KR20090079199A

KR20090079199A - 펩티드

Info

Publication number: KR20090079199A
Application number: KR1020097007727A
Authority: KR
Inventors: 로저 뉴
Original assignee: 렉스시콘 리미티드
Priority date: 2006-09-20
Filing date: 2007-09-20
Publication date: 2009-07-21
Also published as: EP2081952A2; DK2081952T3; US20150307557A1; RU2496789C2; WO2008035093A3; BRPI0716891A2; PL2081952T3; AU2007298717B2; ES2459020T3; JP2010504313A; CA2664064A1; WO2008035093A2; IL197675A; US20100022448A1; AU2007298717A1; PT2081952E; EP2081952B1; JP5475451B2; RU2009114708A; CY1115097T1

Abstract

본 발명은 표적 리간드에 특별하게 결합하기 위한 6개 이상의 아미노산의 링을 포함하는 내부로 구속된 고리 올리고펩티드에 관한 것으로, 상기 링은 다수 개의 아미노산 도메인을 포함하고, 각 도메인은 2개 이상의 에피토프 형성 아미노산, 및 하나 이상의 고리내 연합(intra-cyclic association)을 형성하도록 배치된 2개 이상의 연관 작용기를 포함하고; 상기 고리 올리고펩티드는 상기 에피토프 형성 아미노산이 각 도메인에서 에피토프를 형성하게 하고 각 에피토프가 표적 리간드에 특별하게 결합할 수 있도록 단일 입체형태(conformation)로 구속되게 한다.

펩티드, 올리고펩티드, 표적 리간드, 아미노산, 에피토프, TNF 분비물

Description

펩티드{Peptides}

본 발명은 내부로 구속된 고리 올리고펩티드(cyclic oligopeptide), 올리고펩티드 등을 포함하는 제약 조성물, 의약에서의 올리고펩티드 및 제약 조성물 등의 용도 및 올리고펩티드의 제조방법에 관한 것이다,

단백질 수용체는 전체 단백질 분자의 작은 비율을 구성하는, 에피토프, 아미노산의 결합체를 통해 그의 표적 리간드에 결합하는 것이 일반적으로 공지되어 있다.

세포들 표면의 단백질 수용체는 종종 다른 단백질, 명명된 단백질 리간드에 결합한 결과로서 세포 내에서 신호를 생성하기 위해 트리거된다. 상기 수용체와 상호작용하는 리간드의 포션은 에피토프로 명명되었고, 보통 서로에 아주 근접하여 작은 수의 아미노산의 결합체를 구성하고, 펩티드 사슬의 골격을 지지한다. 에피토프의 일례들은 항체들 또는 티-세포(T-cell) 수용체들과 상호작용하는 단백질들의 표면에 상기의 구조들이 있지만, 사실 다른 것들에 의해 특별하게 인식되어진 단백질 표면의 어떠한 구조는 에피토프의 정의에 포함될 수 있다. 에피토프와 단백질 수용체의 결합은 질병의 병인(病因)에 있어서 또는 반대로 질병 상태의 치료에 있어서 중요한 단계가 될 수 있기 때문에, 에피토프들을 형성하는 기능성 기(基)들의 동일성은 새로운 약의 개발을 위한 가능성 있는 유리한 수단이 되며, 여기서 상기 약은 수용체에 결합하는 에피토프를 구성하는 약품이 된다.

상기와 같이 새로운 약 개발을 위한 접근을 방해하는 데 있어서 두 가지의 과제가 주어진다. 첫 번째 과제는 질병을 치료하기 위해서 적절한 수용체들에 결합되기 위해 약 분자로서 사용될 수 있는 에피토프들의 동일성이다. 두 번째 과제는 세포 수용체와 강하게 결합하는 상호작용이 성취될 수 있도록 에피토프를 형성하는 아미노산의 결합을 지지하고 나타낼 수 있는 분자들을 설계하기 위한 것이다.

에피토프들을 형성할 수 있는 아미노산들의 결합을 동일시하기 위한 방법이 공지되었다. 일반적인 결합의 화학적 작용에 있어서, 특정 수용체에 결합하기 위한 가장 바람직한 순서의 동일성은 각각이 효능을 위해 시험되어지는 여러 가지의 주문 내에서 아미노산들과 같은 다른 기(基)들의 수많은 가능한 결합의 합성을 통해서 실행되어야 한다. 상기 방법은 시간이 소모되고 비용이 많이 들며, 여러 가지의 구성 성분들이 서로 결합하여 실행될 수 있는 화학적 작용의 성질을 통해 제한을 받고 있다.

국제특허공개공보 제WO 01/01140호에는 동일화하는 에피토프들의 개선된 방법이 제공되었다. 조성물이 리간드와 상호작용하기 위해 제공되었다. 상기 조성물은 각 컨쥬게이트가 헤드기와 테일기를 포함하는 다수 개의 상이한 컨쥬게이트의 비공유 집합체를 포함한다. 상기 컨쥬게이트의 테일기는 소수성 응집체를 형성하고 상기 컨쥬게이트는 집합체 내에서 서로에 대해 자유롭게 이동할 수 있기 때문에, 리간드의 존재 하에, 2개 이상의 헤드기는 각각의 헤드기가 개별적으로 상호작용하 는 것보다 강력하게 리간드와 상호작용할 수 있는 에피토프를 형성하도록 적합하게 배치되어진다. 바람직한 생물학적 활성도를 가진 다수 개의 컨쥬게이트는, 헤드기의 배열로 한 세트의 컨쥬게이트를 선택하고, 상기 테일기들이 소수성적으로 모아지고 컨쥬게이트들이 서로에 관계하여 자유로운 이동을 나타내는 비공유 집합체를 형성하고, 상기 비공유 집합체와 리간드 사이에서 충분한 상호작용을 위해 시도되어짐으로써 동일화될 수 있다. 상기 방법에서는 비공유 집합체와 리간드 사이에서 충분한 상호작용을 조사하기 위해 헤드기들의 변경된 배열이 되풀이될 수 있다. 상기 방법은 일반적인 결합의 화학적 작용을 이용하여 여러 가지 기(基)들의 수많은 가능한 결합체의 합성을 위해서 요구됨 없이 집합체에서 파생된 에피토프들을 제공하기 위해 인접한 헤드기들에 의존하여 특정 수용체에 결합하기 위한 가장 바람직한 순서의 동일성을 허용한다. 상기 방법은 간단히 집합체에서 파생된 에피토프를 제공하기 위해 인접한 헤드기에 의존한다. 한 세트의 컨쥬게이트들이 합성되어지면, 추가 합성 화학작용은 요구되지 않고, 단지 비공유 집합체를 통해 여러가지 프로브를 형성하기 위해 컨쥬게이트들을 간단히 혼합한다.

상기의 새로운 조성물 및 방법은 에피토프를 형성하고 표적 리간드에 결합하는 작용기(functional group)들을 동일화하는데는 성공하였지만, 거기에는 바람직한 에피토프를 형성할 수 있고 생물학적 응답을 생성하기 위해서 상기 표적 리간드와 개선된 안정성 및 특이성으로 상호작용할 수 있는 개선된 조성물을 제공하는 일이 여전히 요구되어진다.

결합부위를 구성하는 아미노산의 유일하게 구축된 에피토프에 대한 유사 펩 티드를 제조하기 위한 시도는 상기 펩티드들이 단백질 수용체로서 동일한 생물학적 활성도를 가지지 못하기 때문에 종종 실패하고 있다.

단백질의 결합부위가 단백질 사슬의 여러가지, 비접촉 부분들로부터 올리고펩티드로 구축되는 반면에, 유리 용액(free soultion)에서 고립된 올리고팹티드들을 혼합함으로써 결합부위를 재구축하기 위한 시도는 활성 결합부위를 얻지 못하고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 바람직한 에피토프를 형성할 수 있고 생물학적 응답을 생성하기 위해서 표적 리간드와 개선된 안정성 및 특이성으로 상호작용할 수 있는 개선된 올리고펩티드들을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 표적 리간드에 특별하게 결합하기 위한 6개 이상의 아미노산의 링을 포함하는 고리 올리고펩티드를 제공하고, 여기서 상기 링은 다수 개의 아미노산 도메인을 포함하고, 각 도메인은 2개 이상의 에피토프 형성 아미노산, 및 하나 이상의 고리내 연합(intra-cyclic association)을 형성하도록 위치된 2개 이상의 연관 작용기를 포함하고; 여기서 상기 고리 올리고펩티드는 단일 입체형태(conformation)로 구축되어서 상기 에피토프 형성 아미노산이 각 도메인에서 에피토프를 형성하게 하고 각 에피토프가 표적 리간드에 특별히 결합할 수 있게 한다.

고리 펩티드들은 선형 올리고펩티드들 보다 더욱 제한된 정합을 가지도록 하기 위한 기술로부터 공지되었다. 상기 펩티드의 말단부들의 자유로운 이동은 그들이 화학적으로 고정되어 있기 때문에 고리 펩티드 내에서 제한된다. 그러나, 고리 펩티드들은 여전히 상당한 수준의 유연성을 가지고 있으며 그들은 표적 리간드와 안정적인 결합의 상호작용에 참여하기 위한 불안정함을 만든다.

하나 이상의 고리내 연합을 형성하도록 위치된 2개 이상의 연관 작용기를 가진 고리 올리고펩티드를 구축함으로써, 상기 고리 올리고펩티드는 단일 정합 내에 내부적으로 구속된다. 이는 지금까지 이용할 수 있는 것 보다 더욱 안전성과 특이성을 가진 표적 리간드에 특별하게 결합하기 위한 각 도메인 내에 에피토프 형성 아미노산을 허용한다. 상기 에피토프 형성 아미노산은 생물학적 응답을 유도하기 위해 리간드와 상호작용하기 위한 안정한 에피토프를 형성할 수 있다. 상기 에피토프가 안정하게 형성되기 때문에 표적 리간드와의 상호작용이 개선된다.

미국특허공개공보 제2005/0107289호에는 교대 D- 및 L-α-아미노산 또는 β-아미노산의 아미노산 시이퀀스를 가진 고리 펩티드들을 포함하는 항균제 및 조성물을 개시하고 있다. 상기 문헌에는 고리 펩티드들이 미생물 맴브레인과 관련하여 또는 관련함으로써 거대분자 구조들로 자기 집합가능한 것으로 믿어지는 것이 추가로 개시되었다. 상기의 거대분자 구조들은 예를 들어 나노튜브들일 수 있다. 나노튜브들 각각은 적층 고리 펩티드에 대한 일련의 펩티드 기골(peptide backbone)에 의해 에워싸여진 튜브의 중심에 구멍을 가진다. 이온들 및 작은 분자들이 나노튜브들의 구멍들을 통해서 이동할 수 있다.

미국특허공개공보 제2005/0107289호에는 고리 펩티드들이 특별하게 표적 리간드와 결합할 수 있는 에피토프들을 형성하는 에피토프 형성 아미노산들을 포함하는 것이 개시되었다. 또한 미국특허공개공보 제2005/0107289호에는 상기의 에피토프들의 형성을 허용하기 위해서 고리 펩피드들이 고리내 연합에 의해 구속되는 것이 개시되지 않았다.

G. Abbenante 등에 의해서 J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 10384-10388에 개시된 "해양 유기물의 고리 옥타펩티드들 내의 티아졸 및 옥사졸린 링들에 의한 입체형태 제어. 새로운 장고리(macrocyclic) 체어 및 보트 입체 형태"에는 해양 장고리의 3차원 구조 및 반응성를 조절하기 위해서 입체 형태적 링 구속들(옥사졸린, 티아졸)로서 아미노산 빌딩 블럭들(Thr, Cys)을 개시하고 있다. 고리 옥타펩티드 1, c[Ile-Thr-D-Val-Cys-Ile-Thr-D-Val-Cyc-]은 많은 저에너지 구조들을 채택하여서 매우 유연하다. 상기 고리 옥타펩티드는 어떠한 고리내 연합들을 가지지 않고 있으며 다수 개의 에피토프를 형성하기 위해서 단일 입체 형태로 구속되지 않는다.

또한, G. Abbenante 등에 의해서 J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 10384-10388에 개시된 "해양 유기물의 고리 옥타펩티드들 내의 티아졸 및 옥사졸린 링들에 의한 입체 형태 제어. 새로운 장고리(macrocyclic) 체어 및 보트 입체 형태"에는 용액내 단일 유사체어(pseudochair) 입체형태를 보이고 있는 고리 펩티드 2, c[Ile-Thr-D-(Val)Thz-Ile-Thr-D-(Val)Thz-]가 개시되어 있다. 고리 펩티드 7, c[(Ile)Oxn-D-(Val)-Thz-IleOxn-D-(Val)Thz-]에는 크게 구속된 유사보트(pseudoboat) 또는 새들 형상(saddle-shaped) 장고리가 합성화되고 제조되었다. 고리 옥타펩티드 8은 7의 산 가수분해에 의해 제조되고 더 큰 유연성을 가진 보트 입체형태를 보였다. 상기의 고리 옥타펩티드들은 옥사졸린 및/또는 티아졸의 존재에 의해 어느 정도로 구속되지만 그들은 다수 개의 에피토프를 형성하지 않는다.

R. M. Cusack 등에 의해서 J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 2000, 323-331에 개시된 "고리 옥타펩티드의 입체형태 및 칼슘 결합에 의한 이종환식 링 구속의 영향"에는 이종고리 티아졸 및 옥사졸린 링 구속의 수가 다른 네 개의 고리 옥타펩티드가 개시되었다. 펩티드 1, 2 및 3은 용액 내에서 다른 형상으로 적용되었다. 상기의 고리 옥타펩티드들은 옥사졸린 및/또는 티아졸의 존재에 의해 어느 정도로 구속되지만 그들은 다수 개의 에피토프를 형성하지 않는다.

또한, R. M. Cusack 등에 의해서 J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 2000, 323-331에 개시된 "고리 옥타펩티드의 입체형태 및 칼슘 결합에 의한 이종환식 링 구속의 영향"에는 수소 결합으로부터는 멀어져서 어떠한 구속이 결핍된 상기의 고리 펩티드들이 아주 유연하고 용액 내에서 무수한 입체형태를 잠재적으로 적용할 수 있는 것을 보인 분자 모델링 및 옥사졸린 및 티아졸 링들이 결핍된 펩티드 4를 개시하고 있다. 펩티드 4는 어떠한 고리내 연합을 가지지 않으며 다수 개의 에피토프를 형성하기 위해서 단일 입체형태로 구속되지 않는다.

본 발명의 고리 올리고펩티드는 다음의 추가적인 상세한 설명을 통해서 개시될 것이다.

상기 고리 올리고펩티드는 적어도 6 개의 아미노산의 링을 포함하고, 여기서 상기 링은 다수 개의 아미노산 도메인을 포함하며, 각 도메인은 적어도 두 개의 에피토프 형성 아미노산 및 두 개 이상의 연관 작용기(associating functional group)를 포함한다.

일 실시예에서, 상기 고리 올리고펩티드는 6개의 아미노산의 링을 포함하고, 여기서 상기 링은 두 개의 아미노산 도메인을 포함하며, 각 도메인은 두 개의 에피토프 형성 아미노산 및 두 개의 연관 작용기(associating functional group)를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 상기 고리 올리고펩티드는 8개의 아미노산의 링을 포함하고, 여기서 상기 링은 두 개의 아미노산 도메인을 포함하며, 각 도메인은 세 개의 에피토프 형성 아미노산 및 두 개의 연관 작용기를 포함한다.

다른 실시예에서, 상기 고리 올리고펩티드는 8개 이상의 아미노산의 링을 포함한다. 상기 실시예에서, 상기 링은 세 개의 아미노산 도메인을 생산하기 위해서 고리내 연합을 형성하고 각 도메인은 세 개의 에피토프 형성 아미노산을 포함하고 있는 세 개의 연관 작용기를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 고리 올리고펩티드에서 사용된 아미노산은 천연 아미노산, 치환 유도체, 유사체 및 그의 D-폼(D-form)들 중 어느 하나를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 교호의 입체화학적 입체형상, 즉 L-D-L 또는 D-L-D를 가진 세 개의 에피토프 형성 아미노산이 있다. 이는 모두가 동일 방향에서 마주하고 평면 형상으로 지향될 에피토프 형성 아미노산의 측쇄(side chain)들을 허용하기 때문에 특히 바람직하다. 이는 에피토프를 형성하기 위해서 서로서로 아주 근접하게될 에피토프 형성 아미노산을 허용한다.

다른 실시예에서, 상기 고리 올리고펩티드는 10개 아미노산의 링을 포함하고, 여기서 상기 링은 두 개의 아미노산 도메인을 포함하고, 각 도메인은 네 개의 에피토프 형성 아미노산 및 두 개의 연관 작용기를 포함한다. 상기 에피토프 형성 아미노산은 동일 또는 교호의 입체화학적 입체형상, 즉 L-L-L-L, D-D-D-D, L-D-L-L, L-L-D-L, L-L-L-D, D-L-L-L, L-L-D-D, D-D-L-L, L-D-L-D, D-L-D-L, L-D-D-L, D-L-L-D, D-L-D-D, D-D-L-D, D-D-D-L 또는 L-D-D-D를 가진다.

상기 연관 작용기들은 하나 이상의 고리내 연합을 형성하도록 고리 올리고펩티드 내에 배치되고, 그에 의해 상기 고리 올리고펩티드는 에피토프 형성 아미노산이 각 도메인에서 에피토프를 형성하도록 단일 입체형태로 구속된다. 고리 올리고펩티드 내의 단일 입체형태의 형성은 많은 다른 방법을 통해 측정될 수 있으며, 이는 당업계에서 잘 알려져 있다. ¹H NMR 분광기, 원편광 2색성 분광분석, 광학 회전분산, 또는 X-ray 결정학과 같은 표준 분광기의 방법들이 고리 올리고펩티드의 입체형태를 결정하기 위해 사용될 수 있다.

상기 에피토프 형성 아미노산들은 하나 이상의 고리내 연합에 의해서 고리 올리고펩티드가 단일 입체형태로 구속되기 때문에 각 도메인 내에서 에피토프를 형성한다. 형성된 상기 에피토프들은 표적 리간드에 특별하게 결합할 수 있다. 상기 에피토프 및 표적 리간드의 특수 구조는 본 발명에서는 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은, 수용체(receptor)와 같이 특정 표적 리간드에 에피토프가 강하게 결합할 수 있도록 하기 위해 상기의 에피토프 형성 아미노산들이 충분한 경직(rigidity)을 소유하는 안정한 형상으로 유지되는 방법을 통해서, 두 개 이상의 에피토프 형성 아미노산의 어떠한 적절한 입체형태, 유사체 또는 유도체로 구성된 다수 개의 에피토프를 나타내는 올리고펩티드 골격(oligopeptide scaffold)을 제공하기 위한 것이다. 당업자라면 누구나 에피토프 형성 아미노산의 시이퀀스를 알 수 있고 표적 리간드와 상호작용하는 에피토프를 제공하기 위한 국제특허공개공보 제WO 01/01140에 개시된 것과 같은 방법을 사용할 수 있다. 당업자는 그가 에피토프를 형성하기 위해서 적합한 아미노산을 쉽게 선택할 수 있기 때문에 모든 가능한 에피토프의 상세한 화학적 구조는 불필요하다. 임의의 에피토프 형성 아미노산의 시이퀀스는 임의의 주어진 상황에 적합할 수 있으며 이는 표적 리간드에 의존할 것이다. 또한, 각 도메인 내의 아미노산들의 순서는 형성된 에피토프의 활성도를 결정할 수 있으며 이 또한 표적 리간드에 의존할 것이다. 상기 표적 리간드의 생물학적 활성도가 공지되어서 제공된 리간드의 정확한 화학적 구조는 알 필요가 없다. 에피토프 리간드 상호작용이 발생되는지를 결정하기 위해서 상기 리간드와 관련된 생물학적 작용이 측정될 수 있기 때문에, 에피토프 형성 아미노산들은 리간드의 정확한 화학적 구조에 대한 지식의 필요없이 본 발명의 고리 올리고펩티드에 포함될 수 있다. 당업자는, 적절한 시험 모델을 통해 얻어진 실험 데이터를 바탕으로 하여, 에피토프 형성 아미노산들과 같은 고리 올리고펩티드 내에 포함시키기 위한 아미노산들을 용이하게 선택할 수 있고 각 도메인 내의 아미노산들의 순서가 바람직한 활성도를 시험함으로써 최선의 생물학적 활성도를 제공하는 것을 결정할 수 있다.

상기 고리 올리고펩티드와 표적 리간드 사이의 상호작용을 결정하기 위한 아쎄이(assay)의 일례들은 항체와 항원 사이의 연합의 검출을 위해서 ELISA 원리를 이용하는 것과 같은 결합 아쎄이를 포함할 수 있다. 다른 적합한 시험관내(in vitro) 아쎄이는 환경에 민감한 막결합의 형광 프로브의 형광 변경, 침강 반응, 효소 활성도의 증강 또는 억제 등을 포함한다. 또한 시험관 내에서 배양된 세포의 행동인자를 변경하기 위한 재료들의 능력에 의존하는 아쎄이들은 세포사(cell death), 세포 증식, 세포자멸사(apoptosis), 세포 대 세포 접촉의 억제 또는 자극, 오토키네스(oytokines)의 분비물 또는 다른 가용성 제품, 특정 m-RNA의 합성, 세포내 소포이동, 세포 신호 프로세스의 변경 등을 위한 아쎄이와 같이 적절할 수 있다. 또한, 모든 동물 또는 인간들에서의 생체내 아쎄이들은, 예를 들어 다양한 루트를 통해 투여된 후 그의 연속적인 분포의 조사를 통해 행해진 고리 올리고펩티드 내부의 방사선표지의 결합이 실행될 수 있다.

에피토프는 각 도메인 내에 형성된다. 따라서 상기 고리 올리고펩티드에 형성된 에피토프의 수는 적어도 2개, 바람직하게는 2개 또는 3개다. 상기 고리 올리고펩티드 내의 에피토프들은 동일하거나 다를 수 있다. 상기 고리 올리고펩티드 내의 에피토프들이 다를 때, 각 도메인은 다른 아미노산들을 갖거나 다른 순서에서 동일한 아미노산들을 가질 수 있다. 상기와 같은 에피토프의 일례는 아미노산 세린(S), 페닐알라닌(F) 및 아르기닌(R)의 결합에 의해 형성되고, 대식세포 상의 세포 표면 수용체에 결합된다. 상기 세포 표면 수용체에 대한 에피토프의 결합은 억제될 TNF 분비물을 유발시킨다.

고리내 연합(Intra-cyclic Association)

하나 이상의 고리내 연합들이 다수 개의 아미노산 도메인을 가진 단일 입체형xo 내의 고리 올리고펩티드를 구속하기 위해 사용되었다. 각 도메인 내의 에피토프 형성 아미노산들은 매우 제한된 이동의 자유도로 단단히 구속된다. 이는 생물학적 반응을 생성하기 위해서 표적 리간드와 개선된 안전성 및 특이성으로 상호작용할 수 있는 각 도메인 내의 안정한 에피토프의 형성을 허용한다.

각 고리 올리고펩티드 내의 연관 작용기들의 수 및 선택된 연관 작용기의 타입은 아미노산을 형성하는 에피토프 및 표적 리간드에 의존할 것이다. 상기 연관 작용기의 수 및 성질은 고리 올리고펩티드의 생물학적 활성도에 영향을 미칠 수 있다. 당업자는 바람직한 활성도를 위한 시험을 통해서 사용하기 위한 연관 작용기의 가장 효과적인 수 또는 타입을 용이하게 선택할 수 있다.

하나 이상의 고리내 연합은 두 개 이상의 적절하게 위치된 관련 작용기에 의해 형성된다. 하나 이상의 연관 작용기는 각각의 아미노산 도메인들 사이에 위치되는 것이 바람직하다.

하나 이상의 고리내 연합들은 공유 또는 비공유일 수 있다. 상기 고리 올리고펩티드 내의 연관 작용기들은 동일하거나 다를 수 있다.

상기 연관 작용기들은 연관 아미노산들과 관계될 수 있다. 일실시예에서 상기 연관 작용기들은 연관 아미노산들의 측쇄 또는 연관 아미노산들의 변경된 측쇄 또는 연관 아미노산들의 측쇄에 더해진 집단(group)들이다. 상기 실시예의 일례는 아래 구조 Ⅰ에 나타내어졌다.

다른 방도로, 상기 연관 작용기들은 질소에 결합된 수소의 치환을 통해서 고 리 올리고펩티드 링 내의 펩티드 결합의 질소 원자들과 관계될 수 있다. 상기 실시예의 일례가 아래 구조 Ⅱ에 나타내어졌다.

다른 변경 실시예에서, 상기 연관 작용기는 아미노산들이 아닌, 올리고펩티드 링 내부에 위치된 다른 적당한 집단들과 관계될 수 있다. 상기 집단의 일례는 알파 히드록시 카르복실산이고, 여기서 상기 히드록시기는 펩티드 결합 대신 에스테르 결합에 관여한다.

"두 개 이상의 연관 작용기들"의 용어는 다음과 같은 실시예들을 포함한다.

● 여기서 고리내 연합은 비공유이다:

○ 상기 연관 작용기들은 링 내부의 연관 아미노산과 결합된 올리고펩티드 링으로부터의 두 개의 팬던트기(pendant group)이고, 비공유 결합을 형성하는 것과 관련된다.

○ 상기 연관 작용기들은 링 내부의 펩티드 결합의 질소 원자들과 결합된 올리고펩티드 링으로부터의 두 개의 팬던트기(pendant group)이고, 비공유 결합을 형성하는 것과 관련된다.

○ 상기 연관 작용기들은 링에 위치된 다른 적합한 집단들과 결합된 올리고펩티드 링으로부터의 두 개의 팬던트기(pendant group)이고, 비공유 결합을 형성하는 것과 관련된다.

● 여기서 고리내 연합은 공유이다:

○ 상기 연관 작용기들은 링 내부의 연관 아미노산들과 결합된 두 개의 집단이고, 양작용기와 같이 직접적으로 또는 링커를 통해서 공유결합을 형성하 기 위해 서로 결합된다.

○ 상기 연관 작용기들은 링 내부의 펩티드 결합의 질소 원자들과 결합된 두 개의 집단이고, 양작용기와 같이 직접적으로 또는 링커를 통해서 공유결합을 형성하기 위해 서로 결합된다.

○ 상기 연관 작용기들은 링에 위치된 다른 적합한 집단들과 결합된 두 개의 집단이고, 양작용기와 같이 직접적으로 또는 링커를 통해서 공유결합을 형성하기 위해 서로 결합된다.

"결합된"이라는 표현은 상기 연관 기들이 연관 아미노산, 질소 원자 또는 다른 적합한 집단에 적절한 링커를 통해서 직접적으로 결합되거나 부착되는 것을 의미한다.

바람직한 실시예에서, 상기 연관 작용기들 사이의 하나 이상의 고리내 연합들은 비공유이다. 비공유 고리내 연합들은 그들이 경직성과 유연성 사이에서 올바른 균형을 가지기 위해 고리 올리고펩티드를 허용하기 때문에 본 발명에서 특히 바람직하다. 상기 고리 올리고펩티드는 하나의 입체형태로 펩티드 기골을 유지하고 상기 에피토프 형성 아미노산이 서로에 충분히 근접하게 위치되는 것을 확보하며 표적 리간드에 특별하게 결합할 수 있는 에피토프를 형성하기에 충분히 경직된다. 또한 상기 고리 올리고펩티드는 표적 리간드의 정확한 구조를 채택하기 위해서 결합할 수 있는 에피토프 형성 아미노산의 측쇄들의 충분한 이동을 허용하도록 하는 유연성을 충분히 가진다. 따라서, 비공유 고리 연합을 포함하는 본 발명의 고리 올리고펩티드는 생물학적 반응을 생성하기 위해서 표적 리간드와 함께 개선된 안전성 및 특이성으로 상호작용할 수 있다.

바람직하게 고리내 연합들은 소수성이다. 특히 바람직한 실시예에서는 두 개의 아미노산 도메인 및 두 개의 친지질성 연관 작용기가 있다.

특히 소수성 상호작용을 통한 비공유 고리내 연합들의 사용은 세 개 이상의 연관 작용기들 사이의 상호작용으로부터 형성될 고리내 연합들을 허용하기 때문에 바람직하다. 이는 공유 고리내 연합들이 사용될 때에 어렵게 하는 세 개 이상의 아미노산 도메인들의 형성을 허용한다. 따라서, 본 발명의 다른 바람직한 실시예들에서, 상기 고리 올리고펩티드는 세 개 이상의 아미노산 도메인을 생산하기 위해서 고리내 연합들을 형성하는 세 개 이상의 연합 작용기들을 포함할 수 있다. 소수성 상호작용을 통해서 비공유 고리내 연합들을 형성하기 위해 친지질성 연관 작용기들의 사용은 고리 올리고펩티드가 클 때 특히 바람직하다.

상기 비공유 하나 이상의 고리내 연합들을 형성하기 위해 위치하는 연관 작용기는 고리 올리고펩티드 링의 일부를 형성하는 적절한 입체화학의 적당한 집단과 결합된 임의의 분자를 포함할 수 있다. 상기 연관 작용기들은, 비록 고리 올리고펩티드 링에 유착할 수 있는 다른 집단들이 사용될 수 있지만, 연관 아미노산들 또는 그의 유사체들, 아래에 인용된 일례들과 결합되는 것이 바람직하다. 일반적으로 상기 연관 작용기들이 결합되는 집단들이 펩티드 결합을 통해서 링에 결합되는 것이 바람직하다. 다른 실시예에서, 하나 이상의 펩티드 결합이 다른 형태들의 결합으로 대체될 수 있다. 상기와 같은 결합의 일례들은 에스테르 결합, 에테르 결합, 티오 에스테르 결합 및 티오 에테르 결합이 있다. 이는 생물학적 분야에서 프로테아 제(proteases)에 의한 발작을 제한하기 위해서 간헐적인 것이 바람직할 수 있다.

상기 연관 아미노산들은 연관 작용기들을 지지하는 천연 아미노산을 포함한다.

바람직하게, 상기 연관 아미노산들은 지질 아미노산 유사체들이다. 예를 들면, 상기 연관 아미노산들은 시스테인, 글리신, 리진, 아스파르트산 및 글루타민산으로 이루어진다. 시스테인의 경우, 상기 연관 작용기는 유황성분 작용성을 통해서 시스테인의 측쇄에 더해진 지방족기일 수 있다. 또한 리진, 아스파르트산 및 글루타민산은 연관 작용기를 측쇄에 더함으로써 상기의 방법을 통해서 사용될 수 있다. 다른 방도로 상기 연관 아미노산은 측쇄 잔류물이 연관 작용기를 구성하는 단일 지방족기인 아미노산일 수 있다. 예를 들면, 만약 연관 아미노산이 글리신을 바탕으로 이루어진다면, 글리신의 알파 수소는 연관 작용기를 구성하는 아스파르트기에 의해 대체될 수 있다.

상기에 언급된 연관 작용기를 형성하는 아스파르트기는 바람직하게 8 내지 20 탄소원자, 더욱 바람직하게는 10 내지 16 탄소원자, 및 가장 바람직하게는 10 또는 12 탄소를 가진 지방족 탄화수소 사슬인 것이 바람직하며, 부분 또는 전체적으로 포화 또는 불포화, 곧은 사슬 또는 곁사슬일 수 있고, 미치환되거나 또는 예를 들어 할로겐 원자들로 치환될 수 있다. 다른 방도로, 지방족기는 시레인 모이어티(silane moiety)들로 구성될 수 있다.

아래 일례 구조 Ⅰ에서, 상기 연관 아미노산은 글리신이고, 알파 수소는 C₁₀ 탄화수소 사슬로 대체될 수 있다.

일 실시예에서, 상기 연관 작용기들이 링 내의 펩티드 결합의 질소 원자들, 소수성 연합들과 같은 비공유 고리내 연합들과 결합되고, 예를 들어 상기에 정의된 바와 같이 지방족기와 같은 연관 작용기들에 의해 펩티드 결합의 질소에 관하여 수소원자로 치환함으로써 이루어질 수 있다.

연관 작용기를 통해서 본 발명의 고리 올리고펩티드 내의 펩티드 결합의 질소에 대한 수소 원자의 치환은 예를 들어 -SH, -OH 또는 -NH₂와 같은 적절한 작용기를 가지는 메틸렌기로 수소 원자를 우선적으로 치환함으로써 이루어질 수 있고, 연속적으로 상기에 정의된 지방족기와 같은 연관 작용기에 의한 파생작용을 통해서 행해질 수 있다.

상기 실시예의 일 태양에서, 상기 질소는 아미노산 도메인들을 분리하는 것으로부터 두 개의 에피토프 형성 아미노산을 결합하는 펩티드 결합으로부터 나오고, 본 발명의 고리 올리고펩티드는 다음의 구조 Ⅱ를 가질 수 있다.

여기에서, A, B, C, X, Y 및 Z는 에피토프 형성 아미노산을 나타내고, N은 B/Z와 C/Y 사이의 펩티드 결합들의 질소를 나타내며, Φ는 상기에 정의된 지방족기와 같고 질소에 부착된 연관 작용기를 나타낸다.

비공유, 특히 소수성을 이용에 대한 추가 장점은. 연관 작용기들이 분자내 상호작용을 허용하고, 여기에서 다른 고리 올리고펩티드로부터의 소수성 연관 작용기들은 다른 방향으로 지향된 다수의 반복 에피토프들을 함유하는 2량체 또는 소중합체를 생성하기 위해 서로서로 결합한다. 상기와 같은 상호작용이 발생하는 범위는 고리 올리고펩티드의 시이퀀스 구조에 의존하고, 아미노산 도메인의 상대 친수성을 결정한다. 이는 또한 연관 작용기의 현명한 선택을 통해서 제어될 수 있으며, 키랄성(chirality) 및 거대함은 노출된 올리고펩티드의 소수성 표면의 정확한 양을 제어하기 위해서 변화될 수 있다. 이는 다른 내부로 구속된 고리 올리고펩티들과 분자사이의 상호작용, 또는 단백질 또는 사이클로덱스트린과 같은 다른 분자들과 상호작용을 조절하는데 있어서 장점을 가진다. 이는 본 발명의 두 개 이상의 고리 올리고펩티드를 포함하고 강한 개시 트리거가 단독 연쇄반응으로 얻어진 세포에 나 타내어진 방법으로 수용체들을 교차 결합시킴으로써 동시에 두 개 이상의 세포 표면 수용체에 결합될 수 있는 작은 다중결합 구조들을 만드는데 있어서 장점을 가진다.

본 발명의 다른 동일하지 않은 고리 올리고펩티드를 가진 본 발명의 고리 올리고펩티드들의 상호작용은 다른 올리고펩티드들을 통해서 구조에 공헌하는 다른 에피토프에 의하여 다수의 작용성을 가지는 다중 결합 구조들을 만드는데 있어서 장점을 가질 수 있다. 따라서, 일례로, 하나의 올리고펩티드는 습득될 다중 결합 구조를 허용하는 수용체들에 결합하는 하나 이상의 에피토프를 포함할 수 있는 반면, 상기 다중 결합 구조 내의 두 번째 올리고펩티드는 습득 후 세포 내부의 연쇄반응을 신호하는 구성요소와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 구성한다.

상기 발명의 고리 올리고펩티드에 대한 사이클로덱스트린의 결합은 다른 올리고펩티드들의 소수성 부분들 사이의 상호작용 수준을 감소시키는 것을 도울 수 있고, 따라서 거대한 무리 형성을 방지할 수 있으며, 상기의 거대한 무리 내의 에피토프의 입체구조적 간섭(steric hindrance)으로 인하여 단량체 또는 소중합체와 비교하여 활성도가 감소될 수 있다.

알부민 또는 젤라틴과 같은 단백질의 용액에서, 알킬 또는 아실 탄화수소 사슬들을 위한 친화력을 가지는 단백질의 영역으로 펩티드 내 소수성 연관 작용기의 친지질성 모이어티의 연합 결과로서 본 발명의 고리 올리고펩티들 중 하나 이상이 단백질의 표면에 결합될 수 있다. 거대한 단백질의 표면에 본 발명의 하나 이상의 고리 올리고펩티드에 대한 상기와 같은 결합은 고리 올리고펩티드 상의 에피토프의 다수 배열이 세포 내 트리거링 신호의 상호작용이 최대가 되는 방법을 통해서 나타내어진 한 가지의 배열 방법이다.

추가 실시예에서, 상기 연관 작용기들 사이의 하나 이상의 고리내 연합들은 공유이다. 상기 실시에에서, 또한 연관 작용기들은 연관 아미노산들이 결합될 수 있다. 예를 들면, 상기 연관 작용기들은 시스테인(연관 아미노산)들의 측쇄일 수 있고 상기 연합은 상기의 측쇄들 사이의 고리내 2황화물에 의해 형성된다. 다른 방도로, 상기 연관 아미노산들은 상기의 측쇄(연관 작용기)들에 대한 말단기를 통해서 펩티드 결합의 형성을 통해 공유적으로 결합할 수 있는 리진 및 글루타민산일 수 있고, 또는 에스테르 결합을 형성하기 위해 반응할 수 있는 글루타민산 및 세린일 수 있다. 또한 동일한 작용 모이어티를 가지는 상기의 아미노산의 유사체들이 사용될 수 있다.

일실시예에서, 공유 고리내 연합은 공유 연합을 형성하는 연관 작용기를 가진 링 냉의 펩티드 결합들의 질소 원자에 부착된 수소들을 치환함으로써 성취될 수 있다. 상기 연관 작용기들은 티올, 또는 공유 연합을 형성할 수 있는 그들의 말단에서 작용기들을 가지는 다른 사슬들일 수 있다. 연관 작용기를 통해서 본 발명의 고리 올리고펩티드 내의 펩티드 결합의 질소에 대한 수소원자의 치환은 예를 들어 -SH, -OH 또는 -NH₂,와 같은 적절한 작용기를 가지는 메틸렌기로 수소 원자를 우선적으로 치환함으로써 이루어질 수 있고, 연속적으로 양작용기에 작용기를 결합하는 제2 단계를 통해서 행해진다. 상기 공유 연합은 적절한 작용기를 가지는 제3 메틸렌기로 제2 수소 원자(고리 올리고펩티드 내부의 적당한 위치에 놓인 펩티드 결합의 질소에 대하여)를 추가로 치환함으로써 형성되고, 상기의 양작용기는 고리 올리고펩티드 내 펩티드 결합의 두 개의 질소 원자들 사이에서 공유 결합을 생성하기 위해 상기 제2 메틸렌기의 작용기에 추가로 결합된다. 상기 고리 올리고펩티드에 결합된 연관 작용기의 성질에 의존하여, 적절한 양작용 반응물은 각각의 말단이 선택된 작용기를 소유하고 있는 짧은 사슬을 구성하는 것들이고, 다음과 같은 목록: 카르복실(carboxyl), 아미노(amino), 히드록실(hydroxyl), 설피드릴(sulphydryl), 브로모(bromo), 이오도(iodo), 시아노(cyano), 아조(azo) 및 보론산기(boronic acid)들로 제한되지 않는다.

본 발명의 특별한 태양에서, 고리 올리고펩티드는 각각이 연관 아미노산과 결합되는 두 개의 아미노산 도메인 및 두 개의 연관 작용기를 구성하고, 펩티드는 각 도메인에서 세 개의 에피토프 형성 아미노산으로부터 형성되며, 상기 고리 올리고펩티드는 다음과 같은 구조를 가진다.

여기에서, A, B, C, X, Y 및 Z는 에피토프 형성 아미노산을 나타내고; A 및 X는 D 아미노산을 나타내고, B, C, Y 및 Z는 L 아미노산을 나타내고, 또는 A 및 X는 L 아미노산을 나타내고, B, C, Y 및 Z는 D 아미노산을 나타내고; 하나의 에피토프는 도메인 C-A-B로부터 형성되며 하나의 에피토프는 도메인 Z-X-Y로부터 형성되고; 및 각 Σ는 연관 작용기를 가지는 연관 아미노산을 나타낸다.

본 발명에 따른 고리 올리고펩티드의 일례에서, Z-X-Y 및/또는 C-A-B 도메인은 아미노산 시이퀀스들 RFS, RSF, FSR, FRS, SRF, SFR, QLS, QSL, SQL, SLQ, LQS 또는 LSQ로부터 선택될 수 있고 각 Σ는 연관 작용기와 같이 C₁₀선형 탄화수소 측쇄를 가진 지질 아미노산이다. 바람직하게, Z-X-Y 도메인은, 페닐알라닌 (phenylalanine)이 D 입체형상이고 세린이 L 입체형상이고, 아르기닌이 L입체형상이며 각 지질 아미노산이 L입체형상인 것이 바람직한 RFS이다. 바람직한 실시예에서, 상기의 시이퀀스로부터 선택된 Z-X-Y 도메인 및/또는 C-A-B 도메인 각각은 TNF 분비물을 억제할 수 있는 에피토프를 형성한다. 따라서, 상기의 시이퀀스들은 질병을 치료하는데 있어서 유용하며, 여기서 TNF는 일례를 위한 악화 요소이고, 질병은 암, 비만증, 심장병 환자, 자기면역 질환 및 염증성 질환으로부터 선택된다. 상기의 시이퀀스들은 류머티즘성 관절염, 다발 경화증 및 크론 질병으로부터 선택된 자기면역 질환을 치료하기 위해 사용된다.

상기와 같은 구조에서, 도메인 C-A-B는 도메인 Z-X-Y와 같거나 다를 수 있다.

본 발명의 추가 태양에서, 고리 올리고펩티드는 세 개의 아미노산 도메인을 구성하고, 에피토프는 각 도메인에서 세 개의 에피토프 형성 아미노산으로부터 형성되며, 바람직하게 올리고펩티드는 세 개의 연관 작용기를 구성한다.

본 발명의 추가 태양에서, 고리 올리고펩티드는 두 개의 도메인을 구성하고, 에피토프는 각 도메인에서 네 개의 에피토프 형성 아미노산으로부터 형성된다. 본 발명의 상기 태양의 일 실시예에서 고리 올리고펩티드는 다음과 같은 구조를 가진다.

여기에서, A, B, C, D, W, X, Y 및 Z는 에피토프 형성 아미노산을 나타내고; 하나의 에피토프는 도메인 D-C-A-B로부터 형성되고 하나의 에피토프는 도메인 Z-X-Y-W로부터 형성되며; 및 각 Σ는 연관 아미노산을 나타낸다.

본 발명의 상기 태양의 다른 실시예에서 고리 올리고펩티드는 다음과 같은 구조를 가진다.

여기에서, A, B, C, D, W, X, Y 및 Z는 에피토프 형성 아미노산을 나타내고; 하나의 에피토프는 도메인 D-C-A-B로부터 형성되고 하나의 에피토프는 도메인 Z-X-Y-W로부터 형성되며; 각 N은 B-Z와 C-Y 사이의 펩티드 결합의 질소를 나타내고, 각 Φ는 질소를 통해서 부착된 연관 작용기를 나타낸다.

본 발명의 상기 태양에 따른 고리 올리고펩티드의 일례에서, 상기 Z-X-Y-W 도메인 및/또는 D-C-A-B 도메인은 아미노산 시이퀀스들인 YEKA, YEAK, YAKE, YAEK, YKAE, TKEA, EYKA, EYAK, EKAY, EKYA, EAKY, EAYK, KAYE, KAEY, KYAE, KYEA, KEAY, KEYA, AKEY, AKYE, AYEK, AYKE, AEYK 또는 AEKY로부터 선택되고, 각 Σ는 길이로 8과 20 탄소들 사이에서 탄화수소 사슬을 구성하는 선형 탄화수소 측쇄 사슬 연관 작용기를 가진 지질 아미노산이다. 바람직하게 Z-X-Y-W 도메인은 YEKA이고 D-C-A-B 도메인은 EYAK 이다. 바람직한 실시예에서, 상기 시이퀀스로부터 선택된 Z-X-Y-W 도메인 및/또는 D-C-A-B 도메인 각각은 단백분해효소 활성도를 억제할 수 있는 에피토프를 형성한다. 따라서, 상기의 시이퀀스들은 단백분해효소 활성도가 심장혈관계 질환, 순환계 질환 및 HIV와 같은 악화요소인 질병을 치료하기 위해 사용된다.

본 발명의 상기 태양의 일실시예에서, 도메인 D-C-A-B는 도메인 Z-X-Y-W와 같다.

조성물

추가 태양에서, 본 발명은 상기에 정의된 고리 올리고펩티드 및 약제학적으로 수용할 수 있는 부형제 및/또는 항원보강제를 구성하는 제약 조성물을 제공한다. 상기 부형제는 트랜스큐톨(transcutol), 폴로사머 블록-공중합체(poloxamer block-copolymer), 사이클로덱스트린, 비이온의 표면활성제(non-ionic surfactant) 또는 담즙염으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 만약 부형제가 비이온의 표면활성제라면, 폴리에틸렌 글리콜의 아실 에스테르들 또는 폴리에틸렌 글리콜의 지방성 에스테르들로부터 선택되는 것이 바람직하다.

상기에 논의된 바와 같이, 본 발명의 일실시예에서 고리내 연합들은 개별 고리 올리고펩티드들 사이에서 형성하고, 소수성 연관 작용기들은 다른 방향으로 지향된 다수의 반복 에피토프들을 포함하는 2량체 또는 소중합체를 생산하기 위해 서로서로 관련있는 여러 개의 고리 올리고펩티드를 형성한다. 고리내 상호작용의 범위는 수용성 매개물에서 소수성 모이어티의 용해화를 돕는 부형제와 공동 혼합을 통해 변경될 수 있다.

용도

추가 태양에서, 본 발명은 약제, 예방 또는 진단으로서 사용하기 위한, 상기에 정의된 바와 같은 고리 올리고펩티드 또는 상기에 정의된 바와 같은 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 TNF가 악화요소인 질병을 치료하기 위한 약제의 제조를 위해서 상기 정의된 바와 같은 고리 올리고펩티드 또는 상기 정의된 바와 같은 조성물의 용도를 제공한다. 바람직하게 상기 질병은 비만증, 심장병 환자, 자기면역 질환 및 염증성 질환으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게 상기 질병은 류머티즘성 관절염 또는 크론 질환이다. 상기에 정의된 바와 같은 고리 올리고펩티드는 TNF가 악화요소인 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 상기 암은 양성 또는 음성일 수 있다. 바람직하게 상기 암은 고형종양이다. 그러나 상기와 같은 암들은 난소암, 유방암, 피부암 및 상피암으로 제한되지 않은 것들을 포함한다.

또한, 본 발명은 단백분해효소 활성도가 심장혈관계 질환, 순환계 질환 및 HIV를 포함하는 악화요소인 질병을 치료하기 위한 약제의 제조를 위해서 상기의 정의된 바와 같은 고리 올리고펩티드 또는 상기 정의된 바와 같은 조성물의 용도를 제공한다. 본 발명의 하나의 특정 실시예에서, 고리 올리고펩티드에서의 각 도메인은 트롬빈 단백분해효소 활성도를 억제시키기 위해서 일례 7에서 보인 에피토프 형성 아미노산들인 SRER, SERE, EYKA, YEAK, SFR 또는 RFS를 구성한다.

상술된 바와 같은 본 발명의 하나의 특정 실시예에서, 상기 고리 올리고펩티드는 하나 이상의 도메인에서 에피토프 형성 아미노산과 같이 세린, 페닐알라닌 및 아르기닌 등의 아미노산을 포함한다. 상기의 올리고펩티드들은 대식세포로부터 나오는 TNF의 분비물의 억제에 있어서 활성도를 나타내기 위해 보여진다. 상기 실시 예의 바람직한 태양에서, 연관 작용기는 C₁₂ 탄화수소 측쇄를 가진 지질 아미노산들이고 상기 에피토프 형성 아미노산들은 RFS, FSR 또는 SRF로부터 선택되고, 여기서 중앙의 아미노산은 D 폼 안에 있고, 외부의 두 개 아미노산은 L 폼 안에 있다. 상기 고리 올리고펩티드 내의 각 에피토프는 동일하거나 다를 수 있다.

하향조절 TNF 분비물에 대한 그들의 능력에 의하여, 상기의 올리고펩티드들은 류머티즘성 관절염, 크론 질환, 다수의 경화 비만증, 심장병 환자, 자기면역 질환 및 기타 병들과 같은 질병들을 치료하는데 효능이 있고, 여기서는 염증성 치료가 포함된다.

하향조절 TNF 분비물에 대한 그들의 능력에 의하여, 또한 상기의 올리고펩티드들은 TNF가 악화요소인 암을 치료하는데 효능이 있다. 상기 암은 양성 또는 음성일 수 있다. 바람직하게 상기 암은 고형종양이다. 그러나 상기와 같은 암들은 난소암, 유방암, 피부암 및 상피암으로 제한되지 않은 것들을 포함한다.

상술된 바와 같은 본 발명의 하나의 특정 실시예에서, 상기 고리 올리고펩티드들은 하나 이상의 도메인 내의 에피토프 형성 아미노산들과 같이 A, K, E 및 Y와 같은 아미노산들을 구성한다. 상기의 올리고펩티드들은 대식세포로부터 나오는 TNF의 분비물의 억제에 있어서 활성도를 나타내기 위해 보여진다. 상기 실시예의 바람직한 태양에서, 연관 작용기는 C₁₀ 탄화수소 측쇄를 가진 지질 아미노산들이고 상기 에피토프 형성 아미노산들은 YEKA 및 EYAK로부터 선택된다. 상기 고리 올리고펩티드 내의 각 에피토프는 동일하거나 다를 수 있다. 다발 경화증의 치료에 있어서, 코팍손(Copaxone)(글래티라머 아세테이트(Glatiramer acetate))과 A, K, E 및 Y와같은 아미노산들을 포함하는 랜덤 공중합체의 효능은 체내 하향조절 TNF 분비물에 대한 상기 화합물의 능력을 통해서 반사되는 것이 고려된다. (참고: Weber MS, Starck M, Wagenpfeil S, Meinl E, Hohlfeld R & Farina C. 다발경화증: 글래티라머 아세테이트는 체내 및 체외 단핵세포 반응성을 억제. Brain 127 pp1370-8(2004)). 이 점에 있어서, 일례 6에서 시험된 상기 순황 올리고펩티드 싸이크로(-A-K-Σ-Y-E-K-A-Σ-E-Y)는 또한 다발경화증 치료에 유용할 것인데, 그 이유는 정연한(non-random) 형태에서 동일한 아미노산들을 구성하고 대식세포를 통해서 TNF 분비물에 관하여 동일한 효과를 나타내기 때문이다. 또한 본 발명에 따른 고리 올리고펩티드들 내 A, K, E 및 Y의 다른 시이퀀스 배열이 다발경화증을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 장점은 강한 특수 결합 상호작용들이 종래 생물학적 수용체와 비교하여 본 발명의 고리 올리고펩티드에 의해 성취될 수 있다. 상기 고리 올리고펩티드는 바람직하게 6 또는 8 이하의 아미노산을 포함함으로써 비교적 적다. 따라서, 본 발명에 따른 고리 올리고펩티드는 그들의 단백질 상대물들보타 훨씬 적은 면역원을 만들수 있다.

본 발명의 상기 태양에 따르면, 본 발명의 고리 올리고펩티드는 체내 리간드와 상호작용하기 위해 공식화될 수 있으며 또한 상기 조성물이 체외에서도 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 고리 올리고펩티드 및 조성물은 구강, 비강, 직장, 볼쪽, 혀 하부, 폐, 질, 국소, 눈, 귀, 피하, 피부내, 관절내, 난포막내, 근육내, 대뇌내, 두개골내 및 투여의 정맥 루트를 포함하면서 이에 국한되지 않는 문제의 질병에 대한 적절한 임의의 루트를 통해서 투여될 수 있다.

상기 고리 올리고펩티드들은 유리(free)수용액 내에, 또는 본 발명의 조성물 내의 약재학적 부형제와 관련하여 투여될 수 있다. 또한 상기 고리 올리고펩티드 또는 조성물은 약물 치료제들과 함께 상호작용하게 하거나 그렇지 않으면 약물 치료제들과 같이 그들의 활성도를 강화시키기 위해서 다른 활성 분자 법칙으로 공동 혼합될 수 있다. 예를 들어 구강 또는 직장의 임의의 루트를 통해 투여될 때, 상기 올리고펩티드 또는 조성물은 고체, 반고체 또는 액체 및 캡슐에 채워진 것으로서, 또는 알약으로 압착되거나 펠렛으로 압출된 고체로써 정형화될 수 있다. 이 경우, 만약 투여의 최종 루트가 구강으로 된다면, 캡슐, 알약 또는 펠렛은 장(enteric) 코팅될 수 있다. 국소(topical) 적용을 위해서는 특히 겔, 연고 또는 오일로서의 정형화가 적합할 수 있는 반면, 폐 또는 비강 투여를 위해서는 상기 올리고펩티드가 에어러졸(aerosol)의 형태일 수 있다.

방법

추가 태양에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 고리 올리고펩티드를 제조하는 방법을 제공하는 것으로,

ⅰ) 에피토프 형성 아미노산을 선택;

ⅱ) 상기 에피토프 형성 아미노산과 결합시켜 고리 올리고펩티드를 제조;하 는 것을 포함한다.

방법들은 에피토프들을 증명하기 위해 공지되었다. 정통 조합화학에서는, 특정 수용체에 결합하기 위한 가장 바람직한 시이퀀스의 증명이 각가 하나가 효능을 위해 시험되어지면서 다른 순서 내에서 아미노산들과 같은 수 백개의 여러 집단의 가능한 입체형상의 합성을 통해서 실행되었다. 상기 방법은 시간이 소모되고 비용이 고가이며 다른 성분들을 함께 결합하는 것을 실행할 수 있는 화학적 특징을 통해 제한되었다.

상기에 논의된 바와 같이, 상기 에피토프 형성 아미노산들은 당업계의 당업자에게 공지된 다양한 다른 방법을 통해 선택될 수 있다.

국제공개공보 제WO 01/01140호는 다수 개의 독특한 컨쥬게이트의 비공유 결합체를 사용하는 소정의 리간드와 상호작용할 수 있는 에피토프를 형성하는 분자들을 결정하기 위한 방법을 제공하고 있다. 국제공개공보 제WO 01/01140호의 2 내지 5 페이지에 개시된 바와 같이, 각각의 컨쥬게이트는 헤드기 및 테일기를 구성하고, 여기에서, 상기 컨쥬게이트의 테일기는 소수성 집합체를 형성하고, 상기 컨쥬게이트는 결합체 내부의 서로서로에 관계하여 이동의 자유를 가지며, 그 결과 리간드의 면전에서, 두 개 이상의 헤드기들(동일하거나 다름)이 각 개별적인 헤드기들보다 더욱 강하게 리간드와 상호작용할 수 있는 에피토프를 형성하기 위해서 적절하게 배치된다. 일반적으로 상기 헤드기들은 친수성이고, 일반적으로 상기 테일기들은 소수성, 예를 들어 탄화수소 사슬들로 이루어진 친지질성, 탄화불소 사슬들로 구축된 호염성, 또는 시레인 기저이다. 헤드기와 테일기를 가진 컨쥬게이트를 구축함으 로써, 상기 테일기는 일반적으로 미셀, 라멜라 구조, 리포솜 또는 다른 지질 구조와 같은 초분자 결합체인 소수성 결합체를 형성하기 위해 결합할 수 있고, 이때 상기 컨쥬게이트는 헤드기들이 액상으로 있을 때 가장 근접하게 되는 방향으로 지향된다. 상기 컨쥬게이트들이 결합체 내부로 이동할 수 있기 때문에, 상기 헤드기들은 결합체 내부에서 다수의 다른 배치를 채택할 수 있다. 따라서 일반적으로 동일하지 않은 헤드기들은 결합체 내에서 이동하기 위해, 놀랍게도 헤드기들이 그 자신 스스로에 대하여 유발접종 할 수 없는 셍물학적 결과를 유도하기 위해 서로 협력하여 상호작용하기 위해서 자유롭다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 국제공개공보 제WO 01/01140호에 개시된 방법은 에피토프 형성 아미노산들을 선택하기 위해 사용되었으며, 상기 방법은:

(a) 헤드기들의 배열과 함께, 각 컨쥬게이트가 헤드기 및 테일기로 구성된 일세트의 컨쥬게이트를 선택하는 단계, 여기서 각 헤드기는 아미노산으로 구성됨;

(b) 상기 테일기가 소수성적으로 집합하고 컨쥬게이트들이 이동할 수 있는, 비공유 결합을 형성하는 단계;

(c) 상기 비공유 결합과 표적 리간드 사이의 충분한 상호작용을 위한 아쎄잉(assaying)하는 단계;

(d) 헤드기들의 변경된 배열을 가진 일세트의 컨쥬게이트를 이용하여 (a) 내지 (c)단계를 선택적으로 반복하는 단계; 및

(e) (a) 단계에서 에피토프 형성 아미노산과 같이 일세트의 컨쥬게이트의 헤드기에 대한 아미노산들을 선택하는 (c)단계에서 충분한 상호작용을 조사하는 단 계;를 구성한다.

"충분한 상호작용"을 위한 아쎄이들의 일례는 항체와 항원 사이의 결합을 감지하기 위한 ELISA 원리를 이용하는 것과 같이 결합 아쎄이들을 포함할 수 있다. 다른 적합한 체내(in vitro) 아쎄이들은 환경적으로 예민한 멤브레인 바운드 형광성 프로브의 형광 변경, 침전 반응, 효소의 억제 또는 강화 등을 포함한다. 또한 체내에서 부양된 세포들의 행동인자를 변경하기 위해서 재료들의 능력에 의존하는 아쎄이들은 세포사를 위한 아쎄이, 세포 증식, 세포자멸사, 세포-대-세포 접촉의 억제 또는 자극, 세포질분열 또는 기타 가용성 물질의 분비물, 특정 m-RNA의 합성, 세포내 소포 이송, 세포 신호 처리의 변경 등과 같이 적절할 수 있다. 또한 모든 동물들과 사람들에 있어서의 체외(in vivo) 아쎄이들은, 일례로 다양한 루트를 통해 투여후 그의 연속적인 분포의 조사를 통해 행해진 초분자 결합체 내부로의 방사능표지의 결합이 실행될 수 있다.

상기 방법에 따르면 결합의 접근은 합성전 은행(pre-synthesised bank)으로부터 선택된 컨쥬게이트들의 여러가지 결합을 각각이 포함하는 여러가지 초분자 결합체(또는 "프로브")들의 범위가 준비된 것이 이용된다. 적절한 컨쥬게이트들의 선택은 표적 리간드의 공지된 특성들을 바탕으로 할 수 있거나 두 개 이상의 헤드기가 리간드를 위한 에피토프를 형성할 것이라는 가능성을 증가시키기 위해서 헤드기의 아주 넓은 범위의 사용을 간단히 포함할 수 있다. 상기의 방법에서, 상술된 바와 같이 프로브와 리간드 사이의 충분한 상호작용을 위한 아쎄이에 이어, 가장 효과적으로 이루어질 컨쥬게이트들의 결합은 헤드기들을 추가로 더하고 약간의 헤드 기들을 제거하고 그리고 충분한 상호작용을 위해 다시 한번 얻어진 프로브들을 아쎄이함으로써 변경될 수 있다. 결국, 가장 바람직한 헤드기들의 결합은 에피토프 형성 아미노산들과 같이 사용하기 위해 선택되고 동일시될 수 있다.

일례들

일례 1 - 대식세포 셀 라인에서 지질다당질(LPS)에 의해 자극받은 억제 TNF 분비물 내의 고리 올리고펩티드의 용량 반응

1. 구조로 이루어진 고리 올리고펩티드:

사이크로(-DF-S-Σ-R-DF-S-Σ-R-)는 용액상 고리화(solution-phase cyclisation)에 의해 행해진 메리필드 레진기저 기술(the Merrifield resin-based technique)을 바탕으로 하는 표준 방법들을 이용하여 합성되었다. 정화된 펩티드가 1mg/ml의 농도에서 증류수 내의 용액으로 준비되었다.

R, F 및 S는 에피토프 형성 아미노산을 나타내고 Σ는 연관 아미노산과 관계가 있는 연관 작용기를 나타내며, 여기서 연관 아미노산은 L-알파 아미노카르복실산이고 연관 작용기는 10개의 탄소원자를 포함한 곧은 지방족 사슬로 이루어진 측쇄 잔류물이다.

모든 아미노산들은 다른 것들이 지시되지 않는 한 L 폼 내에 있다.

모든 아미노산들은 펩티드 결합을 통해 연결된다.

2. J774A.1 세포들(대식세포 셀 라인)이 5x10⁵cells/ml/well(웰(well)당 1ml RPMI 1640 배양기)의 시딩 밀도(seeding density)에서 24-웰 군집 플레이트의 모든 웰들 내에 덮혀졌고(plated out), 5% CO₂/air 내의 37℃에서 밤새도록 배양되었다.

3. 다음 날, 1 단계에서의 용액이 50, 25, 12.5, 6.25 또는 3.125 ug/ml의 최종 농도를 가진 세 개의 웰 각각을 제공하기 위해서, 2 단계에 있는 세포를 함유한 15 웰들에 투여되었다. 나머지 웰들은 처리되지 않고 남겨졌다. 상기 플레이트는 37℃에서 추가적으로 4시간동안 배양되었다.

4. 지질다당질(E.coli 스트레인 0111 B4로부터)이 옥타펩티드 용액을 수용하는 웰들 뿐만 아니라 펩티드 없이 수용하는 세 개의 웰들에 첨가되었다. 지질다당질의 최종 농도는 0.625ug/ml이었다.

5. 상기 플레이트는 밤새 배양되었고, 다음 날 상층액(supernatant)들이 상업적인 ELISA 키트를 사용하여 TNF를 위해 아쎄이되었다.

펩티드의 농도(ug/ml) TNF 농도(pg/ml) 표준 편차

0 1780.09 136.49

3.125 1494.53 127.83

6.25 1346.20 45.84

12.5 1037.31 90.01

25.0 621.75 14.53

50.0 613.70 15.46

위의 표에 나타내어진 얻어진 결과들은 LPS에 의해 자극을 받은 억제 TNF 분비물 내에서 고리 올리고펩티드의 활성도가 관계된 용량을 증명한다.

일례 2 - 대식세포 셀 라인에서 콜레라 독소 B(CTB) 분절(fragment)에 의해 자극을 받은 억제 TNF 분비물 내 가변 연관 작용기를 가진 고리 올리고펩티드의 효과

1. 고리 올리고펩티드가 다음의 구조로 준비되었다:

사이크로(-DF-R-Σ₁₀-S-DF-R-Σ₁₀-S-)

사이크로(-DF-S-Σ₁₀-R-DF-S-Σ₁₀-R-)

사이크로(-DF-R-Σ₄-S-DF-R-Σ₄-S-)

사이크로(-DF-S-Σ₄-R-DF-S-Σ₄-R-)

여기서, S, F 및 R은 에피토프 형성 아미노산을 나타내고, Σ는 연관 아미노산과 관계가 있는 연관 작용기를 나타내며, 여기서 Σ₁₀은 아미노카르복실산인 레이세미의(racemic) 연관 아미노산을 나타내고, 상기 연관 작용기는 가지없는 -C₁₀H₂₁로 이루어진 측쇄 잔류물이고, Σ₄는 노르류신(norleucine)을 지시하고, 여기서 상기 연관 작용기는 네 개 탄소원자의 측쇄이다.

상기의 고리 올리고펩티드가 5mg/ml의 농도에서 트랜스큐톨(transcutol) 내의 용액으로 준비되었고, 그 다음 증류수를 첨가함으로써 1mg/ml의 농도로 희석되 었다.

2. J774A.1 세포들(대식세포 셀 라인)이 3x10⁵cells/ml/well(웰(well)당 1ml RPMI 1640 배양기)의 시딩 밀도(seeding density)에서 24-웰 군집 플레이트의 모든 웰들 내에 덮혀졌고(plated out), 5% CO₂/air 내의 37℃에서 밤새도록 배양되었다.

3. 다음 날, 1 단계에서의 용액이 12.5ug/ml의 최종 농도를 가진 세 개의 웰 각각을 제공하기 위해서, 2 단계에 있는 세포를 함유한 12 웰들에 투여되었다. 나머지 웰들은 처리되지 않고 남겨졌다.상기 플레이트는 37℃에서 추가적으로 4시간동안 배양되었다.

4. 콜레라 독소 B(CTB) 분절(fragment)이 옥타펩티드 용액을 수용하는 웰들 뿐만 아니라 펩티드 없이 수용하는 세 개의 웰들에 첨가되었다. 콜레라 독소 B 분절의 농도는 10ug/ml이었다.

다음 표에 나타내어진 얻어진 결과들은 연관 작용기와 같이 가지없는-C₁₀H₂₁를 구성하는 긴사슬 탄화수소 측쇄들의 존재가 콜레라 독소 B 분절에 의해 자극을 받은 억제 TNF 분비물 내에서 고리 올리고펩티드의 활성도를 불러 일으키는 것을 증명하였다. 상기 연관 작용기가 단지 네 개의 탄소의 사슬 길이를 가진 고리 올리고펩티드는 임의의 억제 활성도를 가지지 못한다.

펩티드 TNF 농도(pg/ml) 표준 편차

배지(medium) 제어 67.5 6.7

사이크로(-DF-R-Σ₁₀-S-DF-R-Σ₁₀-S-)+CTB 268.5 17.9

사이크로(-DF-S-Σ₁₀-R-DF-S-Σ₁₀-R-)+CTB 85.7 13.6

사이크로(-DF-R-Σ₄-S-DF-R-Σ₄-S-)+CTB 664.4 57.1

사이크로(-DF-S-Σ₄-R-DF-S-Σ₄-R-)+CTB 621.1 25.3

CTB 단독 690.8 58.6

일례 3 - 대식세포 셀 라인에서 지질다당질(LPS)에 의해 자극을 받은 억제 TNF 분비물 내의 연관 아미노산의 입체 화학적 형상 및 가변 에피토프 형성 아미노산을 가진 고리 올리고펩티드의 효과

1. 고리 올리고펩티드가 다음의 구조로 준비되었다:

사이크로(-DF-S-Σ_L-R-DF-S-Σ_L-R-)

사이크로(-DF-S-Σ_L-R-DF-S-Σ_D-R-)

사이크로(-DF-S-Σ_D-R-DF-S-Σ_D-R-)

사이크로(-DF-R-Σ_L-S-DF-R-Σ_L-S-)

사이크로(-DF-R-Σ_L-S-DF-R-Σ_D-S-)

사이크로(-DF-R-Σ_D-S-DF-R-Σ_D-S-)

여기서, F, S 및 R은 에피토프 형성 아미노산이고, Σ_L은 연관 작용기가 상기 연관 작용기가 가지없는 -C₁₀H₂₁로 이루어진 측쇄 잔류물인 L-알파 아미노카르복실산인 연관 아미노산을 나타내며; Σ_D는 연관 작용기가 상기 연관 작용기가 가지없는 -C₁₀H₂₁로 이루어진 측쇄 잔류물인 D-알파 아미노카르복실산인 연관 아미노산을 나타낸다. 상기의 고리 올리고펩티드가 1mg/ml의 농도에서 증류수 내의 용액으로써 준비되었다.

3. 다음 날, 1 단계에서의 용액이 50ug/ml의 최종 농도를 가진 세 개의 웰 각각을 제공하기 위해서, 2 단계에 있는 세포를 함유한 18 웰들에 투여되었다. 나머지 웰들은 처리되지 않고 남겨졌다.상기 플레이트는 37℃에서 추가적으로 4시간동안 배양되었다.

4. 지질다당질(E.coli 스트레인 0111 B4로부터)이 옥타펩티드 용액을 수용하는 웰들 뿐만 아니라 펩티드 없이 수용하는 세 개의 웰들에 첨가되었다. 지질다당 질의 농도는 1.25ug/ml이었다.

아래 표에 나타내어진 얻어진 결과들은, R-DF-S 내의 아미노산을 함유하는 고리 올리고펩티드가 LPS에 의해 자극을 받은 억제 TNF 분비물 내에서 높은 활성도를 가지며, 가지없는-C₁₀H₂₁를 구성하는 측쇄 잔여물인 연관 작용기를 가진 L-알파 아미노산카르복실산인 하나 이상의 연관 아미노산의 존재가 다른 연관 아미노산이 L 또는 D폼에서 동일한 아미노카르복실산인 것을 필요로 하는 것을 증명한다.

펩티드 TNF 농도(pg/ml) 표준 편차

LPS 단독 1861.9 108.7

사이크로(-DF-S-Σ_L-R-DF-S-Σ_L-R-)+LPS 865.4 68.1

사이크로(-DF-S-Σ_L-R-DF-S-Σ_D-R-)+LPS 987.1 16.1

사이크로(-DF-S-Σ_D-R-DF-S-Σ_D-R-)+LPS 1438.0 32.6

사이크로(-DF-R-Σ_L-S-DF-R-Σ_L-S-)+LPS 1990.4 n/a

사이크로(-DF-R-Σ_L-S-DF-R-Σ_D-S-)+LPS 1625.2 59.6

사이크로(-DF-R-Σ _D -S-DF-R-Σ _D -S-)+LPS 1573.3 45.0

상기 발명의 고리 올리고펩티드에 대한 사이클로덱스트린의 결합은 여러가지 올리고펩티드들의 소수성 부분들 사이의 상호작용의 수준을 감소시키는데 도움을 주고, 따라서 거대한 무리의 형성을 방지하며, 상기와 같은 거대한 무리들 내의 에피토프들의 입체 장애때문에 단량체 또는 소중합체와 비교하여 감소될 수 있다.

일례 4 - 하이드로옥시프로필(hydroxypropyl) 베타 사이클로덱스트린으로 공식화되고, 넒은 범위의 사이클로덱스트린 농도를 넘어서 대식세포 셀 라인에서 지질다당질(LPS)에 의해 자극받은 억제 TNF 분비물 내의 에피토프 형성 아미노산 R- _D F-S로부터 형성된 에피토프들을 함유하는 내부로 구속된 고리 올리고펩티드의 효과와 관계된 용량

1. 구조 사이크로(-_DF-S-Σ-R-_DF-S-Σ-R-)는 5mg/ml의 농도에서 트랜스큐톨 내의 용액으로 준비되었고, 여기서, Σ는 L-알파 아미노카르복실산과 같은 연관 아미노산을 나타내고 연관 작용기는 10개의 탄소원자를 포함한 곧은 지방족 사슬로 이루어진 측쇄 잔류물과 같은 연관 아미노산을 가진다

2. 1 단계에서 6개 개별 할수(aliquot)의 200ul의 용액이 새로운 8ml 작은병들로 이동되었고, 증류수 내에서 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 또는 1.5625mg/ml 농도에서 하이드로옥시프로필(hydroxypropyl) 베타 사이클로덱스트린의 용액의 800ul와 함께 느린 와동(渦動)으로 혼합되었다.

3. 다음 날, 1 단계에서의 용액이 8, 4 또는 2ug/ml의 최종 농도를 가진 세 개의 웰 각각을 제공하기 위해서, 2 단계에 있는 세포를 함유한 웰들에 대하여 적절한 부피로 투여되었다. 나머지 웰들은 처리되지 않고 남겨졌다. 상기 플레이트는 37℃에서 추가적으로 4시간동안 배양되었다.

아래 표에 나타내어진 얻어진 결과들은 LPS에 의해 자극을 받은 억제 TNF 분비물 내에서 올리고펩티드의 활성도가 관계된 용량을 증명한다.

펩티드의 농도 중량으로 펩티드에 대한 TNF 농도 표준

(ug/ml) 사이클로덱스티린의 비율 (pg/ml) 편차

0 - 2519.3 64.4

2 40 2450.2 61.2

2 20 2223.9 37.4

2 10 2278.3 89.4

2 5 2177.2 110.9

2 2.5 2314.2 101.8

2 1.25 2161.8 94.7

4 40 1646.5 98.4

4 20 1488.1 16.6

4 10 1474.8 80.6

4 5 1477.5 33.2

4 2.5 1538.7 80.4

4 1.25 1599.9 106.4

8 40 1276.9 106.5

8 20 1298.4 17.3

8 10 1218.7 20.6

8 5 1140.6 34.5

8 2.5 1105.7 35.9

8 1.25 1130.9 71.8

상기 결과들은 사이클로덱스트린을 가진 옥타펩티드의 형성은 조직배양 웰 내에 2ug/ml의 농도 아래로 상당한 억제의 TNF 분비물을 제공하며, 그리고 억제가 40:1 wt:wt 하향으로부터의 범위인 넓은 범위의 사이클로텍스트린 농도를 넘어서 성취되었음을 증명하였다.

일례 5 - 하이드로옥시프로필(hydroxypropyl) 베타 사이클로덱스트린으로 공식화되고, 쥐(rat)들에서 지질다당질(LPS)에 의해 자극받은 억제 TNF 분비물 내의 에피토프 형성 아미노산 R- _D F-S로부터 형성된 에피토프들을 함유하는 내부적으로 구속된 고리 올리고펩티드의 효과

1. 구조 사이크로(-_DF-S-Σ-R-_DF-S-Σ-R-)로 이루어진 고리 올리고펩티드, 여기서, Σ는 L-알파 아미노카르복실산과 같은 연관 아니모산을 나타내고 연관 작용기는 10개의 탄소원자를 포함한 곧은 지방족 사슬로 이루어진 측쇄 잔류물과 같은 연관 아미노산을 가지며, 일례 4에 기술된 바와 같이 트랜스큐톨 및 하이드로옥시프로필 베타 사이클로덱스트린 내의 용액으로서 준비되고, 여기서 펩티드의 농도는 1mg/ml이었고, 사이클로덱스트린의 최종 농도는 40mg/ml이었다.

2. 250g의 무게의 쥐들에 1ml의 펩티드 용액(쥐 한마리당 1mg 펩티드)이 주입되었다. 제2 그룹의 쥐들은 펩티드가 함유되어 있지 않은 1mg/ml의 트랜스큐톨/사이클로덱스트린이 주입되었다. 한 시간 후, 상기 쥐들에는 1mg의 지질다당질(살모넬라 유산 등(Salmonella abortus equi)으로부터)이 추가로 주입되었다.

3. 150분 후, 혈액 샘플들이 취해졌고, TNF 수준이 ELISA에 의해 두 개의 그룹으로 측정되었다. 아래 표에 나타내어진 결과들은, 상기 펩티드가 자극에 응답하여 세포들을 통해 TNF 생성을 억제할 수 있고 75% 이상의 감소를 제공할 수 있게 한다.

운반체 펩티드

TNF(pg/ml) 10717 2370

SD 6635 1871

그룹당 보통 동물(No of animals) 3 5

일례 6 - 코팍손(copaxone)(글라티라머 아세테이트)의 고리 유사체에 의해 TNF 분비물의 억제

1. 두 개의 고리 올리고펩티드가 다음과 같은 구조로 준비되었다:

사이크로(-A-K-Σ-Y-E-K-A-Σ-E-Y-)

사이크로(-A-K-Σ-E-Y-K-A-Σ-Y-E-)

모든 아미노산들은 다른 것들을 지시하지 않는 한 L폼 내에 있다.

모든 아미노산들은 펩티드 결합을 통해 연결된다.

A, K, Y 및 E는 에피토프 형성 아미노산을 나타내고 Σ는 연관 아미노산과 관계가 있는 연관 작용기를 나타내며, 여기서 연관 아미노산은 L-알파 아미노카르복실산이고 연관 작용기는 10개의 탄소원자를 포함한 곧은 지방족 사슬로 이루어진 측쇄 잔류물이다.

상기 고리 올리고펩티드들이 10mg/ml의 농도에서 불화이소프로판올(hexafluoro isopropanol,HFIP) 내의 용액으로 준비되었고, 그 다음 50mg/ml의 농도에서 하이드로옥시프로필 베타 사이클로덱스트린을 함유한 HFIP 용액의 등부피로 혼합되었다. 그 다음 상기 유기 용액은 질소로 탈수 되었고, 그리고 1mg/ml의 고리 올리고펩티드의 최종 농도를 제공하기 위해서 펩티드/사이클로덱스트린 복합 물이 증류수 내에 재용해되었다.

3. 다음 날, 1 단계에서의 용액이 12.5ug/ml의 최종 농도를 가진 세 개의 웰 각각을 제공하기 위해서, 2 단계에 있는 세포를 함유한 웰들에 투여되었다. 또한 62.5ug/ml에서 사이클로덱스트린 단독을 포함한 추가 웰들이 준비되었다. 상기 플레이트는 37℃에서 추가적으로 4시간동안 배양되었다.

4. 지질다당질(E.coli 스트레인 0111 B4로부터)이 고리 올리고펩티드 용액을 수용하는 웰들 뿐만 아니라 펩티드 없이 수용하는 세 개의 웰들에 첨가되었다. 지질다당질의 최종 농도는 0.1ug/ml이었다.

펩티드의 농도(12.5ug/ml) LPS TNF 농도(pg/ml) 표준 편차

사이크로(-A-K-Σ-Y-E-K-A-Σ-E-Y-) + 486.9 33.5

사이크로(-A-K-Σ-E-Y-K-A-Σ-Y-E-) + 928.8 72.7

사이클로덱스트린 단독 + 622.3 22.9

배지+LPS + 637.6 26.0

배지 제어 - 50.8 9.0

표에 나타내어진 얻어진 결과들은, 하나 그러나 둘이 아닌 상기 고리 올리고펩티드들은 LPS에 의해 자극받아진 억제 TNF 분비물 내에 효과를 미치는 것이 증명되었다. 따라서, 각 도메인 내의 아미노산들의 시이퀀스는 올리고펩티드의 생물학적 활성도에 관한 효과를 가진다. 사이크로(-A-K-Σ-Y-E-K-A-Σ-E-Y-)는 코팍손과 같이 동일한 아미노산들(무질서한 형상은 제외)을 포함하고 대식세포에 의해 TNF 분비물에 대하여 동일한 효과를 나타내기 대문에 다수의 경화증을 치료하는데 유용하다.

일례 7 - 트롬빈(thrombin)의 효소활성의 억제

1. 다음과 같은 구조의 고리 올리고펩티드들은 이전에 설명된 바와 같이 합성되었고, 일례 6에 약술된 절차를 이용하여 행크 평형염용액(Hanks Balanced Salts Solution)에 관하여 1mg/ml의 농도에서 사이클로덱스트린과 함께 복합 형태로 준비되었다.

(ⅰ) 사이크로(-R-E-Σ-S-R-E-R-Σ-S-E-)

(ⅱ) 사이크로(-A-K-Σ-E-Y-K-A-Σ-T-E-)

(ⅲ) 사이크로(-dF-R-C-S-dF-R-C-S-)

(ⅳ) 사이크로(-dF-S-C-R-dF-S-C-R-)

모든 아미노산들은 펩티드 결합을 통해 연결된다.

여기서, R, E, S, Y, K 및 A는 에피토프 형성 아미노산을 나타내고 Σ는 연관 아미노산과 관계가 있는 연관 작용기를 나타내며, 여기서 연관 아미노산은 L-알파 아미노카르복실산이고 연관 작용기는 10개의 탄소원자를 포함한 곧은 지방족 사슬로 이루어진 측쇄 잔류물이이고, C는 시스테인을 나타내며, 여기서, 각 링 내의 시스테인은 내부 간교(internal bridge)를 형성하기 위해 산화된다.

2. 394-웰 마이크로플레이트의 웰들 내에, 20ul의 트롬빈 용액(0.01mg/ml)이 투여되었고, 60ul의 고리 올리고펩티드 용액과 혼합되었다.

3. 20ul의 기질 boc-beta-벤질-Asp-Pro-Arg-7-아미도-4-메틸쿠마린 하이드로클로라이드(0.01mg/ml)가 웰 각각에 첨가되었고, 기질 발생의 타임 코스가 측정되었다.

4. 아래 표에 나타내어진 결과들로부터, 연구된 고리 올리고펩티드들은 트롬빈 단백질분해 활성도를 억제하는데 있어서 차별적인 영향을 미치며, 상기의 차별적인 활성들은 링 내에 포함된 아미노산들의 결합 및 성질과 관계된다. 이는 아미노산들을 정확하게 선택하면, 구속된 고리 올리고펩티드 모형을 바탕으로 하는 구조들이 효소의 활성도에 관하여 상당한 영향을 발휘하기 위해서 충분히 경직되게 만들어질 수 있게 한다.

따라서, 트롬빈 단백질분해 활성도를 억제하는 효과를 가진 본 발명에 따른 고리 올리고펩티드들은 프로테아제 활성도가 심장혈관계 질환, 순환계 질환 및 HIV를 포함하는 악화 요소인 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

트롬빈 단백질분해 활성도의 억제

(형광 유닛-임의 유닛)

시간(분) 제어(효소 단독) (ⅰ) (ⅱ) (ⅲ) (ⅳ)

2.0 770.9 410.8 410.8 634.5 523.2

5.0 1821.1 816.4 816.4 1368.8 1205.3

10.0 2163.5 1189.4 1189.4 1786.9 1586.9

15.0 2253.2 1398.6 1398.6 1980.7 1751.7

20.0 2345.8 1592.1 1592.1 2107.4 1843.1

25.0 2359.0 1673.2 1673.2 2159.7 1864.8

상기 표에서는 약간의 고리 올리고펩티드들이 각 도메인 내의 아미노산들의 질서에 의존하여 다른 것들보다 더 큰 활성도를 가지는 것을 보였다.

일례 8 - 두 개의 다른 에피토프를 포함한 고리 올리고펩티드들에 의한 TNF 분비물의 억제

사이크로(-dF-S-Σ-Q-dL-S-Σ-R-)

사이크로(-dF-S-Σ-L-dQ-S-Σ-R-)

모든 아미노산들은 펩티드 결합을 통해 연결된다.

여기서, Q, L, S, R 및 F는 에피토프 형성 아미노산을 나타내고 Σ는 연관 아미노산과 관계가 있는 연관 작용기를 나타내며, 여기서 연관 아미노산은 L-알파 아미노카르복실산이고 연관 작용기는 10개의 탄소원자를 포함한 곧은 지방족 사슬로 이루어진 측쇄 잔류물이다.

상기 고리 올리고펩티드들이 1mg/ml 펩티드의 최종 농도 및 20mg/ml에서 사이클로덱스트린을 제공하기 위해서, 일례 4에 개시된 바와 같은 트랜스큐톨/사이클로덱스트린 내의 용액으로서 준비되었다.

2. J774A.1 세포들(대식세포 셀 라인)이 3x10⁵cells/ml/well(웰(well)당 1ml RPMI 1640 배양기)의 시딩 밀도(seeding density)에서 세 개의 24-웰 군집 플레이트의 모든 웰들 내에 덮혀졌고(plated out), 5%CO₂/air 내의 37℃에서 밤새도록 배양되었다.

3. 다음 날, 1 단계에서의 용액이 고리 올리고펩티드의 50, 25, 12.5, 6.25 및 3.125ug/ml의 최종 농도를 가진 세 개의 웰 각각을 제공하기 위해서, 2 단계에 있는 세포를 함유한 웰들에 투여되었다. 또한 1, 0.5, 0.25, 0.125 및 0.0625ug/ml에서 사이클로덱스트린을 포함한 추가 웰들이 준비되었다. 나머지 웰들은 처리되지 않고 남겨졌다. 상기 플레이트는 37℃에서 추가적으로 4시간동안 배양되었다.

4. 지질다당질(E.coli 스트레인 0111 B4로부터)이 올리고펩티드 용액을 수용하는 웰들 뿐만 아니라 펩티드 없이 수용하는 세 개의 웰들에 첨가되었다. 지질다당질의 최종 농도는 0.1ug/ml이었다.

아래 표에 나타내어진 얻어진 결과들은, 하나가 F, R 및 S 아미노산으로 구성되는 두 개의 비동일 에피토프를 포함하는 고리 올리고펩티드들이 용량 의존 방법에서 J774 세포들로부터 TNF 분비물을 하향조절할 수 있게 된다.

TNF 농도(pg/ml)

펩티드의 농도(ug/ml) 배지제어 (ⅰ) (ⅱ) 사이클로덱스트린

0 27+3 2856* 2856* 2856*

3.125 2856* 2648±43 2856*

6.25 1595±64 1748±20 2856*

12.5 1595±64 1748±20 2856*

25 1341±50 1437±85 2376±21

50 843±42 1081±142 2225±51

* 최대 검출가능한 한계보다 더 높게 판독

본 발명에 따른 고리 올리고펩티드는 다양한 질병을 치료하기 위한 약제, 예방 또는 진단으로서 사용하는 것을 가능하게 한다.

Claims

내부로 구속된 고리 올리고펩티드에 있어서,

표적 리간드에 특별하게 결합하기 위한 6개 이상의 아미노산의 링을 포함하고,

상기 링은 다수 개의 아미노산 도메인을 포함하고, 각 도메인은 2개 이상의 에피토프 형성 아미노산, 및 하나 이상의 고리내 연합(intra-cyclic association)을 형성하도록 배치된 2개 이상의 연관 작용기를 포함하고; 상기 고리 올리고펩티드는 상기 에피토프 형성 아미노산이 각 도메인에서 에피토프를 형성하게 하고 각 에피토프가 표적 리간드에 특별하게 결합할 수 있도록 단일 입체형태(conformation)로 구속되는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제1항에 있어서, 상기 도메인은 세 개의 에피토프 형성 아미노산을 포함하며, 상기 세개의 에피토프 형성 아미노산은 교번 입체화학적 형상을 가지는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아미노산은 아미노산들, 아미노산 유사체들 또는 그의 D-폼들을 자연스럽게 발생하는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연관 작용기들 사이의 하나 이상의 고리내 연합들은 공유인 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제4항에 있어서, 상기 연관 작용기들은 이황 가교에 의해 결합된 시스테인들에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연관 작용기들 사이의 하나 이상의 고리내 연합들은 비공유인 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제6항에 있어서, 상기 연관 작용기들 사이의 하나 이상의 고리내 연합들은 소수성인 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 연관 작용기는 도메인들 사이에 배치되는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제8항에 있어서, 상기 연관 작용기에 인접한 각 에피토프 형성 아미노산은 인접한 연관 작용기와 같이 동일한 입체화학적 형상을 가지는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에피토프들은 동일한 것을 특 징으로 하는 고리 올리고펩티드.
선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연관 작용기들은 연관 아미노산들에 영향을 받는(borne on) 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연관 작용기는 지질 아미노산인 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제12항에 있어서, 상기 지질 아미노산과 결합되는 하나 이상의 연관 작용기는 C₈-C₂₀ 선형 탄화수소 측쇄인 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제12항에 있어서, 상기 선형 탄화수소 측쇄는 C₁₀-C₁₆ 선형 탄화수소 측쇄인것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서,

다음과 같은 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.

A, B, C, X, Y 및 Z는 에피토프 형성 아미노산을 나타내고; A 및 X는 D 아미노산을 나타내며 B, C, Y 및 Z는 L 아미노산을 나타내고, 또는 A 및 X는 L 아미노산을 나타내며 B, C, Y 및 Z는 D 아미노산을 나타내고; 하나의 에피토프는 도메인 C-A-B로부터 형성되고 하나의 에피토프는 도메인 Z-X-Y로부터 형성되고; 및 각 Σ는 연관 아미노산을 나타냄.
제15항에 있어서, 상기 Z-X-Y 도메인 및/또는 상기 C-A-B 도메인은 아미노산 시이퀀스들 RFS, RSF, FSR, FRS, SRF, SFR, QLS, QSL, SQL, SLQ, LQS 또는 LSQ로부터 선택되며, 각 Σ는 길이에 있어서 8과 20 탄소 사이의 탄화수소 사슬을 포함하는 선형 탄화수소 측쇄 연관 작용기를 가진 지질 아미노산인 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제16항에 있어서, 상기 Z-X-Y 도메인 및/또는 상기 C-A-B 도메인은 TNF 분비 물을 억제할 수 있는 에피토프를 형성하는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연관 작용기들은 고리 올리고펩티드 내에 펩티드 결합의 질소 원자들에 영향을 받는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제18항에 있어서,

다음과 같은 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.

A, B, C, X, Y 및 Z는 에피토프 형성 아미노산을 나타내고; 하나의 에피토프는 도메인 C-A-B로부터 형성되고 하나의 에피토프는 도메인 Z-X-Y로부터 형성되고; 및 각 N은 B-Z와 C-Y 사이에서 펩티드 결합의 질소를 나타내며 각 Φ는 질소를 통해 부착된 연관 작용기를 나타냄.
제19항에 있어서, 상기 Z-X-Y 도메인 및/또는 상기 C-A-B 도메인은 아미노산 시이퀀스들 RFS, RSF, FSR, FRS, SRF, SFR, QLS, QSL, SQL, SLQ, LQS 또는 LSQ로부 터 선택되며, 각 Φ는 길이에 있어서 8과 20 탄소 사이의 지방족탄화수소 사슬을 나타내는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제16항 또는 제20항에 있어서, 상기 Z-X-Y 도메인은 RFS인 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 Z-X-Y 도메인 및 상기 C-A-B 도메인 각각은 TNF 분비물을 억제할 수 있는 에피토프를 형성하는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제21항 또는 제22항에 있어서, 페닐알라닌(phenylalanine)은 D 입체형상이고 세린은 L 입체형상이고, 아르기닌은 L 입체형상이며, 각 지질 아미노산이 L 입체형상인 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제15항 내지 제17항 또는 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 C-A-B는 상기 도메인 Z-X-Y와 동일한 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고리 올리고펩티드는 두 개의 도메인을 포함하고, 에피토프는 각 도메인 내에서 세 개의 에피토프 형성 아미노산으 로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제25항에 있어서, 상기 올리고펩티드는 두 개의 연관 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제1항 내지 제14항 또는 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고리 올리고펩티드는 세 개의 도메인을 포함하고, 에피토프는 각 도메인 내에서 세 개의 에피토프 형성 아미노산으로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제27항에 있어서, 상기 올리고펩티드는 세 개의 연관 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제1항, 제3항 내지 제14항 또는 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고펩티드는 두 개의 도메인을 포함하고, 에피토프는 각 도메인 내에서 네 개의 에피토프 형성 아미노산으로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제29항에 있어서,

다음과 같은 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.

A, B, C, D, W, X, Y 및 Z는 에피토프 형성 아미노산들을 나타내고; 하나의 에피토프는 도메인 D-C-A-B로부터 형성되고 하나의 에피토프는 도메인 Z-X-Y-W로부터 형성되고; 및 각 Σ는 연관 아미노산을 나타냄.
제30항에 있어서, 상기 Z-X-Y-W 도메인 및/또는 D-C-A-B 도메인은 아미노산 시이퀀스들인 YEKA, YEAK, YAKE, YAEK, YKAE, TKEA, EYKA, EYAK, EKAY, EKYA, EAKY, EAYK, KAYE, KAEY, KYAE, KYEA, KEAY, KEYA, AKEY, AKYE, AYEK, AYKE, AEYK 또는 AEKY로부터 선택되고, 각 Σ는 길이로 8과 20 탄소들 사이에서 탄화수소 사슬을 포함하는 선형 탄화수소 측쇄 연관 작용기를 가진 지질 아미노산인 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제31항에 있어서, 상기 Z-X-Y-W 도메인은 YEKA이고, 상기 D-C-A-B 도메인은 EYAK인 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 Z-X-Y-W 도메인 및/또는 상기 D-C-A-B 도메인은 단백분해효소 활성도를 억제할 수 있는 에피토프를 형성하는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제29항에 있어서,

다음과 같은 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.

A, B, C, D, W, X, Y 및 Z는 에피토프 형성 아미노산들을 나타내고; 하나의 에피토프는 도메인 D-C-A-B로부터 형성되고 하나의 에피토프는 도메인 Z-X-Y-W로부터 형성되고; 및 각 N은 B-Z와 C-Y 사이에서 펩티드 결합의 질소를 나타내며 각 Φ는 질소를 통해 부착된 연관 작용기를 나타냄.
제34항에 있어서, 상기 Z-X-Y-W 도메인 및/또는 D-C-A-B 도메인은 아미노산 시이퀀스들인 YEKA, YEAK, YAKE, YAEK, YKAE, TKEA, EYKA, EYAK, EKAY, EKYA, EAKY, EAYK, KAYE, KAEY, KYAE, KYEA, KEAY, KEYA, AKEY, AKYE, AYEK, AYKE, AEYK 또는 AEKY로부터 선택되고, 각 Φ는 길이로 8과 20 탄소들 사이에서 지방족탄화수 소 사슬을 나타내는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제35항에 있어서, 상기 Z-X-Y-W 도메인은 YEKA이고, 상기 D-C-A-B 도메인은 EYAK인 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 Z-X-Y-W 도메인 및 상기 D-C-A-B 도메인각각은 단백분해효소 활성도를 억제할 수 있는 에피토프를 형성하는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 D-C-A-B는 상기 도메인 Z-X-Y-W와 동일한 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드.
약제, 예방 또는 진단으로서 사용하기 위한 선행하는 항 중 어느 한 항에 따른 고리 올리고펩티드.
TNF가 악화 요소인 질병을 치료하기 위한 약제 제조용의 제17항 또는 제22항에 따른 고리 올리고펩티드의 용도.
제40항에 있어서, 상기 질병은 암, 비만증, 심장병 환자, 자기면역 질환 및 염증성 질환으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드의 용도.
제41항에 있어서, 상기 질병은 류머티즘성 관절염, 다발 경화증 및 크론 질병으로부터 선택된 자기면역 질환인 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드의 용도.
단백분해효소 활성도가 악화 요소인 질병을 치료하기 위한 약제 제조용의 제33항 또는 제37항에 따른 고리 올리고펩티드의 용도.
제43항에 있어서, 상기 질병은 심장혈관계 질환, 순환계 질환 및 HIV로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고리 올리고펩티드의 용도.
제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 고리 올리고펩티드 및 약제학적으로 수용할 수 있는 부형제 및/또는 항원보강제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
제45항에 있어서, 상기 부형제는 트랜스큐톨(transcutol), 폴로사머 블록-공중합체(poloxamer block-copolymer), 사이클로덱스트린, 비이온의 표면활성제(non-ionic surfactant) 또는 담즙염으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 비이온의 표면활성제는 폴리에틸렌 글리콜의 아실 에스테르들 또는 폴리에틸렌 글리콜의 지방성 에스테르들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 개시된 바와 같은 표적 리간드에 특별하게 결합하기 위한 고리 올리고펩티드 제조방법에 있어서,

ⅰ) 에피토프 형성 아미노산을 제공하는 단계; 및

ⅱ) 상기 에피토프 형성 아미노산과 결합시켜 고리 올리고펩티드를 제조하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 고리 올리고펩티드 제조방법.
제48항에 있어서,

(a) 헤드기들의 배열과 함께, 각 컨쥬게이트가 헤드기 및 테일기로 구성된 일세트의 컨쥬게이트를 선택하는 단계, 여기서 각 헤드기는 아미노산으로 구성됨;

(b) 상기 테일기가 소수성적으로 집합하고 컨쥬게이트들이 이동할 수 있는, 비공유 결합체를 형성하는 단계;

(c) 상기 비공유 결합과 표적 리간드 사이의 충분한 상호작용을 위해 아쎄잉(assaying)하는 단계;

(d) 헤드기들의 변경된 배열을 가진 일세트의 컨쥬게이트를 이용하여 (a) 내지 (c) 단계를 선택적으로 반복하는 단계; 및

(e) (a) 단계에서 에피토프 형성 아미노산과 같이 일세트의 컨쥬게이트의 헤 드기에 대한 아미노산들을 선택하는 (c)단계에서 충분한 상호작용을 조사하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 고리 올리고펩티드 제조방법.