KR20090043484A - 카텝신 ｇ 저해제를 함유하는 피부노화 방지용 피부외용제 조성물 및 항노화용 물질을 스크리닝하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 노화된 피부에서 많이 생성되는 피부 부착단백질의 분해 산물들이 피부세포에서 콜라겐 분해 효소인 메탈로프로티아제(metalloprotease)의 발현을 증가시키는 사실로부터 부착단백질의 분해 억제를 통해 메탈로프로티아제의 발현을 막을 수 있는 카텝신 G 저해제를 함유하는 피부노화 방지용 피부외용제 조성물 및 상기 카텝신 G 저해제, 즉 항노화 물질을 개발하기 위한 스크리닝 방법에 대한 것으로서, 피부세포의 부착력 증가 및 부착 단백질의 분해억제를 통해 메탈로프로티아제의 발현과 활성을 막아 피부노화 방지, 피부 주름살 증가 억제, 탄력성 증가 및 피부 처짐 방지 개선물질 개발을 할 수 있는 새로운 스크리닝 방법의 개발에 관한 것이다.

부착단백질*파이브로넥틴*카텝신 G*주름개선*탄력개선*피부처짐*피부노화

Description

카텝신 Ｇ 저해제를 함유하는 피부노화 방지용 피부외용제 조성물 및 항노화용 물질을 스크리닝하는 방법{Composition for external application to the skin containing Cathepsin G Inhibitors For Preventing Skin Aging And Screening Method for development of antiaging materials}

본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여 카텝신 G 저해제를 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지용 피부외용제 조성물 및 카텝신 G 효소의 활성을 억제할 수 있는 항노화용 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

피부노화는 자외선과 같은 외적요인에 의한 광노화와 호르몬 변화, 스트레스 등의 내적 인자들의 변화로 인한 자연노화의 복합적인 작용에 의해 피부의 주름살 증가나 탄력성 감소 등이 나타난다. 이러한 이유로 인해 피부노화가 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 콜라겐, 엘라스틴, 히아루론산, 프로테오글리칸, 글리코스아미노글리칸, 피브로넥틴 및 당단백질의 함유량 및 배열이 변하거나 감소하고, 수분과 결합할 수 있는 능력이 저하되고, 그 결과 피부를 구성하는 기질물질이 감소하고, 피부의 수분함유능력이 상실되어 탄력상실, 피부 건조, 피부처짐 등의 증상들이 나타나게 된다.

이러한 피부변화를 예방하거나 치료할 수 있는 기능성 화장품 원료나 의약품 개발을 위해 다양한 연구들이 진행되고 있다. 현재 가장 많이 항노화 억제물질로 연구되고 있는 것은 콜라겐의 생성과 자외선에 의한 콜라겐을 분해하는 효소인 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP, Matrix metalloproteinase)의 적절한 조절을 위한 연구들이 활발히 진행되고 있다.

따라서, 이러한 피부노화의 현상들을 방지하고, 개선시킬 수 있는 활성성분의 개발을 위해가 현재 사용되고 있는 대부분의 in vitro 항노화 물질개발 방법은 피부세포에 자외선을 조사한 후 물질을 처리해 메탈로프로티아제의 발현양을 감소시키는 방법과 피부세포에 물질을 처리하여 콜라겐을 증가시키는 방법을 사용하고 있다. 이를 통해 개발된 피부주름살 억제와 관련된 항주름 물질개발의 경우 자외선에 의한 직접적인 세포영향에 나타나는 메탈로프로티아제의 발현은 어느 정도 극복할 수 있으나 간접적인 인자들에 의한 메탈로프로티아제의 발현에 대한 부분은 해결하기 어려운 상황이다. 기타 콜라겐 유사물질들인 펩타이드나 엘라스타아제 억제제 및 항산화 물질 등의 개발이 주된 방법이다.

본 발명은 노화된 피부에서 증가하는 피부 부착단백질(피브로넥틴)의 분해 산물들이 메탈로프로티아제의 발현을 촉진시키는 것을 토대로 부착단백질의 분해효소가 카텝신 G라는 것을 규명하였다. 또한 카텝신 G 저해물질로 ISMD 38을 세포에 함께 처리한 결과 메탈로프로티아제의 발현양과 활성이 현저히 줄어드는 것을 발견함으로써 새로운 항노화 물질개발 방법을 완성하였다.

파이브로넥틴은 정상적인 상태에서 피부의 진피층에서 세포와 콜라겐을 연결하는 부착단백질로 세포의 이동이나 증식, 분화 등에 관여하며 세포의 내부신호와 밖의 신호를 전달하는 매개체로 보고되고 있다. 파이브로넥틴은 모든 척추동물에서 발견되며 두개의subunit로 구성된 dimer로 구성되어 있으며 440 Kda의 당 단백으로서 가용성인 혈장(plasma Fn;pFN)과 cellular Fn(cFN) 두 가지 형태로 존재한다. pFN은 대부분 간세포에서 생산되고 cFn은 섬유아세포, 상피세포, 대식세포 등 다양한 세포들에서 생산되며 이러한 두 가지 형태의 Fn은 정상피부에서 모두 발견된다 (Roberger DJ. Fibronectin. Int J Biochem Cell Biol 1997;29:939-943). 파이브로넥틴은 세포 표면에서 발현되는 , 두 개의 subunit로 구성된 당 단백인 인테그린 수용체나 비인테그린 수용체와 결합하여 세포의 접착이나 신장의 촉진, 세포이동 촉진, 세포분화 조절, 조직 회복 등의 다양한 생물학적 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다(Couchman JR, Austria MR, Woods A. Fibronectin-cell interactions. J.I.D. 1990;94:7s-14s. Hynes RO, Yamada KM. Fibronectin; multifunctional modular glycoprotein. J. cell boil 1982; 92;369-377).

그러나 이러한 부착단백질들의 분해산물들이 메탈로프로티아제의 발현에 영향을 미치는 것들은 관절염 환자의 연골세포에서 많은 연구가 되어있다. 즉 파이브로넥틴의 분해물들이 다양한 염증반응을 매개하는cytokine(인터루킨-1과 6, TNF-1)의 발현을 촉진시키는 것(Arthritis & Rheumatism, 2002)과 메탈로프로티아제의 발 현을 증가시키는 것들은 J Cell Bio (1983)에 보고되었지만 사람의 피부세포에서 파이브로넥틴의 분해산물들이 메탈로프로티아제의 발현 대한 직접적인 영향은 보고된바 없다. 다만, UV 조사시 ECM에서는 콜라겐 감소와 MMP-1 증가와 같은 구조적인 ECM 단백질들의 변화가 관찰되는데 파이브로넥틴의 경우 UV 조사시 엘라스타아제의 활성이 증가하여 파이브로넥틴의 분해가 촉진되고 이러한 파이브로넥틴의 분해산물들이 피부 노화에 해로운 역할을 할 것이라는 것은 동물시험에서 보고되었다(Journal of photochemistry and photobiology, 2000).

또한, 카텝신 G의 역할에 대하여는 많은 연구가 되어 있지 않지만 피부에는 많은 프로티아제들이 있는데 대표적으로 특히 세린 프로티아제와 메탈로프로티아제가 존재한다. 그러나 세포내와 세포밖의 pH 영향에 의해서 위의 프로티아제들 중 세린프로티아제들인 카텝신 B, D, H, L, K, S 등은 산성의 pH를 갖는 세포 내에서 작용하며 카텝신 G는 중성 pH를 보이는 세포 밖에서 작용하는 효소로 언급되고 있다(Arthritis Research Campaign 1998). 카텝신 G는 분자량이 약 30 kDa을 보이며 기질로는 콜라겐과 파이브로넥틴이 보고되고 있고, 2002년에는 자외선에 의해서 피부 섬유아세포에서 카텝신 G의 발현이 촉진된다고 보고되었다 (Biochemistry 2002) 현재 카텝신 G의 발현 등은 아토피와 같은 병변 부위에 집중적으로 나타나며 표피에서는 존재하지 않고 진피 등에서 많은 발현양이 있음을 알 수 있다.

한편, 현재 사용되고 있는 대표적인 in vitro 항노화 물질개발 스크리닝 방법은 피부세포에 자외선 조사 후 세포에서 메탈로프로티아제의 발현이 촉진되는 양을 억제시키기 위하여 자외선을 조사한 피부세포에 후보 효능물질을 처리하여 메탈 로프로티아제의 발현을 억제시키는 방법과 정상적인 상태의 피부섬유아세포에 물질을 처리한 후 콜라겐 생성을 증가시키는 물질을 찾는 방법을 사용하고 있다. 그러나 우리 피부에서는 자외선과 같은 직접적인 작용 외 다른 염증성 인자들과 같은 다양한 인자들에 의해서도 메탈로프로티아제의 발현과 활성 증가가 나타난다.

따라서 본 발명에서는 염증세포에서 발현이 촉진되는 카텝신 G 의 기능을 규명하고 이를 통해 직접적인 자외선 조사 없이 피부세포에서 카텝신 G에 의한 부착단백질의 분해로 인한 메탈로프로티아제의 양적/질적인 증가를 효율적으로 억제하는 항노화 물질 개발을 할 수 있는 새로운 방법의 개발 및 상기의 항노화 물질 즉, 카텝신 G 저해제를 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지용 피부외용제 조성물을 특징으로 한다.

본 발명자 들은 자외선에 의한 급속한 피부노화 억제 외 자외선 조사 없이 자연노화를 효과적으로 통제하는 방법을 탐색하던 중 피부 부착단백질(파이브로넥틴)의 분해산물들이 피부세포에서 메탈로프로티아제의 발현을 촉진하는 것과 부착단백질의 분해효소로 카텝신 G가 관여하는 것을 발견하게 되었고, 카텝신 G 저해 스크리닝을 통해 항노화용 물질인 카텝신 G 저해제가 카텝신 G의 저해 효과와 피부부착 단백질인의 분해를 막아 피부세포에서 메탈로프로티아제의 생성을 억제하는 것을 발견하였다. 따라서 카텝신 G 저해제를 함유하는 외용제를 사용할 경우, 자연노화와 광노화에 의해 발생하는 피부부착 단백질의 분해를 막고 메탈로프로티아제의 생성을 줄일 뿐만 아니라 활성도 억제할 수 있어 기존의 항노화 물질보다 더욱 강한 항노화 물질개발을 할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 카텝신 G 저해제를 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지용 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 카텝신 G 의 기능을 규명하고 이를 통해 직접적인 자외선 조사 없이 피부세포에서 카텝신 G에 의한 부착단백질의 분해로 인한 메탈로프로티아제의 양적/질적인 증가를 효율적으로 억제하는 항노화 물질 개발을 할 수 있는 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여 카텝신 G 저해제를 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지용 피부외용제 조성물 및 카텝신 G 효소의 활성을 저해할 수 있는 항노화용 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 피부노화 방지용 피부외용제 조성물에서 카텝신 G 저해제는 피부 부착단백질인 파이브로넥틴(fibronectin)의 분해를 막아 피부세포에서 콜라겐을 분해하는 효소, 즉, 상기 파이브로넥틴의 분해산물인 메탈로프로티아제(metalloproteinase)의 생성을 억제시키는 것을 특징으로 한다(도 1). 도 1에 나타낸 바와 같이, 노화된 피부에서 카텝신 G 효소의 활성이 증가되면 피부부착 단백질을 빠르게 분해시켜 피부부착 단백질의 분해산물인 메탈로프로티아제의 발현 및 활성을 증가시켜 주름을 증가시키는 반면, 상기 카텝신 G 효소의 활성을 저해시키기 위해 카텝신 G 저해제를 적용하면 피부부착 단백질의 분해를 막아 피부세포에서 콜라겐을 분해하는 효소인 메탈로프로티아제의 생성을 저해시켜 최종적으로 피부 주름 방지 및 탄력 개선 효과가 나타나는 것이다.

본 발명에 따른 카텝신 G 저해제는 하기 화학식 1 내지 화학식 4의 화합물에서 선택된 것으로, 전체 피부외용제 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량%로 함유되는 것이 바람직하다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 화학식 1 내지 화학식 4의 화합물의 함량이 전체 피부외용제 조성물 총 중량에 대하여 0.01 중량% 미만이면 카텝신 G 효소의 발현 저해 효과를 얻을 수 없으며, 20 중량%를 초과하면 피부외용제 변성의 우려가 있고, 피부외용제 제형의 점도 조절이 쉽지 않으며, 생산 경제성이 떨어지는 문제점이 있다.

본 발명의 피부노화 방지용 피부외용제 조성물은 피부세포의 부착력 증가 및 부착단백질의 분해를 막아 피부 주름살 증가 억제, 탄력성 증가 및 피부 처짐 방지를 위해 사용되는 것으로, 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 에센스, 마사지크림, 아이크림, 팩, 바디로션, 바디크림, 바디오일 또는 바디에센스의 화장료의 제형 및 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제의 경피투여용 제형일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 피부노화 방지용 피부외용제 조성물은 상기한 카텝신 G 저해제 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다.

본 발명의 피부노화 방지용 피부외용제 조성물에서 피부 부착단백질의 분해억제 효과를 나타내는 항노화용 물질인 카텝신 G 저해제를 스크리닝하기 위한 방법으로 카텝신 G 효소의 존재 하에서, 기질에 항노화 후보물질을 투여하여 상기 카텝신 G 효소의 활성 저해 정도를 측정하며, 상기 카텝신 G 효소의 활성 저해 정도는 피부 부착단백질이 분해되어 생성된 메탈로프로티아제의 농도를 측정하여 확인할 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 카텝신 G 저해제를 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지용 피부외용제 조성물은 카텝신 G 저해제가 파이브로넥틴의 분해를 막아 피부세포에서 메탈로프로티아제의 생성을 억제시켜 자외선에 의한 직접적인 효과 외에 피부 내에 존재하는 효소들에 의한 메탈로프로티아제의 양과 질적인 변화를 저해함으로써 피부노화의 제반증상인 주름 및 탄력을 개선하고, 피부에 보습을 주는 항노화 효능이 있는 피부외용제 조성물로 사용할 수 있다. 특히 카텝신 G 저해제는 메탈로프로티아제의 활성을 억제시키는 효과를 가져 피부 주름 및 탄력 개선에 기여할 수 있어 향후 피부노화 개선용 화장품 원료 개발시 효능물질로 사용될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 항노화용 물질을 스크리닝 하는 방법을 통해 카텝신 G 효소의 존재 하에서 기질에 항노화 후보물질을 투여하여 상기 카텝신 G 효소의 활성 저해 정도를 생성된 메탈로프로티아제의 농도 측정으로써 항노화용 물질을 스크리닝할 수 있다.

이하, 시험예 및 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 작용효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[ 시험예 1] 피부세포에서 피부부착단백질의 분해산물에 의한 메탈로프로티아제(matrix metalloproteinase-1)의 발현

상업적으로 시그마에서 구입한 4종의 피부부착 단백질(파이브로넥틴:fibronectin)의 분해산물(Fn-f120, Fn-f70, Fn-f45 및 Fn-f30)들에 대한 세포독성을 하기와 비교한 결과를 하기 표 1에 나타내었으며, 하기 표 1의 세포생존율로부터 파이브로넥틴 분해물-1(Fn-f120; 120 kDa)의 경우는 0.5μM에서 독성이 있었지만 다른 분해산물들의 경우는 독성이 없어 이후 실험들은 독성이 없는 파이브로넥틴 분해물-2,3 및 4(Fn-f70, Fn-f45 및 Fn-f30; 70, 40 및 30 kDa)을 인간의 피부 섬유아세포에 처리하여 메탈로프로티아제의 발현 정도를 ELISA kit으로 측정하였다. 즉, 10%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(fibroblast Growth Media) 배지가 함유된 6공 평판배양기(6well microtiter plate)에 사람의 섬유아세포를 10,000세포/well가 되도록 넣고, 세포가 부착한 후 우태아혈청이 없는 DMEM 배지로 갈아주고 70∼80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 다음, 하기 표 1의 조성물의 농도대로 처리, 2일 후 살아있는 세포의 수를 측정하여, 피부세포에 대한 독성 관찰과 메탈로프로티아제(이하, MMP-1이라 함) 양적변화를 비교하였다. 이때 피부부착 단백질(파이브로넥틴:fibronectin)의 분해산물을 처리하지 않은 군을 대조군으로 하였다. 그 결과는 대조군을 100으로 하여 비교치를 표 1 및 도 2에 나타내었다.

[표 1]

상기 표 1과 도 2로부터, 파이브로넥틴 분해산물들이 피부섬유아세포에서 메탈로프로티아제의 양적 변화를 증가시키는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 도 2에 도시되어 있는 자외선을 조사했을 경우(UVB)보다 최대 50%이상 증가하였음을 알 수 있었다. 현재 파이브로넥틴의 분해산물들이 관절세포에서 메탈로프로티아제의 발현양을 증가시키는 것으로 보고되어 있지만 피부세포에서는 보고되지 않았다.

따라서 상기 도 2의 결과를 통하여 파이브로넥틴 분해 산물이 메탈로프로티아제를 증가시키는 것을 통해 피부노화를 촉진하는 중요한 노화인자임을 예측 할 수 있다.

[ 시험예 2] 파이브로넥틴의 분해 효소 및 메탈로프로티아제의 발현양 증가 확인

파이브로넥틴의 분해 효소를 확인하기 위하여 파이브로넥틴 단백질(0.5㎍)을 에펜돌프 튜브에 넣고 카텝신 G(1, 5 mUnit)을 넣어 37℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 파이브로넥틴의 분해를 카텝신 G를 넣지 않은 경우와 비교하여 웨스턴블럿으 로 관찰하였다(도 3).

또한 인체 섬유아세포에서 파이브로넥틴의 분해를 확인하기 위해서 섬유아세포를 10⁴ 개의 농도로 48공 평판배양기에 배양하면서 카텝신 G를 1 m Unit 및 5 mUnit로 포함한 배지로 교체하였다. 배양 24시간 후 상징액을 수확한 후 웨스턴블럿 방법을 사용하여 파이브로넥틴의 분해를 확인한 후 메탈로프로티아제의 발현양을 웨스턴블럿으로 관찰하여 카텝신 G를 넣지 않은 경우와 비교하여 도 4 에 나타내었다.

한편, 상기 피부세포를 배양하면서 카텝신 G의 농도를 0.1mU 및 1mU로 처리하여 메탈로프로티아제(MMP-1)의 발현량을 웨스턴블럿으로 관찰하여 도 5에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 파이브로넥틴에 카텝신 G를 처리한 경우 파이브로넥틴의 분해산물들이 다양하게 나타나는 것으로 확인되어 카텝신 G가 파이브로넥을 분해하는 효소임을 확인할 수 있었다.

또한 도 4로부터, 피부세포에 카텝신 G를 처리한 경우 파이브로넥틴의 분해가 관찰되었으며, 도 5로부터 파이브로넥틴의 분해 변화로 인해 파이브로넥틴의 분해산물인 메탈로프로티아제의 양적 변화가 증가되는 것을 알 수 있었다. 즉, 도 5에서 저농도의 카텝신 G(0.1mU)의 경우 대조군보다 proMMP-1의 양이 증가되지만 1mU의 카텝신 G를 처리한 경우는 proMMP-1은 줄어들면서 활성 form인 active MMP-1 이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 상기의 도 3 내지 도 5로부터, 카텝신 G가 파이브로넥틴의 분해를 촉진하는 효소라는 점과 메탈로프로티아제의 활성 크기인 42 kDa의 밴드를 확인함(도 5)으로써 기존 자외선을 조사한 세포에서는 보이지 않았던 메탈로프로티아제의 활성 크기를 발견할 수 있었으며, 자외선 조사 없이 노화된 피부에서 발현이 촉진되는 카텝신 G에 의해서 노화가 촉진됨을 알 수 있었다. 상기 카텝신 G 효소는 피부세포에서 피부 부착 단백질의 분해를 촉진하여 메탈로프로티아제의 양을 증가시킴과 동시에 메탈로프로티아제의 활성을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

[ 시험예 3] 카텝신 G 저해제 시험 및 물질 스크리닝 방법

96공 평판배양기에 카텝신 G 효소, 기질, 하기 표 2에 나타낸 본 발명의 후보물질(ISMD 38) 또는 애머샴에서 판매하고 있는 양성대조물질(Inhibitor) 및 완충용액을 하기 표 3과 같이 혼합하여 전체 볼륨을 200㎕로 만든 후 37℃에서 3시간 반응시킨 후 504 nm 흡광도를 이용해 카텝신 G 효소의 활성이 있는지를 확인하였다. 또한 도 6에 카텝신 G 활성을 저해하는 정도를 대조군을 100으로 카텝신 G 효소의 활성이 있다면 기질이 분해되어 노란색의 색깔을 띠게 된다.

이때 카텝신 G 효소와 기질만 넣은 군을 대조군으로 하였다. 그 결과는 대조군을 100으로 하여 비교치를 도 6에 나타내었다.

[표 2]

[표 3]

도 6로부터 양성대조군의 양성대조물질은 1μM에서 IC₅₀값을 보여주었고, 본 발명의 ISMD 38의 경우는 10mM에서 40%의 카텝신 G 활성을 저해하는 것으로 나타났다.

[ 시험예 4] ISMD 38에 의한 MMP -1 발현 억제 확인

카텝신 G 저해 효과가 있는 ISMD 38이 세포수준에서도 작용하는지 확인하기 위하여 피부 섬유아세포에 처리하여 메탈로프로티아제의 발현 정도를 웨스턴 블럿으로 측정하였다. 즉 10%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(fibroblast Growth Media)배지가 함유된 6공 평판배양기(6well microtiter plate)에 사람의 섬유아세포를 10,000세포/well가 되도록 넣고, 세포가 부착한 후 우태아혈청이 없는 DMEM 배지로 갈아주고 70∼80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 다음, 카텝신 G(1mU)와 ISMD 38(0, 0.1, 1, 10μM)을 각각 처리하고, 2일 후 상징액을 취하여 메탈로프로티나제 양적변화를 도 7에서 웨스턴 블럿으로 비교하였다. 이때 카텝신 G와 ISMD를 모두 처리하지 않은 군을 대조군으로 하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, proMMP-1과 active MMP-1의 band에서의 각각의 사이즈(size)가 52와 42로 나타났다.

도 7로부터 카텝신 G만을 처리한 군에서는 카텝신 G를 처리하지 않은 군에 비해 메탈로프로티아제의 발현과 활성 폼(form)이 증가하는 것으로 나타났으며, 이는 카텝신 G가 피부부착단백질을 분해시켜 분해산물인 메탈로프로티아제를 증가시키기 때문이다.

반면, ISMD 38을 처리한 군에서는 카텝신 G을 처리했음에도 불구하고 메탈로프로티아제의 발현과 활성 form이 카텝신 G만을 처리한 군에 비해 모두 줄어든 것을 확인할 수 있다.

[ 시험예 5] 무모생쥐 광노화 동물 모델을 이용한 주름개선 확인

실제 피부 주름개선 효능을 알아보기 위해서 약 7주령의 무모생쥐(SKH-1 female hairless mouse)를 이용하여 도포시험 실시하였다. 하기의 표 4에서와 같이 피부외용제 제형을 제조하여 무모생쥐의 등 부위에 자외선조사와 함께 12주간 도포하였다. 자외선 조사는 격일로, 물질도포는 매일 진행하였고, 이후 모사판(replica) 주름 분석방법을 통해 주름개선 효과를 확인하였다.

도 8에서 R1, R2 R3은 주름의 깊이를 반영하며, R4는 피부의 거칠기를 R5는 얕은 주름의 깊이를 나타낸다. 분석결과 도 8에서 볼 수 있듯이, ISMD 38을 단독으로 사용시 주름개선 효과(R1, R2, R3)가 향상됨을 알 수 있었다.

[표 4]

[ 시험예 6] 노화된 피부세포와 자외선을 조사시킨 피부세포에서 카텝신 G의 활성 변화(a) 및 젊은 피부와 노인 피부에서의 카텝신 G 변화(b)

젊은 세포 및 계대배양을 통해 자연노화(38 계대) 시킨 섬유아세포의 배양액과 자외선을 3번 반복하여 조사한 섬유아세포의 배양액에서 카텝신 G의 활성을 측 정하였다. 각각의 배양액 단백질(80 ㎍)과 카텝신 G의 기질(Suc-AAPF-pNA: 2mM) 및 완충용액(HEPES, pH7.5)을 넣어 반응시킨 후 카텝신 G에 의해 기질의 p-니트로아닐린(pNA)이 떨어지면서 노란색으로 발색반응이 나타나는 405 nM의 흡광도를 측정하여 카텝신 G의 활성을 측정하였다.

또한 사람피부에서 카텝신 G의 양적인 변화를 알아보기 위하여, 젊은이(나이 20대, 3명)의 엉덩이 피부와 나이든 사람(70대, 3명)의 엉덩이 피부를 생검한 후 카텝신 G의 양적인 변화를 카텝신 G 항체를 이용하여 면역형광염색(immunofluoresecence)을 실시하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9의 결과로부터, 노화된 세포와 자외선 조사 세포에서 카텝신 G의 활성이 증가하는 것을 확인하고, 이를 통하여 카텝신 G의 활성을 억제시키는 물질이 항노화 효과가 있음을 알 수 있었다.

도 1 - 노화된 피부에서 카텝신 G활성에 따른 주름살의 증가를 보여주는 그림

도 2 - 시험예 1의 파이브로넥틴의 분해물에 의한 메탈로프로티아제(MMP-1)의 발현양을 나타내는 그래프

도 3 - 시험예 2의 파이브로넥틴의 분해효소를 확인하기 위한 웨스턴블럿

도 4 - 시험예 2의 인체섬유아세포에서 파이브로넥틴의 분해를 확인하기 위한 웨스턴블럿

도 5 - 시험예 2의 인체섬유아세포에서 파이브로넥틴의 분해산물인 메탈로프로티아제의 양적 변화를 나타난 웨스턴블럿

도 6 - 시험예 3의 카텝신 G 활성 억제 정도를 나타내는 그래프

도 7 - 시험예 4의 ISMD 38에 의한 MMP-1 발현 억제 정도를 나타내는 웨스컨블럿

도 8 - 시험예 5의 무모생쥐 광노화 동물 모델을 이용한 주름개선 확인하기 위한 그래프(R1, R2, R3: 주름의 깊이를 반영함,R4: 피부표면의 거칠기를 반영함, R5:는 얕은 주름의 깊이를 반영함)

도 9 - 시험예 6의 노화된 세포와 자외선 조사 세포에서 카텝신 G의 활성이 증가하는 그래프(a) 및 젊은이와 노인 피부에서 카텝신 G의 면역형광 비교 사진(b)

Claims (7)

1. 카텝신 G 저해제를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지용 피부외용제 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 카텝신 G 저해제는 파이브로넥틴(fibronectin)의 분해를 막아 피부세포에서 메탈로프로티아제(metalloproteinase)의 생성을 저해시키는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지용 피부외용제 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 카텝신 G 저해제의 함량은 전체 피부외용제 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지용 피부외용제 조성물.
4. 제 1항에 있어서,

   상기 피부노화 방지용 피부외용제 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화 장수, 영양크림, 에센스, 마사지크림, 아이크림, 팩, 바디로션, 바디크림, 바디오일 또는 바디에센스로부터 선택되는 제형인 것을 특징으로 하는 피부노화 방지용 피부외용제 조성물.
5. 제 1항에 있어서,

   상기 피부노화 방지용 피부외용제 조성물은 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제로부터 선택되는 경피투여용 제형인 것을 특징으로 하는 피부노화 방지용 피부외용제 조성물.
6. 카텝신 G 효소가 존재하는 기질에 항노화 후보물질을 가하여 상기 카텝신 G 효소의 활성 저해 정도를 측정하여 항노화용 물질을 스크리닝하는 방법.
7. 제 6항에 있어서,

   상기 카텝신 G 효소의 활성 저해 정도의 측정은 생성된 메탈로프로티아제의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 항노화용 물질을 스크리닝하는 방법.

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