KR20090074198A - 세포 클론을 선별하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 목적 단백질을 다량으로 생산하는 세포 클론을 선별하는 신규 방법에 관한 것이다. 하나의 방법에서, 단백질의 양은 세포가 최초로 계대되기 전에 측정된다. 다른 방법에서는 클래스 A 입자 부하량이 1m3당 100개 입자 미만인 무균 환경 조건 하에서 고 처리량 자동 플랫폼이 사용된다.
세포 클론 선별, 단백질 생산, 생산 세포주, FACS, HTRF
Description
본 발명은 세포 배양 기술 분야에 관한 것이다. 본 발명은 세포 클론을 선별하는 방법은 물론 이 방법에 의해 선별된 생산자 숙주 세포주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 기술된 선별 방법에 의해 수득된 세포를 이용하여 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 단백질, 특히 치료 단백질, 구체적으로 항체를 생산하는 포유동물 세포의 즉시-초기 고 처리량 선별(immediate-early high throughput screening)을 위한 자동화된 플랫폼(automated platform)에 관한 것이며, 이는 상기 세포가 처음으로 계대배양되기 전에 세포 클론을 선별함을 의미하는 것이다.
인체 치료법에 사용되는 생물약제학 시장은 고속으로 계속 성장하여, 270개의 새로운 생물약제가 임상 연구에서 평가받고 있고 2003년 추정 매출액이 300억이다(Werner 2004). 현재, 증가하는 수의 생물약제는 사람 단백질을 정확하게 프로세싱하고 변형시키는 능력 때문에 포유동물 세포에서 생산되고 있다. 따라서, 생물약 제를 진핵생물, 특히 포유동물 세포로부터 성공적이며 고 처리량으로 생산하는 것은 중요하며, 이는 이 방법에 사용되는 재조합 모노클로날 세포주의 특징에 달려있다. 또한, 치료용 단백질을 생산하는 상기 포유동물 세포주를 발생시키는 시간은 임의의 생물약제를 임상의에게 제공하는데 요구되는 시간의 필수적인 부분이다. 이러한 모든 관점을 종합해보면, 이러한 선별에서 수득되는 세포주의 질을, 특히 생산성 면의 질을 유지하면서 가능한 한 신속하게 신규 생산자 세포주를 선별하는 방법의 개발에 대한 요구는 절박한 상태이다.
일반적으로, 포유동물 생산 세포의 발생은 생물반응기에서 증식된 세포 집단이 유전적으로 가능한 한 균질하도록 하는 클로닝 단계를 필요로 한다. 한계 희석법은 모노클로날 세포주를 발생시키는 간단하고 확립된 방법이다. 하지만, 현탁 세포를 클로닝하는데 사용하는 경우에, 주된 부담은 단일 모세포에서 실제 유래하는 집단을 신뢰할 수 있게 얻기 위하여 희석 단계를 적어도 2회 반복해야 한다는 것이다. 바람직하고 신뢰할 수 있는 대안 방법은 모노클로날 포유동물 세포주를 발생시키는 형광 활성화된 세포 분류법(FACS)의 사용이다(WO2005019442).
통용되는 포유동물 생산 세포는 자신의 산물을 배양 배지로 구성적으로 분비한다. 세포 배양물에서 재조합 단백질의 함량을 검출 및 정량하는 가장 일반적인 방법은 IgG 타입 항체를 검출하는 ELISA법이다. ELISA는 매우 민감한 단백질 검출 및 정량을 제공하지만, 이 프로토콜은 일반적으로 시간 소모적이며 많은 단계를 포함한다. 이러한 특성은 이 분석 포맷이 자동화 및 고 처리량 선별에는 바람직하지 않게 만든다. ELISA를 대체하는 대안적인 다수의 방법이, 포유동물 세포 배양물에 존재하는 재조합 단백질 농도를 측정하는 분석법으로서 기술되었다(Baker et al., 2002). 하지만, 이들 중 대부분의 방법, 예컨대 광학적 바이오센서 또는 고속 크로마토그래피는 세포주 발생의 초기 단계에서 세포 배양 상청액을 고 처리량 선별하는데 아직까지 사용될 수 없다.
일반적으로, 치료용 단백질을 생산하는 신생 모노클로날 세포주의 특징은, 대사 파라미터, 산물 함량 및 산물 품질을 분석하기 위해 상청액으로부터 샘플을 취해야 한다는 점이다. 포유동물 세포의 배양 동안 분석할 샘플의 양 및 처리량을 증가시키기 위해 몇몇 접근법이 개시되었지만, 이러한 개념들은 세포가 처음 계대되기 전을 의미하는 클론 선별의 즉시-초기 단계에서 그러한 측정을 가능하게 하지 못했다(Lutkemyer et al., 2000). 사용된 표준 절차는 시간 소모적일뿐만 아니라 세포 배양 유지에 많은 노력과 이에 따른 비용이 요구된다.
따라서, 목적 단백질을 다량으로 발현하는 세포 클론을 선별하는 방법의 가속화 필요성은 여전히 남아 있다. 뿐만 아니라, 고 생산자 세포주를 발생시키는 방법의 가속화도 여전히 필요한 실정이다.
발명의 개요
이에, 본 발명자들은 세포가 처음 계대되기 전에 세포 클론을 선별하여 이 세포 클론으로 목적 단백질을 다량으로 발현하는 신규 방법을 설명한다. 또한, 본 발명자들은 무혈청 및/또는 화학적 제한 배지에서 치료용 항체와 같은 단백질을 생산하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 세포를 고속으로 고 처리량 선별하기 위한 신규 자동화 구성(set-up)을 기술한다. 이 구성은 FACS 기반 단일 세포 클로닝과 이에 연결된, 바람직하게는 96웰 플레이트에서 단일 세포로부터 증식된 모노클로날(CHO) 배양물 중의 단백질(항체) 함량을 검출하는 균일 시간분해 형광(HTRF®) 분석법과 같은 분석을 수행하는 자동 플랫폼 또는 로봇식 스테이션으로 이루어진다. 이러한 자동 선별 플랫폼의 효율적인 사용에 대한 핵심으로서, 본 발명자들은 추가로 화학적 제한 무혈청 배지에서 높은 클로닝 효율을 달성하기 위한 자가 지지세포(feeder cell)의 사용을 설명한다. 이 개념은 즉시-초기 클론 선별을 위한 최초의 자동화 플랫폼을 나타내는 바, 머지 않아 세포주 발생에 있어서 처리량을 증가시키는 필수 단계로서 작용할 것이다.
균일 시간분해 형광("HRTF®") 분석법은 균일하며, 민감하고, 다재다능하며, 재현성 있고, 안전하며 강력하다는 장점이 있다. 본 발명자들은 이 분석 포맷을 IgG 타입 항체의 검출을 위한 표준적인 시간소모적 ELISA 포맷 대신에 이용했다. 본 발명자들은 재조합 단백질 생산성에 대하여 새로 발생된 모노클로날 생산 세포주를 가장 빠른 가능한 선별을 할 수 있도록 설계했다. 이와 동시에, 데이터는 이 개념이 자동화를 통해 상기 즉시-초기 선별의 역량을 확대시킬 수 있는 방식을 입증해준다. 단일 장치는 10 내지 20일 내에 수천개의 클론을 선별할 수 있다.
이러한 관찰에 비추어, 여기에 기술되는 모노클로날 세포주 생산성에 대한 새로운 신속한(fast-track) 품질 평가는 신규 생산 세포주의 건실한 생산 절차를 확립시키는데 요구되는 급감된 개발 시간을 허용할 것이다.
단일 세포 클로닝 후 가장 빠른 가능한 선별 단계는 1차 모노클로날 세포 배양물의 분석인, 처음 계대되기 전에 세포주를 발생시키는 단일 세포 배양물인 1차 모노클로날 세포 배양물의 분석이며, 본 발명에서는 즉시-초기 선별이라고도 부른다. 이 배양물은 치료용 단백질을 생산하기 위한 1차 스톡(stock)으로서, 궁극적으로 마스터 세포 뱅크(MCB)를 만들 세포 배양물의 모 배양물이므로, 본 발명의 중대한 필요 조건은 전체 선별 절차 동안의 지속적인 무균성이다. 이것은 표적 선별과 같은 다른 목적에 사용된 자동 플랫폼을 이용하는 고 처리량 선별이 충족시키지 못하거나, 또는 적어도 이 정도까지는 아닌 주요 과제이다. 특정 층류형 후드 구조물은 자동 검출 및 선별 단계 동안 무균성을 보장하도록 사용되었고, 이것은 공기 1m3당 입자 100개 미만을 의미한다(무균 환경의 정의를 참조).
본 발명은 종래 기술로부터 자명하지 않다.
즉시-초기 선별을 의미하는, 계대 전에 세포 클론을 선별한다는 개념은 전에 기술된 적이 없으며, 특히 생물약제의 생산 숙주 세포주 선별과 관련하여 기술된 적은 전혀 없다. 세포 계대 이전에 이러한 선별을 적용하는 것은 미계대 세포가 배양 강건함에 관하여 매우 민감하기 때문에 자명한 것이 아니다. 더욱이, 이 단계에서 지원(back-up) 배양물이 없는 경우에는 그 배양물을 취급할 때 잠재적인 오염과 관련한 주의를 상당히 기울여야 한다. 이러한 미계대 세포가 클론 선별에 대한 패턴 관련성을 보유한 목적 단백질을 생산할 것이라는 점은 전혀 예상치 못한 것이었다(실시예 2 참조). 놀랍게도, 이러한 조건 하에서 생산된 단백질의 양은 단일 세포 클로닝 후에 수일(예컨대, 15일) 정도로 조기에 검출되기에 충분했다. 이러한 사실은 세포가 처음 계대되기 전에 클론을 선별할 수 있게 해주는 필수적인 것이다. 단일 세포 공급에 사용되는 용기, 예컨대 96웰 플레이트는 목적 단백질을 측정하기 전에 세포의 배양과 계대 동안에 일반적으로 사용되는 더 큰 용기와 동일한 확산 프로파일을 나타내지 않는다. 미계대 세포의 단백질 발현 프로파일은 세포 배양 파라미터가 비슷한 것은 아니지만, 뜻밖에 놀랍게도 배치(batch) 배양물 중의 세포 프로파일과 유사했다. 이 사실은 가장 일반적인 공정 포맷, 예컨대 치료용 단백질 배치 포맷 또는 배치 유래 포맷이 생산하는데 이용될 때 특히 유리하다. 임의의 클론 선별의 질은, 선별 동안 사용된 배양 포맷이 최종 생산 포맷을 대표하는 정도에 따라 매우 달라진다는 것에는 일반적으로 의견이 같다.
특히, 배치 배양물과 유사한 단백질 발현 프로파일이, 작은 용기, 특히 96웰 과 같은 멀티웰 용기에서, 심지어 멀티웰 용기의 진탕이나 회전 또는 내부 배양 배지의 교반 없이도 달성될 수 있다는 사실은 놀라운 것이다.
더욱이, 기술된 즉시-초기 클론 선별 개념에 의해 측정된 역가 곡선이, 항체와 같은 치료용 단백질의 높은 생산 속도 및 처리량에 대해, 새로 발생된 모노클로날 생산 세포주의 잠재력을 예측한다(개념증명)는 것을 확인할 수 있었다(실시예 3 참조). 기술된 즉시-초기 클론 선별법 데이터에 따른 클론의 랭킹은 MAT6 포맷에서의 씨드-스톡 배양물과 같은 "표준적" 세포 증량 후의 생산성 데이터와 높은 상관관계가 있다. 따라서, 데이터(도 5)는 기술된 즉시-초기 클론 선별 개념에 의해 측정된 역가 곡선이, 항체와 같은 치료용 단백질의 높은 생산 속도와 처리량에 대해, 새로 발생된 모노클로날 생산 세포주의 잠재력을 예측한다는 것을 입증한다.
포유동물 세포의 배양 동안에 샘플 채취와 샘플 관리의 자동화 개념은 문헌(Lutkemeyer et al., 2002)에 기술되어 있다. 하지만, 재조합 단백질의 생산성에 대하여 1차 모노클로날 세포 배양물을 허용한 개념은 전혀 없었다. 모노클로날 세포는 생존하기 위해 자신의 배양 배지를 조정해야만 하는 바, 일반적으로 1차 계대 전에 소량(예컨대, 500㎕, 300㎕ 또는 바람직하게는 200㎕)으로 배양되어야 한다. 이러한 새로운 모노클로날 배양물에 대한 확실한 자료를 얻기 위해, 배양 배지에 존재하는 산물의 구체적인 농도는 적어도 3회의 상이한 시점에서 정량되어야만 한다. 포유동물 세포 배양물의 경우에, 이러한 시점은 24시간 이상 차이가 있어야 한다. 세포 배양물에 부정적인 영향을 미치지 않기 위해, 각 시점마다 샘플의 부피는 초기 배양 부피의 2.5%(v/v)를 초과하지 않아야 한다. 따라서, 이러한 배양물로부터 샘플을 분리할 때의 엄격한 조건은 소량(<20㎕, <10㎕, <5㎕, 바람직하게는 0.2 내지 5㎕, 가장 바람직하게는 0.5 내지 2㎕)으로의 제한 및 산물 검출에 대한 높은 민감도(IgG 타입 항체의 경우 적어도 1mg/리터)이다. 바람직한 검출 범위는 1 내지 20mg/리터 또는 1 내지 10mg/리터이다. 이러한 소량의 취급은 고품질의 선별 과정에 필요한 정확도를 달성하기 위해 로봇식 피펫팅 플랫폼의 사용을 필요로 한다.
HTRF® 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 이 분석법은 균일하고, 민감하며, 다재다능하고, 재현성이 있으며, 안전하고 강력하여, 최근에 인기를 얻고 있다. HTRF® 분석 포맷이 현재 가장 많이 사용되고 있는 용도는 약물 선별 분야에서 이다(Mellor et al. 1998)(www.htrf-assays.com). 하지만, HTRF® 분석법에 관한 종래 기술의 문헌들은 단백질, 예컨대 재조합 단백질의 생산을 위한 숙주 세포주의 선별 또는 세포 클론 선별 방법에서의 사용가능성에 대하여 시사한 바가 전혀 없다.
도 1:
A) 세포 클론을 선별하기 위한 표준 방법의 모식도.
B) 세포주 개발에 있어서 즉시-초기 클론 선별을 위한 FACS와 로봇식 장치의 통합 모식도:
신규 모노클로날 세포주의 생산성에 대한 가장 빠른 가능한 선별은 FACS에 의해 공급된 단일 세포가 96웰에서 세포 집단으로까지 증식하는 동안에 수행한다. 이 개념은 일정한 간격으로 자동 역가 측정을 수행하는, 무균 장치로의 자동 96웰 항온배양기의 통합을 필요로 한다.
도 2:
96웰 및 384웰 분석 포맷에서 ELISA 및 HTRF®을 기반으로 한 항체 농도 측정의 비교:
IgG 타입 항체를 생산하는 CHO DG44 모노클로날 세포주는 96웰 플레이트에서 화학적 제한 무혈청 배지에서 배양했다. 상청액을 모아서 배양 배지에 존재하는 항체의 농도를 96웰 포맷에서의 샌드위치식 항 IgG ELISA 및 이와 동시에 96웰 및 384웰 분석 포맷에서의 HTRF로 측정했다. ELISA와 HTRF® 포맷에 사용된 2가지 항체는 동일한 기원에서 수득했다.
도 3
HTRF® 기반의 역가 측정을 위한 자동화 플랫폼의 도식적 개념:
단일 세포를 함유하는 96웰 플레이트는 FACS 장치로부터 자동 항온배양기로 이송된다. 소프트웨어는 항온배양기로부터 에어락(airlock)을 통해 무균 환경으로 이동되는 단독 플레이트의 이송을 계획한다. 배양 부피의 2.5%(v/v) 미만을 나타내는 샘플을 모든 상청액으로부터 채취하여 피펫팅 장치로 희석하면서 세포를 다시 항온배양기로 이송한다. 피펫팅 장치는 그 다음 384웰 플레이트에서 샘플과 HTRF® 시약을 혼합하고, 이를 항온배양을 위한 보관실로 이송한다. 2시간 후, 플레이트를 665nm 및 620nm에서의 측정을 위해 판독기로 이동시킨다. 샘플 추적은 바코드화된 플레이트와 바코드 판독기로 확인한다.
도 4
항온배양기에서의 증식 동안에 클론의 가장 빠른 가능한 선별.
CHO 세포주의 자동 HTRF® 기반 즉시-초기 선별에 의해 수득된 역가 곡선:
IgG 타입 4 치료용 항체를 발현하는 안정한 CHO 세포 풀(pool)을 FACS에 의 해 96웰에 단일 세포 공급하였다. 세포는 자동 항온배양기로 이송되었고 자동화된 역가 측정 프로그램은 단일 세포 분류 15일 후에 개시되었다. 항체 역가는 각 웰에서 3일마다 측정되었다.
도 5
자동 HTRF® 기반 즉시-초기 선별에 의한 클론의 선별, 및 즉시-초기 클론 선별과 MAT6 포맷에서의 씨드-스톡 배양물로부터의 생산성 데이터의 상관관계
A) IgG 생산 CHO 클론을 96웰 플레이트에 공급하고 클로닝 후 10일, 13일, 15일 및 17일째에 HTRF® 분석법으로 측정했다.
IgG 타입 1 치료용 항체를 발현하는 안정한 CHO 세포 풀을 FACS에 의해 96웰에 단일 세포 공급하였다. 세포는 자동 항온배양기로 이송하였고, 자동 역가 측정 프로그램은 단일 세포 분류 10일 후에 개시되었다. 항체 역가는 기술된 HTRF® 선별 플랫폼으로 각 웰에서 2 내지 3일마다 4회 측정했다.
각 선(상이한 농도의 회색)은 모노클로날 세포주를 각각 나타내는 단일 96웰의 역가 곡선을 나타낸다.
B) 역가에 의한 클론의 랭킹
이어서, 단일 세포 공급 후 17일째 클론을 취하여, 6웰 플레이트에서 증량시 키고 3회 계대 동안에 역가 측정을 수행했다. 즉시-초기 클론 선별(IECS)에 의해 선별된 클론의 역가를 MAT6 스케일에 의해 수득된 역가와 비교했다. IECS에서 높은 역가를 나타낸 클론은 MAT6 스케일에서도 높은 역가를 나타냈다. 특히, IECS에서 상위 클론으로 확인된 5개 클론 중 4개는 후속 MAT6 스케일 선별에서도 상위 클론으로 확인되었다.
표에서 짙은 회색으로 칠해진 셀은 상위 클론을 나타낸다.
"포함하는" 또는 "포함된"이란 일반적 양태는 "~로 이루어진"이란 더 구체적 양태를 포함한다. 또한, 단수 및 복수 형태는 한정하는 방식으로 사용된 것이 아니다. 본 발명의 과정에 사용된 용어들은 다음과 같은 의미를 나타낸다.
"즉시-초기"란, 용어는 모노클로날 배양이 여전히 1차 배양이고 아직 계대되지 않은, 모노클로날 세포주의 발생 동안의 시점을 의미한다. 즉, 단일 모 세포 클론을 바이알에 담고, 몇 번 분열하면, 아직 나누어지지 않은 모노클로날 세포 집단이 되었다. "즉시-초기"인 것으로 언급되고, 세포가 아직 계대되지 않은 시간의 기간은, 0 내지 60일, 바람직하게는 1 내지 60일, 더욱 바람직하게는 1 내지 30일 또는 5 내지 60일 또는 5 내지 30일 또는 5 내지 25일 또는 10 내지 25일, 가장 바람직하게는 14 내지 25일에 해당할 수 있다.
"1차 배양"이란 용어는 FACS 또는 한계 희석에 의해 단일 세포를 공급한 직후의 초기 배양 단계를 의미한다.
"모노클로날 세포주"는 모든 세포가 단일 모 세포에서 유래하는 세포주를 의미한다. 모노클로날 생산 세포주는 모든 세포가 단일 모세포에서 유래하는, 재조합 단백질을 생산하는 세포주를 의미한다.
"자동화"란 용어는 하나 이상의 단계가 수작업 없이 수행되는 것을 의미한다. 연속 운전은 컴퓨터 프로그램에 의해 예정된다.
"자동화 플랫폼"은 플랫폼에서 수행되는 과정이 완전 자동 또는 반자동인 여러 기구로 이루어진 플랫폼을 의미한다.
"멀티웰"은 여러 등가 배양 바이알, 보통 6개, 12개, 24개, 96개 또는 384개 웰로 이루어진 세포 배양 장치를 의미한다.
"무균" 또는 "무균 환경"이란 용어는 클래스 A 입자 부하량이 1m3당 100개 미만인 것으로 정의된다. 무균 환경은 바람직하게는 층류형 후드에 의해 생성된다.
항온배양기는 온도 37℃ +/- 5℃, CO2 함량 3 내지 12%, 바람직하게는 5 내지 10%에서의 세포, 바람직하게는 포유동물 세포의 항온배양을 위한 용기를 의미한다. 이 항온배양기는 세포 배양 바이알을 자동 플랫폼으로 순차 또는 예정된 제공 또는 이송을 가능케 하는 자동 항온배양기인 것이 바람직하다.
"형광 공명 에너지 전이"("FRET")은 2개의 형광단, 공여체와 수용체를 사용하는 방법을 의미한다. 에너지원(예: 플래시 램프 또는 형광계 레이저)에 의한 공여체의 여기(excitation)는 수용체와 소정의 근접 위치에 있다면 수용체쪽으로 에너지 전이를 촉발한다. 수용체는 결국 자신의 소정의 파장에서 광을 방출한다.
이러한 에너지 전이로 인해, 생체분자 간의 분자 상호작용은 각 파트너를 형광 표지에 커플링시킨 뒤, 에너지 전이의 수준을 검출하여 평가할 수 있다. 더욱 중요한 것은, 에너지 전이의 척도로서, 수용체 발광량을 미결합 복합체로부터 결합 복합체를 분리할 필요 없이 검출할 수 있다는 점이다.
"형광 공명 에너지 전이"("FRET")는 여기된 상태의 형광단 공여체가 자신의 여기 에너지를 쌍극자-쌍극자 상호작용을 통해 비방사성으로 이웃하는 발색단 수용체에게 이송할 수 있는 과정이다. 원칙적으로, 공여체 분자의 형광 방출 스펙트럼이 형광 수용체 분자의 흡광 스펙트럼과 중복된다면, 이들은 비방사성 쌍극자-쌍극자 상호작용을 통해 서로 에너지를 교환할 수 있다. 이러한 에너지 전달은 수용체의 존재 하에 공여체 형광의 반응 정지 및 수용체 형광의 증가된 발광에 의해 자명해진다. 에너지 전이 효율은 가장 중요하게는 공여체와 수용체 발색단을 분리하는 거리의 6승의 역수만큼 달라진다. 임계 거리는 소위 포스터(Forster) 거리(보통 10-100Å 사이)이다. 이 현상은 라벨 부착된 표본을 공여체의 최대 흡수(여기)에 대응하는 파장의 빛으로 여기시키고 수용체의 최대 방출에 대응하는 파장에서 방출된 광을 검출하거나, 또는 수용체의 존재 및 부재 하에 공여체의 형광 수명을 측정하여 검출할 수 있다. 공여체-수용체 분리에 있어서 에너지 전이 효율의 의존성은 세포 구성성분 상호작용의 연구시에 이 현상의 유용성의 바탕을 마련한다. FRET의 발생을 위해 존재해야 하는 조건은 다음과 같다: (1) 공여체가 형광성이어야 하고 수명이 충분히 길어야 하며; (2) 전이가 수용체에 의한 광의 실제 재흡수를 수반하지 않고; (3) 공여체 발색단과 수용체 발색단 사이의 거리가 비교적 가까워야 한다(보통 10 내지 50Å 사이)(Herman, 1998, Fluorescence Microscopy, Bios scientific publishers, Springer, 2nd edition, page 12).
시그날을 발생시킬 수 있는 또 다른 가능성은 소위 "생체발광성 에너지 전이"(BRET) 시스템으로 제공된다. 이 시스템은 문헌[Arai et al., 2001, Anal, Biochem. 289(1), 77-81]에 기술되어 있다. 상기 BRET 시스템도 본 발명에 사용될 수 있고, 이 시스템의 민감도는 FRET의 민감도보다 훨씬 높을 수 있다. 아라이(Arai) 등의 문헌에 제시된 예는 레닐라(Renilla) 루시퍼라제(Rluc) 및 증강된 황색 형광 단백질(EYFP)을 포함한다. 또한, 분자내 에너지 전이는 레닐라 루시퍼라제(Rluc)와 에쿼리아(Aequorea) "녹색 형광 단백질"(GFP) 사이에서 밝혀져 있다(Wang et al. 2002, Mol. Genet. Genomics 268(2), 160-8). 루시퍼라제 기질, 코엘렌터라진(coelenterazine)의 존재 하에, GFP 발광은 UV 여기없이 508nm의 파장에서 측정될 수 있다. 즉, 475nm(루시퍼라제) 및 508nm(GFP)에서 "이중 발광"을 측정할 수 있다. 또한, 체계적으로 변형된 란탄족 원소, 예컨대 Ru(II)-Os(II)에서 공여체 수용체 상호작용에 대해서도 기술되어 있다(Hurley & Tor, 2002, J.Am.Chem.Soc. 124(44), 1323-1324). 분석 결과, 포스터 쌍극자-쌍극자 에너지 전이 기전이 입증되었다.
"FACS"는 형광 활성화된 세포 분류법을 의미한다(Herzenberg LA, Sweet RG, Herzenberg LA. Fluorescence-activated cell sorting. Sci Am 1976; 234: 108-117 참조). 형광 활성화된 세포분류법"("FACS")의 이용은 정확성으로 인해 클로닝 단계가 1회만 필요한 바, 공정 개발 시간을 상당히 단축시킨다. 여기에 기술된 개념은 가장 빠른 가능한 단계에서 생산성에 대해 클론이 선별되는 구성으로 이루어진다. 도 1의 B)는 FACS 기반 단일 세포 공급에 이어서 96웰에서 증식하는 세포의 배양 상청액의 산물 역가가 측정되는 즉시-초기 선별을 설명하고 있다. 또한, 역가 측정은 고처리량 1차 선별에서 고 생산자 클론이 선별되도록 하는 384웰 포맷에서 완전 자동화 방식으로 일어난다. 도 1의 A)는 비교용으로, 세포 클론을 선별하는 표준 방법을 모식적으로 나타낸 것이다.
"HTRF®" 분석법은 공여체와 수용체 분자 사이에 FRET에 의한 시그날을 발생시키는 "균일 시간분해 형광 분석법"이다. HTRF®(균일 시간분해 형광)는 장기 발광 반감기를 보유한 형광단의 사용과 FRET 화학의 조합인 TR-FRET를 기반으로 한 기술이다. HTRF®가 TR-FRET 화학을 기반으로 하지만, 다른 TR-FRET 제품과 구분되는 다수의 성질을 갖고 있다. 이러한 성질에는 극히 긴 반감기를 보유한 란탄족 원소(유로퓸)의 사용, 크립테이트에의 Eu3+의 접합, 증가된 분석 안정성을 부여하는 실체 및 반응정지와 샘플 방해에 대한 보정을 허용하는 방사성 측정의 이용을 포함한다. 다른 HTRF® 기술의 특징으로는 균일한 분석 포맷, 낮은 백그라운드, 간단해진 분석 소형화, DMSO 및 EDTA와 같은 첨가제의 내성, 적은 거짓 양성/거짓 음성, 세포계 기능 분석을 포함한다.
HTRF® 분석에서, 공여체는 다환식 크립테이트(Eu-크립테이트)에 갇힌 Eu3+이고, 수용체는 변형된 알로피코시아닌 단백질이다. 337nm에서 공여체의 레이저 여기는 근접 위치(690Å)에 있을 때, 620nm에서 수용체로 에너지를 전이시켜, 665nm에서 장기간(밀리초) 동안 광의 방출을 초래한다. 발광을 기록하는데 있어서의 50-ls 시간 지연과 665nm와 620nm 발광비의 분석은 배지 및 쌍을 이루지 않은 형광단 유래의 간섭 형광을 최소화한다.
특정 양태에서, HTRF 분석은 배양 배지에 존재하는 IgG 타입 항체의 함량을 검출하는 역할을 할 수 있다. 이 경우에, Eu-크립테이트는 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 항 사람 IgG 항체에 접합되어, 이 항체가 IgG 산물에 결합 시에 나타나지만, 카파 경쇄에 특이적으로 결합하는 항 사람 IgG 항체는 D2 수용체로 표지되어 복합체를 완성한다.
"세포 배양물"이란 용어는 세포의 증식에 적합한 조건 하에서 하나의 용기에서 배양된 다수의 세포를 의미한다.
"현탁" 배양은 액체 배지에서 증식능이 있고 일반적인 세포 배양 용기의 지지면에 부착하지 않는 배양된 세포 현탁액을 의미한다. 이러한 세포 중 일부는 이러한 성질을 일정 시간 동안 얻기 위해 적응되었을 수 있다.
세포 배양 기술과 관련하여 "클로닝"이란 용어는 단일 세포를 큰 세포 집단으로부터 선별하거나 또는 분리하는 과정을 의미한다. 이러한 단일 모세포의 모든 딸세포는 동일하다/유전적으로 동일하다.
"고 처리량"이란 용어는 12시간 내에 단백질 농도의 250회 이상의 측정, 바람직하게는 12시간 내에 500회 측정, 더욱 바람직하게는 12시간 내에 2000회 측정, 가장 바람직하게는 12시간 내에 4000회 측정을 의미한다. 이는 샘플을 측정하는 자동 플랫폼의 성능 속도와 관련하여, 사용되는 멀티웰 플레이트, 예컨대 96웰 플레이트의 수용력에, 자동 항온배양기에 장착되는 플레이트의 수를 곱하여 계산된다. 항온배양기를 2개 사용하거나 더 큰 항온배양기를 사용하면, 이에 따라 처리량은 1일 내에 8000회 측정 이상으로 증가할 수 있다. 3일마다의 측정값의 시간 곡선을 사용할 때, 더 큰 항온배양기 용량을 사용하여 처리량을 3일 내에 24000회 이상으로 증가시킬 수 있다.
본 발명의 목적에서 "숙주 세포"는 햄스터 세포와 같은 세포, 바람직하게는 BHK21, BHK TK-, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 및 CHO-DG44 세포 또는 임의의 이러한 세포주의 유도체/자손이다. 특히, CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 및 BHK21이 바람직하고, CHO-DG44 및 CHO-DUKX 세포가 더욱 바람직하다. 본 발명의 다른 양태에서, 숙주 세포는 쥐 골수종 세포, 바람직하게는 NS0 또는 Sp2/0 세포, 또는 임의의 이러한 세포주의 유도체/자손을 의미한다. 본 발명의 의미에서 사용될 수 있는 쥐 및 햄스터 세포의 예는 표 1에 정리했다. 하지만, 이러한 세포의 유도체/자손, 다른 포유동물 세포, 예컨대 사람, 마우스, 래트, 원숭이 및 설치류 세포주(이에 국한되지 않는다), 또는 진핵생물 세포, 예컨대 효모, 곤충, 조류 및 식물 세포(이에 국한되지 않는다)도 본 발명의 목적, 특히 생물약제 단백질의 생산에 사용될 수 있다.
| 세포주 | 주문 번호 |
| NS0 | ECACC No. 85110503 |
| Sp2/0-Ag14 | ATCC CRL-1581 |
| BHK21 | ATCC CCL-10 |
| BHK TK- | ECACC No. 85011423 |
| HaK | ATCC CCL-15 |
| 2254-62.2 (BHK-21 유도체) | ATCC CRL-8544 |
| CHO | ECACC No. 8505302 |
| CHO-K1 | ATCC CCL-61 |
| CHO-DUKX (= CHO duk-, CHO/dhfr-) | ATCC CRL-9096 |
| CHO-DUKX B1 | ATCC CRL-9010 |
| CHO-DG44 | Urlaub et al., Cell 33[2], 405-412, 1983 |
| CHO Pro-5 | ATCC CRL-1781 |
| V79 | ATCC CCC-93 |
| B14AF28-G3 | ATCC CCL-14 |
| CHL | ECACC No. 87111906 |
숙주 세포는 무혈청 조건 하에, 경우에 따라 동물 기원의 임의의 단백질/펩타이드가 없는 배지에서 확립, 적응 및 완전히 배양될 때 가장 바람직하다. 시판되는 배지, 예컨대 햄(Ham)의 F12(시그마, 독일 다이젠호펜 소재), RPMI-1640(시그마), 둘베코(Dulbecco) 변형 이글(Eagle) 배지(DMEM; 시그마), 최소 필수 배지(MEM; 시그마), 이스코브(Iscove) 변형 둘베코 배지(IMDM; 시그마), CD-CHO(인비트로겐, 미국 캘리포니아 칼스배드 소재), CHO-S(인비트로겐), 무혈청 CHO 배지(시그마) 및 무단백질 CHO 배지(시그마)는 대표적인 적당한 영양소 용액이다. 모든 배지에는 필요에 따라 다양한 화합물이 보충될 수 있고, 그 예에는 호르몬 및/또는 다른 성장인자(예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 상피 성장인자, 인슐린 유사 성장인자), 염(예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 인산염), 완충액(예: HEPES), 뉴클레오사이드(예: 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코스 또는 다른 등가의 에너지원, 항생제, 미량원소가 있다. 임의의 다른 필수 보충물도 당업자에게 공지되어 있는 적당한 농도로 첨가될 수 있다. 본 발명에서, 무혈청 배지의 사용은 바람직하지만, 적당한 양의 혈청이 보충된 배지도 숙주 세포의 배양에 사용될 수 있다. 선별가능한 유전자를 발현하는 유전자 변형된 세포의 증식 및 선별을 위해, 적당한 선별제를 배양 배지에 첨가한다.
"단백질"이란 용어는 아미노산 잔기 서열 또는 폴리펩타이드와 호환 사용되며, 임의의 아미노산의 중합체를 의미한다. 이러한 용어들은 또한 글리코실화, 아세틸화, 인산화 또는 단백질 프로세싱을 포함한, 이에 국한되지 않는 반응을 통해 해독후 변형된 단백질도 포함한다. 다른 단백질과의 융합, 아미노산 서열 치환, 결실 또는 삽입과 같은 변형 및 변화는, 그 분자의 생물학적 기능 활성이 유지되는 한, 폴리펩타이드의 구조에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산 서열 치환이 폴리펩타이드 또는 이의 기본 핵산 암호화 서열에서 이루어질 수 있고, 유사한 성질을 가진 단백질이 수득될 수 있다.
목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 보유하는 발현 벡터는 또한 선별가능한 증폭가능 마커 유전자를 포함할 수 있다. "선별가능한 증폭가능 마커 유전자"는 보통 진핵생물 세포의 증식에 필요한 효소를 그러한 조건 하에서 암호화한다. 예를 들어, 선별가능한 증폭가능 마커 유전자는, 이 유전자로 형질감염된 숙주 세포가 선별제, 메토트렉세이트(MTX)의 존재 하에 증식될 때 증폭되는 DHFR을 암호화할 수 있다. 표 3에 예시된 비제한적 선별가능한 유전자 역시 증폭가능한 마커 유전자로서, 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다. 표 3에 열거된 선별가능한 증폭가능 마커 유전자의 검토에는 참고 인용된 문헌[Kaufman, Methods in Enzymology, 185: 537-566(1990)]을 참조한다. 따라서, 본 명세서에 기술된 임의의 방법에 따라 유전자 변형된 숙주 세포는 본 발명에 포함되며, 이 때 선별가능한 증폭가능 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 글루타민 신테타제, CAD, 아데노신 데아미나제, 아데닐레이트 데아미나제, UMP 신테타제, IMP 5'-데하이드로게나제, 잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, HGPRTase, 티미딘 키나제, 티미딜레이트 신테타제, P 당단백질 170, 리보뉴클레오타이드 리덕타제, 아스파라긴 신테타제, 아르기노석시네이트 신테타제, 오르니틴 데카르복실라제, HMG CoA 리덕타제, 아세틸글루코스아미닐 트랜스퍼라제, 트레오닐-tRNA 신테타제 또는 Na+K+-ATPase의 기능을 보유하는 폴리펩타이드를 암호화한다.
| 선별가능한 증폭가능 마커 유전자 | 등록 번호 | 선별제 |
| 디하이드로폴레이트 리덕타제 | M19869 (햄스터) E00236 (마우스) | 메토트렉세이트 (MTX) |
| 메탈로티오네인 | D10551 (햄스터) M13003 (사람) M11794 (래트) | 카드뮴 |
| CAD(카르바모일-포스페이트 신테타제:아스파테이트 트랜스카르바밀라제:디하이드로오로타제) | M23652 (햄스터) D78586 (사람) | N-포스포아세틸-L-아스파테이트 |
| 아데노신 데아미나제 | K02567 (사람) M10319 (마우스) | Xyl-A- 또는 아데노신, 2'-데옥시코포르마이신 |
| AMP(아데닐레이트) 데아미나제 | D12775 (사람) J02811 (래트) | 아데닌, 아자세린, 코포르마이신 |
| UMP 신타제 | J03626 (사람) | 6-아자우리딘, 피라조푸란 |
| IMP 5'데하이드로게나제 | J04209 (햄스터) J04208 (사람) M33934 (마우스) | 마이코페놀산 |
| 잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 | X00221 (이.콜라이) | 마이코페놀산+제한량의 잔틴 |
| 돌연변이 HGPRTase 또는 돌연변이 티미딘 키나제 | J00060 (햄스터) M13542, K02581 (사람) J00423, M68489(마우스) M63983 (래트) M36160 (헤르페스바이러스) | 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT) |
| 티미딜레이트 신테타제 | D00596 (사람) M13019 (마우스) L12138 (래트) | 5-플루오로데옥시우리딘 |
| P-당단백질 170 (MDR1) | AF016535 (사람) J03398 (마우스) | 다수의 약물, 예: 아드리아마이신, 빈크리스 틴, 콜히친 |
| 리보뉴클레오타이드 리덕타제 | M124223, K02927 (마우스) | 아파디콜린 |
| 글루타민 신테타제 | AF150961 (햄스터) U09114, M60803 (마우스) M29579 (래트) | 메티오닌 설폭시민 (MSX) |
| 아스파라긴 신테타제 | M27838 (햄스터) M27396 (사람) U38940 (마우스) U07202 (래트) | β-아스파틸 하이드록사메이트, 알비지인, 5'아자 시티딘 |
| 아르기니노석시네이트 신테타제 | X01630 (사람) M31690 (마우스) M26198 (소) | 카나바닌 |
| 오르니틴 데카르복실라제 | M34158 (사람) J03733 (마우스) M16982 (래트) | α-디플루오로메틸오르니틴 |
| HMG-CoA 리덕타제 | L00183, M12705 (햄스터) M11058 (사람) | 콤팩틴 |
| N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 | M55621 (사람) | 튜니카마이신 |
| 트레오닐-tRNA 신테타제 | M63180 (사람) | 보렐리딘 |
| Na+K+-ATPase | J05096 (사람) M14511 (래트) | 우아바인 |
본 발명은 생물약제 폴리펩타이드/단백질을 생산하는 숙주 세포의 발생에 적합하다. 본 발명은 특히 증강된 세포 생산성을 나타내는 세포에 의한 다수의 다른 목적 유전자의 고 수율 발현에 적합하다.
"목적 유전자", "선택된 서열" 또는 "산물 유전자"는 본 명세서에서 동일한 의미를 나타내는 것이며, "목적 산물"이라는 용어로 언급되기도 하는 목적 산물 또는 "목적 단백질"을 암호화하는 임의의 길이의 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 선택된 서열은 전장(full length)이거나 또는 절두된(truncated) 유전자, 융합 유전자 또는 태그화된 유전자일 수 있고, cDNA, 게놈 DNA 또는 DNA 단편, 바람직하게는 cDNA일 수 있다. 이 서열은 천연 서열, 즉 자연 발생 형태(들)이거나 또는 목적에 따라 돌연변이되거나 또는 달리 변형된 형태일 수 있다. 이러한 변형에는 선별된 숙주 세포의 코돈 용법에 가장 적합하게 하기 위한 코돈 최적화, 사람화 또는 태그화를 포함한다. 선별된 서열은 분비된 폴리펩타이드, 세포질 폴리펩타이드, 핵 폴리펩타이드, 막 결합된 폴리펩타이드 또는 세포 표면 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
"목적 단백질"에는 선별된 숙주 세포에서 발현될 수 있는, 단백질, 폴리펩타이드, 이의 단편, 펩타이드가 포함된다. 바람직한 단백질은 예컨대 항체, 효소, 사이토카인, 림포카인, 부착 분자, 이의 수용체 및 유도체 또는 단편, 효능제 또는 길항제로서 작용하고/하거나 치료용 또는 진단용으로 사용되는 임의의 다른 폴리펩타이드일 수 있다. 바람직한 단백질/폴리펩타이드의 예는 이하에 제시된다. "목적 산물"은 또한 안티센스 RNA일 수 있다.
"목적 단백질" 또는 바람직한 단백질은 앞에서 언급한 것이다. 구체적으로, 바람직한 단백질/폴리펩타이드 또는 목적 단백질은 예컨대 인슐린, 인슐린 유사 성장인자, hGH, tPA, 사이토카인, 예컨대 인터루킨(IL), 예컨대, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 인터페론(IFN) 알파, IFN 베타, IFN 감마, IFN 오메가 또는 IFN 타우, 종양 괴사 인자(TNF), 예컨대 TNF 알파 및 TNF 베타, TNF 감마, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF이나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 에리트로포이에틴 또는 임의의 다른 호르몬 성장 인자의 생산도 포함된다. 본 발명에 따른 방법은 항체 또는 이의 단편의 생산에 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 단편에는, 예컨대 Fab 단편(항원 결합 단편=Fab)이 포함된다. Fab 단편은 인접 불변 영역에 의해서 함께 유지된, 두 쇄의 가변 영역으로 이루어진다. 이 단편은 통상의 항체로부터 파파인과 같은 프로테아제 분해에 의해 형성될 수 있고, 또한 그러한 동안에 유전자 조작에 의해 유사한 Fab 단편을 생산할 수도 있다. 또 다른 항체 단편에는 펩신에 의한 단백분해 절단에 의해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편이 포함된다.
유전자 조작 방법을 이용하면, 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역으로만 이루어진 단축된 항체 단편을 생산하는 것이 가능하다. 이 단편은 Fv 단편(가변 단편 = 가변성 부분의 단편)으로 불린다. 이러한 Fv 단편은 불변 쇄의 시스테인으로 인한 두 쇄의 공유 결합이 없기 때문에, Fv 단편은 종종 안정화된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 짧은 펩타이드 단편, 예컨대 10 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 15개의 아미노산으로 연결시키는 것이 유리하다. 이러한 방식으로, 펩타이드 링커에 의해 연결된 VH와 VL로 이루어진 단일 펩타이드 가닥이 수득된다. 이러한 종류의 항체 단백질은 단쇄 Fv(scFv)로 알려져 있다. 종래 기술에서 공지된 이러한 종류의 scFv-항체 단백질의 예는 문헌[Huston et al., 1988, PNAS 16: 5879-5883]에 기술되어 있다.
최근, scFv를 다량체성 유도체로서 제조하기 위하여 다양한 전략이 개발되었다. 이것은 특히 증가된 결합 활성뿐만 아니라 개선된 약동학 성질 및 생체분포성을 보유한 재조합 항체를 생성하도록 의도된 것이다. scFv의 다량체화를 달성하기 위해, scFv는 다량체화 도메인을 보유하는 융합 단백질로서 제조되었다. 다량체화 도메인은, 예컨대 IgG의 CH3 영역 또는 꼬인 코일 구조(나선 구조), 예컨대 류신-지퍼 도메인일 수 있다. 하지만, scFv의 VH/VL 영역 사이의 상호작용이 다량체화(예: 디아바디(diabody), 트리바디(tribody) 및 펜타바디(pentabody))에 사용되는 전략도 있다. 당업자에게 디아바디는, 2가의 동종이량체 scFv 유도체를 의미한다. scFv 분자의 링커를 5 내지 10개 아미노산으로 단축시키면, 쇄간 VH/VL 중첩이 일어난 동종이량체의 형성이 일어난다. 디아바디는 이황화 가교의 혼입에 의해 더욱 안정화될 수 있다. 종래 기술의 디아바디-항체 단백질의 예는 문헌[Perisic et al. 1994, Structure 2: 1217-1226]에서 찾아볼 수 있다.
당업자에게 미니바디(minibody)는, 2가의 동종이량체 scFv 유도체를 의미한다. 미니바디는 힌지 영역(예컨대, 역시 IgG1 유래) 및 링커 영역을 통해 scFv에 결합되는 이량체화 영역으로서 면역글로불린의 CH3 영역, 바람직하게는 IgG, 더욱 바람직하게는 IgG1을 함유하는 융합 단백질로 이루어진다. 종래 기술의 미니바디-항체 단백질의 예는 문헌[Hu et al. 1996, Cancer Res. 56: 3055-61]에서 찾아볼 수 있다.
당업자에게 트리바디는, 3가의 동종삼량체 scFv 유도체를 의미한다(Kortt et al. 1997 Protein Engineering 10: 423-433). VH-VL이 링커 서열없이 직접 융합되는 scFv 유도체는 삼량체를 형성하게 된다.
당업자는 또한 2가, 3가 또는 4가의 구조를 보유하고 scFv에서 유래되는 소위 미니항체를 잘 알고 있을 것이다. 다량체화는 2가, 3가 또는 4가의 꼬인 코일 구조에 의해 수행된다(Pack et al., 1993, Biotechnology 11: 1271-1277; Lovejoy et al., 1993 Science 259: 1288-1293; Pack et al., 1995 J.Mol.Biol. 246: 28-34).
본 발명은
a) 목적 단백질을 발현하는 단일 세포를 배양 배지에서 각 용기에 공급하는 단계,
b) 이 세포를 적어도 1일 동안 배양하는 단계,
c) 세포가 최초로 계대되기 전에 각 용기로부터 배양물의 일정량을 채취하는 단계,
d) 각 일정량 중에 존재하는 목적 단백질의 양을 측정하는 단계,
e) 각 일정량에서 측정된 단백질의 양에 따라 클론을 선별하는 단계를 특징으로 하는 세포 클론의 선별 방법에 관한 것이다.
바람직한 양태는 처리량이 12시간 내에 250회 이상의 측정(단백질 농도의 측정), 바람직하게는 12시간 내에 500회 이상의 측정, 더욱 바람직하게는 12시간 내에 2000회 이상의 측정, 가장 바람직하게는 12시간 내에 일정량의 4000회 이상의 측정이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 단계 c)가 1m3당 입자 100개 미만의 클래스 A 입자 부하량인 무균 환경에서 수행되는 본 발명의 방법이다.
본 발명의 구체적 양태는 하나 이상의 단계가 멀티웰 플레이트에서 수행되는 본 발명의 방법 뿐만 아니라 적어도 단계 d)가 멀티웰 플레이트에서 수행되는 방법 및 멀티웰 플레이트가 96웰 플레이트 또는 384웰 플레이트, 바람직하게는 384웰 플레이트인 방법이다.
또 다른 바람직한 양태는 단계 a)가 96웰 플레이트에서 수행되고 단계 d)가 384웰 플레이트에서 수행되는 방법으로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 클론/클론 배양물을, 배치 유사 역가 곡선을 수득하기에 충분한 시간 동안, 바람직하게는 2 내지 3일마다 샘플을 취하면서 5 내지 15일 동안 모니터하는 본 발명의 방법이다.
또한, 본 발명은
a. 목적 단백질을 발현하는 단일 세포를 세포 배양 배지에서 멀티웰 용기에 공급하는 단계;
b. 유도된 세포 배양물을 최대 10회까지 계대하는 단계;
c. 상기 멀티웰 용기를 자동 항온배양기로 이송하는 단계;
d. 상기 멀티웰 용기를 항온배양기로부터 에어락을 통해 클래스 A 입자 부하량이 1m3당 100개 미만의 입자인 무균 환경으로 순차적으로 이송하는 단계,
e. 각 용기로부터 배양물의 일정량을 채취하는 단계,
f. 샘플을 피펫팅 장치로 희석하면서 세포를 항온배양기로 다시 이송하는 단계,
g. 희석된 샘플과 분석 시약을 다른 멀티웰 용기 속으로 혼합하는 단계,
h. 단계 g)의 멀티웰 용기를 항온배양을 위한 보관실로 이송하는 단계,
i. 단계 h)의 멀티웰 플레이트를 판독기로 이동시키는 단계,
j. 각 용기에 존재하는 목적 단백질의 양을 측정하는 단계를 특징으로 하며, 이로 인해 처리량이 12시간 내에 250회 이상의 측정, 바람직하게는 12시간 내에 500회 측정, 더욱 바람직하게는 12시간 내에 2000회 측정, 가장 바람직하게는 12시간 내에 4000회 이상의 측정인, 세포 클론의 선별 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법의 바람직한 양태는 샘플 추적이 바코드화된 플레이트 및 바코드 판독기에 의해 보장되는 방법이다.
또 다른 바람직한 양태는 단계 b)에서의 계대 횟수가 0이고 단계 e)는 세포가 최초로 계대되기 전에 수행되는 방법이다.
또 다른 바람직한 양태는 멀티웰 플레이트가 96웰 플레이트 또는 384웰 플레이트, 바람직하게는 384웰 플레이트인 방법, 및 단계 a) 내지 e)가 96웰 플레이트에서 수행되고 단계 g) 내지 j)가 384웰 플레이트에서 수행되는 방법이다.
또 다른 구체적인 양태는 모노클로날 세포를 배양하기 위한 멀티웰 용기가 최대 5분의 시간 동안 항온배양기로부터 제거되고, 단계 e)에서 멀티웰 용기의 뚜껑이 1분 이하, 바람직하게는 30초 동안 제거되는 본 발명의 방법이다.
또 다른 바람직한 양태는 단계 a)의 세포가 목적 단백질을 발현하기 위해서 목적 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질감염된 본 발명의 임의의 방법이다.
구체적 양태는 형광 활성화된 세포 분류법(FACS) 또는 한계 희석법에 의해서 단일 세포가 수득된 본 발명의 임의의 방법이다.
다른 구체적 양태는 첫번째 방법의 단계 b)에서의 배양 시간 및 두번째 방법의 단계 b)에서의 1차 계대와 이후 계대 사이의 시간이 1 내지 60일 또는 1 내지 30일 또는 5 내지 60일 또는 5 내지 30일 또는 10 내지 60일 또는 10 내지 30일 또는 5 내지 30일 또는 5 내지 25일, 또는 바람직하게는 14 내지 24일인 임의의 방법이다.
바람직한 양태는 첫번째 방법의 단계 c)에서의 일정량과 두번째 방법의 단계 e)에서의 일정량이 세포 배양 상청액에서 유래된 것인 본 발명의 임의의 방법이다.
또 다른 바람직한 양태는 일정량이 < 20㎕, < 10㎕, < 5㎕의 부피이고, 바람직하게는 0.2 내지 5㎕ 범위, 가장 바람직하게는 0.5 내지 2㎕ 범위인 본 발명의 임의의 방법이다.
다른 바람직한 양태는 일정량이 세포 배양물 부피의 < 2.5%(v/v)이고, 단백질 측정의 검출 민감도가 적어도 1mg/l인 본 발명의 임의의 방법이다.
또 다른 바람직한 양태는 일정량이 세포 배양물 부피의 <2.5%(v/v)이고, 검출 범위가 1 내지 20mg/리터, 또는 1 내지 10mg/리터인 본 발명의 임의의 방법이다.
바람직한 양태는 단계 a)의 세포 배양 배지의 부피가 500㎕, 300㎕ 또는 바람직하게는 200㎕인 본 발명의 임의의 방법이다.
또 다른 바람직한 양태는 측정 단계가 효소 연결된 면역흡착 분석법(ELISA) 또는 바람직하게는 균일 시간분해 형광 분석법(HTRF), 바람직하게는 HTRF에 의해 수행되는 본 발명의 임의의 방법이고, 특히 바람직하게는 HTRF 분석이
a. IgG 타입 항체의 Fc 부분 및
b. IgG 타입 항체의 경쇄
에 대한 검출 항체를 포함하는 방법이다.
특히 바람직한 양태는 검출 항체가 유로퓸 크립테이트 공여체에 접합된 항 h IgG(Fc) 및 D2 수용체에 접합된 항 h 카파 경쇄인 본 발명의 임의의 방법이다.
또 다른 바람직한 양태는 배양 배지가 무혈청 및/또는 동물성 성분 미함유 및/또는 단백질 미함유 및/또는 화학적 제한 배지인 본 발명의 임의의 방법이다.
또 다른 특히 바람직한 양태는 세포가 현탁 배양물에서 증식되는 본 발명의 임의의 방법이다.
또 다른 바람직한 구체 양태는 선별된 클론이 목적 단백질을 다량으로 발현하는 것으로 측정된 상위 30%의 세포, 바람직하게는 상위 20%, 가장 바람직하게는 상위 10%의 세포를 나타내는 본 발명의 임의의 방법이다.
본 발명의 임의의 방법의 다른 바람직한 양태에서, 본 방법은 멀티웰 용기의 진탕 또는 회전 없이, 또는 내부 배양 배지의 교반 없이 수행된다.
다른 바람직한 양태는 자가 지지세포의 사용을 특징으로 하는 본 발명의 임의의 방법이다. 바람직하게는, 이 방법은 공급되는 세포가 CHO 또는 BHK 세포인 경우에 사용되는 지지세포는 햄스터 세포이고, 공급되는 세포가 NSO 세포인 경우에는 지지세포로서 마우스 골수종 세포가 사용되는 방법이다. 더욱 바람직하게는, 이 방법은 공급된 세포가 배지 1ml당 100개 내지 200,000개의 지지세포의 존재 하에 증식되는 방법이다.
다른 바람직한 양태는 목적 단백질이 치료용 단백질인, 바람직하게는 단백질이 항체, 특히 치료용 항체인 본 발명의 임의의 방법이다.
또 다른 구체 양태는 공급된 세포가 햄스터 세포, 예컨대 CHO 또는 BHK 세포이거나, 또는 공급된 세포가 마우스 골수종 세포, 예컨대 NSO 세포인 본 발명의 임의의 방법이다.
또한, 본 발명은 세포 클론을 선별하는 임의의 종래 방법을 사용하여 세포주 개발에서 처리량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 무혈청 배양 조건 하에서 진핵생물 세포, 예컨대 포유동물 세포에서 단백질을 생산하는 방법으로서,
a. 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 함유하는 진핵생물 세포를 생성하는 단계,
b. 상기 세포의 증식을 허용하는 무혈청 조건 하에서 세포를 배양하는 단계,
c. 96웰 플레이트와 같은 멀티웰 용기에 단일 세포를 공급하는 단계,
d. 상기 단일 세포를 경우에 따라 자가 지지세포의 존재 하에 배양하는 단계,
e. 앞에서 기술한 본 발명의 방법 중 어느 하나의 방법에 따라 클론 세포를 선별하는 단계,
f. 목적 단백질을 다량으로 발현하는 것으로 측정된 상위 30%, 바람직하게는 상위 20%, 가장 바람직하게는 상위 10%의 선별된 세포를 배양하는 단계,
g. 상청액으로부터 세포의 분리 등에 의해 목적 단백질을 수거하는 단계, 및
h. 목적 단백질을 정제하는 단계를 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 양태는 목적 단백질이 재조합 단백질, 바람직하게는 치료용 단백질, 더욱 바람직하게는 항체인 방법이다.
또한, 본 발명은 기술된 방법 중 어느 한 방법에 의해 생산된 단백질 산물에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 기술된 방법 중 어느 한 방법을 사용하여 생산자 숙주 세포주를 선별하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 기술된 방법 중 어느 한 방법에 의해 선별된 생산자 숙주 세포주에 관한 것이다.
구체 양태는 숙주 세포가 진핵생물 세포, 특히 포유동물 세포인 생산자 숙주 세포주, 바람직하게는 숙주 세포가 햄스터 또는 마우스 골수종 세포, 특히 CHO 또는 BHK 세포 또는 NSO 세포인 생산자 숙주 세포주이다.
더욱이, 본 발명은 생물약제 단백질 제조에서 기술한 바와 같은 생산자 숙주 세포주의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 100개 입자/m3 미만의 클래스 A 입자 부하량을 공급하는 무균 환경을 조성하기에 적합하고 기술된 바와 같은 본 발명의 임의의 방법을 수행하는 자동 플랫폼에 적합한 층류형 후드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
a) 목적 단백질을 발현하도록 유전자 변형된 형질감염된 세포의 단일 세포 클로닝을 수행하는 단계,
b) 자동 플랫폼을 사용하는 멀티웰 플레이트 포맷에서 증식하는 모노클로날 세포의 1차 세포 배양물에 존재하는 상기 목적 단백질을 검출하기에 적합한 단백질 검출 분석법을 수행하면서
c) 상기 1차 세포 배양물의 무균 환경을 유지시키는 단계를 특징으로 하는 세포의 즉시-초기 고 처리량 선별 방법에 관한 것이다.
구체적 양태에서, 본 발명은 다음과 같은 단계들이 수행되는 자동 플랫폼을 이용하는 세포의 즉시-초기 고 처리량 선별 방법에 관한 것이다:
a. 단일 세포를 함유하는 96웰 플레이트를 FACS 장치로부터 자동 항온배양기로 이송하는 단계,
b. 소프트웨어가 순차적으로 항온배양기로부터 에어락을 통해 무균 환경으로 단일 플레이트의 이송을 계획하는 단계,
c. 상청액을 수거하여 피펫팅 장치로 희석하면서 세포를 다시 항온배양기로 이송하는 단계,
d. 그 다음, 피펫팅 장치로 샘플과 분석 시약을 멀티웰 플레이트 중에서 혼합한 뒤, 이를 항온배양용 보관실로 이송하는 단계,
e. 2시간 후, 플레이트를 예상 파장에서의 측정을 위해 판독기로 이동시키는 단계,
f. 샘플 추적을 바코드화된 플레이트 및 바코드 판독기로 확실시하는 단계.
본 발명의 임의의 방법의 바람직한 양태에서, 자동화된 구성을 이용하여 수득한 데이터의 양은 전술한 배양 조건 하에서 각각 특정 세포 타입의 전형적인 역가 프로파일을 수득할 수 있게 해준다. 이러한 프로파일은 그 다음 외삽을 가능하게 할 수 있어서, 클론 선별에 필요한 측정 횟수를 감소시키는데 이용될 수 있다. 이 프로파일은 다시 이러한 임의의 구성의 가능한 최대 처리량을 증가시킬 것이다.
선별 절차에서 샘플 채취 횟수 및/또는 시간 틀을 제한하는 것이 바람직한 경우에, 기술된 구성은 이러한 클론들의 역가 포텐셜을 추정하는데 사용될 수 있는 전형적인 역가 프로파일의 작성을 가능하게 할 것이다(수학적 모델링 접근법). 역가 포텐셜은 1차 계대 전에 배양물이 도달할 수 있는 최종 단백질 농도를 의미한다.
본 발명의 실시는 다른 언급이 없는 한, 세포 생물학, 분자 생물학, 세포 배양, 면역학의 통상적인 기술 및 당업자의 기술 범위 안에 있는 유사 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 현재의 문헌에 충분히 개시되어 있다[예컨대, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987, updated); Brown ed., Essential Molecular Biology, IRL Press (1991); Goeddel ed., Gene Expression Technology, Academic Press (1991); Bothwell et al. eds., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Bartlett Publ. (1990); Wu et al., eds., Recombinant DNA Methodology, Academic Press (1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression, Stockton Press (1990); McPherson et al., PCR: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1991); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis (1984); Miller & Calos eds., Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (1987); Butler ed., Mammalian Cell Biotechnology (1991); Pollard et al., eds., Animal Cell Culture, Humana Press (1990); Freshney et al., eds., Culture of Animal Cells, Alan R. Liss (1987); Studzinski, ed., Cell Growth and Apoptosis, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Presss (1995); Melamed et al., eds., Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss (1990); Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, Inc. (updated); Wirth & Hauser, Genetic Engineering of Animals Cells, in: Biotechnology Vol. 2, Puhler ed., VCH, Weinheim 663-744; the series Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.), 및 Harlow et al., eds., Antibodies: A Laboratory Manual (1987) 참조].
이상 일반적으로 기술된 본 발명은 이하 실시예를 참고로 하여 더 쉽게 이해할 수 있을 것이고, 이러한 실시예는 본 발명의 특정 양태를 단지 예시하기 위한 목적이며 어떠한 방식으로든지 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
재료 및 방법
세포 배양
생산 및 개발 규모에 사용된 모든 세포주는 37℃의 온도로 특별히 설계된 항온배양실에서 공기와 5% CO2(Wheaton, USA) 혼합물이 살포되는 스피너 플라스크 또는 일련의 씨드스톡 배양물을 표면 통기된 T-플라스크(눈크, 덴마크 소재)에 넣고 항온배양기(써모, 독일 소재)에서 유지시켰다.
씨드스톡 배양물은 2E5-3E5 세포/ml의 접종 밀도로 2 내지 3일마다 부차배양했다. 모든 배양물의 세포 농도는 혈구계로 측정했다. 생육성은 트립판 블루 배제 방법으로 평가했다. 배양물은 마스터, 작업 또는 안전 세포 뱅크 유래인 것이며, 적어도 무균성, 마이코플라즈마 및 외래 바이러스의 존재에 대해 철저하게 검사했다. 모든 작업은 공기 여과된 실험실에서 '현행 우수 제조 관리 기준(cGMP: current Good Manufacturing Practices)'에 부응하는 엄격한 절차 하에서 수행했다. 모든 CHO 생산 세포는 베링거 잉겔하임에 독점권이 있는 배지 및 이의 조성물에서 배양했다.
재조합 단백질(당해 단백질)을 생산하는 세포주는 이 단백질을 암호화하는 DNA를 함유하는 플라스미드로 CHO 세포를 안정하게 형질감염시켜 생성했다. 안정한 세포 풀(폴리클로날 세포 집단)은 문헌[Sautter and Enenkel: Selection of high-producing CHO cells using NPT selection marker with reduced enzyme activity. Biotechnol Bioeng. 2005 Mar 5;89(5):530-8]에 기술된 것과 같은 선별 절차를 적용하여 생성했다.
단일 세포 분류
펄스 프로세싱, 분류 증진 모듈 및 자동 세포 공급 장치가 장착된 FACS Vantage(Coulter FPICS ALTRA HyPerSort System) 흐름 세포측정기를 분석 및 세포 분류에 사용했다. 488nm로 조정된 아르곤 레이저(Coherent)를 사용했다. 레이저 출력 전력은 220mW였다. 생존 세포는 모든 단일 세포를 포함하는 게이트를 전진 스캐터(FSC) 대 사이드 스캐터(SSC)의 도트 플롯에 따라서 세팅하여 분류했다. 분류된 세포는 200㎕ 증식 배지를 함유하는 96웰 마이크로역가 플레이트에 자동 세포 공급 장치를 이용하여 웰당 세포 2개씩 공급하였다. 무균 분류를 위해, 세포 분류기의 배관을 세척하고 시스 유체(sheath fluid)로서 70% 에탄올, 멸균수를 각각 1시간 동안 이동시켜 멸균했다.
HTRF 분석
"HTRF" 분석은 공여체와 수용체 분자 사이에서 FRET에 의한 시그날을 발생시키는 "균일 시간분해 형광 분석"이다.
공여체는 다환식 크립테이트에 갇힌 Eu3+(Eu-크립테이트)이고, 수용체는 변형된 알로피코시아닌 단백질이다. 337nm에서 공여체의 레이저 여기는 공여체와 수용체가 근접 위치(690Å)에 있을 때, 620nm에서 수용체로 에너지를 전이시켜, 665nm에서 장기간(밀리초) 동안 광의 방출을 초래한다. 발광을 기록하는데 있어서의 50-ls 시간 지연과 665nm와 620nm 발광비는 배지 및 쌍을 이루지 않은 형광단 유래의 간섭 형광을 최소화한다. 배양물 배지에 존재하는 IgG 타입 항체의 함량을 검출하기 위해, Eu-크립테이트는 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 항 사람 IgG 항체에 접합시켜, 이 항체가 IgG 산물에 결합 시에 나타나지만, 카파 경쇄에 특이적으로 결합하는 사람 IgG 항체는 D2 수용체로 표지하여 복합체를 완성했다.
HTRF® 분석은 무균 조건 하에 완전 자동화된 피펫팅 플랫폼에서 수행한다. 단일 세포를 함유하는 96웰 플레이트를 FACS 장치로부터 자동 항온배양기로 이송한다. 소프트웨어는 항온배양기로부터 에어락을 통해 무균 환경으로 이동되는 단독 플레이트의 이송을 계획한다. 배양 부피의 2.5%(v/v) 미만을 나타내는 샘플을 모든 상청액으로부터 채취하여 피펫팅 장치로 희석하면서 세포를 다시 항온배양기로 이송한다. 피펫팅 장치는 그 다음 384웰 플레이트에서 샘플과 HTRF® 시약을 혼합하고, 이를 항온배양을 위한 보관실로 이송한다. 2시간 후, 플레이트를 665nm 및 620nm에서의 측정을 위해 판독기로 이동시킨다. 샘플 추적은 바코드화된 플레이트와 바코드 판독기로 확인한다.
유로퓸 크립테이트 공여체에 대한 항 h IgG(Fc)의 접합
먼저, 항체를 50mM 인산염 완충액(pH 8)에서 투석한 뒤, 밀리포어사의 Biomax 팁(컷오프 30,000MW)을 이용하여 1mg/ml로 농축했다. 그 다음, 항체는 N-하 이드록시-석신이미드 활성화된 크립테이트와 15 크립테이트/항체의 몰비로 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 마지막으로 G25 초미세 겔에서 항체 크립테이트 접합체를 미반응 형광단으로부터 정제했다.
D2 수용체에의 항 h 카파 경쇄의 접합
먼저, 항체를 50mM 인산염 완충액(pH 8.5)에서 투석한 뒤, 밀리포어사의 Biomax 팁(컷오프 30,000MW)을 이용하여 1mg/ml로 농축했다. 그 다음, 항체는 N-하이드록시-석신이미드 활성화된 D2와 5 D2/항체의 몰비로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 G25 초미세 겔에서 항체 D2 접합체를 미반응 형광단으로부터 정제했다.
실시예
1:
무균 환경에서 CHO 세포의 배양 상청액에 존재하는 IgG 항체의 HRTF 기반 측정을 수행하는 로봇식 플랫폼
도 1의 B)는 사용된 즉시-초기 선별 구성의 모식도이다. FACS 기반 단일 세포 공급에 이어서 96웰에서 증식하는 세포의 배양 상청액의 산물 역가를 측정했다. 또한, 역가 측정은 고생산자 클론의 고처리량 초기 선별을 위해 384웰 포맷에서 완전 자동화된 방식으로 수행했다.
표준적인 ELISA 대신에 사용한 당해 HTRF 분석의 유용성을 평가하기 위해, 여러 IgG 생산 CHO 세포 집단을 항체 생산에 대하여 두 분석법으로 함께 분석했다 (도 2). 또한, 현재의 96웰 포맷에서 384웰 포맷으로의 변환이 어떻게 분석 성능에 영향을 미칠 수 있는지를 평가했다. 도 2는 광범위한 절대 항체 농도 0.025 내지 10mg/l에서 모든 세포 집단의 3가지 분석 포맷 간의 높은 상관관계를 나타낸다. 종합하면, 384웰 HTRF 포맷을 기반으로 한 CHO 세포 집단의 모든 생산성 기반 랭킹은 기본 ELISA 포맷을 이용한 경우와 동일한 결과를 제공했다.
384웰 HTRF 포맷은 자동화되었고 세포 클론을 함유하는 96웰 플레이트 42개를 보유한 소스 항온배양기에 연결시켰다. 즉시-초기 클론 선별 플랫폼의 설계는 도 3에 도시했다. 이 플랫폼은 Freedom EVO 200 기본 모듈(Tecan, 스위스), Te-MO-96 3/5, Te-MO WRC 및 Te-MO Refill 스테이션(Tecan, 스위스)으로 이루어진 피펫팅 장치, Ultra Evolution 판독기(Tecan), LPR240 Karussell(Liconics), Cytomat 2C 항온배양기(Thermo) 및 전산 장치(Dell)로 구성된다. 항온배양기는 모든 플레이트를 에어락을 통해 중심 피펫팅 장치로 순차적으로 제공했고, 각 배양물 상청액의 샘플을 채취했다. 초기 희석 단계 이후, 모든 추가 반응은 384웰에서 수행했다. 샘플은 4회의 연속 희석하여 공여체 및 수용체 용액과 함께 항온배양했다. 플레이트는 측정에 앞서 2시간 동안 항온배양했다. 플랫폼은 FACTS 소프트웨어(Tecan, 스위스)를 이용하여 최대 처리량으로 최적화시켰다. 이러한 계획은 42개 세포 배양물 소스 플레이트로부터 HRTF 기반 항체 정량이 약 12시간 내에 이루어지게 했다. 이것은 1회 실행에서 4000개가 넘는 모노클로날 세포주를 항체 분비에 대해 선별할 수 있는 능력으로 해석된다. 현재의 처리량 역시 같은 날에 다른 항온배양기 장치를 선별하게 했다. 3일마다의 역가 측정으로 추정해 볼 때, 당해 자동화된 선별 플 랫폼은 24000개의 모노클로날 세포주 상청액을 동시에 선별할 수 있을 것이다.
실시예
2
IgG 4 타입 항체를 생산하는 모노클로날 CHO 세포의 자동화된 즉시-초기 선별
IgG 4 타입 항체를 암호화하는 유전자로 화학적 제한 무혈청 배지에서 증식한 CHO DG44 세포를 형질감염시키고, 네오마이신에 의한 선별을 통해 안정한 세포 풀을 생성했다. 세포를 전술한 자가 지지세포의 사용을 비롯한 FACS 기반 단일 세포 클로닝으로 처리했다. 단일 세포 클로닝 후 15일의 기간이 지난 다음, 42개 플레이트를 자동 항온배양기로 이송하고, 즉시-초기 클론 선별 프로그램을 개시시켰다. 모든 클론 배양물의 상청액을 3일마다 채취하고, 항체 농도는 당해 HTRF 분석으로 측정했다.
도 4는 96웰에서 단일 세포로부터 증식시킨 16개 대표 클론 CHO 배양물(패널 1 내지 16으로 표시)의 결과를 나타낸다. 대부분의 배양물에서, 역가 곡선은 단일 세포 공급 후 약 15일 경에 지수 증식기로 들어간 것을 나타낸다(예: 패널 4, 11 및 14의 클론). 하지만, 일부 배양물은 항체 농도가 15일과 25일 사이에 이미 정체기(plateau)에 도달한, 더욱 빠른 증식 속도론을 입증했다(예: 패널 8 및 12의 클론).
일부 배양물은 마지막 측정 시점에서 지수 증식기 초기에 막 들어갔다(예: 패널 9과 13의 클론).
선별 절차에서 시간 틀 및/또는 채취 샘플의 수를 제한하는 것이 바람직한 경우에, 당해 구성은 상기 클론들의 역가 포텐셜을 추정하는데 사용될 수 있는 전형적인 역가 프로파일을 작성할 수 있게 해준다(수학적 모델링 접근법). 역가 포텐셜은 1차 계대 전에 배양물이 도달할 수 있는 최종 단백질 농도를 의미한다.
이들 데이터는 이러한 즉시-초기 선별 개념이 고 생산자 및 저 생산자 클론을 신속하게 구별하여 이 초기 선별에서 수천개의 클론을 포함할 수 있게 하는 방식을 입증해준다.
실시예
3
IgG1 타입 항체를 생산하는 모노클로날 CHO 세포의 자동화된 즉시-초기 선별 및 이후의 MAT6 웰에서의 부차배양, 및 즉시-초기 클론 선별과 MAT6 규모에서의 생산성의 비교
IgG1 타입 항체를 암호화하는 유전자로 화학적 제한 무혈청 배지에서 증식한 CHO DG44 세포를 형질감염시키고, 네오마이신에 의한 선별을 통해 안정한 세포 풀을 생성했다. 세포를 전술한 자가 지지세포의 사용을 비롯한 FACS 기반 단일 세포 클로닝으로 처리했다. 단일 세포 클로닝 후 10일의 기간이 지난 다음, 플레이트를 자동 항온배양기로 이송하고, 즉시-초기 클론 선별 프로그램을 개시시켰다. 모든 클론 배양물의 상청액을 2 내지 3일마다 4회 채취하고, 항체 농도는 당해 HTRF 분석으로 측정했다.
클론은 단일 세포 공급 후 17일째에 취하여, 6웰 플레이트에서 증량시킨 뒤, 3회 계대 동안에 역가를 측정했다. IECS에서 고 역가인 클론은 MAT6 규모에서 높은 역가를 나타냈고, 5개의 상위 클론 중 4개 클론이 두 포맷에서 동일하였다. 도 5에 도시된 데이터는 당해의 즉시-초기 클론 선별 개념에 의해 측정된 역가 곡선이, 항체와 같은 치료용 단백질의 높은 생산 속도 및 수율에 대해, 새로 생성된 모노클로날 생산 세포주의 잠재력을 예측한다는 것을 입증한다.
실시예
4
IgG1 타입 항체를 생산하는 모노클로날 NS0 세포의 자동화된 즉시-초기 선별
IgG1 타입 항체를 암호화하는 유전자로 화학적 제한 무혈청 배지에서 증식한 NS0 세포를 형질감염시키고, 네오마이신과 퓨로마이신에 의한 선별을 통해 안정한 세포 풀을 생성했다. 세포를 전술한 재료 및 방법 섹션에서 설명한 FACS 기반 단일 세포 클로닝으로 처리했다. 단일 세포 클로닝 후 15일의 기간이 지난 다음, 42개 플레이트를 자동 항온배양기로 이송하고, 즉시-초기 클론 선별 프로그램을 개시시켰다. 모든 클론 배양물의 상청액을 3일마다 채취하고, 항체 농도는 당해 HTRF 분석으로 측정했다. 이들 데이터에 따라 클론의 랭킹을 정하고, 이어서 선별 클론을 채취하여 6웰 플레이트에서 증량시킨 뒤, 3회 계대 동안 역가를 측정하여 앞에서 얻은 데이터를 확인했다.
Claims (43)
- a) 목적 단백질을 발현하는 단일 세포를 배양 배지에서 각 용기에 공급하는 단계,b) 상기 세포를 1일 이상 동안 배양하는 단계,c) 세포가 최초로 계대되기 전에 각 용기로부터 배양물의 일정량을 채취하는 단계,d) 각 일정량 중에 존재하는 목적 단백질의 양을 측정하는 단계, 및e) 각 일정량에서 측정된 단백질의 양에 따라 클론을 선별하는 단계를 특징으로 하는, 세포 클론의 선별 방법.
- 제1항에 있어서, 처리량이 12시간 내에 250회 이상의 측정, 바람직하게는 12시간 내에 500회 측정, 보다 바람직하게는 12시간 내에 2000회 측정, 가장 바람직하게는 12시간 내에 4000회 이상의 측정인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 c)가, 클래스 A 입자 부하량이 1m3당 입자 100개 미만인 무균 환경에서 수행되는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 단계가 멀티웰(multi-well) 플레이트에서 수행되는 방법.
- 제4항에 있어서, 적어도 단계 d)가 멀티웰 플레이트에서 수행되는 방법.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 멀티웰 플레이트가 96웰 플레이트 또는 384웰 플레이트, 바람직하게는 384웰 플레이트인 방법.
- 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)가 96웰 플레이트에서 수행되고 단계 d)가 384웰 플레이트에서 수행되는 방법.
- a. 목적 단백질을 발현하는 단일 세포를 세포 배양 배지에서 멀티웰 용기에 공급하는 단계;b. 유도된 세포 배양물을 최대 10회까지 계대하는 단계;c. 상기 멀티웰 용기를 항온배양기로 이송하는 단계;d. 상기 멀티웰 용기를 항온배양기로부터 에어락(airlock)을 통해, 클래스 A 입자 부하량이 1m3당 100개 미만의 입자인 무균 환경으로 순차적으로 이송하는 단계,e. 각 용기로부터 배양물의 일정량을 채취하는 단계,f. 샘플을 피펫팅 장치로 희석하면서 세포를 항온배양기로 다시 이송하는 단계,g. 희석된 샘플과 분석 시약을 다른 멀티웰 용기 속으로 혼합하는 단계,h. 단계 g)의 멀티웰 용기를 항온배양을 위한 보관실로 이송하는 단계,i. 단계 h)의 멀티웰 플레이트를 판독기로 이동시키는 단계, 및j. 각 용기에 존재하는 목적 단백질의 양을 측정하는 단계를 특징으로 하며,k. 이로 인해 처리량이 12시간 내에 250회 이상의 측정, 바람직하게는 12시간 내에 500회 측정, 보다 바람직하게는 12시간 내에 2000회 측정, 가장 바람직하게는 12시간 내에 4000회 이상의 측정인, 세포 클론의 선별 방법.
- 제8항에 있어서, 샘플 추적이 바코드화된 플레이트 및 바코드 판독기에 의해 보장되는 방법.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 단계 b)에서의 계대 횟수가 0이고, 단계 e)는 세포가 최초로 계대되기 전에 수행되는 방법.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 멀티웰 플레이트가 96웰 플레이트 또는 384웰 플레이트, 바람직하게는 384웰 플레이트인 방법.
- 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, a) 내지 e)가 96웰 플레이트에서 수행되고, 단계 g) 내지 j)가 384웰 플레이트에서 수행되는 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)의 세포가, 목적 단백질을 발현하기 위해서 목적 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질감염된 세포인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 세포가, 형광 활성화된 세포 분류법(FACS) 또는 한계 희석법에 의해서 생성된 세포인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항에 따르는 방법의 단계 b)에서의 배양 시간 및 제9항에 따르는 방법의 단계 b)에서의 1차 계대와 이후 계대 사이의 시간이 1일 내지 60일 또는 1일 내지 30일 또는 5일 내지 60일 또는 5일 내지 30일 또는 10일 내지 60일 또는 10일 내지 30일 또는 5일 내지 30일 또는 5일 내지 25일이거나, 바람직하게는 14일 내지 25일인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항에 따르는 방법의 단계 c)에서의 일정량과 제9항에 따르는 방법의 단계 e)에서의 일정량이 세포 배양 상청액으로부터 채취된 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 일정량의 부피가 20㎕ 미만, 10㎕ 미만, 5㎕ 미만이고, 바람직하게는 0.2 내지 5㎕ 범위, 가장 바람직하게는 0.5 내지 2㎕ 범위인 방법.
- 제16항에 있어서, 일정량이 세포 배양물 부피의 2.5%(v/v) 미만이고, 단백질 측정의 검출 민감도가 1mg/l 이상인 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)의 세포 배양 배지의 부피가 500㎕, 300㎕ 또는 바람직하게는 200㎕인 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 측정 단계가 효소 연결된 면역흡착 측정법(ELISA) 또는 바람직하게는 균일 시간분해 형광 분석법(HTRF), 바람직하게는 HTRF에 의해 수행되는 방법.
- 제17항에 있어서, HTRF 분석이a. IgG 타입 항체의 Fc 부분 및b. IgG 타입 항체의 경쇄에 대한 검출 항체를 포함하는 방법.
- 제21항에 있어서, 검출 항체가 유로퓸 크립테이트 공여체에 접합된 항 h IgG(Fc) 및 D2 수용체에 접합된 항 h 카파 경쇄인 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 무혈청 및/또는 동물성 성분 미함유 및/또는 단백질 미함유 및/또는 화학적 제한 배지인 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 현탁 배양물에서 증식되는 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 선별된 클론이, 목적 단백질을 다량으로 발현하는 것으로 측정된 상위 30%, 바람직하게는 상위 20%, 가장 바람직하게는 상위 10%의 세포를 나타내는 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 자가 지지세포(feeder cell)의 사용을 또한 특징으로 하는 방법
- 제26항에 있어서, 공급되는 세포가 CHO 또는 BHK 세포인 경우에 사용되는 지지세포는 햄스터 세포이고, 공급되는 세포가 NSO 세포인 경우에는 지지세포로서 마우스 골수종 세포가 사용되는 방법.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, 공급된 세포가 배지 1ml당 100개 내지 200,000개의 지지세포의 존재 하에 증식되는 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 목적 단백질이 치료용 단백질인 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 항체, 특히 치료용 항체인 방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 공급된 세포가 햄스터 세포, 예를 들어, CHO 또는 BHK 세포인 방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 공급된 세포가 마우스 골수종 세포, 예를 들어, NSO 세포인 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따르는 방법을 사용하여 세포주 개발시 처리량을 증가시키는 방법.
- a. 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 함유하는 진핵생물 세포를 생성하는 단계,b. 상기 세포의 증식을 허용하는 무혈청 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계,c. 96웰 플레이트와 같은 멀티웰 용기에 단일 세포를 공급하는 단계,d. 상기 단일 세포를 경우에 따라 자가 지지세포의 존재 하에 배양하는 단계,e. 제1항 내지 제33항에 따르는 방법 중 어느 한 방법에 따라 클론 세포를 선별하는 단계,f. 목적 단백질을 다량으로 발현하는 것으로 측정된 상위 30%, 바람직하게는 상위 20%, 가장 바람직하게는 상위 10%의 선별된 세포를 배양하는 단계,g. 상청액으로부터 세포의 분리 등에 의해 목적 단백질을 수거하는 단계, 및h. 목적 단백질을 정제하는 단계를 특징으로 하는, 무혈청 배양 조건 하에서 진핵생물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포에서 단백질을 생산하는 방법.
- 제34항에 있어서, 목적 단백질이 재조합 단백질인 방법.
- 제34항 또는 제35항에 있어서, 목적 단백질이 치료용 단백질인 방법.
- 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 목적 단백질이 항체인 방법.
- 제34항 내지 제37항에 따르는 방법 중 어느 한 방법에 의해 생산된 단백질 산물.
- 제1항 내지 제32항에 따르는 방법 중 어느 한 방법을 사용하여 생산자 숙주 세포주를 선별하는 방법.
- 제39항에 따르는 방법에 의해 선별된 생산자 숙주 세포주.
- 제40항에 있어서, 숙주 세포가 진핵생물 세포, 특히 포유동물 세포인 생산자 숙주 세포주.
- 제41항에 있어서, 숙주 세포가 햄스터 또는 마우스 골수종 세포, 특히 CHO 또는 BHK 세포 또는 NSO 세포인, 생산자 숙주 세포주.
- 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따르는 생산자 숙주 세포주의, 생물약제 단백질 제조를 위한 용도.
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