质合成。

将TCS的基因序列与ELBD突变体核苷酸序列以及H2穿膜肽序列融合表达后，其TCS-ELBD-H2对B16(鼠黑色素瘤细胞)的抑制率显著提高(图7)。

MAP30同样也是一种具有抗肿瘤活性的蛋白药物，其来自于苦瓜种子，也是一种RIP蛋白。将其与ELBD-H2融合表达后，MAP30-ELBD-H2对肿瘤细胞HeLa、B16细胞的抑制率显著提高，然而对正常细胞MRC-5的抑制率没有显著提高(图8)。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

序列表

<110> 浙江孚诺医药股份有限公司

<120> 一种肿瘤靶向多肽、制备方法及其应用

<130> 20210601

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 1

Arg Cys Ser His Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Ser His Met Ala Ala Thr

1 5 10 15

Thr Ala Gly Ile Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Gln His Val Val Leu

20 25 30

<210> 2

<211> 31

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 2

Arg Ala Ser His Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Ser His Met Ala Ala Thr

1 5 10 15

Thr Ala Gly Ile Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Gln His Val Val Leu

20 25 30

<210> 3

<211> 31

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 3

Arg Cys Ser His Tyr Thr Gly Ile Arg Ala Ser His Met Ala Ala Thr

1 5 10 15

Thr Ala Gly Ile Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Gln His Val Val Leu

20 25 30

<210> 4

<211> 31

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 4

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1 5 10 15

Thr Ala Gly Ile Tyr Thr Gly Ile Arg Gly Gln His Val Val Leu

20 25 30

<210> 5

<211> 31

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 5

Arg Cys Ser His Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Ser Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu Ala Gly Ile Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Gln His Val Val Leu

20 25 30

<210> 6

<211> 31

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 6

Arg Cys Ser His Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ala Gly Ile Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Gln His Val Val Leu

20 25 30

<210> 7

<211> 23

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 7

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1 5 10 15

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20

<210> 8

<211> 28

<212> PRT

<213> artificial sequence

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1 5 10 15

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20 25

<210> 9

<211> 25

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 9

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1 5 10 15

Gly Ile Arg Cys Gln His Val Val Leu

20 25

<210> 10

<211> 27

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 10

Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Ser His Met Ala Ala Thr Thr Ala Gly Ile

1 5 10 15

Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Gln His Val Val Leu

20 25

<210> 11

<211> 31

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 11

Arg Cys Ser His Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Ser His Gly Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ala Gly Ile Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Gln His Val Val Leu

20 25 30

<210> 12

<211> 21

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 12

Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Gly Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro Cys

1 5 10 15

Leu Arg Lys Tyr Lys

20

<210> 13

<211> 56

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 13

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1 5 10 15

Thr Ala Gly Ile Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Gln His Val Val Leu Val

20 25 30

Asp Gly Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Gly Leu Gly Lys Lys Arg

35 40 45

Asp Pro Cys Leu Arg Lys Tyr Lys

50 55

<210> 14

<211> 53

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 14

Arg Cys Ser His Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Ser His Met Ala Ala Thr

1 5 10 15

Thr Ala Gly Ile Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Gln His Val Asp Gly Gly

20 25 30

Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Gly Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro Cys

35 40 45

Leu Arg Lys Tyr Lys

50

<210> 15

<211> 50

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 15

Arg Cys Ser His Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Ser His Gly Ile Tyr Thr

1 5 10 15

Gly Ile Arg Cys Gln His Val Val Leu Val Asp Gly Gly Lys Arg Lys

20 25 30

Lys Lys Gly Lys Gly Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro Cys Leu Arg Lys

35 40 45

Tyr Lys

50

Claims

1.一种缀合物，其特征在于包含肿瘤靶向多肽和一种活性成分，所述肿瘤靶向多肽为氨基酸序列为SEQ ID NO.1-4或SEQ ID NO.8-9或RCSHYTGIRCSHGIYTGIRCQH中之一的多肽；

二者通过一种连接器(linker)缀合；并且其中所述活性成分为治疗成分或诊断成分。

2.如权利要求1所述的缀合物，其所述连接器包含共价键连接或非共价键连接。

3.如权利要求2所述的缀合物，其所述共价键连接包含肽键，酯键，二硫键，磷酸二酯键，脲键，异氰酸酯键，或它们的组合。

4.如权利要求1所述的缀合物，其特征在于所述治疗成分包含细胞穿膜肽(CPP)。

5.如权利要求4所述的缀合物，其特征在于所述细胞穿膜肽为SEQ ID NO.12氨基酸序列所示的多肽，来自HIV的反式激活蛋白TAT的氨基酸片段，EC-SOD来源的肝素结合域(HBD)的氨基酸片段或HBEGF来源的肝素结合域(HBD)的氨基酸片段。

6.如权利要求4所述的缀合物，其特征在于所述缀合物包含氨基酸序列为SEQ IDNO.13-15中之一的多肽。

7.如权利要求1所述的缀合物，其特征在于所述治疗成分包含放射性治疗成分，化学治疗成分，酶或它们的组合。

8.如权利要求7所述的缀合物，其特征在于所述放射性治疗成分包含放射性同位素，所示放射性同位素为碘-131，镥-177，钇-90，钐-153，磷-32，铯-131，钯-103，镭-223，碘-125，硼-10，锕-225，铋-213，镭-225，铅-212，钍-232或它们的组合。

9.如权利要求7所述的缀合物，其特征在于所述化学治疗成分包含卡培他滨(capecitabine),顺铂(cisplatin),曲妥珠单抗(trastuzumab),氟维司群(fulvestrant),它莫西芬(tamoxifen),来曲唑(letrozole),依西美坦(exemestane),阿那曲唑(anastrozole),氨鲁米特(aminoglutethimide),睾内酯(testolactone),伏氯唑(vorozole),福美坦(formestane),法倔唑(fadrozole),来曲唑(letrozole),埃罗替尼(erlotinib),阿法替尼(lafatinib),达沙替尼(dasatinib),吉非替尼(gefitinib),伊马替尼(imatinib),pazopinib,拉帕替尼(lapatinib),舒尼替尼(sunitinib),尼罗替尼(nilotinib),索拉非尼(sorafenib),nab-紫杉醇(nab-palitaxel)，或它们的组合物。

10.如权利要求1所述的缀合物，其特征在于所述诊断成分包含放射性诊断成分，荧光成分或它们的组合物。

11.如权利要求10所述的缀合物，其特征在于所述放射性诊断成分包含氟-18，锝-99，钼-99，铷-82，锶-82，铊-201或它们的组合物。