KR20090068358A - 골량 감소증 모델 동물 - Google Patents

Abstract

본 발명은, RANKL을 투여함으로써 골량 감소증 모델 동물을 작출하는 방법 및 골량 감소증 모델 동물을 제공한다.

본 발명은, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 비인간 동물에 투여하여, 상기 비인간 동물 체내에서의 파골세포의 분화 및 활성화를 촉진시키는 것을 포함하는 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법 및 상기 방법에 의해 작출된 골량 감소증 모델 동물에 관한 것이다.

골량 감소증 모델 동물, 가용형 RANKL, 에피토프 태그, 융합 단백질

Description

골량 감소증 모델 동물{OSTEOPENIA MODEL ANIMAL}

본 발명은, 골량이 정상 동물에 비해 감소한 골량 감소증 모델 동물에 관한 것이다.

골 파괴를 담당하는 파골세포는 단구ㆍ대식세포계의 조혈 세포에서 유래하는 대형의 다핵 세포이다. 그 전구 세포는 골 표면에서 골아세포/간질 세포에 의한 조절을 받아 파골세포로 분화ㆍ성숙된다. 파골세포 분화 인자(RANKL; receptor activator of NF-κB ligand)는, 골 흡수 인자에 의해 골아세포/간질 세포 상에 유도되는 종양 괴사 인자(TNF; tumor necrosis factor) 패밀리에 속하는 막 결합 단백질이며, 파골세포의 분화ㆍ성숙에 필수적인 인자이다(비특허 문헌 1 및 2를 참조). RANKL의 일부는 세포외 영역에서 메탈로프로테아제에 의해 절단되어, 가용형이 된다는 것이 알려져 있다. 실제로 가용형 RANKL은 시험관내에서 M-CSF와의 공존하에 골수세포, 비장 세포, 말초혈 중의 전구 세포, 또는 대식세포 세포주 등의 대식세포계의 전구 세포로부터 파골세포를 유도한다는 것이 알려져 있다.

한편, 현재까지 골량 감소증의 모델로서는 난소 적출(비특허 문헌 3 내지 6을 참조), 저칼슘식(비특허 문헌 7 및 8을 참조), 신경 절제(비특허 문헌 9를 참조), 뒷다리 부유에 의한 부동화(비특허 문헌 10을 참조) 등의 방법이 행해졌지만, 어떠한 방법도 골량 감소증이 발증할 때까지 1 내지 4주일 정도의 기간을 필요로 하였다. 그 때문에, 골 흡수 억제제(비스포스포네이트, 카텝신 K 저해제 등)나 골 형성 촉진제(부갑상선 호르몬(PTH) 등) 등의 약제의 평가에 시간이 걸렸다. 또한, 상기한 동물 모델은 에스트로겐의 소실, PTH의 증가 등에 의해 간접적으로 파골세포를 활성화시키기 때문에, 약물의 평가를 행할 때 생체내에서 어떠한 과정에 효력이 있는지를 증명하는 것이 용이하지 않았다.

비특허 문헌 1: Yasuda 외, Proc Natl Acad Sci USA 95: 3597, 1998

비특허 문헌 2: Lacey 외, Cell 93: 165, 1998

비특허 문헌 3: Thompson 외, Bone 17(Suppl.): S125, 1995

비특허 문헌 4: Wronski 외, Calcif Tissue Int 42: 179, 1988

비특허 문헌 5: Wronski 외, Endocrinology 123: 681, 1988

비특허 문헌 6: Wronski 외, Calcif Tissue Int 45: 360, 1989

비특허 문헌 7: de Winter 외, Calcif Tissue Res 17: 303, 1975

비특허 문헌 8: Geusens 외, J Bone Miner Res 6: 791, 1991

비특허 문헌 9: Wakley 외, Calcif Tissue Int 43, 383, 1988

비특허 문헌 10: Globus 외, J Bone Miner Res 1: 191, 1986

<발명의 개시>

본 발명은, RANKL을 투여함으로써 골량 감소증 모델 동물을 작출하는 방법 및 골량 감소증 모델 동물의 제공을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 종래의 골량 감소증 모델 동물의 문제점을 해소할 수 있는 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법에 대하여 예의 검토를 행하였다. 그 결과, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 비인간 동물에 투여함으로써, 직접 파골세포를 활성화하고, 골량 감소를 신속하게 (수일 사이 내에) 발생시킬 수 있으며, 골량 감소증 모델 동물을 작출할 수 있다는 것을 발견하였다. 이 골량 감소증 모델 동물은 신속한 약물 평가에 유효하다. 본 발명의 골량 감소증 모델 동물에서의 골량 감소의 메커니즘은 RANKL에 의한 파골세포의 분화ㆍ활성화 촉진이라는 매우 단순한 것이며, 순수하게 파골세포의 저해제(비스포스포네이트, 카텝신 K 저해제 등)를 개발하는 경우에는, 평가계로서 매우 유효하다. 또한, 1회의 골량 감소가 발생한 후 본래대로 되돌아갈 때까지의 속도를 비교함으로써, 골량을 증가시키는 약제(PTH 등)의 평가에도 사용할 수 있다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1] 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 비인간 동물에 투여하여, 상기 비인간 동물 체내에서의 파골세포의 분화 및 활성화를 촉진시키는 것을 포함하는 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.

[2] 상기 [1]에 있어서, 에피토프 태그가 글루타티온-S-트랜스퍼라아제인 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.

[3] 상기 [1] 또는 [2]에 있어서, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 비인간 동물에 투여한 후, 1주일 이내에 골량 감소증 모델 동물을 작출할 수 있는 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.

[4] 상기 [3]에 있어서, 50 시간 이내에 골량 감소증 모델 동물을 작출할 수 있는 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.

[5] 상기 [4]에 있어서, 24 시간 이내에 골량 감소증 모델 동물을 작출할 수 있는 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.

[6] 비인간 동물이 설치류에 속하는 동물인 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 골량 감소증 모델 동물.

[7] 상기 [6]에 있어서, 비인간 동물이 마우스인 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.

[8] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질의 투여량을 변경함으로써, 중증도가 상이한 골량 감소증 모델 동물을 작출하는 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.

[9] 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 있어서, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 투여하는 동물로부터 추가로 난소를 적출하는 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.

[10] 상기 [9]에 있어서, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 비인간 동물에 투여한 후, 72 시간 이내에 골량 감소증 모델 동물을 작출할 수 있는 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.

[11] 상기 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 작출된 골량 감소증 모델 동물.

[12] 상기 [11]에 있어서, 체내의 골 흡수 마커 레벨이 정상 개체에 비해 상승한 골량 감소증 모델 동물.

[13] 상기 [11]에 있어서, 골 밀도 및/또는 단위 골량이 정상 개체에 비해 저하된 골량 감소증 모델 동물.

[14] 상기 [13]에 있어서, 추가로 파골세포수 및/또는 골소주수가 정상 개체에 비해 저하된 골량 감소증 모델 동물.

[15] 상기 [11] 내지 [14] 중 어느 하나에 있어서, 혈중 에스트로겐 농도, 혈중 PTH 농도 및 혈중 OPG 농도 중 적어도 하나가 정상 개체에 비해 변동되지 않은 골량 감소증 모델 동물.

[16] 상기 [11] 내지 [15] 중 어느 하나에 기재된 골량 감소증 모델 동물에 골 흡수 억제제 또는 골 흡수 억제제 후보 물질을 투여하고, 골량 감소증 모델 동물에서의 감소된 골량이 증가하는지의 여부를 지표로 하여 상기 골 흡수 억제제 또는 골 흡수 억제제 후보 물질의 효과를 평가하는 방법이며, 골량이 증가한 경우 골 흡수 억제에 효과가 있다고 판정하는 골 흡수 억제제 또는 골 흡수 억제제 후보 물질을 평가하는 방법.

[17] 상기 [16]에 있어서, 골량의 증가를 골량 감소증 모델 동물에서의 체내의 골 흡수 마커 레벨의 상승, 골 밀도의 상승, 단위 골량의 상승, 골소주수의 상승, 파골세포수의 저하, 골아세포면의 저하 및 CT에 의해 관찰되는 골량의 증가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 지표로 판단하는 골 흡수 억제제 또는 골 흡수 억제제 후보 물질을 평가하는 방법.

[18] 상기 [11] 내지 [15] 중 어느 하나에 기재된 골량 감소증 모델 동물에 골 형성 촉진제 또는 골 형성 촉진제 후보 물질을 투여하고, 골량 감소증 모델 동물에서의 감소된 골량이 증가하는지의 여부를 지표로 하여 상기 골 형성 촉진제 또는 골 형성 촉진제 후보 물질의 효과를 평가하는 방법이며, 골량이 증가한 경우 골 형성 촉진에 효과가 있다고 판정하는 골 형성 촉진제 또는 골 형성 촉진제 후보 물질을 평가하는 방법.

[19] 상기 [18]에 있어서, 골량의 증가를 골량 감소증 모델 동물에서의 체내의 골 형성 마커 레벨의 상승, 골 밀도의 상승, 단위 골량의 상승, 골소주수의 상승, 파골세포수의 저하, 골아세포면의 상승 및 CT에 의해 관찰되는 골량의 증가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 지표로 판단하는 골 형성 촉진제 또는 골 형성 촉진제 후보 물질을 평가하는 방법.

[20] 상기 [8]에 기재된 방법에 의해 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 투여하고 추가로 난소를 적출하여 작출된 골량 감소증 모델 동물에 호르몬 또는 호르몬 수용체 모듈레이터를 투여하고, 골량 감소증 모델 동물에서의 감소된 골량이 증가하는지의 여부를 지표로 하여 상기 호르몬 또는 호르몬 수용체 모듈레이터의 효과를 평가하는 방법이며, 골량이 증가한 경우 골 흡수 억제에 효과가 있다고 판정하는 호르몬 또는 호르몬 수용체 모듈레이터를 평가하는 방법.

[21] 상기 [20]에 있어서, 호르몬 또는 호르몬 수용체 모듈레이터가 선택적 에스트로겐 수용체 모듈레이터인 호르몬 또는 호르몬 수용체 모듈레이터를 평가하는 방법.

[22] 상기 [20] 또는 [21]에 있어서, 골량의 증가를 골량 감소증 모델 동물에서의 체내의 골 형성 마커 레벨의 상승, 골 밀도의 상승, 단위 골량의 상승, 골소주수의 상승, 파골세포수의 저하, 골아세포면의 상승 및 CT에 의해 관찰되는 골량의 증가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 지표로 판단하는 호르몬 또는 호르몬 수용체 모듈레이터를 평가하는 방법.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2006-278029호, 2007-095017호 및 국제 특허 출원 PCT/JP2007/063871호의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.

도 1은, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 혈중 Ca 농도를 나타내는 도면이다.

도 2는, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 혈중 CTx 농도를 나타내는 도면이다.

도 3은, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 혈중 TRAP-5b 농도를 나타내는 도면이다.

도 4는, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 혈중 오스테오칼신 농도를 나타내는 도면이다.

도 5는, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 혈중 ALP 농도를 나타내는 도면이다.

도 6은, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 대퇴골 의 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 7은, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 경골의 단위 골량을 나타내는 도면이다.

도 8은, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 경골의 파골세포수를 나타내는 도면이다.

도 9는, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 경골의 골소주수를 나타내는 도면이다.

도 10은, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스의 대퇴골의 마이크로 CT에 의해 측정한 골 형태를 나타내는 사진이다.

도 11은, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 경골의 골아세포면을 나타내는 도면이다.

도 12는, GST-RANKL을 213 nmol 내지 852 nmol 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 혈중 Ca 농도를 나타내는 도면이다.

도 13은, GST-RANKL을 213 nmol 내지 852 nmol 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 혈중 CTx 농도를 나타내는 도면이다.

도 14는, GST-RANKL을 213 nmol 내지 852 nmol 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 혈중 TRAP-5b 농도를 나타내는 도면이다.

도 15는, GST-RANKL을 213 nmol 내지 852 nmol 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 대퇴골의 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 16은, GST-RANKL을 213 nmol 내지 852 nmol 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스의 대퇴골의 마이크로 CT에 의해 측정한 골 형태를 나타내는 사진이다.

도 17은, GST-RANKL을 투여하여 작출한 골량 감소증 모델 마우스에 리세드로네이트를 투여한 경우의 혈중 TRAP-5b 농도를 나타내는 도면이다.

도 18은, GST-RANKL을 투여하여 작출한 골량 감소증 모델 마우스에 리세드로네이트를 투여한 경우의 혈중 CTx 농도를 나타내는 도면이다.

도 19는, GST-RANKL을 투여하여 작출한 골량 감소증 모델 마우스에 리세드로네이트를 투여한 경우의 혈중 ALP 농도를 나타내는 도면이다.

도 20은, GST-RANKL을 투여하여 작출한 골량 감소증 모델 마우스에 리세드로네이트를 투여한 경우의 혈중 오스테오칼신 농도를 나타내는 도면이다.

도 21은, GST-RANKL을 투여하여 작출한 골량 감소증 모델 마우스에 리세드로네이트를 투여한 경우의 대퇴골의 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 22는, GST-RANKL을 투여하여 작출한 골량 감소증 모델 마우스에 리세드로네이트를 투여한 마우스의 대퇴골의 마이크로 CT에 의해 측정한 골 형태를 나타내는 사진이다.

도 23은, 가용형 RANKL을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 혈중 Ca 농도를 나타내는 도면이다.

도 24는, 가용형 RANKL을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 혈중 CTx 농도를 나타내는 도면이다.

도 25는, 가용형 RANKL을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 혈중 TRAP-5b 농도를 나타내는 도면이다.

도 26은, 가용형 RANKL을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 혈중 오스테오칼신 농도를 나타내는 도면이다.

도 27은, 가용형 RANKL을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 혈중 ALP 농도를 나타내는 도면이다.

도 28은, 가용형 RANKL을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스에서의 대퇴골의 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 29는, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 PBS를 투여한 마우스에서의 단위 골량을 나타내는 도면이다.

도 30은, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 PBS를 투여한 마우스에서의 골소주폭을 나타내는 도면이다.

도 31은, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 PBS를 투여한 마우스에서의 골소주수를 나타내는 도면이다.

도 32는, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 PBS를 투여한 마우스에서의 유골(類骨) 두께를 나타내는 도면이다.

도 33은, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 PBS를 투여한 마우스에서의 흡수면을 나타내는 도면이다.

도 34는, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 PBS를 투여한 마우스에서의 파골세포수를 나타내는 도면이다.

도 35는, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 PBS를 투여한 마우스에서의 파골세포면을 나타내는 도면이다.

도 36은, GST-RANKL을 투여한 마우스 및 PBS를 투여한 마우스에서의 파골세포의 증가를 나타내는 TRAP 염색상을 나타내는 사진이다.

도 37은, GST-RANKL을 투여한 마우스에 리세드로네이트를 투여한 경우의 혈중 Ca, TRAP-5b 및 ALP 농도를 나타내는 도면이다.

도 38은, GST-RANKL을 투여한 마우스에 리세드로네이트를 투여한 경우의 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 39는, GST-RANKL을 투여한 마우스에 리세드로네이트를 투여한 경우의 마이크로 CT를 사용한 화상 해석의 결과를 나타내는 사진이다.

도 40은, GST-RANKL을 투여한 마우스에 에티드로네이트, 알렌드로네이트 또는 리세드로네이트를 투여한 경우의 혈중 Ca, ALP 및 TRAP-5b 농도를 나타내는 도면이다.

도 41은, GST-RANKL을 투여한 마우스에 에티드로네이트, 알렌드로네이트 또는 리세드로네이트를 투여한 경우의 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 42는, GST-RANKL을 투여한 마우스에 에티드로네이트, 알렌드로네이트 또는 리세드로네이트를 투여한 경우의 마이크로 CT를 사용한 화상 해석의 결과를 나타내는 사진이다.

도 43은, GST-RANKL을 투여하여 난소를 적출한 마우스의 혈중 Ca, TRAP-5b 및 ALP 농도를 나타내는 도면이다.

도 44는, GST-RANKL을 투여하여 난소를 적출한 마우스의 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 45는, GST-RANKL을 투여하여 난소를 적출한 마우스의 마이크로 CT를 사용한 화상 해석의 결과를 나타내는 사진이다.

도 46은, C57BL/6 마우스에 GST-RANKL 및 PBS를 투여한 경우의 혈중 Ca, ALP 및 TRAP-5b 농도를 나타내는 도면이다.

도 47은, C57BL/6 마우스에 GST-RANKL 및 PBS를 투여한 경우의 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 48은, C57BL/6 마우스에 GST-RANKL 및 PBS를 투여한 경우의 마이크로 CT를 사용한 화상 해석의 결과를 나타내는 사진이다.

도 49는, GST-RANKL을 투여하여 난소를 적출한 마우스에 PTH를 투여한 경우의 혈중 Ca, ALP 및 TRAP-5b 농도를 나타내는 도면이다.

도 50은, GST-RANKL을 투여하여 난소를 적출한 마우스에 PTH를 투여한 경우의 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 51은, GST-RANKL을 투여하여 난소를 적출한 마우스에 PTH를 투여한 경우의 마이크로 CT를 사용한 화상 해석의 결과를 나타내는 사진이다.

도 52는, GST-RANKL 및 PBS를 투여한 수컷 마우스의 혈중 Ca, ALP 및 TRAP-5b 농도를 나타내는 도면이다.

도 53은, GST-RANKL 및 PBS를 투여한 수컷 마우스의 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 54는, GST-RANKL 및 PBS를 투여한 수컷 마우스의 마이크로 CT를 사용한 화상 해석의 결과를 나타내는 사진이다.

도 55는, GST-RANKL 및 PBS를 투여한 ICR 마우스의 혈중 Ca, ALP 및 TRAP-5b 농도를 나타내는 도면이다.

도 56은, GST-RANKL 및 PBS를 투여한 ICR 마우스의 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 57은, GST-RANKL 및 PBS를 투여한 ICR 마우스의 마이크로 CT를 사용한 화상 해석의 결과를 나타내는 사진이다.

도 58은, GST-RANKL 및 PBS를 투여한 피셔 래트(Fischer rat)의 혈중 Ca, ALP 및 TRAP-5b 농도를 나타내는 도면이다.

도 59는, GST-RANKL 및 PBS를 투여한 피셔 래트의 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 60은, GST-RANKL 및 PBS를 투여한 피셔 래트의 마이크로 CT를 사용한 화상 해석의 결과를 나타내는 사진이다.

도 61은, GST-RANKL을 단회 투여한 마우스의 혈청중 RANKL 농도를 나타내는 도면이다.

도 62는, GST-RANKL 및 PBS를 단회 투여한 마우스의 혈청중 Ca, ALP 및 TRAP-5b 농도를 나타내는 도면이다.

도 63은, GST-RANKL 및 PBS를 단회 투여한 마우스의 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 64는, GST-RANKL 및 PBS를 단회 투여한 마우스의 마이크로 CT를 사용한 화상 해석의 결과를 나타내는 사진이다.

도 65는, GST-RANKL 및 PBS를 7일간 연속 투여한 마우스의 혈청중 Ca, ALP 및 TRAP-5b 농도를 나타내는 도면이다.

도 66은, GST-RANKL 및 PBS를 7일간 연속 투여한 마우스의 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 67은, GST-RANKL 및 PBS를 7일간 연속 투여한 마우스의 마이크로 CT를 사용한 화상 해석의 결과를 나타내는 사진이다.

도 68은, GST-RANKL 및 PBS를 두개관에 투여한 마우스의 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 69는, GST-RANKL 투여 마우스에 LFM-A13을 투여한 경우의 골량을 나타내는 사진이다.

도 70은, GST-RANKL 투여 마우스에 LFM-A13을 투여한 경우의 단위 골량(골량/조직량)을 나타내는 도면이다.

도 71은, GST-RANKL 투여 마우스에 LFM-A13을 투여한 경우의 골소주폭(골소주/두께)을 나타내는 도면이다.

도 72는, GST-RANKL 투여 마우스에 LFM-A13을 투여한 경우의 골소주수(골소주/수)를 나타내는 도면이다.

도 73은, GST-RANKL 투여 마우스에 LFM-A13을 투여한 경우의 파골세포수(파골세포수/골 둘레 길이)를 나타내는 도면이다.

도 74는, GST-RANKL 투여 마우스에 LFM-A13을 투여한 경우의 흡수면(침식된 표면/골 표면)을 나타내는 도면이다.

도 75는, GST-RANKL 투여 마우스에 LFM-A13을 투여한 경우의 혈중 Ca 농도를 나타내는 도면이다.

도 76은, 난소를 적출한 GST-RANKL 투여 마우스에 랄록시펜을 투여한 경우의 혈청중 Ca, ALP 및 TRAP-5b 농도를 나타내는 도면이다.

도 77은, 난소를 적출한 GST-RANKL 투여 마우스에 랄록시펜을 투여한 경우의 전체 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 78은, 난소를 적출한 GST-RANKL 투여 마우스에 랄록시펜을 투여한 경우의 피질골 염량을 나타내는 도면이다.

도 79는, 난소를 적출한 GST-RANKL 투여 마우스에 랄록시펜을 투여한 경우의 피질골 두께를 나타내는 도면이다.

도 80은, 난소를 적출한 GST-RANKL 투여 마우스에 랄록시펜을 투여한 경우의 마이크로 CT를 사용한 화상 해석의 결과를 나타내는 사진이다.

도 81은, 난소를 적출한 GST-RANKL 투여 마우스에 랄록시펜을 투여한 경우의 혈중 Ca, ALP 및 TRAP-5b 농도를 나타내는 도면이다.

도 82는, 난소를 적출한 GST-RANKL 투여 마우스에 랄록시펜을 투여한 경우의 해면골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 83은, GST-RANKL 투여 마우스에 PTH를 투여한 경우의 전체 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 84는, GST-RANKL 투여 마우스에 PTH를 투여한 경우의 피질골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 85는, GST-RANKL 투여 마우스에 PTH를 투여한 경우의 피질골 염량을 나타내는 도면이다.

도 86은, GST-RANKL 투여 마우스에 PTH를 투여한 경우의 피질골 두께를 나타내는 도면이다.

도 87은, GST-RANKL 투여 마우스에 PTH를 투여한 경우의 골간에서의 피질골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 88은, GST-RANKL 투여 마우스에 PTH를 투여한 경우의 마이크로 CT를 사용한 화상 해석의 결과를 나타내는 사진이다.

도 89는, 12주령 마우스에 GST-RANKL을 투여한 경우의 혈청중 Ca, ALP 및 TRAP-5b 농도를 나타내는 도면이다.

도 90은, 12주령 마우스에 GST-RANKL을 투여한 경우의 전체 골 밀도를 나타내는 도면이다.

도 91은, 12주령 마우스에 GST-RANKL을 투여한 경우의 마이크로 CT를 사용한 화상 해석의 결과를 나타내는 사진이다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 골량 감소증 모델 동물은, 비인간 동물에 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 투여함으로써 작출할 수 있다.

RANKL(Receptor activator of NF-κB ligand)은 TNF 수퍼패밀리의 구성원인 RANK(NF-κB의 수용체 활성화제)의 리간드이고, 세포내 도메인(RANK의 N 말단으로 부터 제1번째 내지 48번째의 아미노산을 포함하는 도메인), 막관통 도메인 및 세포외 도메인을 갖는 2형 관통 단백질이다(일본 특허 공표 제2002-509430호 공보, 국제 공개 제WO98/46644호 공보(일본 특허 제3523650호 공보)). 세포외 도메인 중, N 말단으로부터 제152번째 이후의 아미노산을 포함하는 도메인은, TNF 리간드 패밀리 상동성 도메인이다. 가용형 RANKL은, 세포내 도메인을 포함하지 않는다. RANKL은, 파골세포의 분화ㆍ활성화, 림프구 분화, 수상 세포 활성화, 유선 상피 세포 분화, 림프절 형성 등의 기능을 갖는다.

가용형 RANKL에는, 가용형 RANKL 유도체 및 가용형 RANKL 유사체가 포함된다. 가용형 RANKL 유래 동물종은 한정되지 않으며, 인간에서 유래하는 RANKL, 마우스에서 유래하는 RANKL, 래트에서 유래하는 RANKL 등 모든 동물종에서 유래하는 RANKL을 사용할 수 있다. 인간에서 유래하는 RANKL의 전장 염기 서열 및 아미노산 서열을 각각 서열 1 및 2로 나타낸다. 가용형 RANKL 유도체 또는 가용형 RANKL 유사체는, RANKL의 말단절단체 등 RANKL의 아미노산 서열의 일부 서열을 포함하는 단백질이며, RANKL의 활성을 갖는 단백질을 포함한다. 가용형 RANKL 유도체는, 바람직하게는 서열 2의 아미노산 서열에서 제152번째의 아미노산으로부터 시작되는 TNF 리간드 패밀리 상동 도메인을 포함한다. 가용형 RANKL 유도체로서, 예를 들면 제127번째의 아미노산으로부터 제317번째의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 제140번째의 아미노산으로부터 제317번째의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 제159번째의 아미노산으로부터 제317번째의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 등을 들 수 있다. 또한, 인간 이외의 동물종에서 유래하는 RANKL이며, 상기한 인간 RANKL의 부분 아미노산 서열에 대응하는 부분의 아미노산 서열을 포함하는 RANKL 유도체도 포함된다. 또한, 가용형 RANKL 유도체 또는 가용형 RANKL 유사체는, 서열 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, RANKL의 활성을 갖는 단백질, 또는 상기한 RANKL의 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 단백질의 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, RANKL의 활성을 갖는 단백질을 포함한다. 여기서, 1 또는 수개란 1 내지 9개, 바람직하게는 1 내지 5개, 더욱 바람직하게는 1 또는 2개이다.

가용형 RANKL과 함께 융합 단백질을 형성시키는 에피토프 태그로서, 항체 등의 특정한 화합물과 결합할 수 있는 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드를 들 수 있다. 통상적으로 에피토프 태그는 융합 단백질의 정제를 위해 사용되며, 본 발명에서 에피토프 태그는 가용형 RANKL의 활성을 높이는 기능을 갖고 있다.

에피토프 태그로서는 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST), 2 내지 12개, 바람직하게는 4개 이상, 보다 바람직하게는 4 내지 7개, 더욱 바람직하게는 5개 또는 6개의 히스티딘을 포함하는 폴리히스티딘, FLAG 태그(아미노산 서열 DYKDDDDK; 서열 3), Myc 태그(아미노산 서열 EQKLISEEDL; 서열 4), V5 태그(아미노산 서열 GKPIPNPLLGLDST; 서열 5), Xpress 태그, HQ 태그(아미노산 서열 HQHQHQ; 서열 6), HA 태그(아미노산 서열 YPYDVPDYA; 서열 7), AU1 태그(아미노산 서열 DTYRYI; 서열 8), T7 태그(아미노산 서열 MASMTGGQQMG; 서열 9), VSV-G 태그(아미노산 서열 YTDIEMNRLGK; 서열 10), DDDDK 태그(아미노산 서열 DDDDK; 서열 11), S 태그(아미 노산 서열 KETAAAKFERQHIDSC; 서열 12), CruzTag09(아미노산 서열 MKAEFRRQESDR; 서열 13), CruzTag22(아미노산 서열 MRDALDRLDRLA; 서열 14), CruzTag41(아미노산 서열 MKDGEEYSRAFR; 서열 15), Glu-Glu 태그(아미노산 서열 EEEEYMPME; 서열 16), Ha.11 태그(아미노산 서열 CTPTDVPDYASL; 서열 17), KT3 태그(아미노산 서열 PPEPET; 서열 18), 티오레독신, 말토오스 결합 단백질(MBP), 면역 글로블린 Fc 영역, β 갈락토시다아제 등이 있지만, 상기한 것으로 한정되지는 않는다. 이 중에서도, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제가 바람직하다.

가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 얻기 위해서는 양자를 각각 코드하는 유전자를 연결하여, 발현시킬 수 있다. RANKL을 코드하는 유전자 및 에피토프 태그를 코드하는 유전자의 융합은, 통상적인 유전자 재조합의 방법에 의해 행할 수 있다. 이 때, 적당한 제한 부위를 도입하여 행할 수 있다. 이 때, 융합하는 유전자 사이에 정지 코돈이 나타나지 않도록 한다. 융합하는 유전자 사이의 거리는 한정되지 않으며, 양자간에 링커가 포함될 수도 있다. 또한, 2개의 유전자의 오픈 리딩 프레임을 맞추도록 한다. 상기 에피토프 태그는, RANKL의 아미노산 서열의 N 말단측에 융합시킬 수도 있고, C 말단측에 융합시킬 수도 있다.

서열 19 및 20에, RANKL의 아미노산 서열 중 제127번째의 아미노산으로부터 제317번째의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 GST가 융합한 단백질을 코드하는 DNA의 염기 서열 및 상기 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 21 및 22에, RANKL의 아미노산 서열 중 제140번째의 아미노산으로부터 제317번째의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 GST가 융합한 단백질을 코드하는 DNA의 염기 서열 및 상기 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. 또한, 서열 23 및 24에, RANKL의 아미노산 서열 중 제159번째의 아미노산으로부터 제317번째의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 GST가 융합한 단백질을 코드하는 DNA의 염기 서열 및 상기단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.

이와 같이 하여 제조한 융합 유전자를 입수할 수 있는 적당한 발현 벡터에 조합하여 발현시켜, 목적으로 하는 융합 단백질을 회수, 정제할 수 있다. 또한, 이 때 무세포계(셀 프리 시스템)에서 발현시킬 수도 있다.

벡터로서 플라스미드, 파지, 바이러스 등의 숙주 세포에서 복제 가능한 한 어떠한 벡터도 사용할 수 있다. 벡터는 복제 개시점, 선택 마커, 프로모터를 포함하고, 필요에 따라 인핸서, 전사 종결 서열(터미네이터), 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 시그널 등을 포함할 수도 있다. 또한, 미리 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 등의 에피토프 태그를 코드하는 유전자를 조합한 벡터를 사용할 수도 있다.

DNA의 벡터로의 도입은, 공지된 방법으로 행할 수 있다. 벡터는, 다양한 제한 부위를 그 내부에 갖는 폴리 링커를 포함하고 있거나, 또는 단일 제한 부위를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 벡터 중의 특정한 제한 부위를 특정한 제한 효소로 절단하고, 그 절단 부위에 DNA를 삽입할 수 있다. 융합 유전자를 포함하는 발현 벡터를 적절한 숙주 세포의 형질 전환에 사용하여, 숙주 세포에 상기 융합 유전자가 코드된 융합 단백질을 발현, 생산시킬 수 있다.

숙주 세포로서는 대장균, 스트렙토미세스, 고초균 등의 세균 세포, 진균 세포, 빵 효모, 효모 세포, 곤충 세포, 포유류 세포 등을 들 수 있다.

형질 전환은 염화칼슘, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 개재 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 리포펙션 등의 공지된 방법으로 행할 수 있다.

얻어진 재조합 융합 단백질은, 각종 분리 정제 방법에 의해 분리ㆍ정제할 수 있다. 예를 들면 황산암모늄 침전, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 적절하게 조합하여 사용할 수 있다. 이 때, 발현 산물이 GST 등과의 융합 단백질로서 발현되는 경우에는, 목적 단백질과 융합되어 있는 단백질 또는 펩티드의 성질을 이용하여 정제할 수도 있다. 예를 들면 GST와의 융합 단백질로서 발현시킨 경우, GST는 글루타티온에 대하여 친화성을 갖기 때문에, 글루타티온을 담체에 결합시킨 칼럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 효율적으로 정제할 수 있다. 또한, 히스티딘 태그와의 융합 단백질로서 발현시킨 경우, 히스티딘 태그를 갖는 단백질은 킬레이트 칼럼에 결합하기 때문에, 킬레이트 칼럼을 사용하여 정제할 수 있다. 또한, 어떠한 에피토프 태그를 사용한 경우에도, 그 에피토프 태그가 갖는 에피토프를 인식하는 항체를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.

가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 투여하는 동물종은 한정되지 않으며, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 말, 소, 양, 돼지, 원숭이, 개, 고양이 등 인간 이외의 모든 포유동물이 대상이 되고, 이들 동물에서 골량 감소증 모델 동물을 작출할 수 있다. 또한, 자웅 모두 골량 감소증 모델 동물의 작출에 사용할 수 있다. 또한, 골량 감소증 모델 동물의 작출에 사용하는 동물의 나이도 한정되지 않으며, 고령 동물을 이용하여도 본 발명의 골량 감소증 모 델 동물을 작출할 수 있다. 예를 들면, 동물로서 마우스를 이용하는 경우, 1 내지 52주령, 바람직하게는 4 내지 12주령의 마우스를 이용하여 골량 감소증 모델 동물을 작출할 수 있다.

가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질 동물로의 투여량은 한정되지 않으며, 동물종에 따라 적절하게 결정될 수 있지만, 예를 들면 1 마리당 10 nmol 내지 5000 nmol, 바람직하게는 50 nmol 내지 1000 nmol, 또는 투여하는 동물의 체중당 100 ㎍/㎏ 내지 50 ㎎/㎏, 바람직하게는 500 ㎍/㎏ 내지 5 ㎎/㎏을 투여할 수 있다. 투여 경로는 한정되지 않으며, 정맥 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 근육 주사, 좌약, 점안, 두개관 투여 등에 의해 투여할 수 있다.

또한, 투여 횟수는 한정되지 않으며, 단회 투여일 수도 있고, 2 내지 십수회의 복수회 연속 투여일 수도 있다. 연속 투여를 행하는 경우 투여 간격은 한정되지 않으며, 예를 들면 매일 수일간에 걸쳐서 투여할 수 있다. 또한, 총 투여량을 조절함으로써 모델 동물의 골량 감소의 정도를 조절할 수 있으며, 예를 들면 단회 투여를 행하는 경우, 1회의 투여량을 증가시킴으로써 골량 감소의 정도가 큰 모델 동물을 작출할 수 있다.

가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 동물에 투여한 경우, 이들이 동물의 체내에서 파골세포를 직접 분화시켜 활성화시킨다는, 다른 물질을 개재하지 않는 단순한 메커니즘에 의해 신속하게 골량 감소증 모델 동물을 작출할 수 있다.

본 발명의 골량 감소증 모델 동물은 이하의 특징을 갖는다. 또한, 이하의 기재에서 정상 동물이란 골 대사 질환에 이환되어 있지 않고, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질이 투여되어 있지 않은 동물을 말하며, 예를 들면 골량 감소증 모델 동물 작출시에 대조군으로서 PBS 등을 투여한 동물을 정상적인 동물로 할 수 있다.

(1) 체액 중의 골 흡수 마커 농도(레벨)가 동일한 종류의 정상적인 동물(정상 개체)에 비해 일시적으로 상승한다. 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질의 투여량에 따라서도 다르지만, 정상 동물에 대하여 예를 들면 1.1배 이상, 바람직하게는 1.2배 이상, 더욱 바람직하게는 1.3배 이상, 특히 바람직하게는 1.4배 이상 상승한다. 혈청중 골 흡수 마커로서 혈청중 칼슘, 혈청중 콜라겐 분해물(CTx{I형 콜라겐 가교 C-텔로펩티드}, NTx{I형 콜라겐 가교 N-텔로펩티드}, PICP{I형 프로콜라겐-C-프로펩티드}, 또는 PINP{I형 프로콜라겐-N-프로펩티드}), 혈청중 타르타르산 내성 산 포스파타아제(TRAP-5b) 등을 들 수 있으며, 뇨중 골 흡수 마커로서, 뇨중 CTx 또는 NTx, 뇨중 히드록시프롤린, 뇨중 피리디놀린, 데옥시피리디놀린 등을 들 수 있다. 이외에 히드록시리신 배당체(혈청중 및 뇨중), 골 시알로 단백(혈청중) 등을 들 수 있다. 이들 마커는 파골세포가 증식하여, 활성이 촉진되었을 때 상승한다. 이들 마커는, 통상적으로 골다공증의 골 대사 질환에서의 골 대사 마커로서 사용되고 있다. 이들 마커는, 비색법이나 특이적 항체를 사용한 면역학적 측정법에 의해 측정할 수 있다.

(2) 혈청중 골 형성 마커 농도(레벨)가 정상적인 동물에 비해 변동되지 않는다. 혈청중 골 형성 마커로서, 혈청중 오스테오칼신(osteocalcin), 혈청중 알칼리 포스파타아제(특히 골특이적 알칼리포스파타아제)를 들 수 있다. 이들 마커는 골아세포에서 유래하는 단백질이고, 골아세포가 증식되었을 때 농도가 상승한다. 이들 마커는, 통상적으로 골다공증의 골 대사 질환에서의 골 대사 마커로서 사용되고 있다. 이들 마커는, 비색법이나 특이적 항체를 사용한 면역학적 측정법에 의해 측정할 수 있다. 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질은 직접 골아세포에 대하여 작용하지 않지만, 골 흡수와 골 형성의 커플링 현상 때문에 간접적으로 혈청중 골 형성 마커 농도가 변동되는 경우가 있다. 변동의 유무는 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질의 투여량, 투여 횟수, 투여 후의 시간 경과에 따라 상이하다.

또한, (1)의 골 흡수 마커 및 (2)의 골 형성 마커를 합하여 골 대사 마커라고 한다.

(3) 골 밀도가 정상 동물에 비해 저하된다. 골 밀도란, 골 중의 칼슘 등 미네랄 성분의 밀도를 숫자로 나타낸 것을 말한다. 골 밀도에는 해면골 밀도, 전체 골 밀도, 피질골 밀도가 있지만, 본 발명에서 단순히 골 밀도라고 하는 경우에는 해면골 밀도를 말한다. 골 밀도는, pQCT(peripheral quantitative computerized tomography; 말초골 X선 CT 장치), DXA(Dual Energy X-Ray Absorptiometry; 이중 에너지 X선 흡수법) 등에 의해 계측할 수 있다. 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질의 투여량에도 의존하지만, 본 발명의 골량 감소증 모델 동물에서는 pQCT로 대퇴골 또는 경골의 골 밀도를 계측한 경우, 성장판으로부터의 거리에 따라 다르지만, 예를 들면 골 밀도가 1 ％ 이상, 2 ％ 이상, 3 ％ 이 상, 5 ％ 이상, 바람직하게는 7.5 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 10 ％ 이상, 가장 바람직하게는 20 ％ 이상 저하된다.

또한, 전체 골 밀도도 정상 동물에 비해 저하되며, pQCT로 대퇴골 또는 경골의 골 밀도를 계측한 경우 성장판으로부터의 거리에 따라 다르지만, 예를 들면 전체 골 밀도가 1 ％ 이상, 2 ％ 이상, 3 ％ 이상, 5 ％ 이상, 바람직하게는 7.5 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 10 ％ 이상, 가장 바람직하게는 20 ％ 이상 저하된다.

또한, 피질골 밀도도 정상 동물에 비해 저하되며, pQCT로 대퇴골 또는 경골의 골 밀도를 계측한 경우 성장판으로부터의 거리에 따라 다르지만, 예를 들면 피질골 밀도가 1 ％ 이상, 2 ％ 이상, 3 ％ 이상, 5 ％ 이상, 바람직하게는 7.5 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 10 ％ 이상, 가장 바람직하게는 20 ％ 이상 저하된다.

또한, 피질골 염량이 정상 동물에 비해 저하된다. 골 염량은 골염(수산화인회석)의 양이며, 골 밀도를 반영하고 있다. 골 염량은 pQCT 등에 의해 계측할 수 있다. pQCT로 대퇴골 또는 경골의 피질골 염량을 계측한 경우 성장판으로부터의 거리에 따라 다르지만, 예를 들면 피질골 염량이 5 ％ 이상, 바람직하게는 7.5 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 10 ％ 이상, 특히 바람직하게는 15 ％ 이상, 가장 바람직하게는 20 ％ 이상 저하된다.

또한, 피질골 두께가 정상 동물에 비해 저하된다. 피질골 두께는 pQCT 등에 의해 계측할 수 있다. pQCT로 대퇴골 또는 경골의 피질골 두께를 계측한 경우 성장판으로부터의 거리에 따라 다르지만, 예를 들면 피질골 두께가 5 ％ 이상, 바람직하게는 7.5 ％ 이상, 보다 바람직하게는 10 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 15 ％ 이상, 가장 바람직하게는 20 ％ 이상 저하된다.

(4) 골 형태 계측에서 단위 골량(BV/TV; 골량/총 조직량), 골소주수(Tb.N; 골소주수), 골소주폭(Tb.Th; 골소주 두께)이 정상적인 동물에 비해 저하된다. 단위 골량이란, 병리 절편에 있어서 조직 전체의 면적에서 차지하는 골소주 전체의 면적을 말한다. 골소주란, 골단 해면질의 골 조직이 미세하게 풀린 부분을 말한다. 본 발명의 골량 감소증 모델 동물에서 단위 골량 및 골소주수는, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질의 투여량에 따라서도 다르지만, 정상적인 동물에 비해 예를 들면 10 ％ 이상, 바람직하게는 20 ％ 이상, 보다 바람직하게는 30 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 40 ％ 이상, 특히 바람직하게는 50 ％ 이상 감소되어 있다.

(5) 파골세포수가 정상적인 동물에 비해 증가되어 있다. 파골세포수는, 통상법에 따라 골 형태 계측에 의해 측정할 수 있다. 파골세포수는, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질의 투여량에 따라서도 다르지만, 정상적인 동물에 비해 예를 들면 20 ％ 이상, 바람직하게는 30 ％ 이상, 보다 바람직하게는 40 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 50 ％ 이상, 특히 바람직하게는 60 ％ 이상 상승되어 있다.

(6) 골아세포면(Ob.S/BS; 골아세포 표면/골 표면)이 정상적인 동물에 비해 유의하게 상승한다. 골아세포면이란, 골소주 표면 전체에서의 골아세포가 부착되어 있는 면의 비율(％)을 말한다. 골아세포면은, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질의 투여량에 따라서도 다르지만, 정상적인 동물에 비해 예를 들면 20 ％ 이상, 바람직하게는 30 ％ 이상, 보다 바람직하게는 40 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 50 ％ 이상, 특히 바람직하게는 60 ％ 이상 상승되어 있다.

또한, 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질의 투여량을 크게 한 경우, 예를 들면 마우스에 2 ㎎/㎏으로 투여한 경우, 골 흡수와 골 형성의 커플링 현상이 관찰될 때까지 시간이 걸리고, 골아세포면의 변화의 출현이 지연되는 경우가 있다. 따라서, 골아세포면의 관찰 시기에 따라 골아세포면의 상승이 관찰되지 않는 경우도 있다.

(7) 유골 두께(O.Th; 유골 두께), 흡수면(ES/BS; 침식된 표면/골 표면) 및 파골세포면(Oc.S/Bs; 파골세포 표면/골 표면)이 정상적인 동물에 비해 상승한다. 유골이란 석회화되어 골 기질이 되기 전의 상태를 말하며, 흡수면이란 골소주 표면 전체에서의 침식을 받아 요철이 되어 있는 면의 비율을 말한다. 파골세포면이란, 골소주 표면 전체에서의 파골세포가 부착되어 있는 면의 비율을 말한다. 유골 두께, 흡수면 및 파골세포면은, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질의 투여량에 따라서도 다르지만, 정상적인 동물에 비해 예를 들면 20 ％ 이상, 바람직하게는 30 ％ 이상, 보다 바람직하게는 40 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 50 ％ 이상, 특히 바람직하게는 60 ％ 이상 상승되어 있다.

(8) 골 형태를 관찰한 경우, 정상적인 동물에 비해 골의 감소가 관찰된다. 골 형태는 마이크로 CT 등에 의해 측정할 수 있다.

(9) 본 발명의 골량 감소증 모델 동물에서 에스트로겐은 체내에서 합성되기 때문에, 정상적인 동물에 비해 혈중 에스트로겐 농도는 변동되지 않는다. 이 점이 종래의 난소를 적출함으로써 작출된 모델 동물과는 상이하다. 또한, 혈중 PTH 농도는, 정상적인 동물에 비해 상승되지 않는다. 이 점이 종래의 저칼슘 농도의 먹이를 동물에게 제공함으로써 작출된 모델 동물과는 상이하다.

또한, 종래의 난소를 적출함으로써 작출된 모델 동물 및 저칼슘 농도의 먹이를 동물에게 제공함으로써 작출된 모델 동물에서는 혈중 OPG(osteoprotegerin; 오스테오프로테게린) 농도가 저하되지만, 본 발명의 골량 감소증 모델 동물에서는 변동되지 않는다.

또한, 동물에 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 투여하고 추가로 난소를 적출하여도, 골량 감소증 모델 동물을 작출할 수 있다. 이 경우, 바람직하게는 RANKL을 투여한 후 난소를 적출한다. 난소 적출과 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질의 투여를 병용함으로써, 생리적인 폐경 상태와 유사한 골량 감소증 모델 동물을 작출할 수 있다. 본 발명은, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 투여하고 추가로 난소를 적출함으로써 작출할 수 있는 골량 감소증 모델 동물을 포함한다. 상기 골량 감소증 모델 동물은, 폐경 후의 골 대사에 이상이 있는 인간의 병태 모델 동물로서 이용할 수 있다.

상기한 특징 중, 직접 골량의 감소를 반영하고 있는 마이크로 CT에 의해 관찰되는 골의 감소, 골 밀도 및 단위 골량의 저하가 특히 특징적이며, 이어서 파골세포수(파골세포수/골 둘레 길이)의 증가 및 골소주수의 감소가 특징적이다. 또 한, 피질골 염량의 감소도 관찰된다.

또한, 상기한 특징은 투여하는 GST-RANKL량이 많을수록 현저하게 나타나며, 특징의 정도는 투여량에 의존한다. 상기한 특징의 정도는 골량 감소증의 중증도를 나타내고 있으며, 본 발명의 골량 감소증 모델 동물은 투여하는 GST-RANKL의 양을 변경함으로써 중증도를 조절할 수 있다. 즉, 경증의 골량 감소증 모델 동물을 얻고자 하는 경우에는 소량의 GST-RANKL을 투여할 수 있으며, 중증의 골량 감소증 모델 동물을 얻고자 하는 경우에는 대량의 GST-RANKL을 투여할 수 있다. 여기서, 중증의 골량 감소증 모델 동물이란, 상기한 특징이 강하게 나타나 있는 모델 동물을 말하며, 예를 들면 체액 중의 골 흡수 마커 농도(레벨)가 동일한 종류의 정상적인 동물(정상 개체)에 비해 일시적으로 비교적 크게 상승한 모델 동물이고, 정상 동물에 비해 예를 들면 1.2배 이상, 바람직하게는 1.3배 이상, 더욱 바람직하게는 1.4배 이상 상승한 모델 동물이다. 또한, 골 밀도가 정상 동물에 비해 비교적 크게 저하된 모델 동물이며, pQCT로 대퇴골 또는 경골의 골 밀도를 계측한 경우 성장판으로부터의 거리에 따라 다르지만, 예를 들면 골 밀도가 7.5 ％ 이상, 바람직하게는 10 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 20 ％ 이상 저하된 모델 동물이다. 또한, 골 형태 계측에서 단위 골량(BV/TV; 골량/총 조직량), 골소주수(Tb.N; 골소주수) 및 골소주폭(Tb.Th; 골소주 두께)이 정상적인 동물에 비해 비교적 크게 저하된 모델 동물이며, 정상적인 동물에 비해 예를 들면 10 ％ 이상, 바람직하게는 20 ％ 이상, 보다 바람직하게는 30 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 40 ％ 이상, 특히 바람직하게는 50 ％ 이상 감소되어 있는 모델 동물이다. 또한, 골 형태 계측에서 유골 두 께(O.Th; 유골 두께), 흡수면(ES/BS; 침식된 표면/골 표면) 및 파골세포면(Oc.S/Bs; 파골세포 표면/골 표면)이 정상적인 동물에 비해 비교적 크게 상승한 모델 동물이며, 정상적인 동물에 비해 예를 들면 20 ％ 이상, 바람직하게는 30 ％ 이상, 보다 바람직하게는 40 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 50 ％ 이상, 특히 바람직하게는 60 ％ 이상 상승되어 있는 모델 동물이다.

따라서, 본 발명의 골량 감소증 모델 동물의 전형적인 예로서, 골 밀도 및/또는 단위 골량이 정상적인 동물에 비해 감소되어 있는 동물, 파골세포수의 증가 및/또는 골소주수의 감소가 정상적인 동물에 비해 관찰되는 동물을 들 수 있다. 또한, 골소주폭의 감소가 정상적인 동물에 비해 관찰되는 동물, 유골 두께, 흡수면, 파골세포면 등의 상승이 정상적인 동물에 비해 관찰되는 동물을 들 수 있다.

또한, 가용형 RANKL 및 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 동물에 투여한 후, 상기한 특징이 서서히 시간 경과에 따라 출현하고, 특징이 가장 현저하게 출현한 후 이어서 골 형성이 진행되며, 상기한 특징은 서서히 소실되어 결국 정상으로 되돌아간다. 즉, 가용형 RANKL 및 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 투여하여 얻어지는 골량 감소증 모델 동물은, 골량 감소라는 특징에 대하여 가역적이다.

특히, 상기한 특징 중 (1)의 골 흡수 마커는, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 투여한 후 변동되지만, 골량 감소증 모델 동물의 작출 후 서서히 상승하여 결국 정상값으로 되돌아간다.

후술하는 바와 같이, 본 발명의 골량 감소증 모델 동물을 이용하여 골 대사 에 따른 약제의 평가나 스크리닝을 행하는 경우, 목적에 따라 골량이 감소되고 있는 시기, 골량이 가장 감소된 시기, 또는 일단 감소된 골량이 다시 증가하고 있는 시기 중 적절한 시기의 모델 동물을 이용한다. 따라서, 발현되어 있는 상기한 특징의 강도에 관계없이, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 투여한 후 골량이 감소하고 있는 동물이며, 상기한 특징이 발현되어 있는 동물은, 본 발명의 골량 감소증 모델 동물에 포함된다.

본 발명의 골량 감소증 모델 동물은, 상기한 바와 같이 다른 물질을 개재하지 않는 단순한 메커니즘에 의해 작출된다. 따라서, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 정상적인 동물에 투여한 후, 1주일 이내, 바람직하게는 3일 이내(72 시간 이내), 더욱 바람직하게는 2일 이내(50 시간 이내), 더욱 바람직하게는 24 시간 이내에 상기한 특징을 갖게 되고, 골량 감소증 모델 동물이 작출된다.

본 발명의 골량 감소증 모델 동물은 골다공증, 고칼슘혈증, 파제트병, 신성 골이영양증, 구루병ㆍ골연화증, 관절 류마티스 등의 골량 감소를 동반하는 골 대사 이상 질환의 질환 모델 동물로서 이용할 수 있다. 구체적으로는, 이하와 같이 이용할 수 있다.

본 발명의 골량 감소증 모델 동물은, 골 흡수 억제제의 평가 또는 새로운 골 흡수 억제제(골 흡수 저해제)의 스크리닝에 사용할 수 있다. 본 발명에서는, 이들을 골 흡수 억제제 또는 골 흡수 억제제 후보 물질의 평가라고 부르는 경우가 있다. 공지된 골 흡수 억제제로서는, 리세드로네이트, 에티드로네이트, 알렌드로네 이트 등의 비스포스포네이트, 칼시토닌, 카텝신 K 저해제, 양성자 펌프 저해제 등이 있다. 골 흡수 억제제는, 골량이 감소되고 있을 때 효력이 있다. 따라서, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 투여한 후, 골량이 감소되고 있는 시기에 평가하는 것이 바람직하다. 이 경우, 골 흡수 억제제 또는 골 흡수 억제제 후보 물질을 본 발명의 골량 감소증 모델 동물에 투여하고, 골량의 감소가 억제되는지의 여부에 의해 골 흡수 억제제 또는 골 흡수 억제제 후보 물질의 효과를 평가할 수 있다. 또한, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 투여하기 전, 예를 들면 1 내지 3일, 바람직하게는 1일 전에 후보 물질을 투여할 수도 있다. 즉, 골량 감소증 모델 동물에서의 골량의 감소가 저하, 또는 골량이 증가하는지의 여부를 지표로 할 수 있다. 구체적으로는, 골량의 증가를 골량 감소증 모델 동물에서의 체내의 골 흡수 마커 레벨의 저하, 골 밀도의 상승, 단위 골량의 상승, 골소주수, 골소주폭의 상승, 유골 두께, 흡수면의 상승, 파골세포수의 저하, 골아세포면의 상승 및 CT에 의해 관찰되는 골량의 증가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 지표로 판단할 수 있다. 본 발명의 모델 동물을 이용함으로써 수일 이내, 예를 들면 3 내지 4일 정도에 약제의 평가를 행할 수 있다.

또한, 난소를 적출한 본 발명의 골량 감소증 모델 동물은, 에스트로겐이나 안드로겐 등의 호르몬 또는 호르몬 수용체 모듈레이터의 약제 평가 또는 새로운 호르몬 수용체 모듈레이터의 스크리닝에 사용할 수 있다. 호르몬 수용체 모듈레이터인 선택적 에스트로겐 수용체 모듈레이터는 골 형성 흡수 억제제 중 1개이고, 호르 몬인 에스트로겐형의 작용에 의해 골 흡수를 억제한다는 효과를 나타낸다. 내인성의 에스트로겐이 존재하는 통상적인 야생형 동물에 의한 평가는 곤란하다. 본 발명의 골량 감소증 모델 동물의 난소를 적출(OVX)함으로써, 단순히 난소를 적출한 경우의 모델 동물에 의한 평가보다 매우 신속하게 선택적 에스트로겐 수용체 모듈레이터의 약제 평가를 행할 수 있다. 단순히 난소를 적출한 경우의 모델 동물은, 약제의 효과가 관찰되어 약제의 평가를 행할 수 있을 때까지 수주일 이상을 필요로 하지만, 난소를 적출한 본 발명의 골량 감소증 모델 동물을 이용한 경우, 반 이하의 기간, 예를 들면 2주일 이내, 바람직하게는 1주일 이내, 더욱 바람직하게는 수일 이내에 평가를 행할 수 있다. 공지된 선택적 에스트로겐 수용체 모듈레이터로서는, 랄록시펜 등이 있다. 또한, 작용이 알려지지 않은 호르몬형 화합물이나 호르몬 수용체 모듈레이터 후보 물질의 평가에 이용할 수도 있다. 호르몬 또는 호르몬 수용체 모듈레이터 등의 평가는, 골량 감소증 모델 동물에 호르몬 또는 호르몬 수용체 모듈레이터 등을 투여하고, 골량 감소증 모델 동물에서의 감소된 골량이 증가하는지의 여부를 지표로 하여 평가할 수 있다.

또한, 본 발명의 골량 감소증 모델 동물은, 골 형성 촉진제의 평가 또는 새로운 골 형성 촉진제의 스크리닝에 사용할 수 있다. 본 발명에서는, 이들을 골 형성 촉진제 또는 골 형성 촉진제 후보 물질의 평가라고 부르는 경우가 있다. 골 형성 촉진제는 골량이 일단 감소하고, 본래대로 되돌아갈 때 효력이 있다. 따라서, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 투여한 후, 골량이 계속 감소되어 골량의 감소가 정지한 시기로부터, 일단 감소된 골량이 다시 상승하는 시기에 평가하는 것이 바람직하다. 이 경우, 골 형성 촉진제 또는 골 형성 촉진제 후보 물질을 본 발명의 골량 감소증 모델 동물에 투여하고, 골량의 증가가 촉진되는지의 여부에 의해 골 형성 촉진제 또는 골 형성 촉진제 후보 물질의 효과를 평가할 수 있다. 이 경우, 후보 물질은 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 동물에 투여하여 골량의 감소가 관찰된 후, 투여하는 것이 바람직하다. 평가는, 골량 감소증 모델 동물에서의 감소된 골량이 증가하는지의 여부를 지표로 할 수 있다. 구체적으로는, 골량의 증가를 골량 감소증 모델 동물에서의 체내의 골 형성 마커 레벨의 상승, 골 밀도의 상승, 단위 골량의 상승, 골소주수, 골소주폭의 상승, 유골 두께의 상승, 파골세포수 및 흡수면의 저하, 골아세포면의 상승 및 CT에 의해 관찰되는 골량의 증가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 지표로 판단할 수 있다. 골 형성 촉진제로서는, 예를 들면 PTH(부갑상선 호르몬) 등이 있다.

상기한 골 흡수 억제제, 골 형성 촉진제는 골다공증이나 골량 감소증의 치료약으로서 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 골량 감소증 모델 동물은, 골 대사 연구를 위한 실험용 동물로서 사용할 수 있다. 즉, 본 발명의 골량 감소증 모델 동물에서는 골 흡수에 따른 골 형성(커플링)이 발생하기 때문에, 골 재구축 조절 메커니즘의 해명 등의 기초 연구에 이용할 수 있다. 또한, 골 흡수와 골 형성을 커플링하고 있는 커플링 요인의 탐색에 이용할 수 있다. 또한, RANKL 시그널을 저해하는 약제의 평가 및 파골세포 분화를 비롯한 메커니즘 연구에 이용할 수 있다. RANKL 시그널을 억제하 는 약제로서는, 예를 들면 Tec 키나아제 패밀리의 저해제인 LFM-A13 등이 있다.

또한, 본 발명의 골량 감소증 모델 동물에서는, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 투여한 후 불과 1 내지 2일 정도에 골량의 감소가 관찰되기 때문에, 대학 등의 교육 기관에서 생체내에서의 골량 감소의 실습에 사용할 수 있다. 또한, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 투여한 후, 대학이나 제약 메이커 등의 연구 기관에 골량 감소증 모델 동물을 송부함으로써, 연구자에게 본 발명의 골량 감소증 모델 동물을 제공할 수 있다.

본 발명을 이하의 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되지 않는다.

실시예 1 골량 감소증 모델 마우스의 작출 (1)

GST-RANKL의 제조

인간형 RANKL 잔기 140-317을 코드하는 cDNA에 PCR로 Sal I, Not I 사이트를 부가하고, 이들의 엔도뉴클레아제를 사용하여 pGEX-4T-2(GE 헬스케어(GE healthcare); 진뱅크(Genbank) 수탁 번호 U13854)의 글루타티온 S-트랜스퍼라아제의 하류에 클로닝하였다. BL21 (DE3) 대장균(인비트로젠(Invitrogen))에서의 IPTG(최종 농도: 0.5 mM)에 의한 단백질 발현의 유도 후, 균체를 추출 완충액(50 mM 트리스(Tris)-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 ％(v/v) 트리톤(Triton) X-100)으로 현탁하고, 4 ℃에서 소니케이터를 사용하여 파쇄하였다. 18000×g, 15 분으로 원심한 후, 상청을 회수하여 글루타티온 세파로오스 칼럼에 첨가하였다. 이어서 세정 완충액(50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 ％(v/v) 트리톤 X-100)으로 세정하였다. 그 후, 글루타티온 용액(20 mM 환원형 글루타티온, 50 mM 트리스-HCl, pH 8.0)으로 용출하였다. SDS-PAGE로 정제한 GST-RANKL의 분자량 및 순도를 확인하고, 필터 여과하였다. 분자량 47.0 kDa, 순도 95 ％ 이상이었다. 또한, 리물루스 변형 세포 용해물 시험(limulus amebocyte lysate assay)에 의해 엔도톡신 농도를 측정하여, 1 EU/㎍ 미만인 것을 확인하였다.

GST-RANKL 투여 시험

7주령의 C57BL/6N 마우스 암컷 10 마리에 GST-RANKL, 57 nmol(저용량) 및 426 nmol(고용량)을 24 시간마다 3회 복강내 투여하고 3회째 투여로부터 1.5 시간 후 전체 채혈을 행하였다. 비교 대상으로서 PBS를 동일하게 투여한 군을 사용하였다.

전혈 채혈한 혈액은 혈청중의 골 흡수 파라미터(칼슘, CTx, TRAP-5b)와 골 형성 파라미터{오스테오칼신, 알칼리포스파타아제(ALP)}의 측정을 행하였다. 칼슘은 OCPC법(WAKO, 272-21801)로 측정을 행하고, CTx(노르딕 바이오사이언스 다이아그노스틱스(Nordic Bioscience Diagnostics)), TRAP-5b(IDS Ltd, SB-TR103) 및 오스테오칼신((주)바이오메디칼 테크놀로지스 인크.(Biomedical Technologies Inc.))은 ELISA법으로 측정을 행하고, ALP는 베시-로리(Bessey-Lowry)법(WAKO, 274-04401)으로 측정을 행하였다.

전혈 채혈 후의 마우스는 대퇴골, 경골, 대뇌, 폐, 심장, 간장, 흉선, 비장, 신장, 피부를 채취하고, 대뇌, 폐, 심장, 간장, 흉선, 비장, 신장, 피부는 HE 염색에 의해 자연 발생 병변을 관찰하였다.

대퇴골에 대해서는, pQCT를 사용하여 원위단 성장판으로부터 근위측으로 0.6 ㎜, 0.8 ㎜, 1.0 ㎜의 해면골의 위치에서 골 밀도 측정을 행하고, 경골에 대해서는 절편을 제조하여 골 형태 계측을 행하였다. 각각의 측정값은 던넷(Dunnett)법에 의해 대조군과 비교하여 검정을 행하였다.

골 흡수 파라미터와 골 형성 파라미터

GST-RANKL 투여에 의해, 고용량의 투여에서 혈중 Ca 농도는 약 1.4배 정도 유의(p<0.01)하게 상승하였다(도 1). 콜라겐 대사 산물인 CTx는 고용량에서 대조군에 비해 약 1.5배 정도 유의(p<0.01)하게 상승하였다(도 2). TRAP-5b에 대해서는, GST-RANKL 고용량의 투여에 의해 약 1.5배 정도 유의하게(p<0.01) 상승하였다(도 3). 혈중의 오스테오칼신, ALP에 대해서는, GST-RANKL 투여에서 고용량, 저용량의 어떠한 경우에도 변화는 관찰되지 않았다(도 4 및 5).

골 밀도와 골 형태 계측

pQCT에 의한 대퇴골의 골 밀도 측정의 결과, 성장판으로부터 근위측으로 0.6 ㎜의 위치에서는 GST-RANKL 고용량 투여에서 10 ％, 0.8 ㎜에서는 23 ％, 1.0 ㎜에서는 20 ％의 감소가 관찰되었다. Anova; 던넷법에 의해 유의차를 검정한 바, GST-RANKL 고용량 투여에서는 측정한 모든 위치에서 p<0.01이었다. 또한, GST-RANKL의 저용량 투여에서는 유의차가 얻어지지 않았다(도 6).

골 형태 계측의 결과, 단위 골량 및 골소주수는 GST-RANKL 고용량의 투여에 의해 약 50 ％까지 감소되었으며, 파골세포수는 증가하였다. 또한, 저용량의 투여에서 감소는 관찰되지 않았다(도 7, 8 및 9).

대퇴골의 골 형태를 마이크로 CT에 의해 측정한 바, 고용량의 GST-RANKL 투여군에서는 현저한 골의 감소가 관찰되었다(도 10).

채취한 대뇌, 폐, 심장, 간장, 흉선, 비장, 신장 및 피부를 HE 염색하여 관찰하였지만, 모든 군에서 이상 소견 및 자연 발생 병변은 관찰되지 않았다.

GST-RANKL 고용량의 투여에 의해 골 흡수 파라미터의 상승, 골 밀도, 단위 골량, 골소주수의 감소 및 파골세포수의 증가가 관찰되었기 때문에, 골량 감소증의 모델 마우스로서 이용이 가능하며, 종래의 방법에 비해 간편하고, 보다 단기간에 골량 감소증 모델 마우스의 제조를 행할 수 있다.

골아세포면

고용량의 GST-RANKL 투여에 의해 파골세포수의 증가, 골량의 감소, 골 흡수가 관찰되었다. 또한, 골아세포면을 조사한 바, 유의하게 상승되었다는 것을 알 수 있었다(도 11). 이것은 파골세포수의 증가나 파골세포의 활성화에 의한 골 흡수의 항진에 의해 골 형성이 촉진되는 현상, 즉 골 흡수와 골 형성의 커플링이 관찰되는 모델이라는 것을 시사하고 있다. 그러나, 골아세포의 마커인 혈청중의 오스테오칼신 농도나 알칼리포스파타아제 활성에는 변화가 없기 때문에, 골아세포의 활성화는 시작된지 얼마 안 되었다는 것을 알 수 있다.

실시예 2 골량 감소증 모델 마우스의 작출 (2)

GST-RANKL은 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.

RANKL 투여 시험

7주령의 C57BL/6N 마우스 암컷 각 10 마리에 GST-RANKL 213 nmol, 426 nmol, 852 nmol을 24 시간마다 3회 복강내 투여하고, 3회째 투여로부터 1.5 시간 후 전체 채혈을 행하였다. 비교 대상으로서 PBS를 동일하게 투여하였다. GST-RANKL의 213 nmol, 426 nmol 및 852 nmol은, 각각 10 ㎍, 20 ㎍ 및 40 ㎍에 상당한다.

전혈 채혈한 혈액은 혈청중의 골 흡수 파라미터(칼슘, CTx, TRAP-5b)와 골 형성 파라미터{오스테오칼신, 알칼리포스파타아제(ALP)}의 측정을 행하였다. 칼슘은 OCPC법(WAKO, 272-21801)으로 측정을 행하고, CTx(노르딕 바이오사이언스 다이아그노스틱스), TRAP-5b(IDS Ltd, SB-TR103) 및 오스테오칼신((주)바이오메디칼 테크놀로지스 인크.)은 ELISA법으로 측정을 행하고, ALP는 베시-로리법(WAKO, 274-04401)으로 측정을 행하였다.

전혈 채혈 후의 마우스는 대퇴골, 경골을 채취하고, 대퇴골에 대해서는 pQCT를 이용하여 성장판으로부터 근위측으로 0.6, 0.8, 1.0 ㎜의 해면골의 골 밀도 측정을 행하였다.

각각의 측정값은 던넷법에 의해 대조군과 비교하여 검정을 행하였다.

GST-RANKL 투여에 의해, 혈중 Ca, CTx, TRAP-5b는 용량 의존적으로 상승하였다(각각 도 12, 13 및 14). 칼슘의 상승은, 213 nmol 투여에서는 p<0.05로 유의한 상승이 관찰되었으며, 426 nmol, 852 nmol 투여에서 p<0.01로 보다 현저한 상승이 관찰되었다. CTx 및 TRAP-5b에 대해서는, 213 nmol에서는 유의한 상승이 관찰되지 않았지만, 426 nmol, 852 nmol 투여에서 p<0.01로 현저한 상승이 관찰되었다.

pQCT를 사용하여 골 밀도의 측정을 행한 바, 성장판으로부터 근위측으로 0.6 ㎜의 위치에서는 GST-RANKL 213 nmol 투여에서 11 ％, 426 nmol 투여에서 19 ％(P<0.01), 852 nmol 투여에서 30 ％(P<0.01)의 골 밀도의 감소가 관찰되었다. 0.8 ㎜에서는 각각 23 ％(p<0.01), 29 ％(p<0.01), 42 ％(p<0.01), 1.0 ㎜에서는 각각 23 ％(p<0.01), 31 ％(p<0.01), 44 ％(p<0.01)의 골 밀도의 감소가 관찰되었다(도 15). 또한, 이러한 용량 의존적인 골 밀도의 감소는, 마이크로 CT를 사용한 화상 해석에서도 확인할 수 있었다(도 16). 상기한 결과로부터 종래법에서는 모델 마우스의 제조에 수주일 단위의 시간이 걸리기 때문에 난소 적출(OVX) 등의 특수한 기술을 필요로 했지만, 본법에서는 복강내 투여라는 간편한 방법으로 약 50 시간에 모델 마우스를 제조할 수 있다. 또한, 종래 골다공증 및 골량 감소증의 정도를 간단히 변경하는 모델 마우스의 제조 기술은 없었지만, GST-RANKL의 용량을 변경하여 투여함으로써 골 흡수 파라미터의 상승 및 골량의 감소량을 자유롭게 조절하여, 골다공증 및 골량 감소증의 정도를 맞춘 모델 마우스를 제조할 수 있다.

실시예 3 GST-RANKL 투여 마우스를 사용한 골다공증 치료약의 평가

GST-RANKL은 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.

7주령의 C57BL/6N 마우스 암컷 각 5 내지 6 마리에 GST-RANKL 426 nmol을 24 시간마다 3회 복강내 투여하고, 골다공증 치료약(리세드로네이트)은 GST-RANKL 투여 3일 전부터 0.01 ㎎/㎏으로 피하 투여하고, 24 시간마다 실험 종료까지 투여를 계속하였다. GST-RANKL 3회째의 투여로부터 1.5 시간 후 혈청, 대퇴골 및 경골의 채취를 행하고, 혈청중의 골 흡수 파라미터(칼슘, CTx, TRAP-5b)와 골 형성 파라미터(오스테오칼신, ALP)의 측정을 행하였다. 대퇴골은, pQCT 및 마이크로 CT를 이용하여 골 밀도를 측정하였다. 각각의 측정값은 던넷법에 의해 대조군과 비교하여 검정을 행하였다.

골 흡수 마커인 TRAP-5b는, GST-RANKL 투여군에서는 대조군에 비해 약 1.5배 정도의 유의한 상승이 관찰되었으며(P<0.01), CTx는 1.4배 정도의 유의한 상승이 관찰되었다(p<0.05). 그러나, GST-RANKL, 리세드로네이트 병용 투여군에서 TRAP-5b 및 CTx는 대조군에 비해 3할 정도 감소하였다(도 17 및 18). GST-RANKL, 리세드로네이트 병용 투여군에서의 감소는, 마우스 생체내에 본래 존재하는 파골세포가 리세드로네이트에 의해 억제되었기 때문이라고 생각된다. 또한, 골 형성 마커인 알칼리포스파타아제 및 오스테오칼신은, GST-RANKL 투여군 및 GST-RANKL, 리세드로네이트 병용 투여군에서 대조군에 비해 변화가 없었다(도 19 및 20).

골 밀도는, GST-RANKL 투여군에서 대조군에 비해 유의한 감소가 관찰되었으며, 성장판으로부터 근위측으로 0.6 ㎜, 0.8 ㎜, 1.0 ㎜의 어떠한 위치에서도 2할 정도의 유의한 감소가 관찰되었다(p<0.01). GST-RANKL, 리세드로네이트 병용 투여군에서는 대조군과 동일한 정도의 골 밀도의 값을 나타내었다. 이들 결과는, 마이크로 CT를 이용한 화상 해석에서도 동일하게 확인할 수 있었다. 도 21은 대퇴골의 골 밀도를 나타내고, 도 22는 마이크로 CT에 의해 측정한 골 형태를 나타낸다.

상기한 결과로부터 골다공증 및 골량 감소증 치료약을 이 모델 마우스에 투여함으로써 새로운 치료약의 평가에 이용할 수 있으며, 종래의 OVX 등을 이용한 골 량 감소증 모델 마우스에서의 약제 평가에 비해 수주일의 시간 단축 및 이용하는 약제량을 대폭 감소시키는 것이 가능하다고 생각된다.

실시예 4 가용형 RANKL을 사용한 골량 감소증 모델 마우스의 제조

가용형 RANKL(페프로텍(Peprotech)사 제조)의 57 nmol, 426 nmol을 7주령 C57BL/6N 마우스 암컷 각 10 마리에 24 시간마다 3회 복강내 투여하고, 3회째의 투여로부터 1.5 시간 후의 혈청 및 대퇴골을 채취하였다. 혈청은 골 흡수 마커 및 골 형성 마커를 측정하고, 대퇴골은 pQCT에 의해 성장판으로부터 근위측으로 0.6, 0.8, 1.0 ㎜의 위치의 골 밀도를 측정하였다. 골 흡수 마커인 혈중 칼슘, CTx는 426 nmol의 고용량 투여에 의해 각각 1.4배 정도, 1.5배 정도 유의하게 상승되었으며(도 23 및 24), TRAP-5b는 유의한 차는 아니지만 1.25배 정도의 상승 경향을 나타내었다(도 25). 또한, 골 형성 마커인 오스테오칼신, 알칼리포스파타아제에는 변화가 없었다(도 26 및 27). 대퇴골의 골 밀도는, 2할 정도 유의하게 감소하였다(도 28).

상기한 바와 같이 골량 감소증 모델 마우스는, GST-RANKL 특이적으로 제조할 수 있는 것이 아닌 가용형 RANKL 모두에 적응하여 제조할 수 있는 기술이며, GST-RANKL과 동일하게 약제 평가에도 이용할 수 있다고 생각된다.

실시예 5 골량 감소증 모델 마우스의 평가

형태 계측

7주령 암컷 C57BL/6N 마우스에 GST-RANKL을 2 ㎎/㎏으로 24 시간마다 3회 복강내 투여한 후 해부하고, 경골을 톨루이딘 블루 염색한 후 형태 계측을 행하였다. 대조군은 용매(PBS)를 동일하게 투여하였다. GST-RANKL 복강내 투여군의 경골의 골 형태 계측을 행한 바, 대조군에 비해 단위 골량(BV/TV)은 약 30 ％(p<0.03), 골소주폭(Tb.Th)은 약 10 ％(P<0.03), 골소주수(Tb.N)는 약 20 ％(p<0.05) 감소하였다(도 29 내지 31). 또한, 유골 두께(O.Th)는 약 1.2배(p<0.04), 흡수면(ES/BS)은 약 1.8배(p<0.001), 파골세포수(N.Oc/B.Pm)는 약 1.9배(p<0.001), 파골세포면(Oc.S/BS)은 약 1.8배(p<0.001)로 상승하였다(도 32 내지 35). 또한, 이 때의 절편을 TRAP 염색한 바, 파골세포가 대조군에 비해 많이 관찰되었다(도 36). 이 결과로부터 혈청 및 골 밀도 뿐만 아니라, 파골세포수, 파골세포면 등의 골 형태 계측에 의해서도 골량의 감소를 평가할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, GST-RANKL 투여에 의해 유골 두께는 유의하게 증가하였지만, 골아세포면의 증가는 관찰되지 않았으며, 흡수면, 파골세포수, 파골세포면 등의 흡수계의 항목에서 유의한 상승이 관찰되기 때문에, GST-RANKL은 골아세포에는 작용하지 않고 직접 파골세포를 분화ㆍ활성화시킴으로써 골량 감소를 야기한다는 것을 알 수 있었다. 즉, GST-RANKL 투여 골량 감소증의 메커니즘은, 골 형성의 저하가 아닌 골 흡수의 항진이었다. 그러나, GST-RANKL의 투여량, 투여 횟수, 투여 후의 시간 경과에 따라, 커플링 현상에 의해 골 형성이 촉진되어 골아세포면의 증가가 관찰되는 경우도 있다.

비스포스포네이트(리세드로네이트)를 사용한 약제 평가의 검토

7주령 C57BL/6 암컷 마우스에 리세드로네이트를 3, 10, 30 ㎍/㎏의 용량으로 GST-RANKL 투여 전일부터 실험 종료까지 24 시간마다 피하 투여하였다. 3회째의 GST-RANKL 투여 후 1.5 시간 후 대퇴골, 혈청을 채취하여 TRAP-5b, 칼슘(Ca), 알칼 리포스파타아제(ALP)의 측정을 행하고, 대퇴골은 pQCT에 의해 골 밀도의 측정 및 마이크로 CT를 이용하여 화상 해석을 행하였다.

Ca는 큰 변화는 관찰되지 않았지만, TRAP-5b는 RANKL 투여에 의해 약 2배로 유의하게 상승하였다(p<0.01). 이 상승한 TRAP-5b의 농도는 리세드로네이트 투여에 의해 RANKL 단독 투여군에 비해 각각 약 30 ％(p<0.01), 50 ％(p<0.01), 70 ％(p<0.01)로 용량 의존적으로 감소하였다. 또한, ALP는 리세드로네이트 30 ㎍/㎏ 투여에 의해, RANKL 단독 투여군에 비해 유의한 감소(p<0.01)가 관찰되었다(도 37). 대퇴골은 pQCT에 의해 성장판으로부터 근위측으로 0.6, 0.8, 1.0 ㎜의 위치의 골 밀도를 측정한 바, PBS 투여군에 비해 RANKL 투여군에서는 각각 27 ％(p<0.01), 35 ％(p<0.01), 35 ％(p<0.01)의 감소가 관찰되었다. 이 골 밀도의 감소는, 각각 0.6, 0.8, 1.0 ㎜의 위치에 있어서 리세드로네이트 투여에서는 3 ㎍/㎏의 용량에서 12 ％(p<0.05), 18 ％(p<0.05), 24 ％, 10 ㎍/㎏에서는 13 ％(p<0.05), 28 ％, 30 ％, 30 ㎍/㎏에서는 10 ％(p<0.05), 18 ％(p<0.05), 20 ％(p<0.05)까지 억제되었다(도 38). 또한, 이들 결과는, 마이크로 CT를 이용한 화상 해석에서도 동일하게 확인할 수 있었다(도 39).

복수의 비스포스포네이트를 비교한 약제 평가의 검토

7주령 암컷 C57BL/6N 마우스에 에티드로네이트를 3, 30 ㎎/㎏, 알렌드로네이트를 3, 30, 300 ㎍/㎏, 리세드로네이트를 1, 10, 100 ㎍/㎏의 용량으로 GST-RANKL 투여 전일부터 실험 종료까지 24 시간마다 피하 투여하였다. GST-RANKL은 1 ㎎/㎏으로 24 시간마다 3회 복강내 투여하였다. 3회째의 GST-RANKL 투여 후 1.5 시간 후에 대퇴골, 경골, 혈청을 채취하여 혈청중의 TRAP-5b, 칼슘(Ca), 알칼리포스파타아제(ALP)의 측정을 행하고, 대퇴골은 pQCT에 의해 골 밀도의 측정 및 마이크로 CT를 이용하여 화상 해석을 행하였다.

Ca는 알렌드로네이트 300 ㎍/㎏, 리세드로네이트 1 또는 100 ㎍/㎏의 투여에 의해 각각 RANKL 투여에 비해 유의하게 감소(p<0.05, p<0.01, p<0.01)가 관찰되었다(도 40).

TRAP-5b는 RANKL 투여에 의해 약 40 ％ 상승하였지만, 유의차는 얻어지지 않았다. 알렌드로네이트 투여에서는 300 ㎍/㎏의 용량에서 TRAP-5b의 증가가 유의하게(p<0.01) 억제되었다. 또한, 리세드로네이트 투여에서는 각각 1, 10, 100 ㎍/㎏의 용량에서 유의하게(p<0.05, p<0.01, p<0.01) 억제되었다(도 40). ALP는 알렌드로네이트 및 리세드로네이트 투여에 의해 RANKL 투여군에 비해 약 20 내지 30 ％(p<0.01)의 감소가 관찰되었으며, 이 감소는 용량 의존적이었다(도 40). 대퇴골은 pQCT에 의해 성장판으로부터 근위측으로 0.6, 0.8, 1.0 ㎜의 위치의 골 밀도를 측정한 바, PBS 투여군에 비해 RANKL 투여군에서는 각각 7 ％(p<0.01), 13 ％(p<0.01), 18 ％(p<0.01)의 감소가 관찰되었다. 이 골 밀도의 감소는, 에티드로네이트 투여에서는 30 ㎎/㎏ 투여에 의해 모든 위치에서 2 내지 4 ％(p<0.05)까지 감소가 억제되었다. 마찬가지로, 알렌드로네이트 투여에서는 300 ㎍/㎏의 용량에 있어서 0.6, 0.8 ㎜에서 각각 1 ％ (p<0.01), 5 ％ (p<0.05)까지 감소가 억제되었다. 또한, 리세드로네이트 투여에서는 100 ㎍/㎏의 용량에 있어서 0.6 ㎜에서 1 ％까지 감소가 억제되었다(p<0.01)(도 41). 또한, 이들 결과는, 마이크로 CT를 이 용한 화상 해석에서도 동일하게 확인할 수 있었다(도 42).

상기한 결과로부터 제1세대부터 제3세대까지의 비스포스포네이트를 RANKL 투여 1일 전에 사전 투여함으로써, 그 약리 효과를 평가할 수 있었다. 또한, 그 효과를 나타낸 용량은, 에티드로네이트는 30 ㎎/㎏, 알렌드로네이트는 300 ㎍/㎏, 리세드로네이트는 100 ㎍/㎏이었으며, 각각의 약리 효과의 강도를 반영하고 있었다. 이들 결과로부터, RANKL 투여 골량 감소 모델이 보다 약리 효과가 강한 신규 약제의 스크리닝, 평가에 응용 가능하다는 것을 알 수 있었다. 또한, 비스포스포네이트 사전 투여부터 마우스 해부까지의 시간은 불과 73.5 시간이며, 골 대사 마커나 골 밀도의 측정도 포함하여 불과 4일에 약리 효과의 평가를 행할 수 있었기 때문에, 신속한 골 흡수 억제제의 평가계로서도 응용 가능하다는 것을 알 수 있었다.

단기 OVX 마우스 제조법

7주령 암컷의 C57BL/6N 마우스를 25일간 사육한 후, GST-RANKL을 1 ㎎/㎏으로 24 시간마다 2회 복강내 투여하였다. 2회째의 투여로부터 24 시간 후 난소 적출을 행하고, 난소 적출로부터 24 시간 후 대퇴골, 경골, 혈청을 채취하였다. 이들 샘플을 난소 적출 후 4주간 사육한 군으로부터 얻은 샘플과 비교하였다. 또한, GST-RANKL 투여의 비교 대조로서 PBS 투여를 행하고, 난소 적출의 비교 대조로서 의사 수술(샴(Sham))을 행하였다.

골 대사 마커는 혈중의 TRAP-5b, 칼슘(Ca), 알칼리포스파타아제(ALP)의 측정을 행하고, 대퇴골은 각각 pQCT에 의해 골 밀도의 측정, 마이크로 CT에 의해 화상 해석을 행하였다. 사육 개시 후, OVX 또는 샴의 수술을 행한 일을(X일)로 표시하 였다.

TRAP-5b는 PBS 투여+샴(27일)군에 비해 모든 GST-RANKL 투여군에서 약 1.8배로 상승하였지만 유의한 차는 관찰되지 않았다. Ca는 OVX(0일)군에서 샴(0일)에 비해 약 11 ％의 상승이 관찰되었지만, 모든 OVX 처리군에 변화는 없었다. 또한, ALP에 대해서는 샴(0일)군과 OVX(0일)군에서는 변화가 없었고, PBS 투여 샴(27일)군에 비해 GST-RANKL 투여 OVX(27일)군에서는 약 40 ％(p<0.01)의 상승이 관찰되었다(도 43).

대퇴골의 골 밀도는 성장판으로부터 근위측으로 0.6, 0.8, 1.0 ㎜의 위치에서 측정한 바, GST-RANKL 투여 샴(27일)군 및 OVX(0일)군에서 각각의 대조군인 PBS 투여 샴(27일)군 및 샴(0일)군에 비해 0.6 ㎜에서는 약 7 ％, 약 4 ％, 0.8 ㎜에서는 약 14 ％(p<0.01), 약 9 ％, 1.0 ㎜에서는 약 16 ％(p<0.01), 약 12 ％(p<0.05)의 감소가 관찰되었다. GST-RANKL 투여 OVX(27일)군에서는 약 4 ％, 약 13 ％, 약 15 ％(p<0.01)로 대조군인 PBS 투여 샴(27일)군에 비해 유의하게 감소하였지만, GST-RANKL 투여 샴(27일)군과는 차가 없었다(도 44). 또한, 이들 결과는 마이크로 CT에 의한 화상 해석에서도 확인할 수 있었다(도 45).

상기한 결과로부터 GST-RANKL 투여에 의해 제조한 골량 감소증 모델 마우스는, 종래의 난소 적출 마우스와 동일한 증상을 나타내었다. 통상적으로, 난소 적출에 의한 골량 감소증 모델 마우스 제조에는 4주일 이상의 기간이 필요하지만, GST-RANKL 투여 후 난소 적출을 행함으로써, 그 제조 기간을 불과 72 시간으로 단축시킬 수 있었다. 이들 GST-RANKL 투여 후 난소 적출을 행한 마우스는 적출 1일 후에는 에스트로겐이 거의 소실되어, 호르몬 균형도 통상적인 난소 적출에 의한 골량 감소증 모델 마우스와 유사한 상태가 된다. 따라서, 난소 적출에 의한 골량 감소증 모델 마우스와 거의 동일한 상태의 마우스를 간이적이면서도 단기간에 제조할 수 있었다. 이 GST-RANKL/OVX 모델은 생리적으로 폐경 후의 여성 상태에 가까운 골량 감소 모델이며, 72 시간이라는 단기간에 제조할 수 있기 때문에 호르몬 균형을 고려한 신속한 약제 평가에 응용할 수 있다.

골 치유

7주령 암컷 C57BL/6N 마우스에 GST-RANKL을 1 ㎎/㎏으로 24 시간마다 2회 복강내 투여하고, 2회째의 투여로부터 24 시간 후를 0주로 하여 0, 1, 4, 6, 8주의 혈청 및 대퇴골을 채취하고, 동일하게 PBS 투여한 마우스와 비교하였다. 골 대사 마커는 혈중의 TRAP-5b, 칼슘(Ca), 알칼리포스파타아제(ALP)의 측정을 행하고, 대퇴골은 각각 pQCT에 의해 골 밀도의 측정 및 마이크로 CT를 이용하여 화상 해석을 행하였다.

혈청중의 Ca에 큰 차는 없지만, TRAP-5b는 RANKL 투여 24 시간 후(0주) PBS 투여군에 비해 약 3배로 상승되었으며, 그 후 PBS 투여군과 동일한 거동을 나타내었다. ALP에 대해서는 0 및 1주에 약 1.4배의 상승이 관찰되었으며, 그 후 PBS 투여군과 동일한 거동을 나타내었다(도 46).

대퇴골은, pQCT에 의해 성장판으로부터 근위측으로 0.6 ㎜, 0.8 ㎜, 1.0 ㎜의 위치에서 골 밀도 측정을 행하였다.

pQCT에 의한 골 밀도 측정의 결과, PBS군에 비해 0, 1, 4주에 0.6 ㎜에서는 각각 5, 7, 9 ％, 0.8 ㎜에서는 10, 11, 15 ％, 1.0 ㎜에서는 16, 13, 11 ％의 골 밀도의 감소가 관찰되었다. 0.6 ㎜, 0.8 ㎜, 1.0 ㎜의 모든 위치에서 RANKL 투여 후 4주째까지 PBS 투여군에 비해 골 밀도의 감소가 관찰되었으며, 그 후 6주에 PBS 투여군과 동일한 정도까지 회복하였다(도 47). 또한, 이들 결과는 마이크로 CT에 의한 화상 해석에서도 확인할 수 있었다(도 48).

상기한 결과로부터 RANKL 투여에 의한 골량 감소증 모델 마우스는, 골량의 회복을 비교할 때에도 유용하다는 것을 알 수 있었다. 즉, 2회의 RANKL 투여 후, 6주까지의 기간에 골량 증가를 촉진시키는 약제의 평가가 가능하다는 것을 알 수 있었다.

PTH에 의한 골량 증가 평가

7주령 암컷의 C57BL/6N 마우스에 GST-RANKL을 1 ㎎/㎏으로 24 시간마다 2회 투여하고, 2회째의 투여로부터 24 시간 후 난소 적출을 행하였다. 또한, 난소 적출 24 시간 후로부터 부갑상선 호르몬(PTH)을 피하 투여로 160 ㎍/㎏으로 10일간 연속 투여하였다. 또한, 비교 대조로서 PBS 투여 및 의사 수술(샴)을 행하여, 혈청 마커 및 대퇴골의 골 밀도를 측정하였다.

혈청중의 ALP는 모든 GST-RANKL 투여군에서 약 24 ％의 감소가 관찰되었으며, Ca에 변화는 관찰되지 않았다. 또한, TRAP-5b에서는 모든 PTH 투여군에서 각각의 PTH 비투여군에 비해 약 1.5배(p<0.05)의 유의한 상승이 관찰되었다(도 49). 또한, PBS 투여+샴군에 비해 PBS 투여 OVX군과 RANKL 투여 샴군은 차가 관찰되지 않았다.

골 밀도는, 성장판으로부터 근위측으로 0.6 ㎜, 0.8 ㎜, 1.0 ㎜의 위치에서 측정한 바, GST-RANKL+샴군에서는 PBS+샴군에 비해 각각 약 17 ％(p<0.05), 15 ％(p<0.05), 18 ％(p<0.05)의 감소가 관찰되었다. 또한, OVX군에서는 각각 약 5 ％, 4 ％, 8 ％의 감소가 관찰되었지만, OVX 후 10일 동안에는 골 밀도의 감소가 충분히 관찰되지 않았다. GST-RANKL+OVX군에서는 PBS+샴군에 비해 골 밀도의 감소는 관찰되지 않았다. PBS+샴군에 PTH를 투여한 경우, 1.0 ㎜의 위치에서만 유의한 골 밀도의 상승(p<0.05)이 관찰되었다. OVX군에 PTH를 투여하여도 골 밀도의 상승은 관찰되지만, 유의하지 않았다. 한편, GST-RANKL+샴군에 PTH를 투여한 경우에는 골 밀도의 감소가 유의하게 억제되었으며(p<0.05), PBS+샴군의 골 밀도보다 높았다(도 50). 또한, 이들 결과는 마이크로 CT에 의한 화상 해석에서도 확인할 수 있었다(도 51).

상기한 결과로부터 GST-RANKL 투여에 의한 골량 감소증 모델 마우스는, 평가 시기 및 기간을 변경함으로써 비스포스포네이트와 같은 골 흡수 억제제 뿐만 아니라, PTH와 같은 골 형성 촉진제의 평가에도 이용할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, GST-RANKL 투여에 의해 골 형성이 활성화되어, PTH의 평가를 보다 단기간에 고감도로 행할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

수컷에서의 평가

C57BL/6N 마우스 7주령 수컷에 GST-RANKL을 1 ㎎/㎏으로 24 시간마다 3회 복강내 투여하고, 3회째의 투여로부터 1.5 시간 후 대퇴골, 혈청을 채취하여 PBS 투여군과 비교하였다. 골 대사 마커는, 혈중의 TRAP-5b, 칼슘(Ca), 알칼리포스파타 아제(ALP)의 측정을 행하고, 대퇴골은 pQCT에 의해 골 밀도의 측정 및 마이크로 CT를 이용하여 화상 해석을 행하였다.

Ca는 PBS 투여군에 비해 7 ％ 상승이 관찰되었지만 유의한 차는 얻어지지 않았으며, TRAP-5b는 약 65 ％(p<0.003)의 유의한 상승이 관찰되었다. 또한, ALP는 변화가 없었다(도 52). 대퇴골의 골 밀도는 성장판으로부터 근위측으로 0.6, 0.8, 1.0 ㎜의 위치에서 측정한 바, 0.6 ㎜에서는 약 6 ％, 0.8 ㎜에서는 약 10 ％, 1.0 ㎜에서는 약 15 ％(p<0.03)의 감소가 관찰되었다(도 53). 또한, 이들 결과는 마이크로 CT에 의한 화상 해석에서도 확인할 수 있었다(도 54).

이 결과로부터 GST-RANKL 투여에 의한 골량 감소증 모델 마우스는, 종래의 난소 적출에 의한 모델 마우스와는 달리 자웅을 선택하지 않고 이용할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, 수컷인 경우에도 이용할 수 있는 모델로서 뒷다리 부유, 저칼슘식, 신경 절제 등이 알려져 있지만, GST-RANKL 투여 골량 감소 모델은 보다 단기간에 제조할 수 있다는 점에서 이들보다 우수하다.

다른 계통의 마우스에서의 평가

ICR 마우스 7주령 암컷에 GST-RANKL을 1 ㎎/㎏으로 24 시간마다 3회 복강내 투여하고, 3회째의 투여로부터 1.5 시간 후 대퇴골, 혈청을 채취하여 PBS 투여군과 비교하였다. 골 대사 마커는, 혈중의 TRAP-5b, 칼슘(Ca), 알칼리포스파타아제(ALP)의 측정을 행하고, 대퇴골은 pQCT에 의해 골 밀도의 측정 및 마이크로 CT를 이용하여 화상 해석을 행하였다.

대조군에 비해 혈중 Ca에 변화는 없지만, TRAP-5b는 PBS 투여군에 비해 1.8 배로 상승하였다(p<0.01). 또한, ALP는 변화가 없었다(도 55). 대퇴골의 골 밀도는 성장판으로부터 근위측으로 1.0, 1.2, 1.4 ㎜의 위치에서 측정한 바, 대조군에 비해 1.0 ㎜에서는 약 20 ％, 1.2 ㎜에서는 약 20 ％, 1.4 ㎜에서는 약 22 ％(p<0.05)의 감소가 관찰되었다(도 56). 또한, 이들 결과는 마이크로 CT에 의한 화상 해석에서도 확인할 수 있었다(도 57). 이 결과로부터 RANKL 투여에 의한 골량 감소증 모델 마우스는, C57BL/6 마우스 뿐만 아니라 다른 계통의 마우스로도 제조할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

피셔 래트를 이용한 검토

피셔 래트 7주령 암컷에 GST-RANKL을 1 ㎎/㎏으로 24 시간마다 3회 복강내 투여하고, 3회째의 투여로부터 1.5 시간 후 혈청 및 대퇴골을 채취하여 PBS 투여군과 비교하였다. 혈청을 사용하여 골 흡수 마커인 Ca, TRAP-5b(IDS Ltd, SB-TR102 키트 사용), 골 형성 마커인 ALP를 측정하고, 대퇴골은 pQCT에 의해 골 밀도의 측정 및 마이크로 CT를 이용하여 화상 해석을 행하였다.

혈청중의 TRAP-5b, Ca, ALP는 대조군에 비해 변화가 없었지만(도 58), 대퇴골의 골 밀도는 성장판으로부터 근위측으로 3 ㎜의 거리를 측정한 바, 약 20 ％(p<0.02)의 감소가 관찰되었다(도 59). 또한, 이들 결과는 마이크로 CT에 의한 화상 해석에서도 확인할 수 있었다(도 60). 이 결과로부터 RANKL 투여에 의한 골량 감소증 모델은, 마우스 뿐만 아니라 래트 등의 다른 동물에도 이용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

GST-RANKL의 단회 투여

7주령 암컷의 C57BL/6N 마우스에 GST-RANKL을 1 ㎎/㎏으로 복강내 투여하고, 12, 24, 48 시간 후의 혈청중의 골 흡수 마커, 골 형성 마커를 측정하였다. 혈청중 인간 RANKL 농도는 GST-RANKL 투여 전과 투여 후, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 시간 후에 채혈하고, ELISA를 이용하여 측정하였다. 또한, 투여 후 24, 48 시간 후의 대퇴골의 골 밀도도 pQCT로 측정하였다.

혈청중 인간 RANKL 농도는 투여 후 빠르게 상승하여, 4 시간 후 피크에 도달하였다. 그 후, 급속히 감소하여 24 시간 후에는 검출할 수 없게 되었다(도 61). 혈청중의 Ca에 변화는 관찰되지 않았으며, TRAP-5b에서는 투여 후 12 시간에 약 1.7배(p<0.01)로 유의하게 상승하였다. 또한, ALP에서는 GST-RANKL 투여군에서 약 30 ％(p<0.01)의 유의한 감소가 관찰되었다(도 62). 대퇴골의 골 밀도는 성장판으로부터 근위측으로 0.6, 0.8, 1.0 ㎜의 위치에서 측정한 바, 24 시간 후, 48 시간 후의 골 밀도는 대조군에 비해 0.6 ㎜에서는 각각 약 4 ％, 약 5 ％, 0.8 ㎜에서는 약 9 ％, 약 9 ％, 1.0 ㎜에서는 약 12 ％(p<0.05), 약 15 ％(p<0.01)의 감소가 관찰되었다(도 63). 또한, 이들 결과는 마이크로 CT에 의한 화상 해석에서도 확인할 수 있었다(도 64).

이 결과는, GST-RANKL을 1 ㎎/㎏의 단회 투여로 골량을 유의하게 감소시킨다는 것을 나타내고 있다. 그러나, 1회의 투여와 2회의 투여를 비교하면, 2회의 투여가 성장판으로부터 근위측으로 0.6 ㎜, 0.8 ㎜, 1.0 ㎜의 3점 모두에서 유의한 골 밀도의 감소가 관찰되기 때문에 바람직하다고 생각되지만, 단회 투여로도 충분히 골 밀도를 감소시키는 것이 가능하다는 것을 나타내고 있다. GST-RANKL을 2회 투여하는 경우, 투여량을 2 ㎎/㎏으로 함으로써 투여량 0.5 ㎎/㎏ 및 1 ㎎/㎏에 비해 골량 감소 효과가 증가하였기 때문에, 단회 투여로도 투여량을 증가시킴으로써 자유롭게 골량 감소의 정도를 조절할 수 있다. 즉, 단회 투여인 경우에도 예를 들면 투여량을 2 ㎎/㎏으로 함으로써, 성장판으로부터 근위측으로 0.6 ㎜, 0.8 ㎜, 1.0 ㎜의 3점 모두에서 유의한 골 밀도의 감소가 관찰되는 것을 기대할 수 있다.

GST-RANKL의 7일간 연일 투여

7주령 암컷 C57BL/6 마우스에 GST-RANKL을 2 ㎎/㎏/일로 7일간 연속 복강내 투여하고, 7회째의 투여 후 1.5 시간 후에 혈청 및 대퇴골의 채취를 행하였다. 얻어진 혈청 및 대퇴골은 혈청 마커의 측정 및 골 밀도를 pQCT로 측정하였다.

골 흡수 마커인 Ca는 약 20 ％ 상승이 관찰되었지만 유의한 차는 얻어지지 않았으며, TRAP-5b에서도 약 30 ％의 상승 경향은 관찰되었지만 유의한 차는 관찰되지 않았다. 또한, ALP는 약 30 ％의 유의한 상승이 관찰되었다(p<0.02)(도 65). 대퇴골의 골 밀도는 성장판으로부터 근위측으로 0.6, 0.8, 1.0 ㎜의 거리를 측정한 바, 대조군에 비해 0.6 ㎜에서는 약 21 ％(p<0.05), 0.8 ㎜에서는 약 32 ％(p<0.05), 1.0 ㎜에서는 약 47 ％(p<0.01)의 감소가 관찰되었다(도 66). 또한, 이들 결과는 마이크로 CT에 의한 화상 해석에서도 확인할 수 있었다(도 67).

상기한 결과로부터 7일간의 연속 투여에 의해 골 흡수 마커 뿐만 아니라 골 형성 마커의 상승이 관찰되었기 때문에, 골 흡수와 골 형성의 커플링 현상이 발생하였던 것으로 추측된다. 따라서, 이 모델 마우스는 골량 감소증, 골다공증의 연구 뿐만 아니라 커플링 현상의 해명에도 이용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

GST-RANKL의 마우스 두개관 투여

8주령 암컷 C57BL/6N 마우스에 GST-RANKL을 두개관으로 3일간 투여하였다. 실험 개시 5일째에 대퇴골을 채취하고, 그 골 밀도를 pQCT에 의해 평가하였다. 실험군으로서는, GST-RANKL을 0.5 ㎎/㎏으로 1일 2회 투여하는 실험군 1, GST-RANKL을 1 ㎎/㎏으로 1일 1회 투여하는 실험군 2, 비교 대조로서 PBS를 투여하는 PBS군의 합계 3군으로 실험을 행하였다. 채취한 대퇴골은, pQCT에 의해 성장판으로부터 근위측으로 0.6 ㎜, 0.8 ㎜, 1.0 ㎜의 위치에서 해면골의 골 밀도 측정을 행하였다.

pQCT에 의한 골 밀도 측정의 결과, PBS군에 비해 실험군 1에서는 계측한 모든 위치에서 골 밀도의 감소가 관찰되었다. 실험군 2에서는 성장판으로부터 근위측으로 0.8 ㎜, 1.0 ㎜의 위치에서 골 밀도의 감소가 관찰되었다(도 68).

또한, 실험군 1과 실험군 2를 비교하면 실험군 1에서 보다 골 밀도가 감소되었기 때문에, 1일당 GST-RANKL 투여량이 동량인 경우, 단회 투여보다 복수회 투여하는 것이 보다 골 밀도 감소가 현저하다는 것을 알 수 있었다.

실시예 6 골량 감소증 모델 마우스를 이용한 RANKL 시그널 저해 화합물의 평가

7주령의 C57BL/6N 암컷 마우스에 20 ㎍의 GST 또는 GST-RANKL을 24 시간마다 3회 투여하였다. LFM-A13(20 ㎎/체중 ㎏) 또는 생리 식염수를 GST-RANKL 투여 1 시간 전에 투여하였다. 3회째의 GST-RANKL 투여로부터 1.5 시간 후 혈중 Ca의 측정 및 골 형태 계측을 행하였다. 또한, 마이크로 CT에 의해 3D 화상 해석을 행하였다.

Tec 패밀리 키나아제인 Tec, Btk는 KO 마우스를 이용한 해석 등으로부터 파골세포 분화에 중요한 역할을 담당하고 있다는 것이 시사되어 있다. LFM-A13은 Tec 패밀리 키나아제에 속하는 Btk의 ATP 결합 영역에 특이적으로 결합함으로써, Tec 키나아제의 활성을 저해하는 약제이다(Mahajan 외, J. Biol. Chem., 274, 9587-9599, 1999; Fernandes 외, J. Leukoc. Biol., 78, 524-532, 2005).

마이크로 CT에 의한 화상 해석의 결과로부터, LFM-A13을 투여함으로써 GST-RANKL 투여에 의한 골량 감소가 억제되었다(도 69). 또한, 골 형태 계측에서 GST-RANKL 투여에 의한 단위 골량(BV/TV)의 감소가 LFM-A13 투여에 의해 유의하게(p<0.01) 억제되었다(도 70). 골소주폭(Tb.Th) 및 골소주수(Tb.N)는 GST-RANKL 투여에 의해 감소하지만, LFM-A13 투여에 의해 각각 유의하게(p<0.05 및 p<0.01) 감소가 억제되었다(도 71 및 72). 파골세포수(N.Oc/B.Pm) 및 흡수면(ES/BS)은 GST-RANKL 투여에 의해 증가하지만, LFM-A13 투여에 의해 각각 유의하게(p<0.01) 증가가 억제되었다(도 73 및 74). 혈중 Ca 농도는 GST-RANKL 투여에 의해 증가하지만, LFM-A13 투여에 의해 유의하게(p<0.05) 억제되었다(도 75).

상기한 결과로부터 GST-RANKL 투여 골량 감소증 모델은 RANKL 시그널을 저해하는 약제의 평가 및 파골세포 분화를 비롯한 메커니즘 연구에도 응용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

실시예 7 선택적 에스트로겐 수용체 모듈레이터(랄록시펜)를 이용한 약제 평가의 검토

7주령의 C57BL/6N 암컷 마우스에 GST-RANKL을 1 ㎎/㎏으로 24 시간마다 2회 복강내 투여하고, 2회째의 투여로부터 24 시간 후 난소 적출(OVX) 또는 의사 수 술(샴)을 행하고, 그 후 24 시간 후로부터 랄록시펜 1 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏을 각각 24 시간 간격으로 14일간 계속 경구 투여하였다. 또한, GST-RANKL 및 랄록시펜 투여의 비교 대상으로서 각각 PBS(i.p.), 초순수 (p.o.)를 이용하였다. 랄록시펜의 14일째의 투여로부터 24 시간 후 혈청 및 대퇴골의 채취를 행하였다.

채취한 혈청은, 혈중의 골 흡수 마커(Ca, TRAP-5b) 및 골 형성 마커(ALP)의 측정을 행하고, 대퇴골은 pQCT에 의해 성장판으로부터 근위측으로 0.6, 0.8, 1.0 ㎜의 거리에서 골 밀도, 골 염량, 피질골 두께의 측정을 행하였다. 또한, 마이크로 CT에 의해 화상 해석을 행하였다.

혈중의 Ca, TRAP-5b는 큰 변화는 관찰되지 않았으며, PBS 투여 OVX군에서 PBS 투여 샴군보다 유의한 Ca의 상승이 관찰되었을 뿐이었다(도 76). ALP는 GST-RANKL 투여 OVX군에서 PBS 투여 샴군보다 상승하는 경향이 있었지만, 랄록시펜 1 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏ 투여에 의해 각각 유의하게 감소하였다(p<0.05, p<0.01)(도 76). pQCT를 이용한 골 밀도의 측정에서는, 각 군 사이에서 해면골 밀도에 큰 변화는 관찰되지 않았다. 한편, 전체 골 밀도에서는 PBS 투여 OVX군에서 PBS 투여 샴군보다 유의한 감소가 관찰되었지만, GST-RANKL 투여 OVX군에서는 감소 경향은 있지만 유의한 차는 관찰되지 않았다. GST-RANKL 투여 OVX군에서는 랄록시펜 1 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏ 투여에 의해, 성장판으로부터 근위측으로 1.0 ㎜의 위치에서 각각 10 ％(p<0.05), 11 ％(p<0.05) 증가하였다(도 77). 또한, GST-RANKL 투여 OVX군에서 랄록시펜 10 ㎎/㎏ 투여에 의해, 전체 골 밀도는 성장판으로부터 근위측으로 0.6, 0.8 ㎜의 위치에서 각각 10 ％(p<0.05), 11 ％(p<0.05) 증가하였다(도 77). pQCT 측정에 의한 피질골 염량에서는, PBS 투여 OVX군 및 GST-RANKL 투여 OVX군에서 PBS 투여 샴군보다 성장판으로부터 근위측으로 1.0 ㎜의 위치에서 각각 34 ％(p<0.05), 49 ％(p<0.01)의 감소가 관찰되었다(도 78). GST-RANKL 투여 OVX군에서는 랄록시펜 10 ㎎/㎏ 투여에 의해, 피질골 염량은 성장판으로부터 근위측으로 0.6, 0.8, 1.0 ㎜의 위치에서 각각 87 ％(p<0.05), 118 ％(p<0.01), 137 ％(p<0.01) 증가하였다(도 78). 또한, GST-RANKL 투여 OVX군에서 랄록시펜 1 ㎎/㎏ 투여에 의해, 피질골 염량은 성장판으로부터 근위측으로 0.8, 1.0 ㎜의 위치에서 각각 93 ％(p<0.05), 136 ％(p<0.01) 증가하였다(도 78). 마찬가지로 pQCT 측정에 의한 피질골 두께에서는, PBS 투여 OVX군 및 GST-RANKL 투여 OVX군에서 PBS 투여 샴군보다 성장판으로부터 근위측으로 1.0 ㎜의 위치에서 각각 35 ％(p<0.05), 49 ％(p<0.01)의 유의한 감소가 관찰되었다(도 79). GST-RANKL 투여 OVX군에서는 랄록시펜 10 ㎎/㎏ 투여에 의해, 피질골 두께는 성장판으로부터 근위측으로 0.6, 0.8, 1.0 ㎜의 위치에서 각각 92 ％(p<0.01), 123 ％(p<0.01), 133 ％(p<0.01) 증가하였다(도 79). 또한, GST-RANKL 투여 OVX군에서 랄록시펜 1 ㎎/㎏ 투여에 의해, 피질골 두께는 성장판으로부터 근위측으로 0.8, 1.0 ㎜의 위치에서 각각 101 ％(p<0.05), 137 ％(p<0.01) 증가하였다(도 79). 이들 결과는, 마이크로 CT를 이용한 화상 해석에서도 동일하게 확인할 수 있었다(도 80). 이 결과로부터 RANKL 투여에 의한 골량 감소증 모델 마우스는, 랄록시펜 등의 선택적 에스트로겐 수용체 모듈레이터의 약제 평가에 이용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

실시예 8 저용량의 PTH를 사용한 골량 증가 평가

7주령 암컷의 C57BL/6N 마우스에 GST-RANKL을 1 ㎎/㎏으로 24 시간마다 2회 복강내 투여하고, 2회째의 투여로부터 24 시간 후부터 24 시간 간격으로 10일간 연속적으로 PTH를 40, 80 ㎍/㎏으로 각각 피하 투여를 행하였다. 또한, GST-RANKL 및 PTH 투여의 비교 대조로서 각각 PBS를 투여하였다. 투하하는 동안 투여 후 24 시간의 마우스로부터 혈청 및 대퇴골의 채취를 행하였다.

채취한 혈청은, 혈중의 골 흡수 마커(Ca, TRAP-5b) 및 골 형성 마커(ALP)의 측정을 행하고, 대퇴골은 pQCT에 의해 성장판으로부터 근위측으로 0.6, 0.8, 1.0 ㎜의 위치에서 전체 골 밀도, 피질골 밀도, 피질골 두께, 피질골 염량 및 골격의 피질골 밀도의 측정을 행하였다. 또한, 마이크로 CT에 의해 화상 해석을 행하였다.

혈중의 Ca, TRAP-5b는 큰 변화는 관찰되지 않았으며, GST-RANKL 투여군에서 80 ㎍/㎏의 PTH 투여에 의해 Ca는 근소하지만 유의하게 감소하였다(p<0.05)(도 81). 한편, ALP는 GST-RANKL 투여군에서 80 ㎍/㎏의 PTH 투여에 의해 유의하게 감소하였으며(p<0.01), 40 ㎍/㎏의 PTH 투여에 의해서도 감소 경향을 나타내었다(도 81). GST-RANKL 투여군에서는 40 ㎍/㎏의 PTH 투여에 의해, PBS 투여에 비해 해면골 밀도는 성장판으로부터 근위측으로 0.6, 0.8 ㎜의 위치에서 각각 25 ％(p<0.01), 28 ％(p<0.05) 증가하였다(도 82). 또한, GST-RANKL 투여군에서 80 ㎍/㎏의 PTH 투여에 의해, 해면골 밀도는 성장판으로부터 근위측으로 0.6 ㎜의 위치에서 20 ％(p<0.01) 증가하였다(도 82). 한편, 전체 골 밀도에서는 GST-RANKL 투여군에서 40 ㎍/㎏의 PTH 투여에 의해, PBS 투여에 비해 성장판으로부터 근위측으로 0.6, 0.8, 1.0 ㎜의 위치에서 각각 14 ％(p<0.01), 17 ％(p<0.01), 19 ％(p<0.01) 증가하였다(도 83). 또한, GST-RANKL 투여군에서 80 ㎍/㎏의 PTH 투여에 의해 동일하게 10 ％(p<0.01), 13 ％(p<0.01), 13 ％(p<0.01) 증가하였다(도 83). GST-RANKL 투여군에서는 40 ㎍/㎏의 PTH 투여에 의해, PBS 투여에 비해 피질골 밀도는 성장판으로부터 근위측으로 0.8, 1.0 ㎜의 위치에서 각각 4 ％(p<0.01), 5 ％(p<0.01) 증가하였다(도 84). 또한, GST-RANKL 투여 OVX군에서 80 ㎍/㎏의 PTH 투여에 의해, 피질골 밀도는 성장판으로부터 근위측으로 1.0 ㎜의 위치에서 3 ％(p<0.05) 증가하였다(도 84). 피질골 염량에서는 GST-RANKL 투여군에서 40 ㎍/㎏의 PTH 투여에 의해, PBS 투여에 비해 성장판으로부터 근위측으로 0.6, 0.8, 1.0 ㎜의 위치에서 각각 80 ％(p<0.01), 123 ％(p<0.01), 100 ％(p<0.01) 증가하였으며, 80 ㎍/㎏의 PTH 투여에 의해서도 각각 46 ％(p<0.05), 83 ％(p<0.01), 77 ％(p<0.01) 증가하였다(도 85). 마찬가지로, 피질골 두께에서도 GST-RANKL 투여군에서 40 ㎍/㎏의 PTH 투여에 의해, PBS 투여에 비해 성장판으로부터 근위측으로 0.6, 0.8, 1.0 ㎜의 위치에서 각각 86 ％(p<0.01), 127 ％(p<0.01), 98 ％(p<0.01) 증가하였으며, 80 ㎍/㎏의 PTH 투여에 의해서도 각각 50 ％(p<0.05), 89 ％(p<0.01), 79 ％(p<0.01) 증가하였다(도 86). 한편, 골격에서의 피질골 밀도는 GST-RANKL 투여에 의해 PBS 투여의 대조군에 비해 3 ％(p<0.01) 감소하였다(도 87). GST-RANKL 투여군에서 40, 80 ㎍/㎏의 PTH 투여에 의해, PBS 투여에 비해 각각 3 ％(p<0.01), 3 ％(p<0.01) 증가하였다(도 87). 이들 결과는, 마이크로 CT를 이용한 화상 해석에서도 동일하게 확인할 수 있었다(도 88).

이 결과로부터 RANKL 투여에 의한 골량 감소증 모델 마우스는, 저용량의 PTH 에 의한 골량 증가 작용을 단기간에 검출할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

실시예 9 가용형 RANKL과 GST의 융합 단백질을 12주령의 마우스에 투여한 골량 감소증 모델 마우스의 제조

GST-RANKL을 1 ㎎/㎏으로 24 시간마다 12주령 C57BL/6N 마우스 자웅에 24 시간마다 3회 복강내 투여하고, 3회째의 투여로부터 1.5 시간 후의 혈청 및 대퇴골을 채취하였다. 채취한 혈청은 혈중의 골 흡수 마커(Ca, TRAP-5b) 및 골 형성 마커(ALP)의 측정을 행하고, 대퇴골은 이중 에너지 X선 흡수법(DEXA)에 의해 골 밀도를 측정하고, 마이크로 CT에 의해 화상 해석을 행하였다.

혈중의 TRAP-5b는 수컷에서는 GST-RANKL 투여에 의해, PBS 투여에 비해 유의한 상승이 관찰되었다(p<0.05). Ca 및 ALP는 상승 경향이 관찰되었지만, 유의한 변화는 관찰되지 않았다(도 89). 한편, 혈중의 Ca 및 TRAP-5b는 암컷에서 GST-RANKL 투여에 의해, PBS 투여에 비해 각각 유의한 상승이 관찰되었다(p<0.05, p<0.01). 그러나, ALP에서는 상승 경향이 관찰되었지만, 유의한 변화는 관찰되지 않았다(도 89). DEXA에 의한 골 밀도 측정의 결과, GST-RANKL 투여군에서 수컷 암컷 모두 대조군에 비해 각각 8 ％(p<0.05), 6 ％(p<0.05)의 전체 골 밀도 감소가 관찰되었다(도 90). 이들 결과는, 마이크로 CT를 이용한 화상 해석에서도 동일하게 확인할 수 있었다(도 91). 12주령의 자웅 마우스의 결과로부터 RANKL 투여에 의한 골량 감소증 모델 마우스는 주령을 선택하지 않고, 비교적 고주령의 마우스에 도 이용할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, RANKL 투여에 의한 골량 감소증 모델 마우스는 12주령에서도 자웅에 관계없이 제조할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

본 발명에 따르면, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질의 투여에 의한 파골세포의 직접적인 분화ㆍ활성화 촉진이라는 단순한 메커니즘에 의해, 신속하게 골량 감소증의 모델 동물을 작출할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 골량 감소증 모델 동물을 이용함으로써, 약제의 평가도 신속하게 행할 수 있다. 또한, 본 발명의 골량 감소증 모델 동물에서는 RANKL에 의해 직접 파골세포의 분화ㆍ활성화가 발생하기 때문에, 순수하게 파골세포의 작용에 의한 골 파괴에 대한 골 흡수 억제제의 효과를 평가할 수 있다. 또한, 골량 감소증의 모델 동물을 제조한 후, 골량을 본래대로 되돌리는 속도에 주목하면, 골량 증가약의 평가도 가능하다.

또한, 난소 적출과 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질의 투여를 조합함으로써, 생리적으로 호르몬 균형이 폐경과 유사한 상태에서, 통상적으로 제조에 수주일 정도를 필요로 하는 난소 적출 모델보다 더욱 신속하게 골량 감소증 모델 동물을 작출할 수 있다.

본 발명의 골량 감소증 모델 동물은, 골 대사 질환의 치료 등에 사용하는 약제의 스크리닝에 사용할 수 있으며, 골 대사 질환의 연구용 동물로서 사용할 수 있다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 그대로 참고로서 본 명세서에 도입된다.

서열 목록 프리 텍스트

서열 3 내지 18 합성

<110> ORIENTAL YEAST Co., Ltd. <120> A bone mass reducing model animal <130> PH-3329-PCT <150> JP2006/278029 <151> 2006-10-11 <150> JP2007/095017 <151> 2007-03-30 <150> PCT/JP2007/063871 <151> 2007-07-05 <160> 24 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2201 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (129)..(1082) <400> 1 ggccaaagcc gggctccaag tcggcgcccc acgtcgaggc tccgccgcag cctccggagt 60 tggccgcaga caagaagggg agggagcggg agagggagga gagctccgaa gcgagagggc 120 cgagcgcc atg cgc cgc gcc agc aga gac tac acc aag tac ctg cgt ggc 170 Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly 1 5 10 tcg gag gag atg ggc ggc ggc ccc gga gcc ccg cac gag ggc ccc ctg 218 Ser Glu Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu 15 20 25 30 cac gcc ccg ccg ccg cct gcg ccg cac cag ccc ccc gcc gcc tcc cgc 266 His Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Gln Pro Pro Ala Ala Ser Arg 35 40 45 tcc atg ttc gtg gcc ctc ctg ggg ctg ggg ctg ggc cag gtt gtc tgc 314 Ser Met Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu 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265 270 Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu 275 280 285 Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp 290 295 300 Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp 305 310 315 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 3 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 4 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 5 Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 6 His Gln His Gln His Gln 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 7 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 8 Asp Thr Tyr Arg Tyr Ile 1 5 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 9 Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 10 Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 11 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 12 Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Ile Asp Ser Cys 1 5 10 15 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 13 Met Lys Ala Glu Phe Arg Arg Gln Glu Ser Asp Arg 1 5 10 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 14 Met Arg Asp Ala Leu Asp Arg Leu Asp Arg Leu Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 15 Met Lys Asp Gly Glu Glu Tyr Ser Arg Ala Phe Arg 1 5 10 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 16 Glu Glu Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 17 Cys Thr Pro Thr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu 1 5 10 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 18 Pro Pro Glu Pro Glu Thr 1 5 <210> 19 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GST-RANKL (aa127-317) <400> 19 atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60 ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120 tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180 ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240 atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300 gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360 gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420 acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480 gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540 aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600 tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660 ctggttccgc gtggatcccc aggaattccc gggtcgactg tgcaaaagga attacaacat 720 atcgttggat cacagcacat cagagcagag aaagcgatgg tggatggctc atggttagat 780 ctggccaaga ggagcaagct tgaagctcag ccttttgctc atctcactat taatgccacc 840 gacatcccat ctggttccca taaagtgagt ctgtcctctt ggtaccatga tcggggttgg 900 gccaagatct ccaacatgac ttttagcaat ggaaaactaa tagttaatca ggatggcttt 960 tattacctgt atgccaacat ttgctttcga catcatgaaa cttcaggaga cctagctaca 1020 gagtatcttc aactaatggt gtacgtcact aaaaccagca tcaaaatccc aagttctcat 1080 accctgatga aaggaggaag caccaagtat tggtcaggga attctgaatt ccatttttat 1140 tccataaacg ttggtggatt ttttaagtta cggtctggag aggaaatcag catcgaggtc 1200 tccaacccct ccttactgga tccggatcag gatgcaacat actttggggc ttttaaagtt 1260 cgagatatag attga 1275 <210> 20 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GST-RANKL (aa127-317) <400> 20 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220 Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Ser Thr Arg Ala Ala Ala Ser Leu Val 225 230 235 240 Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Ser Thr Val Gln Lys Glu Leu 245 250 255 Gln His Ile Val Gly Ser Gln His Ile Arg Ala Glu Lys Ala Met Val 260 265 270 Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu Glu Ala Gln 275 280 285 Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro Ser Gly Ser 290 295 300 His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala Lys 305 310 315 320 Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Val Asn Gln Asp 325 330 335 Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His Glu Thr 340 345 350 Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr Val Thr 355 360 365 Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met Lys Gly Gly 370 375 380 Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr Ser Ile 385 390 395 400 Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu Ile Ser Ile 405 410 415 Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala Thr Tyr 420 425 430 Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp 435 440 <210> 21 <211> 1236 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GST-RANKL (aa140-317) <400> 21 atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60 ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120 tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180 ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240 atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300 gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360 gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420 acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480 gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540 aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600 tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660 ctggttccgc gtggatcccc aggaattccc gggtcgacta tcagagcaga gaaagcgatg 720 gtggatggct catggttaga tctggccaag aggagcaagc ttgaagctca gccttttgct 780 catctcacta ttaatgccac cgacatccca tctggttccc ataaagtgag tctgtcctct 840 tggtaccatg atcggggttg ggccaagatc tccaacatga cttttagcaa tggaaaacta 900 atagttaatc aggatggctt ttattacctg tatgccaaca tttgctttcg acatcatgaa 960 acttcaggag acctagctac agagtatctt caactaatgg tgtacgtcac taaaaccagc 1020 atcaaaatcc caagttctca taccctgatg aaaggaggaa gcaccaagta ttggtcaggg 1080 aattctgaat tccattttta ttccataaac gttggtggat tttttaagtt acggtctgga 1140 gaggaaatca gcatcgaggt ctccaacccc tccttactgg atccggatca ggatgcaaca 1200 tactttgggg cttttaaagt tcgagatata gattga 1236 <210> 22 <211> 429 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GST-RANKL (aa140-317) <400> 22 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220 Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Ser Thr Arg Ala Ala Ala Ser Leu Val 225 230 235 240 Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Ser Thr Ile Arg Ala Glu Lys 245 250 255 Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu 260 265 270 Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro 275 280 285 Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly 290 295 300 Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Val 305 310 315 320 Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His 325 330 335 His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val 340 345 350 Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met 355 360 365 Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe 370 375 380 Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu 385 390 395 400 Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp 405 410 415 Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp 420 425 <210> 23 <211> 1179 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GST-RANKL (aa159-317) <400> 23 atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60 ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120 tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180 ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240 atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300 gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360 gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420 acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480 gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540 aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600 tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660 ctggttccgc gtggatcccc aggaattccc gggtcgacta agcttgaagc tcagcctttt 720 gctcatctca ctattaatgc caccgacatc ccatctggtt cccataaagt gagtctgtcc 780 tcttggtacc atgatcgggg ttgggccaag atctccaaca tgacttttag caatggaaaa 840 ctaatagtta atcaggatgg cttttattac ctgtatgcca acatttgctt tcgacatcat 900 gaaacttcag gagacctagc tacagagtat cttcaactaa tggtgtacgt cactaaaacc 960 agcatcaaaa tcccaagttc tcataccctg atgaaaggag gaagcaccaa gtattggtca 1020 gggaattctg aattccattt ttattccata aacgttggtg gattttttaa gttacggtct 1080 ggagaggaaa tcagcatcga ggtctccaac ccctccttac tggatccgga tcaggatgca 1140 acatactttg gggcttttaa agttcgagat atagattga 1179 <210> 24 <211> 410 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GST-RANKL (aa159-317) <400> 24 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220 Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Ser Thr Arg Ala Ala Ala Ser Leu Val 225 230 235 240 Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Ser Thr Lys Leu Glu Ala Gln 245 250 255 Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro Ser Gly Ser 260 265 270 His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala Lys 275 280 285 Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Val Asn Gln Asp 290 295 300 Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His Glu Thr 305 310 315 320 Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr Val Thr 325 330 335 Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met Lys Gly Gly 340 345 350 Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr Ser Ile 355 360 365 Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu Ile Ser Ile 370 375 380 Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala Thr Tyr 385 390 395 400 Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp 405 410

Claims (22)

1. 가용형 RANKL(파골세포 분화 인자) 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 비인간 동물에 투여하여, 상기 비인간 동물 체내에서의 파골세포의 분화 및 활성화를 촉진시키는 것을 포함하는 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.
2. 제1항에 있어서, 에피토프 태그가 글루타티온-S-트랜스퍼라아제인 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 비인간 동물에 투여한 후, 1주일 이내에 골량 감소증 모델 동물을 작출할 수 있는 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.
4. 제3항에 있어서, 50 시간 이내에 골량 감소증 모델 동물을 작출할 수 있는 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.
5. 제3항에 있어서, 24 시간 이내에 골량 감소증 모델 동물을 작출할 수 있는 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.
6. 비인간 동물이 설치류에 속하는 동물인 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 골량 감소증 모델 동물.
7. 제6항에 있어서, 비인간 동물이 마우스 또는 래트인 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질의 투여량을 변경함으로써, 중증도가 상이한 골량 감소증 모델 동물을 작출하는 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 투여하는 동물로부터 추가로 난소를 적출하는 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.
10. 제9항에 있어서, 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태그의 융합 단백질을 비인간 동물에 투여한 후, 72 시간 이내에 골량 감소증 모델 동물을 작출 할 수 있는 골량 감소증 모델 동물의 작출 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 작출된 골량 감소증 모델 동물.
12. 제11항에 있어서, 체내의 골 흡수 마커 레벨이 정상 개체에 비해 상승된 골량 감소증 모델 동물.
13. 제11항에 있어서, 골 밀도 및/또는 단위 골량이 정상 개체에 비해 저하된 골량 감소증 모델 동물.
14. 제13항에 있어서, 추가로 파골세포수 및/또는 골소주수가 정상 개체에 비해 저하된 골량 감소증 모델 동물.
15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 혈중 에스트로겐 농도, 혈중 PTH 농도 및 혈중 OPG 농도 중 적어도 하나가 정상 개체에 비해 변동되지 않은 골량 감소증 모델 동물.
16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 골량 감소증 모델 동물에 골 흡수 억제제 또는 골 흡수 억제제 후보 물질을 투여하고, 골량 감소증 모델 동물에서의 감소된 골량이 증가하는지의 여부를 지표로 하여 상기 골 흡수 억제제 또는 골 흡수 억제제 후보 물질의 효과를 평가하는 방법이며, 골량이 증가한 경우 골 흡수 억제에 효과가 있다고 판정하는 골 흡수 억제제 또는 골 흡수 억제제 후보 물질을 평가하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 골량의 증가를 골량 감소증 모델 동물에서의 체내의 골 흡수 마커 레벨의 상승, 골 밀도의 상승, 단위 골량의 상승, 골소주수의 상승, 파골세포수의 저하, 골아세포면의 상승 및 CT에 의해 관찰되는 골량의 증가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 지표로 판단하는 골 흡수 억제제 또는 골 흡수 억제제 후보 물질을 평가하는 방법.
18. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 골량 감소증 모델 동물에 골 형성 촉진제 또는 골 형성 촉진제 후보 물질을 투여하고, 골량 감소증 모델 동물에서의 감소된 골량이 증가하는지의 여부를 지표로 하여 상기 골 형성 촉진제 또는 골 형성 촉진제 후보 물질의 효과를 평가하는 방법이며, 골량이 증가한 경우 골 형성 촉진에 효과가 있다고 판정하는 골 형성 촉진제 또는 골 형성 촉진제 후보 물질을 평가하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 골량의 증가를 골량 감소증 모델 동물에서의 체내의 골 형성 마커 레벨의 상승, 골 밀도의 상승, 단위 골량의 상승, 골소주수의 상승, 파골세포수의 저하, 골아세포면의 상승 및 CT에 의해 관찰되는 골량의 증가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 지표로 판단하는 골 형성 촉진제 또는 골 형성 촉진제 후보 물질을 평가하는 방법.
20. 제8항에 기재된 방법에 의해 가용형 RANKL 또는 가용형 RANKL과 에피토프 태 그의 융합 단백질을 투여하고 추가로 난소를 적출하여 작출된 골량 감소증 모델 동물에 호르몬 또는 호르몬 수용체 모듈레이터를 투여하고, 골량 감소증 모델 동물에서의 감소된 골량이 증가하는지의 여부를 지표로 하여 상기 호르몬 또는 호르몬 수용체 모듈레이터의 효과를 평가하는 방법이며, 골량이 증가한 경우 골 흡수 억제에 효과가 있다고 판정하는 호르몬 또는 호르몬 수용체 모듈레이터를 평가하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 호르몬 또는 호르몬 수용체 모듈레이터가 선택적 에스트로겐 수용체 모듈레이터인 호르몬 또는 호르몬 수용체 모듈레이터를 평가하는 방법.
22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 골량의 증가를 골량 감소증 모델 동물에서의 체내의 골 형성 마커 레벨의 상승, 골 밀도의 상승, 단위 골량의 상승, 골소주수의 상승, 파골세포수의 저하, 골아세포면의 상승 및 CT에 의해 관찰되는 골량의 증가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 지표로 판단하는 호르몬 또는 호르몬 수용체 모듈레이터를 평가하는 방법.

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