KR20090065643A

KR20090065643A - 세포배양용기 및 세포배양계

Info

Publication number: KR20090065643A
Application number: KR1020070133044A
Authority: KR
Inventors: 송효주
Original assignee: 송효주
Priority date: 2007-12-18
Filing date: 2007-12-18
Publication date: 2009-06-23
Also published as: WO2009078637A2; WO2009078637A9

Abstract

본 발명은, 동물 또는 사람으로부터 분리 배양된 조직(tissue) 또는 세포(cell)의 증식(增殖, proliferation) 및 분화 등에 이용되는 세포배양계(細胞培養系, cell culture system) 중 배양용기(培養容器, culture container)에 관한 발명과, 이 발명을 이용한 세포분화유도를 위한 새로운 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)에 관한 발명이다.

이 발명의 배양용기는 원형의 배양접시(culture dish)형 또는 사각형(四角形, quadrangle) 등의 형태를 갖추고 있으며, 원형의 배양접시형 배양용기의 하단부에 유출구(流出口, outflow port) 또는 유입구(流入口, inflow port)를 갖추고 있으며 뚜껑을 소유하고 있으며, 사각형 배양용기는 용기내부를 2개로 분리하는 분리벽(分離壁, dividing wall)이 있으며, 분리벽 일부분에는 분리벽 양측의 배양액이 서로 통과 할 수 있는, 일정크기의 세공(細孔, pore)을 소유한 막(膜, membrane)을 소유하고 뚜껑을 소유하며, 뚜껑 또는 측벽에 세균 등은 통과하지 못하나 공기와 기체는 통과 가능한 통기막(通氣膜, Germ barrier filter membrane)을 소유한다.

세포배양용기는 원형접시형 또는 사각형 등으로 구분되며, 설치 모양에 따라, 두 개를 상하로 겹쳐 설치하였을 경우의 이층형 세포배양용기(二層形細胞培養容器, two storied cell culture container)는, 상실(上室, upper chamber)과 하실(下室, lower chamber)로 구성되며, 두 개를 겹치지 않고 설치하였을 경우의 단 층형 세포배양용기(單層形細胞培養容器, single storied cell culture container)는 좌실(左室, left chamber)과 우실(右室, right chamber)로 구성되도록 하였다.

본 발명의 새로운 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)는, 본 발명의 세포 배양용기와, 페리스탈틱(peristaltic) 펌프, 필터, 3방향(三方向, 3 way) 발브(valve) 및 연결관을 포함하는 것으로서, 본 세포배양계는, 페리스탈틱(peristaltic) 펌프에 의해 상실과 하실(또는 좌실과 우실)을 통과하여 각각 세포배양액이 일정 방향으로만 지속적으로 순환하도록 되어 있다.

이 세포배양계는 줄기세포 등을 포함하는 여러 세포의 증식 또는 분화하는데 필요한 체액성요소(體液性要素, humoral factor) 공급원(供給源, source)을 따로 분리시키면서, 체액성요소 공급원의 미세환경(微細環境, microenvironment) 및 유전자외(遺傳子外, epigenetic)요소를 이용하여 줄기세포 등을 증식 또는 분화를 유도(guided 또는 directed 또는 induced differentiation)하여, 필요한 세포만을 선택적으로 채취할 수 있게 하는 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)에 관한 발명이다.

세포증식, 세포분화, 세포배양, 유입구, 유출구, 필터, 페리스탈틱펌프

Description

세포배양용기 및 세포배양계 {Cell culture container and cell culture system.}

본 발명이 속하는 기술분야는 생명공학분야 중 세포의 증식 및 세포분화에 사용되는 배양계(培養系, culture system) 중 세포배양용 용기(containers for cell culture)에 관한 것과,

이 발명의 세포배양용 용기를 이용한 세포분화를 유도할 수 있는 새로운 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)에 관한 발명으로서, 이 발명은 미세환경(微細環境, microenvironment) 또는 유전자외(遺傳子外, epigenetic)요소를 이용함으로서, 세포의 증식 및 분화유도(induced 또는 guided 또는 directed differentiation)를 쉽게 저가로 성취하기 위한 고안이다.

세포배양은, 얼마 전까지, 연구의 목적으로만 사용되던 술기(術技, technique)로 알려져 왔으나, 현재는 질병의 치료에 배양세포들을 이용하는 세포치료(細胞治療, cell therapy)가 점차 확대되어감에 따라 의료계에서도 세포배양의 가치가 높아져 가고 있다.

인공적으로 배양하는 세포들은 성장-증식-분화의 과정에서 다양한 특징적인 소견을 보이는데, 대부분의 세포는 세포배양용기의 바닥에 부착(附着, adhesion)하여 증식 생존하면서, 한정된 용기 바닥이 완전히 증식된 세포에 의해 점유(占有, occupy)되면 더 이상의 증식-성장-분화를 멈춘다(contact inhibition). 그러나, 일부 세포는 여러 층(層, layer)을 형성하면서 지속적으로 다른 세포 위에 겹쳐 증식하면서 세포덩어리(cell mass)를 형성하면서 분화하기도 한다. 한편 다른 어떤 세포들은 세포배양용기 용액 내에서 부유(suspension)상태를 유지하면서 성장-증식-분화하는 특성을 소유하기도 한다. 본 발명은, 부착하여 성장-증식-분화하는 세포들에 사용되는 배양용기에 관한 발명과 이 발명의 새로운 배양용기를 이용한 새로운 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)에 대한 발명 이다.

현재 사용되고 있는 배양계(culture system)에는 다양한 기기들이 관계하고 있으나, 이 중 매우 중요한 요소 중 하나는 배양하는 세포를 성장시키고, 이들 배양 세포가 자랄 수 있는 세포배양용 용기(細胞培養用容器, containers for cell culture)이다. 현재 전 세계에서 사용되고 있는 세포 배양용 용기의 형태는 배양세포의 특성 및 배양목적에 따라 배양접시(culture dishes), 배양플라스크(culture plasks), 롤러 병(roller bottles), 배양슬라이드(culture slide 또는 chamber slide) 및 변형된 보이덴쳄버(modified Boyden chamber) 등으로 구성되어 있으며, 극히 일부에서 이들 용기를 변형하여 이용하고 있다. 이들 중 배양접시 및 배양플라스크 또는 롤러 병은 일차적으로 세포의 증식을 목적으로 주로 사용되며, 일부분 에서 세포의 분화와 관련된 연구에도 사용되기도 한다. 배양슬라이드는 슬라이드의 크기가 매우 작은 이유로 인하여, 기본적으로, 세포 증식의 목적이 아니라 대부분 형태적 또는 일부에서 기능을 연구하는데 사용하고 있다.

변형된 보이덴쳄버(modified Boyden chamber)는, 기존의 배양계와는 달리, 한 배양계(culture system)가 상실(上室, upper chamber) 및 하실(下室, lower chamber)의 두 개의 분리되는 방(室, chamber)으로 구성되어 있으며, 상실의 바닥면(bottom or lower surface of the upper chamber)은 다양한 크기의 미세한 구멍(pore)을 소유한 막(膜, membrane)으로 구성되어 있어서, 하실(lower chamber) 내의 배양액과 상방의 바닥면에 있는 세포가 서로 배양액을 공유하거나 접촉할 수 있도록 되어 있다. 그리고, 변형된 보이덴쳄버의 상실(upper chamber)의 바닥면 상부(upper surface)에는 주로 세포막(細胞膜, cell wall) 구성물을 포함한 여러 가지 생물학적 물질(collagens, fibronectin, laminin, poly-D-lysine, Matrigel® 등)들이 도포(cover)되어 있거나 도포할 수 있도록 하여, 세포의 운동(運動, motility), 부착(附着, adhesion), 전이(轉移, metastasis) 또는 침윤(浸潤, invasion) 등의 연구에 사용할 수 있도록 되어 있다.

변형된 보이덴쳄버(modified Boyden chamber)의 사용법은 하실(lower chamber)에 일정한 양의 배양액을 채우고, 하실에 채워진 배양액과 동일한 배양액 또는 연구목적에 따라 다른 배양액을 상실(upper chamber)에 채운 후, 상실에 연구하고자 하는 세포를 파종(seeding)하여, 파종된 세포들이 상실 바닥의 막(膜, membrane) 상면(upper surface)에 부착하여 성장하게 된다. 연구의 목적에 따라 하실(lower chamber)에 어떤 물질(chemo-attractant)을 첨가하기도 하여, 시간의 경과와 함께 상실(upper chamber)에 있던 세포의 변화를 관찰하기도 한다. 변형된 보이덴쳄버의 상실(upper chamber)의 바닥은 다양한 크기의 미세공(微細孔, micropore)을 소유한 막(膜, membrane)으로 제작되어 있으며, 이 미세공의 크기는 대부분의 세포들이 통과하기에 충분한 크기이므로, 배양시간에 경과에 따라, 일부 또는 대부분의 세포가 바닥면(membrane) 상면(upper surface)으로부터 미세공을 통하여 바닥면 하면(lower surface)로 이동하거나, 하실(lower chamber)로 이동한다. 대부분의 연구에서 이 이동된 세포의 숫자나 모양 등을 관찰하여 연구의 목적을 달성하기도 한다. 이 변형된 보이덴쳄버(modified Boyden chamber)의 단점은 연구를 위해 상실(upper chamber)에 파종(seeding)한 세포를 다시 수집하여 다른 목적의 연구 및 임상 환자(臨床患者)에 사용하기가 불가능하다는 것이다.

배양세포의 분화(differentiation of cultured cell)는, 극히 최근, 줄기세포(幹細胞, stem cell)의 연구와 함께 크게 부각되고 있는 분야이다. 줄기세포는 크게 두 종류로 구분하는데, 배아줄기세포와 성체줄기세포이다. 현재 줄기세포와 관련된 연구의 가장 중요한 해결해야 할 실질적인 문제점은, 만족스러운 치료효과를 얻기에 충족되는 만큼의, 다량의, 미분화 줄기세포를 획득하는 것과 원하는 조직으로 줄기세포를 분화시키는 것이다. 줄기세포원천(stem cell source)에 따라 다르기는 하나, 실제 일회(一回, one time)에 채취할 수 있는 줄기세포의 숫자는 매 우 적다.

배아줄기세포는 수정된 배아의 내세포괴(inner cell mass)로부터 미성숙 줄기세포를 채취하여 배양-증식-성장시키는 것이다. 이와 대조적으로 성체줄기세포는, 이미 성장된 여러 장기로부터 줄기세포를 채취한 것으로, 제대혈줄기세포(臍帶血幹細胞, umbilical cord blood stem cell)를 포함하여 골수(骨髓, bone marrow)줄기세포, 지방조직유래(脂肪組織由來, adipose tissue derived)줄기세포 및 다른 다양한 조직원천(tissue source)으로 부터 줄기세포가 계속 발굴되고 있다.

줄기세포의 특징인 여러 종류의 세포 또는 조직으로 분화할 수 있는 다분화능력(多分化能力, multipotent differentiation potential)은, 현재의 의학 지식에서는 불치 또는 난치로 여겨지는 질환을 소유한 많은 환자의 치료에 도움을 줄 미래의학의 핵심 치료방법으로 여겨지고 있다. 배양 중인 줄기세포의 분화는 일부에서 배양세포에 아무 처치가 없는 일반적인 세포배양 과정에서도 발생되기도 한다고 보고되었다. 줄기세포의 분화가 환자의 치료에 적합한 세포 또는 조직으로 분화하는 경우 환자에게 도움을 주기도 하지만, 그렇지 못하고 치료의 목적에 적합하지 못한 세포 또는 조직으로 줄기세포가 분화하는 예에서는 바람직하지 않은 결과를 초래하여 환자에게 해가 되기도 한다. 예로, 배아줄기세포(embryonic stem cell) 분야에서 해결하지 못한 당면 과제로서 테라토마(teratoma)가 있는데, 테라토마는 환자치료에 절대적으로 도움이 되지 않으며, 암으로 변성될 가능성이 높기 때문에 배아줄기세포가 실용화되지 못하고 있다.

현재, 의학계에서는 줄기세포의 분화를 원하는 세포 또는 조직으로 분화(directed 또는 guided differentiation)시키려는 연구는 매우 활발히 진행되고 있다. 현재 국내외적으로 가장 많이 이용되는 분화유도 방법은 여러 종류의 조직에서 줄기세포를 채취하여 배양하면서, 배양액에 현재까지 알려진 다양한 성장요소(成長要素, growth factor) 중 일부 성장요소를 첨가하여 분화 결과를 확인하거나, 줄기세포의 염색체(染色體, chromosome)에 유전자조작(遺傳子造作, genetic manipulation)을 실시하여 원하는 세포로 분화시키거나, 환자 치료에 필요한 물질을 더 많이 생산하도록 유도하는 방법을 연구하고 있다.

즉 성장요소를 첨가하는 연구방법으로 접근하는 이유는, 현재 어떤 학자도, 줄기세포가 우리들이 원하는 특이 세포 또는 조직으로 분화하는데 필요한 성장요소를 정확히 모르기 때문이다. 그러므로, 많은 학자들이, 과거의 다른 실험에서의 경험 및 학술보고를 바탕으로, 유도하고자 하는 조직으로의 분화에 도움이 될 것으로 추측되는 성장요소를 배양액등에 첨가하여 그 결과를 관찰하는 것이다. 현재까지 이러한 많은 연구에도 불구하고 극히 일부에서만 특정 세포 또는 조직으로의 분화되는 실험결과의 재현성(再現性, reproducibility)을 만족시키면서 실험되고 있으며, 대부분 재현성을 상실하고 있다.

즉, 현재의 의학적 상황에서의 성체줄기세포를 이용한 세포치료(cell therapy)에서의 문제점은, 질병의 세포치료(cell therapy)에 필요한 적절한 수의 미분화 줄기세포를 획득하기가 어렵고, 여러 조직원천(tissue source)에서 채취한 성체줄기세포가 원하는 세포 또는 조직으로 분화(directed 또는 guided differentiation) 시키기가 매우 어려워 세포치료가 힘들다는 것이다. 현재, 줄기세포의 미분화상태에서의 증폭(expansion)을 유지하는 것은 많은 연구와 함께 상당한 진전을 이루었다. 그러나, 저가(低價, low cost)의, 그리고 쉬운 분화유도 방법은 현재까지 개발되지 않았기 때문에, 난치(difficult to cure) 또는 불치(noncurable)의 질병을 줄기세포를 이용하여 세포치료(cell therapy)를 하기 위해서는 임상적으로 저가(低價, low cost)의 그리고 쉽게 원하는 특이 세포 또는 조직으로 분화시킬 수 있는 분화기구 및 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)의 개발이 매우 중요하다.

즉, 세포치료(細胞治療, cell therapy)와 관련하여, 줄기세포 등을 증식시킬 수 있으면서, 줄기세포가 소유한 다양한 분화 잠재성을 저가의 쉬운(low cost and easy) 방법에 의한 분화유도(分化誘導, induced 또는 guided or direct differentiation)를 이루는 방법 및 이에따른 장비를 개발하는 것이 가장 급선무의 과제이다.

최근, 줄기세포와 관련하여 니치(niche)의 중요성이 부각되면서, 줄기세포의 분화와 관련되어 미세환경(微細環境, microenvironment) 또는 유전자 외적요소 (遺傳子外的要素, epigenetic factor)의 가치가 중요시되고 있다. 즉, 어떤 특이장기에서 그 특이장기를 구성하는 세포 또는 조직의 구성에 필수적인, 우리가 아직 발견하지 못해 모르고 있는, 어떤 체액성 물질(體液性物質, humoral substance)을 분비하고 있다는 학설이며, 이 물질이 세포분화에 매우 중요한 역할을 하는 물질로 믿고 있으나, 아직 그 물질에 대해 모르고 있고 현재 많은 학자들이 그 물질이 어떤 성장인자(growth factor)인지를 확인하고자 노력하고 있다. 이를 위해 고가(high cost)의 프로테옴연구(proteomics) 등 여러 연구방법을 이용하여 연구하고 있으나 아직 매우 미미한 결과를 얻었을 뿐이다.

세포분화에서의 미세환경(微細環境)과 유전자 외적요소(遺傳子外的要素)의 중요성은 오래전부터 강조되어 왔으며, 최근 여러 학자들이 미세환경과 유전자 외적요소의 중요성을 인식하고, 세포분화를 유도하고 연구하기 위한 새로운 실험모델로 변형된 보이덴쳄버(modified Boyden chamber, Transwell®) 나 공배양계(共培養系, coculture system)을 이용하여 저렴한 연구비로 분화를 유도한 실험을 하였으며, 그 실험에서 매우 바람직한 결과가 도출되었다.

이들의 변형된 보이덴쳄버를 이용하는 경우, 이 세포를 이용하여 임상적으로 세포치료(cell therapy)에 사용하기에 가장 치명적인 결함은 하실(下室, lower chamber)에 위치한 특이 세포 또는 조직의 미세환경(微細環境, microenvironment)과 유전자 외적요소(遺傳子外的要素)에 의해 영향을 받아 분화를 시작한 상 실(upper chamber)의 줄기세포들이 세포배양 중 하실(lower chamber)로 이동하여, 상실에서 줄기세포로부터 분화가 개시된 초기분화세포(初期分化細胞, early differentiated cell)들을 순수하게 얻을 수 없다는 것이다. 즉, 상실(upper chamber)과 하실(lower chamber)이 엄격히 분리되어 있지 않아 결국 상실의 줄기세포가 분화되었다 하더라도 하실의 세포 또는 조직과 혼재되어 있어 세포치료(cell therapy)를 위해 필요한 순수하게 새로 분화된 세포를 얻을 수 없다는 것이다.

그리고, 공배양계(共培養系, coculture system)를 이용하는 실험은, 기존의 이미 분화된 세포 또는 조직과 미분화된 세포를 함께 배양함으로서, 분화되기를 원하는 세포의 인접위치에 존재하는 기존의 분화된 세포로부터 나오는, 미상의 체액성의 물질(體液性物質, humoral substance)에 의해 실험하고자 하는 미분화세포가 분화유도되는 것을 확인하는 실험으로, 그 결과는 매우 좋음이 발표되었다. 그러나, 이 새로 분화된 세포를 선택적으로 추출하여 어떤 세포치료를 하는 것은 실질적으로 불가능하다.

즉, 이러한 결점을 보완할 수 있는 새로운 배양용기(培養容器, culture container)를 포함한 새로운 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)는 발명되지 않아, 이 보완 배양용기의 발명 및 새로운 세포배양계의 발명이 절실히 요구되고 있으며, 본 발명은 이를 만족시키기 위해 발명되었다.

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현재 전 세계 의료계에서의 줄기세포 등 다양한 세포들이 증식(增殖, proliferation) 또는 증폭(增幅, amplification)되어 임상치료에 이용되고 있으나, 세포치료(細胞治療, cell therapy)의 기술적 과제는 효과적인 환자치료를 위해 줄기세포 등을 포함하는 각종 세포의 분화유도(分化誘導, induced 또는 guided 또는 directed differentiation)가 아직까지 확실하게 재현성을 소유하면서 성공하지 못한다는 것이다. 동시에, 이 연구에 엄청난 연구비가 소요되고 있는 것도 풀어야 할 과제이다. 최근 미세환경(微細環境, microenvironment)과 유전자 외적요소(遺傳子外的要素, epigenetic factor)에서 유래된 미상(未詳, unidentified)의 체액성 물질(體液性物質, humoral substance)을 이용하여 분화를 유도하는 방법이 간편하고 성공적이라는 보고와 함께, 변형된 보이덴쳄버(modified Boyden chamber)와 공배양계(共培養系, coculture system)가 이용되고 있다. 분화연구 과정에서 기존의 변형된 보이덴쳄버(modified Boyden chamber)와 공배양계(共培養系, coculture system)는 연구용으로 소수의 줄기세포 등이 분화에 이용되고 있으나, 임상 환자치료를 위한 세포분화에 기존의 변형된 보이덴쳄버(modified Boyden chamber)와 공배양계(共培養系, coculture system)를 이용하는 경우, 분화를 시작한 분화유도(分化誘導, differentiation induction)된 초기분화세포(初期分化細胞, early differentiated cell)의 숫자도 적을 뿐 아니라, 만약 유도분화(誘導分化, induced 또는 guided 또는 directed differentiation)된 세포가 있다 하더라도 미분화 세포로부터 유도분 화된 세포만을 순수하게 분리하여 획득할 수 없는 것이, 임상적으로, 현재의 세포치료(cell therapy)에 변형된 보이덴쳄버 및 공배양계(共培養系, coculture system)를 사용할 수 없는 가장 치명적인 기술적과제이다.

즉, 이러한 결점을 보완하면서 쉽게 세포치료에 사용할 수 있는 새로운 배양용기(培養容器, culture container) 및 이 배양용기를 포함한 새로운 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)를 연구-발명하는 것은 기술적과제이다.

본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는, 세포분화를 유도하기 위해 사용되는 변형된 보이덴쳄버 및 공배양계가 소유한 기술적과제를 해소시키면서, 세포의 유도분화(誘導分化, induced 또는 guided 또는 directed differentiation)를 이루는데(induce) 필요한 비용(費用, cost)을 감소시키고자 하는 것이다.

즉, 본 발명은 세포치료(細胞治療, cell therapy)를 위해 줄기세포를 포함한 다양한 세포들을 세포치료에 필요한 세포로 증식 및 분화시키기 위해, 특이 목표세포의 미세환경(microenvironment) 등을 이용하여, 쉽게 그리고 낮은 경비(low cost)로 특이 세포로 유도(induced 또는 guided 또는 directed)된 분화세포를 얻을 수 있는 세포배양용기(細胞培養容器, container for cell culture)를 개발하고, 이 발명된 배양용기를 이용한 세포 배양계(細胞培養系, cell culture system)를 구성하는 것이다.

본 발명은 2가지로서, 첫째, 미세환경(微細環境, microenvironment) 또는 유전자 외적요소(遺傳子外的要素, epigenetic factor) 등에서 분비하는 미상(未詳, unidentified)의 체액성 물질(體液性物質, humoral substance)을 이용하여 분화유도(分化誘導, induced 또는 guided 또는 directed differentiation)를 효과적으로 이루기 위해, 우선 새로운 형태의 세포배양용 용기(細胞培養用容器, container for cell culture)를 발명하는 것이고, 다른 하나는, 이 발명의 세포배양용기를 포함하여 새로운 세포 배양계(細胞培養系, cell culture system)를 이루는 것이다.

첫째, 본 발명의 새로운 세포배양용기는, 원형 또는 사각 등의 형태를 이루고 있다. 원형의 세포배양용기는, 두 종류로서 한 종류는 원형의 세포배양용기 2개를 겹쳐 사용도록 발명된 이층형 세포배양용기(二層形細胞培養容器, two storied cell culture container)이며 다른 하나는 단층형 세포배양용기(單層形細胞培養容器, single storied cell culture container)이다.

이층형 세포배양용기(二層形細胞培養容器)는 두 개의 방(室, chamber)로 구성되어 있는데, 아래 세포배양용기(下室, lower chamber)와 윗 세포배양용기(上室, upper chamber)는 나사 홈을 이용하여 단단히 밀착 연결시켜 완전 폐쇄가 가능하고,

상실 배양용기는 뚜껑과 나사모양의 홈을 이용하여 단단히 밀착폐쇄하여 닫을 수 있도록 발명되었으며,

하실 및 상실의 하부에 배양액이 나가거나 들어갈 수 있는 유출구(流出口, outflow port) 및 유입구(流入口, inflow port)를 각각 1개씩 총 2개가 각 용기(各室, each chamber)마다 설치되어 있으며 이는 각 상-하실의 바닥에서 세포들이 증식하여 용기바닥을 완전히 점거(占居, occupy, confluence)한 후 세포들이 넘어오지 못할 어떤 높이 이상에 위치하며,

뚜껑 또는 용기 측면에는 균은 통과하지 못하나 공기 및 탄산가스를 포함한 기체의 출입이 자유로운 통기막(通氣膜, Germ barrier filter membrane)을 가지고 있다.

원형 세포배양용기의 다른 한 종류는, 두 개의 세포배양용기를 겹치지 않고 한 개씩 분리하여 두 용기를 연결관(連結管, connecting tube)로 연결하여 사용하기 위해 발명된 단층형 세포배양용기(單層形細胞培養容器, single storied cell culture container)로,

세포배양용기는 뚜껑과 나사모양의 홈을 이용하여 단단히 밀착폐쇄 고정시킬 수 있도록 발명되었으며,

배양용기의 하부에 배양액이 나가거나 들어갈 수 있는 유출구(流出口, outflow port) 또는 유입구(流入口, inflow port)를 각 1개씩 총 2개가 각 용기의 바닥(bottom)보다 상부에 위치하고 있으며,

뚜껑은 균은 통과하지 못하나 공기 및 탄산가스를 포함한 기체의 출입이 자유로운 통기막(通氣膜, Germ barrier filter membrane)을 가지고 있다.

사각형의 세포배양용기(四角形細胞培養容器, quadrangle type cell culture container)는 직사각형 또는 정사각형으로, 내부가 칸막이에 의해 분리되어 있으며,

이 분리벽은, 세포배양용기 바닥보다 상부에 세포 또는 세포 부스러기는 통과하지 못하고 배양액 및 배양액에 녹아 있는 체액성의 물질(體液性物質, humoral substance)을 포함하는 세포배양용기 내(內)의 세포배양액(細胞培養液, cell culture media)만이 자유롭게 통과할 수 있는 일정크기의 세공(細孔, pore)의 막(膜, membrane)을 소유하고 있다.

뚜껑에는, 일부분에 균은 통과하지 못하나 공기 및 탄산가스를 포함한 기체의 출입이 자유로운 통기막(通氣膜, Germ barrier filter membrane)을 가지고 있다.

본 발명의 다른 하나는, 전술한 본 발명의 새로운 세포배양용기와, 페리스탈틱(peristaltic) 펌프, 필터(濾過板, filter), 3방향(三方向, 3 way) 발브(valve) 및 연결관(連結管, connecting tube)을 포함하는 새로운 세포 배양계(新細胞培養系, new cell culture system)이다. 이 세포 배양계는 분화를 필요로 하는 줄기세포 등의 다양한 세포를 배양하할 수 있는 세포 배양용기와 이와 분리된 세포 배양용기에 배양중인 장기(臟器, organ), 조직(組織, tissue) 또는 세포(細胞, cell) 등의 체액성요소(體液性要素, humoral factor) 공급원(供給源, source)을 배양하는 세포 배양용기를 연결하는 세포 배양계를 주축으로 구성되며, 체액성요소 공급원의 미세환경(微細環境, microenvironment) 또는 유전자 외적요소(遺傳子外的要素, epigenetic factor)를 이용하여 다른 세포배양용기에 있는 줄기세포 등의 세포들을 분화유도(guided differentiation)하면서, 분화된 세포를 쉽게 선택적으로 채취할 수 있게 하는 새로운 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)에 관한 발명이다.

이 새로운 세포배양계의 구성은,

두 개의 세포배양용기를 겹쳐 사용하도록 발명된 이층형 세포배양용기(二層形細胞培養容器, two storied cell culture container)를 사용하는 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)의 경우는 하실(下室, lower chamber) 또는 상실(上室, upper chamber) 중 하나에 적절한 양의 배양액을 채운 후 체액성요소(體液性要素, humoral factor) 공급원(供給源, source)으로 조직(組織, tissue) 또는 세포(細胞, cell) 등을 넣고 배양하고,

이 세포 배양용기의 유출구(流出口, outflow port)에 연결관(連結管, connecting tube)을 연결시킨 후, 필터(濾過板, filter) 및 3방향 발브(3 way valve)를 중간에 설치하고, 이 연결관은 페리스탈틱 펌프(peristatic pump)를 통과한 후, 분화시키고자 하는 줄기세포 등이 자라고 있는 상실 또는 하실의 유입구(流入口, inflow port)로 배양액을 이동시킨 후,

분화시키고자 하는 줄기세포 등이 자라고 있는 상실 또는 하실의 세포들을 통과하여 상실 또는 하실의 유출구(流出口, outflow port)을 통해, 연결관에 연결되고, 이 연결관 중간에는 필터 및 3 방향 발브를 중간에 설치하고, 이 연결관은 페리스탈틱펌프를 다시 통과하여, 체액성요소(體液性要素, humoral factor) 공급원(供給源, source)으로 장기(臟器, organ), 조직(組織, tissue) 또는 세포(細胞, cell) 등을 넣고 배양하고 있는 하실 또는 상실의 유입구(流入口, inflow port)로 세포배양액을 이동시킨다.

배양용기가 분리되어 있는 단층형 세포배양용기(單層形細胞培養容器, single storied cell culture container)를 이용하는 세포배양계의 경우 한쪽(좌실 또는 우실)의 배양용기에 체액성요소(體液性要素, humoral factor) 공급원(供給源, source)으로 장기(臟器, organ), 조직(組織, tissue) 또는 세포(細胞, cell) 등을 넣어 배양하고, 다른 쪽(우실 또는 좌실)의 배양용기에는 증식-분화시키고자 하는 줄기세포를 포함하는 세포 등을 넣어 배양하면서, 이층형 배양용기를 사용하는 세포배양계와 같이, 필터(濾過板, filter) 및 3방향 발브(3 way valve)를 중간에 설치하고 이들을 연결시키는 연결관(connecting tube)이 페리스탈틱 펌프를 통과하면서 한쪽 방향으로 세포배양액을 순환시키게 된다.

본 발명의 효과는, 분화유도(induced 또는 guided 또는 directed differentiation)의 높은 유도(induction) 성적을 보이는 기존의 변형된 보이덴쳄버(modified Boyden chamber) 또는 공배양(共培養, coculture)의 특성은 그대로 보 존하면서, 변형된 보이덴쳄버 및 공배양의 단점을 해결한, 순수한 분화세포만을 쉽게 수집할 수 있게 하여, 추후 세포치료(細胞治療, cell therapy)에 적합한 순수한 분화세포를 다량 획득할 수 있게 함에 있다.

현재의 세포분화(細胞分化, cell differentiation)와 관련된 생물학적 지식의 한계는, 기존의 세포배양(細胞培養, cell culture)을 통해 원래의 세포 또는 조직으로부터 다른 세포 또는 조직으로 분화시키기 위해 필요한 성장요소(growth factor)가 어떤 것인지 알지 못하는 상황에서 분화유도(分化誘導, induced 또는 guided 또는 directed differentiation)를 위해서는 많은 실험의 반복하는 상황이며, 이에 따른 많은 경비와 시간을 소모하면서도 실험의 재현성을 확보하는 것이 매우 낮거나 거의 없다는 것이나,

최근 지속적으로 발표되는 미세환경(微細環境, microenvironment) 및 유전자 외적요소(遺傳子外的要素, epigenetic factor)를 분화에 이용하여 성공하였다는 많은 보고는, 이 미세환경이나 유전자 외적요소들이 줄기세포 등의 세포가 다른 세포로 분화하는데 중요하다는 학설을 뒷받침하고 있다. 이를 입증하는데 이용되는 기구는 변형된 보이덴쳄버(modified Boyden chamber) 또는 공배양(共培養, coculture) 등 이다.

그러나, 변형된 보이덴쳄버는 이 배양계(培養系, culture system)의 특성상 소량의 세포분화실험에는 사용이 가능하여, 환자를 치료할 만큼 많은 수의 세포를 확보하는 것이 어려우며, 변형된 보이덴쳄버를 이용하게 되는 경우, 상실(上室, upper chamber)과 하실(下室, lower chamber)에서 배양되고 있던 세포가 서로 섞일 수 밖에 없어, 환자 치료에 필요한 순수 분화세포만을 수집(collection)하는 것은 다른 특수한 장비를 사용하기 전에는 불가능하다. 그리고, 공배양(coculture)의 경우도, 분화시키고자 하는 세포가 분화된 경우, 이 세포를 기존의 분화된 세포로부터 분리 추출하는 것은, 실험적인 연구 외에, 임상에서는 불가능하다.

동시에, 본 발명을 이용함으로서, 분화유도(induced 또는 guided 또는 directed differentiation)를 위해 이전에 사용하던 여러 연구방법보다 매우 간편하게 실험을 효과적으로 종료할 수 있으므로 많은 경비와 시간을 절약할 수 있는 효과가 있다.

본 발명은, 현재의 난치(難治) 또는 불치질환(不治疾患)의 미래 치료의 희망으로 믿어지는 세포치료(細胞治療, cell therapy) 및 유전자치료(遺傳子治療, gene therapy) 중 세포치료와 관련된 세포배양용기(細胞培養容器)와 이를 이용하여 세포배양을 통한 증식 및 분화를 위한 새로운 세포배양계(細胞培養系, Cell culture system)에 관한 것이다.

이미 요약에서 언급한 바와 같이, 이 발명은 두 가지로 구성되어 있는데, 하나는 새로운 발명의 세포배양용기(細胞培養容器, culture container)의 발명이고, 다른 하나는, 이 새로운 발명의 세포배양용기를 이용하여 새로운 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)의 구성에 대한 발명이다.

본 발병의 세포배양용기는, 일반 세포와 최근 논의의 주제가 되고 있는 줄기세포(幹細胞, stem cell) 등과 관련하여 증식 및 분화에 중요한 요소로 인정되고 있는 미세환경요소(微細環境要素, microenvironmental factor) 또는 유전자외요소(遺傳子外要素, epigenetic factor)가 분비하는 체액성요소(體液性要素, humoral factor)의 공급원(供給源, source)과 분화를 목적으로 배양하는 세포를 분리할 수 있는 세포배양용기(細胞培養容器, culture container)에 대한 것이 하나이며,

다른 하나의 발명은, 본 발명의 세포배양용기를 이용하여, 일반세포 또는 미분화 줄기세포를 증식시키고, 필요에 따라선 이들 세포를 취급하는 사람이 원하는 세포로 유도분화(誘導分化, induced 또는 guided 또는 directed differentiation) 시켜 개인치료(個人治療, individualized treatment) 또는 주문치료(注文治療, customized 또는 tailored treatment)를 위해 고안 발명된 새로운 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)이다.

본 발명의 새로운 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)는, 본 발명의 세포배양용기와 기존의 페리스탈틱펌프(peristaltic pump), 필터(濾過板, filter), 3방향(三方向, 3 way) 발브(valve) 및 연결관(連結管, connecting tube)을 포함하며,

배양중인 세포의 증식 및 분화에 중대한 영향을 준다고 보고되고 있는 체액성요소(體液性要素, humoral factor) 공급원(供給源, source)인 미세환경(微細環境, microenvironment) 또는 유전자외요소(遺傳子外要素, epigenetic factor)를 분화시 키고자 하는 세포와 분리시키면서, 체액성요소에 의해 연구하는 세포의 증식 또는 분화를 유도하는데 이용하여, 배양세포의 분화유도(induced 또는 guided 또는 directed differentiation) 또는 증식을 연구자가 목적하는 대로 진행할 수 있게 하는 새로운 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)에 관한 발명이다.

도면 1은 세포배양용기(細胞培養容器, container for cell culture)의 대표도면으로서, 두 개의 접시형 세포배양용기를 겹쳐 놓은 이층형 세포배양용기(二層形細胞培養容器)의 단면도 도면(AA)과 각각의 접시형 세포배양용기를 평행으로 놓았을 때의 한(1)개의 세포배양용기에 대한 단층형 세포배양용기(單層形細胞培養容器)의 단면도 도면(BB)이다. 이를 자세히 설명하면,

이층형 세포배양용기(二層形細胞培養容器, AA)는 상실(上室, upper chamber)과 하실(下室, lower chamber)로 구성되며, 이는 단층형 세포배양용기(細胞培養容器, container for cell culture) 두 개를 쌓아 놓은 것과 같으나, 상실과 하실의 연결부분(B)은 도면 3에 확대되어 있는데, 상실과 하실의 연결부분을 보면, 하실(下室, lower chamber)의 뚜껑을 제거한 대신, 하실 용기 상단의 내부에 나사모양의 홈이 파여져 있고(도면 3의 F), 상실(上室, upper chamber)의 바닥에 하실의 상단 홈에 정확히 맞는 나사모양의 돌기(도면 3의 F)가 있어서, 상실과 하실을 맞추면 완전 밀착폐쇄될 수 있도록 하여, 상실과 하실의 완전 밀착폐쇄 시 이 연결부를 통하여 아무것도 통과할 수 없어, 하실(lower chamber)로 모든 물질의 유입이 이 연결부를 통해서는 불가능하게하고 있다. 그리고, 상실과 하실의 바닥으로부터 조금 올라온 곳에 연결관을 끼울 수 있는 유출구(流出口, outflow port) 또는 유입구(流入口, inflow port)가 각각 설치되어 있는데, 이에 대한 확대도면은, 도면 3과 도면 4에 그려져 있다. 이 유출구 또는 유입구는 각 배양기(상실 또는 하실)의 배양용기 바닥에서 세포들이 부착-증식하여 용기바닥을 완전히 점거(占居, occupy, confluence)한 후 이들 세포가 넘어오지 못할 어떤 최소한의 높이 상부에 위치한다. 이는, 대부분의 부착성 세포(附着性細胞, adherent cell)들이 배양용기 바닥에 부착하여 증식하다가 배양용기 벽에 도달하면, 더 이상의 증식을 멈추는데(contact inhibition), 이 증식하는 세포들이 증식을 멈추기 전, 세포들이 넘어오지 못할 높이 상부의 위치에 유출구(流出口, outflow port) 또는 유입구(流入口, inflow port)가 위치하여야 연구하는 세포들이 이 유출구 또는 유입구를 통해 유출되는 것을 막을 수 있다. 도면 3은 상실(upper chamber)의 유출구(또는 유입구)를 확대한 도면(D)이고, 도면 4는 하실(lower chamber)을 확대한 도면(C)으로, 하실은 바닥부분이 다른 세포배양용기와 연결됨이 없음을 보이며, 외부로 돌출된 유출구(또는 유입구) 부분은 연결관을 유출구(또는 유입구) 위로 끼었을 경우, 쉽게 빠지지 않도록 톱니와 같은 모양을 구성하고 있으며, 이 톱니모양의 숫자는 제작자의 기호에 따라 증가 또는 감소시킬 수 있다. 동시에 이층형(二層形) 또는 단층형(單層形) 세포배양용기의 뚜껑(A 및 K)은, 도면 2(A)에서 보는 바와 같이, 세포배양용기 상부의 나사모양의 돌기와 뚜껑의 나사모양의 홈이 꼭 맞도록 되어 있어, 뚜껑을 돌려 막으면, 만약, 통기막이 없이 외부와 통하는 다른 부위가 없으면, 세포배양용기가 완전히 밀착 폐쇄되도록 발명되어 있다. 그러나 세포가 생물인 이유로 세포배양 때 산소공급이 매우 중요한 필요 사항이므로, 도면 6에서 확대한 것과 같이 뚜껑의 중앙부위(E) 또는, 상실(upper chamber) 및 하실(lower chamber)의 측면(E)에 세균은 통과하지 못하나 공기나 다른 가스는 자유롭게 통과할 수 있는 미세공(微細孔, micropore)을 포함하고 있는 통기막(通氣膜, Germ barrier filter membrane)이 있어서, 배양액에 적정량의 산소가 공급될 수 있도록 고안되어 있다. 이층형 세포배양용기(二層形細胞培養容器, AA)에서는, 뚜껑(X)에 통기막을 소유하는 경우, 측면의 통기막이 필요 없을 수도 있다. 도면 1의 AA에서 보면, 상실과 하실 중간에 빗금 또는 단절부위는 이 부위를 확대함으로써 이 세포배양용기(細胞培養容器, container for cell culture)의 크기를 필요 목적에 따라 확대 또는 축소가 가능하도록 하였다.

단층형 세포배양용기(單層形細胞培養容器, BB)는 이층형 세포배양용기의 상실(upper chamber) 만이 분리되어 있는 것과 동일하다. 뚜껑(X)과 세포배양용기(細胞培養容器, container for cell culture)는, 도면 2와 같이, 배양용기 상단의 나사모양 돌출부와 뚜껑에 있는 나사모양의 홈이 꼭 맞도록 고안되어, 뚜껑을 돌려 배양용기와 완전 밀착폐쇄할 수 있으며, 뚜껑의 상부에는, 도면 6(E)와 도면 8과 같이, 세균은 통과하지 못하나 공기나 다른 가스는 자유롭게 통과할 수 있는 미세공(微細孔, micropore)을 포함하고 있는 통기막(通氣膜, Germ barrier filter membrane)이 설치되어 있으나, 이 통기막이, 제작상의 이유로, 뚜껑이 아닌 세포배양용기의 측면에도 설치될 수도 있다. 동시에, 세포배양용기의 밑면으로부터 약간 위로 떨어진 부위에 도면 4와 같이 유출구(또는 유입구)가 설치되며, 도면 4 (CA) 와 같이 톱니모양의 돌출부를 두어, 연결관을 끼웠을 때 연결관이 빠지지 않도록 하였으며, 이 톱니모양의 갯수는 제작자의 기호에 따라 증가 또는 감소시킬 수 있다. 동시에 바닥 및 뚜껑에 표시된 사선은 이 배양용기의 크기도 필요에 따라 자유자재로 확대 또는 축소 가능하도록 하였다.

도면 2는, 이층형 세포배양용기(A) 또는 단층형 세포배양용기(K) 모두에 해당되는 뚜껑과 배양용기 사이의 용기의 나사모양의 돌출부와 뚜껑의 나사모양의 홈을 확대한 도면으로, 세포배양용기와 뚜껑을 돌려 닫으면 완전 밀착폐쇄가 가능하여, 이 부위를 통하여 다른 물질이 통과하지 못하도록 하고 있다.

도면 3은 이층형 세포배양용기(二層形細胞培養容器, AA)에서 상실(upper chamber)과 하실(lower chamber)의 연결부위를 확대한 도면(F)으로서, 하실의 상단 내면에 나사모양의 홈이 고안되고, 상실의 바닥에 나사모양의 돌기가 있어 상실과 하실을 꼭 맞추어 끼면, 어떤 물질도 통과할 수 없는 완전 밀착폐쇄된 한 조(組, set)의 이층형 배양용기가 될 수 있음을 표시하는 것이며, D는 유출구(또는 유입구)의 확대 도면으로서 도면과 같이 톱니모양의 돌출부로 설계하여 연결관을 끼우면 쉽게 빠지지 않도록 하였다.

도면 4는 도면의 1의 이층형 세포배양용기(二層形細胞培養容器, AA)의 하실 및 단층형 세포배양용기(單層形細胞培養容器, BB)의 바닥면의 유출구(또는 유입구)를 포함하는 부위(C)의 확대도면으로서, CA의 확대 도면과 같이 톱니모양의 돌출부를 두어, 유출구(또는 유입구)에 연결관을 끼우면 쉽게 빠지지 않도록 하였다.

도면 5는 상기 이층형 세포배양용기 또는 단층형 세포배양용기를 이용하여 새로운 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)에 사용되는 페리스탈틱 펌프 (peristaltic pump)에 연결관(連結管, connecting tube)이 장착된 확대 도면이다. 이 페리스탈틱 펌프의 회전축에 달린 날개(ee)는 2개, 3개 또는 4개로 제작하는 사람에 따라 달리 할 수 있다. 각 페리스탈틱 펌프의 회전축에 설치된 날개(ee)는 날개의 크기는 각각 동일하여야 하며, 이 날개가 일정한 방향으로 회전하면서, 신축성을 소유하여 압박될 수 있는 연결관(連結管, connecting tube) A(Tube A, aa-bb)와 연결관 B(Tube B, cc-dd)를 동시에 압박하면, 연결관 내의 배양액을 화살표 방향으로 이동시켜 세포배양액이 순환된다. 페리스탈틱 펌프의 회전방향에 따라 연결관 A와 연결관 B 내부의 배양액은 순환 방향이 정 반대가 될 것이며, 회전축에 달린 날개(ee)의 크기가 좌우 또는 상하 각각 동일할 경우, 연결관 A 및 연결관 B의 굵기와 관계없이 순환하는 배양액의 양은 동일 할 것이다.

도면 6은, 도면 1에서의 배양용기의 측면 또는 뚜껑에 설치된 세균은 통과하지 못하나 공기나 다른 가스는 자유롭게 통과할 수 있는 미세공(微細孔, micropore)을 포함하고 있는 통기막(通氣膜, Germ Barrier Filter Membrane)의 확대 도면이다.

도면 7은, 이층형 세포배양용기를 통기막(通氣膜, Germ barrier filter membrane)이 설치된 방향에서 본 측면도이다. kk, gg, oo 및 mm은 유출구(流出口, outflow port) 또는 유입구(流入口, inflow port) 이다.

도면 8은, 접시형 이층형 세포배양용기 또는 단층형 세포배양용기의 위에서 관찰한, 뚜껑에 세균은 통과하지 못하나 공기나 다른 가스는 자유롭게 통과할 수 있는 미세공(微細孔, micropore)을 포함하고 있는 통기막(通氣膜, Germ barrier filter membrane)이 설치된 도면이다.

도면 9는 사각형 세포배양용기(四角形細胞培養容器, quadrangle type cell culture container)를 위에서 본 상면도로서, 사각(정사각형 또는 직사각형)의 세포배양용기의 중간에 칸막이(qq-qq)가 있어서, 사각용기를 양분하고 있는데, 사각형 세포배양용기 내에서 이 칸막이의 위치는 연구목적에 따라 제작자가 임의적으로 변경 설치할 수 있다. 이 칸막이의 중간에는, 세포 또는 세포 부스러기 같은 거대분자는 통과하지 못하나 체액성요소(體液性要素, humoral factor)를 포함하는 배양액은 자유롭게 서로 통과할 수 있는 크기의 미세공(微細孔, micropore)을 포함한 막(膜, membrane)을 설치하였다. 이 막은 세포배양용기 바닥의 세포들이 증식하여 용기바닥을 완전히 점거(占居, occupy, confluence)한 후, 세포증식을 멈춘 후(contact inhibition) 세포들이 넘어오지 못하는 높이 상부에 위치한다. 동시에, 사각 세포배양용기의 뚜껑에도 세균 등은 통과하지 못하나 공기나 다른 가스는 자 유롭게 통과할 수 있는 미세공(微細孔, micropore)을 포함하고 있는 통기막(通氣膜, Germ barrier filter membrane)이 있어서, 이 사각 배양용기를 밀봉하여도 이 멸균막을 통해 산소를 포함한 기체가 유입될 수 있으므로, 배양용기내의 세포는 산소결핍에 빠지지 않는다. 이 사각형 배양용기의 뚜껑과 용기를 완전 밀착폐쇄 시킨 경우, 세포배양액의 교환(media change)이 어려워 단기간의 배양에만 사용할 수 있을 것이다.

도면 10은 본 발명의 세포배양용기와 기존에 사용하고 있는 여러 기기들을 조합하여 발명한 새로운 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)의 계통도로서, 본 발명의 이층형 세포배양계에 페리스탈틱펌프(peristaltic pump), 필터(세포 또는 세포부스러기 등은 여과하되 체액성요소가 포함된 세포배양액은 통과시키는 여과막을 소유한 필터), 3방향(三方向, 3 way) 발브(valve) 및 연결관을 포함하여 배양중인 세포와 체액성요소(體液性要素, humoral factor) 공급원(供給源, source)을 분리시키면서, 체액성요소 공급원인 미세환경(微細環境, microenvironment) 또는 유전자외(遺傳子外, epigenetic) 요소를, 증식 또는 분화를 유도하는데 이용하여 배양세포의 분화유도(guided 또는 induced 또는 directed differentiation) 또는 증식을 연구자가 목적하는 대로 선택적으로 진행할 수 있게 하는 새로운 세포 배양계(細胞培養系, cell culture system)를 보여주는 계통도이다.

도면 11은 단층형 세포배양용기(單層形細胞培養容器)를 연결하는 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)의 계통도로서, 세포배양용기 G와 H가 상하로 연결되지 않고 서로 분리되어 위치하는 것으로서, 세포배양용기 G의 유출구(流出口, outflow port, Gaa)를 나온 배양액은 연결관 D(Tube D)를 통해 3방향 발브(3方向발브, 3 way valve, Gbb)를 통한 후, 페리스탈틱 펌프를 지나, 필터(濾過膜, filter, Gcc)를 통과해 다른 세포배양용기 H의 유입구(流入口, inflow port, Hdd)로 들어간다. 이 배양액은 세포배양용기 H에 파종되어 있는 조직 또는 세포를 거쳐 체액성요소(體液性要素, humoral factor)를 포함하고, 세포배양용기 H의 유출구(流出口, outflow port, Haa)와 연결관 C (Tube C)를 통해 페리스탈틱 펌프를 거친 후, 3방향 발브(3方向발브, 3 way valve, Hbb)를 거쳐 다시 필터(濾過膜, filter, Hcc)를 통과하여 세포배양기 G의 유입구(流入口, inflow port, Gdd)로 들어간다.

이상과 같은 구조를 가지고 있는 본 발명의 세포배양용기를 가진 구체적인 실시를 위한 내용은,

이 발명은 두 가지로 구분되어 있는데, 하나는 세포배양용기이며, 다른 하나는 본 발명의 세포배양용기를 이용한 새로운 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)이다.

첫째, 본 발명의 세포배양용기는 원형의 배양접시(culture dish)형 또는 정사각(正四角, regular square) 또는 직사각(直四角, rectangle)형의 형태를 갖추고 있다. 원형의 배양접시(culture dish)형은 세포배양용기의 하단부에 유출구(流出口, outflow port) 또는 유입구(流入口, inflow port)를 갖추고 있으며 뚜껑을 소유하는 것을 특징으로 하며, 원형의 세포배양용기는 다시 두 종류로 구분되는데, 한 종류는 원형의 세포배양용기 2개를 겹쳐 연결시켜 사용하도록 발명된 이층형 세포배양용기(二層形細胞培養容器, two storied cell culture container) 이며, 다른 하나는 두 개의 세포배양용기를 겹쳐 연결시키지 않고 각각을 분리하여 두 용기를 나란히 연결하여 사용하기 위해 발명된 단층형 세포배양용기(單層形細胞培養容器, single storied cell culture container) 이다. 사각형 배양용기는 유입구 또는 유출구 없이 용기내부를 2개로 분리하는 분리벽(分離壁, dividing wall)을 소유하며, 분리벽 일부에는 분리벽 양측에 배양액이 서로 통할 수 있도록, 일정크기의 세공(細孔, pore)의 막(膜, membrane)을 소유한다.

본 발명의 새로운 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)는, 본 발명의 세포 배양용기와, 페리스탈틱펌프(peristaltic pump), 필터(filter), 3방향(三方向, 3 way) 발브(valve) 및 연결관을 포함하는 것으로서, 줄기세포 등 분화를 필요로 하는 세포와 체액성요소(體液性要素, humoral factor) 공급원(供給源, source)를 분리시키면서, 체액성요소 공급원인 미세환경(微細環境, microenvironment) 또는 유전자외(遺傳子外, epigenetic) 요소를 이용하여 줄기세포 등 여러 세포를 증식(增殖, proliferation) 및 분화유도(induced 또는 guided 또는 directed differentiation)하여, 목적하는 증식 또는 분화된 세포만을 선택적으로 채취할 수 있는 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)에 관한 발명이다.

실시 예는, 배양접시형 세포배양용기를 설치 방법에 따라, 두 개를 상하로 겹쳐 설치한 이층형 세포배양용기(二層形細胞培養容器, two storied cell culture container)의 경우, 상실(上室, upper chamber)과 하실(下室, lower chamber)로 구성되며, 두 개를 분리하여 평행하게 설치한 단층형 세포배양용기(單層形細胞培養容器, single storied cell culture container)의 경우 좌실(左室, left chamber)과 우실(右室, right chamber)로 구성되도록 하였으며,

세포배양용기의 상실 또는 하실(또는 좌실 또는 우실)의 유출구(流出口, outflow port) 또는 유입구(流入口, inflow port)를 통하여 지속적으로 상실과 하실 (또는 좌실과 우실)의 배양액이 유출구(流出口, outflow port) 또는 유입구(流入口, inflow port)에 연결된 연결관(連結管, connecting tube)을 통해 세포배양액이 지속적으로 순환할 수 있도록 하였으며, 세포배양액의 순환은 페리스탈틱 펌프(peristatic pump)에 의해 강제적으로 실시하도록 되어 있고 이들 중간에 일정한 규격의 필터와 3방향 발브(3way valve)가 설치되어 있다.

본 발명의 세포배양용기(細胞培養容器, container for cell culture)와 이 발명을 이용한 새로운 세포 배양계(細胞培養系, cell culture system)를 이용하는 실시 예로, 지방유래 세포(adipose derived cell)와 동일한 숙주의 방광근(膀胱筋, bladder muscle)을 이용하는 실험을 성장한 개(成犬, adult dog)를 대상으로 실시한 세포분화 실험 실시 예를 들면,

체중 12Kg의 성견(成犬, adult dog)을 아트로핀(atropin)으로 전처치한 후, 페노바비탈(phenobarbital)과 자이라진(xylazine)으로 마취하여, 개의 등을 수술대에 대고(supine position) 사지를 고정시킨 다음, 복부를 삭모(削毛, shaving)하고, 포타딘용액으로 소독한 후, 수술 칼로 개복(開腹)하여, 복강 내 지방을 약 20그램 멸균적으로 채취해 영상 4도의 항생제(페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신 비)가 첨가된 둘베코씨 최소 필수배지(DMEM)에 보관하고, 계속 멸균적으로 방광을 분리-채취하여 별도의 영상 4도 온도의 동일 배지(DMEM)에 보관하였다.

영상 4도의 배지에 멸균적으로 보관 중이던 복부지방은 다시 새로운 배지에서 멸균적으로 세척한 후, 세절(細切, chopped)하여 세절된 지방조직을 0.2% 콜라겐나제(collagenase) 용액에 37도에서 처리한다. 이를 DMEM 배지를 이용하여 효소활성을 억제시킨다음. 이를 망사체(mesh screen)로 여과한 후, 원심분리하여 성숙된 지방세포와 죽은 세포를 제거하고 간질세포를 모은다. 혼합되어 있는 적혈구를 버퍼액(0.154mol/L, NH4Cl, 10 mmol/l KHCO3 and 0.1 mmol/l EDTA)으로 5분간 처리하여 제거하고, 모아진 간질세포를 DMEM 용액으로 부유액을 만들어 원심분리해 다시 간질세포를 모아 망사체를 통해 여과시킨 후, 이층형 세포배양용기(二層形細胞培養容器)의 경우에는 상실(upper chamber) 또는 하실(lower chamber), 단층형 세포배양용기(單層形細胞培養容器)의 경우에는 좌실(左室, left chamber)과 우실(右室, right chamber)의 한 방(室, chamber)의 최소 필수배지(DMEM, 10% FBS, 1% Antibiotic)에 파종(播種, seeding) 한다.

지방세포분리와 별도로, 같은 시간에, 냉 최소 필수배지(cold-DMEM)에 보관 중이던 방광을 정중절개하여 방광내부를 항생제 첨가된 DMEM으로 추가 세척한 후, 방광내피를 제거하고, 방광근육을 세절(細切, chopped)하여, 이를 콜라겐나제(collagenase)로 37도에서 30분간 진동 교반시킨 후, DMEM으로 세척한 후 원심분리한 후 침전물을 다시 소량의 DMEM으로 부유액을 만든 후, 이를 앞에서 기술한 지방세포를 파종한 방(室, chamber)과와 다른 방인 하실(lower chamber) 또는 상실(upper chamber), 그렇지 않으면 우실(右室, right chamber) 또는 좌실(左室, left chamber)에 파종한다.

이러한 상태에서, 도면 10에서 관찰하는 바와 같이 이층형 세포배양용기(二層形細胞培養容器, two storied cell culture container)를 이용한 세포배양계에 관한 계통도에서, 하실(下室, lower chamber)에 체액성요소(體液性要素, humoral factor)를 분비하는 세포 또는 조직을 파종(seed)하였다면, 이 이층형 세포배양계의 상실(上室)의 유출구(流出口, outflow port, gg)를 통해 나온 배양액이 연결관 A를 통하여 필터(濾過膜, filter, XXX)를 통하고, 상실(upper chamber)에서 발생된 세포부스러기 등의 물질이 여과된 깨끗한 배양액은 페리스탈틱 펌프(peristatic pump)를 통과한 후, 연결관 A를 통하여 다시 3방향 발브(3 way valve, xx)를 통과하여 깨끗한 배양액이 하실(下室, lower chamber)의 유입구(流入口, inflow port, oo)를 통해 하실(lower chamber)로 들어가며, 하실의 유입구(oo)로 유입된 배양액은 하실에 파종된 세포 또는 조직 등을 지나쳐 통과하면서 하실의 세포 또는 조직이 분비 하는 체액성요소(體液性要素, humoral factor)의 공급원인 미세환경(微細環境, microenvironment) 또는 유전자외(遺傳子外, epigenetic) 요소를 거치게 되고, 이 배양액은 하실의 건너편에 있는 유출구(流出口, outflow port, mm)을 통해 배출되어, 하실의 조직으로부터 분비된 어떤 체액성요소(體液性要素, humoral factor)를 포함한 채 연결관 B(Tube B)를 지나 3방향 발브(3方向발브, 3 way valve, yy)를 통과하여 페리스탈틱 펌프를 통과한 배양액은 필터(濾過膜, filter, YYY)를 통해 체액성요소의 손상 없이 그대로 필터를 통과하되 하실로부터의 세포 부스러기 등의 물질은 여과된 후 체액성요소를 소유한 깨끗한 배양액이 상실의 유입구(流入口, inflow port, kk)로 유입됨으로써, 이 체액성물질을 함유하고 있는 배양액이 상실(upper chamber)에 파종된 세포에 영향을 준다. 이는, 이전의 여러 학자들이 보고하던 변형된 보이덴쳄버(modified Boyden chamber)를 사용할 경우 초래되었던 여러 단점을 보완하면서, 변형된 보이덴쳄버와 동일한 효과를 낼 수 있을 것이다.

이와 같은 방법으로 도면 11과 같은 단층형 세포배양용기(單層形細胞培養容器)를 이용하는 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)에서는, 세포배양용기 G와 H가 상하 연결되지 않고 서로 분리되어 위치하는 것으로서, 좌측(左側, left)의 세포배양용기 G에 위에서 분리한 지방세포를 파종(播種, seeding)하였다면, 세포배양용기 G의 유출구(流出口, outflow port, Gaa)를 나온 배양액은 연결관 D(Tube D)를 통해 3방향 발브(3方向발브, 3 way valve, Gbb)를 통한 후, 페리스탈틱 펌프를 지나, 필터(濾過膜, filter, Gcc)를 통과하여, 체액성요소(體液性要素, humoral factor) 공급원인 미세환경(微細環境, microenvironment) 또는 유전자외(遺傳子外, epigenetic) 요소를 가진 우측(右側, right)의 세포배양용기 H의 유입구(流入口, inflow port, Hdd)로 들어간다. 이 배양액은 세포배양용기 H에 파종되어 있는 조직 또는 세포를 거침으로서 체액성요소를 함유한 채, 세포배양용기 H의 유출구(流出口, outflow port, Haa)를 통해, 연결관 C (Tube C)를 지나- 페리스탈틱 펌프를 거친 후, 3방향 발브(3方向발브, 3 way valve, Hbb)를 거쳐 다시 필터(濾過膜, filter, Hcc)를 통과하여 세포배양기 G의 유입구(流入口, inflow port, Gdd)로 들어간다.

이 세포배양계(cell culture system)의 장점은, 일단 멸균적으로 상실(上室, upper chamber)과 하실(下室, lower chamber)에 세포 또는 조직이 파종된 후, 뚜껑과 상실 그리고 상실과 하실의 연결부에 일단 밀착시키고 단단히 폐쇄한 후에는, 배양액교환(培養液交換, media change)을 위해 이 세포배양계를 더 개방(開放, open)할 필요 없이, 이미 사용한 배양액(old media)을 3방향 발브(3方向발브, 3 way valve, xx)를 통하여 신선 배양액(新鮮培養液, fresh media)으로 교환할 수 있다. 도면 10에서의 배양계를 약간씩 좌우로 기울이면서 3방향 발브(3方向발브, 3 way valve, xx)의 손잡이를 조절함으로써, 배양액의 진행방향(ss)을 변경시켜, 일방적(一方的, one way)으로 오래된 배양액(old media)을 외부로 배출시키고, 다른 3방향 발브(3方向발브, 3 way valve, yy)를 통하여 신선배양액을 일정방향 발브(tt)를 통해 충분한 양을 흡입함으로서 이 신선 배양액을 상실(upper chamber) 을 통하여 세포배양계(cell culture system) 전체에 공급할 수 있다.

본 발명은 총11개의 도면으로 구성되어 있으며,

도면 1은 두 개의 접시형 세포배양용기(細胞培養容器, container for cell culture)를 겹쳐 놓은 이층형 세포배양용기(二層形細胞培養容器, two storied cell culture container)의 단면도(AA)와 각각의 접시형 세포배양용기를 분리하여 배치할 때의 한(1)개의 세포배양용기에 대한 단층형 세포배양용기(單層形細胞培養容器, single storied cell culture container)의 단면도(BB)이다.

도면 2부터 도면 6은 도면 1의 각 부위의 확대도면으로서,

도면 2는 뚜껑과 세포배양용기 상단의 확대도면이며,

도면 3은 이층형 세포배양용기의 상실(上室, upper chamber)과 하실(下室,lower chamber)의 연결부위의 확대도면(F)과 상실하부의 유출구(流出口, outflow port) 또는 유입구(流入口, inflow port)의 확대도면(D)이며

도면 4는 단층형 세포배양용기의 하단부의 확대도면으로 유출구 또는 유입구의 확대도면(CA)를 포함하고 있으며,

도면 5는 페리스탈틱 펌프(peristaltic pump)와 연결관(Tube A와 Tube B) 사이의 관계를 보여주는 확대도면이며,

도면 6은 배양용기의 측벽 또는 뚜껑에 설치되는 통기막(通氣膜, Germ barrier filter membrane)의 확대 도면이며,

도면 7은 두 개의 접시형 세포배양용기(細胞培養容器, container for cell culture)를 겹쳐 놓은 이층형 세포배양용기의 통기막측에서 관찰한 측면도이며,

도면 8은 접시형 세포배양용기의 상면도이며,

도면 9는 사각형 세포배양용기의 상면도이며,

도면 10은 본 발명을 이용한 두 개의 세포배양용기(細胞培養容器, container for cell culture)를 겹쳐 놓은 이층형 세포배양용기(二層形細胞培養容器)와 페리스탈틱펌프(peristaltic pump), 필터(濾過板, filter), 3방향(3 way) 발브(valve) 및 연결관을 포함하는 새로운 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)의 연결도이고,

도면 11은 각각의 접시형 세포배양용기를 분리시켜 놓은 단층형 세포배양용기(單層形細胞培養容器) 두 개의 분리된 세포배양용기와 페리스탈틱펌프(peristaltic pump), 필터(濾過板, filter), 3방향(3 way) 발브(valve) 및 연결관을 포함하는 새로운 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)의 연결도이다.

Claims

세포배양용기(細胞培養容器, culture container)에 있어서,

세포배양용기 바닥보다 상부위치에, 세포배양용기 내(內)의 세포배양액(細胞培養液, cell culture media)이 연결관을 통하여 외부로 배출될 수 있거나, 연결관을 통하여 세포배양액을 세포배양용기내로 유입시킬 수 있는 유출구(流出口, outflow port) 또는 유입구(流入口, inflow port)가 달려있으며,

세포배양용기와 뚜껑은 완전 밀착폐쇄시킬 수 있어서, 폐쇄된 이 밀착부위로는 모든 것이 통과불가(通過不可, non-passable)하며,

뚜껑에는 세균 등은 통과불가하나 공기 등의 가스가 통과가능한 통기막(通氣膜, germ barrier filter membrane)을 소유하고 있는 세포배양용기.
제1항에 있어서, 세포배양용기 두개가 겹쳐 연결된 2층형 세포배양용기로서,

상실(上室, upper chamber)과 하실(下室, lower chamber)의 연결부위가 연결되었을 때는 완전 밀착폐쇄가 가능하며,

상실(上室, upper chamber)과 하실(下室, lower chamber) 각각에 별개의 유출구와 유입구를 소유하고 있으며,

상실(上室, upper chamber)과 하실(下室, lower chamber) 각각의 측면에는 세균 등이 통과불가(通過不可, non-passable)하나 공기 및 가스가 통과할 수 있는 통기막(通氣膜, germ barrier filter membrane)을 소유할 수 있는 2층형 세포배양용기.
사각형 세포배양용기(四角形細胞培養容器, quadrangle type cell culture container)에 있어서,

용기내부를 2개의 공간으로 분리하는 분리벽(分離壁, dividing wall)을 소유하며,

이 분리벽은, 세포배양용기 바닥보다 상부에, 세포 또는 세포 부스러기는 통과하지 못하고 세포배양용기 내(內)의 세포배양액(細胞培養液, cell culture media)만이 자유롭게 통과할 수 있는 일정크기의 세공(細孔, pore)의 막(膜, membrane)을 소유하며,

이 세포배양용기 뚜껑에는 세균 등이 통과불가(通過不可, non-passable)하나 공기 및 가스의 통과가 가능한 통기막(通氣膜, germ barrier flter membrane)을 소유하는 사각형 세포배양용기.
제1항과 제2항의 본 발명의 세포배양용기를 포함하는 세포배양계(細胞培養系, cell culture system)의 연결에 있어서, 세포 배양용기와, 페리스탈틱(peristaltic) 펌프, 필터, 3방향(三方向, 3 way) 발브(valve) 및 이들 사이를 연결하는 연결관을 포함하는 세포배양계로서,

세포배양기와 뚜껑은 완전 밀착폐쇄시키고, 공기 또는 가스는 통기막(通氣膜, germ barrier filter membrane)을 통해서 배양액에 공급될 수 있으며,

각각 분리된 세포배양용기로부터 배출된 배양액은 필터를 통과하면서 세포 또는 세포부스러기 만을 여과하고 세포배양액은 자유롭게 통과시키며,

세포배양액의 교환은, 페리스탈틱 펌프가 가동되는 상황에서 3방향(三方向, 3 way) 발브(valve)의 손잡이를 조작함으로서, 이 세포배양계 내의 3방향(三方向, 3 way) 발브(valve)를 통해서만 세포배양계 내부의 오래된 배양액을 배출하며, 이 세포배양계 외부로부터의 신선배양액도 연결된 3방향(三方向, 3 way) 발브(valve)를 통하여 이 세포배양계로 공급이 가능하도록 된 세포배양계.