KR20090042398A - 악티노마이신 d를 유효성분으로 하는 ddr과 콜라겐결합 저해제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 악티노마이신 D를 유효성분으로 하는 DDR과 콜라겐 결합 저해제에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 악티노마이신 D을 DDR 단백질의 과잉 활성에 의해 유발되는 질환을 치료하는 방법에 사용하는 용도에 관한 것이다. DDR의 세포외 도메인은 DDR의 리간드인 콜라겐 단백질과 결합하는 특성이 있으며 악티노마이신 D는 이들 결합을 저해하는 활성이 우수하여 DDR 단백질의 과잉 활성에 의해 유발되는 암, 간경화, 류마티스 질환 또는 동맥경화 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
DDR, 곤충세포, 악티노마이신 D, 티로신 키나아제, 콜라겐
Description
본 발명은 악티노마이신 D를 유효성분으로 하는 디스코이딘 도메인 리셉터(Discoidin Domain Receptor, 이하 'DDR'이라 칭함) 단백질과 콜라겐 결합 저해제에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 악티노마이신 D를 DDR 단백질의 과잉 활성에 의해 유발되는 질환을 치료하는 방법에 사용하는 용도에 관한 것이다.
일반적으로 외부의 자극을 세포가 인지하는 방법 중의 하나는 세포막에 있는 수용체인 티로신 키나아제 단백질류를 통한 인지이다. 수용체 티로신 키나아제는 N-말단의 세포 밖에 노출된 세포외 도메인, 세포막 통과 도메인 및 C-말단 쪽의 세포 내 사이토졸에 노출되는 티로신 키나아제 활성을 가지는 도메인으로 구성되어 있다. 세포외 도메인은 특정 리간드가 결합하는 부분이며 세포 내 도메인은 세포외 도메인에 특정 리간드가 결합하면 그 티로신 키나아제 효소 활성이 활성화되면 서 c-말단 부위에 티로신을 인산화하며 세포 내로 신호를 전달하게 된다. 이러한 기작을 가지고 세포외 자극을 세포 내로 전달하는 티로신 키나아제 활성을 갖는 수용체는 많이 알려져 있다. 대표적인 예로서 EGFR, PDGFR, IR, IGFR, c-fms, VEGFR 등을 들 수 있다.
DDR 패밀리 수용체류 단백질도 이러한 수용체 티로신 키나아제류 중의 하나이다. DDR은 디스코이딘 도메인 리셉터(Discoidin Domain Receptor)의 약어로서 미생물에서 발견된 렉틴에 부착되는 단백질인 디스코이딘과 그 세포외 부위가 유사성이 있는 관계로 그러한 명명이 이루어졌다. 인간 등 동물의 경우 DDR1 형과 DDR2 형의 아미노산 서열상 서로 유사성을 가진 단백질이 각각 다른 유전자에 의해 코딩되면서 존재하는 것으로 알려져 있다. DDR 단백질에 대한 연구는 1997년 그 리간드가 파이버 콜라겐이라는 사실이 처음 밝혀져 주목을 끌기 시작하면서 본격화되고 있다.
한편, DDR 수용체의 필요 이상의 활성화는 여러 인간 질환과 관련이 있는 것으로 발표되고 있다. DDR1이나 DDR2의 과잉발현이 뇌암, 전이성 유방암 등에서 발견되었다. 또한, DDR2 수용체 키나아제의 이상성이 난치성 인간 질병인 간경화증, 류마티즘, 관절염, 동맥경화 등과 연관이 있음이 증명되었다. 현재 간경화 증상 유발의 주원인으로 지목되는 간 조직 내의 간 성상 세포가 활성화되는 과정에서 DDR2의 발현이 증가한다는 결과가 발표되었다. 이는 DDR2의 발현증가가 간 성상 세포의 활성화에 주요 역할을 하며 간 경화의 주요 발병 인자임이 제안되었다. 류마티즘이나 관절염에서 특정 Matrix Metallo Protease(MMP)류 단백질의 증가된 발현 으로 제 2형 콜라겐으로 주로 이루어진 연골 조직을 파괴하는 것으로 알려져 있는데 이때 이들 MMP류 단백질의 발현증가에 DDR2의 발현증가가 기여함이 알려져 있다. 동맥경화의 주요 원인인 혈관에 있는 평활근 세포의 증식과 주위 콜라겐 축적에 DDR 패밀리 단백질이 관여함도 알려져 있다.
상기 기재된 사실로부터 특이적으로 DDR 패밀리 활성을 저해하는 물질은 암, 간경화, 관절염, 동맥경화의 치료제 등으로 유용하게 활용될 수 있다고 유추된다.
이에 본 발명자는 악티노마이신 D가 DDR 단백질과 콜라겐의 결합을 저해하여 DDR 활성을 방해함으로써 DDR 과잉 활성에 의한 질환 치료제의 유효성분으로 사용될 수 있다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 DDR 패밀리 단백질의 과잉 활성을 저해하는 악티노마이신 D의 새로운 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 목적은 악티노마이신 D를 유효성분으로 하는 디스코이딘 도메인 리셉터(DDR) 단백질과 콜라겐 결합 저해제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 악티노마이신 D와 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 DDR 단백질 과잉 활성과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식(1)의 악티노마이신 D를 유효성분으로 하는 디스코이딘 도메인 리셉터(DDR) 단백질과 콜라겐 결합 저해제를 제공한다.
화학식(1)
악티노마이신(Actinomycin)은 최초의 안트라사이클린 계열 항생물질이다. 악 티노마이신 A, C, D형이 있으며 A형과 C형은 심한 독성으로 현재는 사용하지 않고 악티노마이신 D만이 상품화되어 닥티노마이신(Dactinomycin)이라는 이름으로 사용된다. 닥티노마이신은 현재까지 사용된 안트라사이클린 항생물질 중 가장 오래된 것이다. 안트라사이클린(Anthracycline, 안트라시클린)은 화학요법의 분류 중 항생물질의 주류를 이루고 있는 화합물들을 포함하는 하나의 부문으로 광범위한 암의 치료와 증상의 완화를 위해 사용된다. 그의 작용기전은 세포의 DNA/RNA 염기쌍 가닥을 손상시킴으로서 세포의 분열을 근본적으로 차단하는 것으로, 암세포처럼 그 과정이 활발한 세포일수록 더 큰 피해를 받는다.
한편, 본 발명에서는 1,500개의 약물을 모아놓은 화합물 라이브러리에서 DDR2와 콜라겐의 결합을 방해하는 물질을 하기 검색 방법으로 검색하던 중 악티노마이신 D 화합물이 이들 결합을 방해하는 것을 처음으로 발견하였다.
먼저, 제 1형 콜라겐으로 코팅된 96웰 배양접시나 ELISA 플레이트를 100 ul의 세포 배양액에 있는 100만개의 DDR2를 발현하는 배큘로 바이러스로 3일간 감염시킨 sf9 세포를 200 uM의 라이브러리 화합물과 같이 동시에 가한 후 이 배양접시를 약 1시간 정도 약하게 흔들어 준다. 여기에 100 ul의 포르말린 용액을 가하여 세포를 픽싱한다. 부착되지 않은 세포와 배양액을 물로 씻어낸 후 부착된 세포를 SRB(sulfo-rhodamine B)로 염색하고 염색된 SRB를 용출하여 흡광도를 측정하여 부착된 세포의 양을 정량하여 부착된 세포의 양을 줄이는 후보 화합물을 선별하였다. 이 선별된 화합물이 실지로 DDR2와 콜라겐과의 결합 저해에 특이적으로 작용하는지를 확인하기 위하여 바이러스를 감염시키지 않아서 배양접시 표면에 잘 부착되는 성질을 가지고 있는 sf9 세포에 이 화합물 처리 시 배양접시 표면에 부착되는 성질의 변화가 생기는지를 관찰하여 바이러스를 감염하지 않은 sf9 세포가 배양접시 표면에 부착되는 것을 저해하지 않는 화합물을 다시 선별하였다.
상기 검색방법으로 본 발명에서는 악티노마이신 D 화합물을 발굴하였다. 악티노마이신 D는 DDR2를 발현하는 곤충세포의 콜라겐으로 코팅된 표면에 부착은 IC50 = 20 uM 정도로 저해하였지만 대조군으로 DDR1b를 발현하는 곤충세포의 제 1형 콜라겐으로 코팅된 표면에의 부착은 거의 저해하지 않았고 동시에 바이러스를 감염하지 않은 sf9 세포가 배양접시 표면에 부착되는 것도 저해하지 않았다(도 7 참조).
실제로 본 발명에서 기술한 검색법으로 발굴한 악티노마이신 D가 제 1형 콜라겐에 의한 DDR2 활성화를 동물세포에서도 저해하는지 알기 위하여 DDR2를 발현하는 HEK293 세포를 제 1형 콜라겐이 코팅된 배양접시에 플레이팅 한 후 악티노마이신 D를 농도를 바꾸어가며 처리하여 DDR2가 활성화되면서 증가하는 티로신 인산화가 감소하는지를 살펴 본 결과, 악티노마이신 D 농도 20 uM 정도에서 약 50% 정도 그 인산화 증가를 저해하였다(도 8 참조). 반면에 악티노마이신 D는 또 다른 수용체 티로신 키나아제인 EGFR이나 인슐린 수용체의 리간드에 의한 활성화에는 100 uM의 고 농도 처리에도 영향을 미치지 않았다(도 9 및 10 참조). 이 사실은 동물세포에서도 본 검색법에 의해 발굴된 DDR2-콜라겐 결합 저해제인 악티노마이신 D가 특이적으로 리간드 콜라겐에 의한 DDR2 활성화를 저해함을 증명한다.
또한, 본 발명은 악티노마이신 D와 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 DDR 단백질 과잉 활성과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르는 약학 조성물은 통상적인 방법에 의하여 정제, 캡셀제, 산제, 과립제, 현탁액, 유화액 또는 비경구투여용 제제와 같은 단위투여형 또는 수회투여형 제제로 제형화할 수 있다.
본 발명에 따르는 악티노마이신 D의 1일 투여량은 성인 체중 1 kg당 3-8 mg이나, 사용될 특정 화합물, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 악티노마이신 D는 DDR 단백질과 콜라겐 결합을 저해하는 것으로 나타나는데, 이는 DDR 단백질의 과잉 발현으로 유도된 질환을 치료하는 것과 관련되어 있으므로 악티노마이신 D는 암, 간경화, 류마티스성 관절염 또는 동맥경화와 같은 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 세포 배양
곤충세포 Spodoptera frugoperda SF9 세포(클론텍사)는 TNM-FH 곤충세포배지(시그마 사)에 10% FBS, 50 ug/ml 겐타마이신 및 2 mM 글루타민을 첨가하여 27℃에서 배양접시 표면에 부착된 상태로 배양하였다. HEK293 세포 (ATCC에서 구입)는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium) 동물세포 배양배지에 10% FBS 및 150 ug/ml 페니실린-스트렙토마이신(Gibco-BRL)을 첨가 후 5% 이산화탄소상에서 37℃에서 동물세포 배양기에서 배양하였다. DDR2, 인슐린 수용체 또는 EGFR을 발현하는 HEK 293 세포는 각각의 전장 c-DNA를 인비트로젠사에서 구입한 pcDNA 3.1 벡터에 클로닝한 발현 벡터를 트랜스펙션하여 안정적으로 발현하는 콜로니를 선별하여 만든 세포주를 사용하였으며 이들 세포배양은 HEK293 세포와 동일하게 배양하였다.
<실시예 2> 배큘로 바이러스 발현 벡터 및 배큘로 바이러스 제조
배큘로 바이러스 발현 벡터는 pBacPAK8 벡터(클론텍사)를 이용하였다. 전장 인간 DDR2 cDNA(NCBI Gene Bank accession number: BC 052998, 서열번호 1)를 포함하는 5'-말단이 XhoⅠ 제한효소 절단부위이고 3' 말단이 EcoRⅠ 제한효소 절단부위를 가진 DNA 조각을 pBacPAK8 벡터의 멀티플 클로닝 사이트에 클로닝하였다.
DDR2의 세포외 부위 및 세포막 통과 부위를 포함하는 도메인(아미노산 1-440, 서열번호 2)과 인슐린 수용체의 세포질 노출 부위인 티로신 키나아제 부위를 포함하는 도메인(서열번호 3)을 융합한 키메라 단백질의 곤충세포 발현벡터는 인간 인슐린 수용체 유전자 중 세포질에 노출된 티로신 키나아제 활성 도메인를 포함하는 유전자 절편을 주형으로하여 5′ 프라이머: GGCCATGGGTGTTTCCATGCTCTGTG(서열번호 5) 및 3' 프라이머: GGGAATTCTTAGGAAGGATTGGACCG(서열번호 6)를 이용하여 5' 쪽에 NcoⅠ, 3′쪽에 EcoRⅠ 제한효소 절단 부위를 가지는 DNA 절편을 100℃ 1분, 48℃ 1분, 63℃ 1분의 조건으로 30 사이클로 PCR 증폭 후 이를 Nco I, Eco RⅠ 제한 효소로 동시에 절단한 후 이를 상기에 언급한 pBacPAK8 벡터에 전장 DDR2 c-DNA를 클로닝한 벡터에서 DDR2 cDNA의 3' 말단에 있는 NcoI과 EcoRⅠ으로 잘리는 DNA 절단 조각을 제거하고 여기에 대신 삽입하여 클로닝하였다.
또한, 사람의 DDR2 cDNA 중 아미노산 441부터 855에 해당되는 부분(서열번호 4)을 상기 전장 인간 DDR2 cDNA를 주형으로 하여 5' 프라이머; GG GGATCCACAGTCAGCCTTTCCCTG(서열번호 7) 및 3' 프라이머: GGGAATTCTCACTCGTCGCCTTGTT(서열번호 8)을 이용하여 100℃ 1분, 48℃ 1분, 63℃ 1분의 조건으로 30 사이클로 PCR 증폭하여 이를 BamHⅠ, EcoRⅠ 제한효소로 동시 절단 후 이를 곤충세포 발현 벡터인 pBacPak8에 이미 클로닝된 글루타치온-S-전이효소(GST) 유전자 3′부위의 BamHⅠ 사이트에 융합시켜 GST에 융합된 DDR2의 c-말단 세포질 노출 티로신 키나아제 도메인을 발현하는 벡터를 클로닝하였다. 이들 발현벡터 DNA를 이용하여 배큘로 바이러스 제조키트(클론텍사)를 사용하여 배큘로 바이러스를 제조하였다.
<
실시예
3>
배큘로
바이러스 감염 및 단백질 발현
배큘로 바이러스 타이터가 CFU(colony forming unit) 값이 108/ml 이상이 되도록 배큘로 바이러스를 sf9 세포에 연속 감염하여 증폭하여 사용한다. 배큘로 바이러스를 sf9 곤충세포에서 MOI 10으로 감염시켜 단백질을 발현한다. sf9 곤충세포는 실시예 1에서와 같이 배양접시에 부착된 상태로 배양한다. 배큘로 바이러스 감염 후 하루나 이틀까지는 배양접시에 붙어있지만 2-3일 후에는 배양 접시에서 떨어진다.
<
실시예
4> 항체 및
웨스턴
블롯팅
곤충세포에서 발현된 DDR2 단백질을 인식하는 항체는 세포외 도메인에 위치한 아미노산 292-399 부위를 인식하는 항체인 폴리크로날 항-DDR2 토끼 IgG 항체인 H-108 항체(산타크루즈사)를 사용하였다. HEK293 세포에서 발현된 DDR2를 인식하기 위해서는 R&D systems사에서 구매한 인간 DDR2의 세포외 도메인을 인식하는 항-DDR2 염소 IgG 항체를 사용하였다. 인슐린 수용체를 인식하는 항체는 산타크루즈사에서 구입한 인슐린 수용체 c-말단을 인식하는 항체인 모노크로날 항-인슐린 수용체 마우스 IgG 항체인 CT-3 항체를 사용하였다. EGFR을 인식하는 항체는 산타크루즈사에서 구입한 인간 EGFR의 c-말단을 인식하는 폴리크로날 항-EGFR 염소 IgG 항체를 사용하였다. 인산화된 티로신을 인식하는 항체는 셀 시그날링 테크놀로지사에서 구입한 단백질내의 인산화된 티로신을 인식하는 모노크로날 항-포스포 티로신 마우스 IgG 항체인 P-Tyr-100 항체를 사용하였다. 단백질이 발현된 세포를 1× 램리 용액에서 2분간 끓여서 세포 파쇄액을 만든다. 이를 10% SDS-폴리 아크릴 아마이드 젤에서 전기 영동하여 분리 후 분리된 단백질을 Immobilon-P 멤브레인(밀리포어사)에 옮긴다. 멤브레인을 10% 스킨 밀크를 넣은 1×TBS 용액에서 1 시간 이상 담근 후 여기에 각 항체를 1:1000으로 묽힌 상태에서 처리 후 1시간 더 적당히 흔들어 주면서 방치한다. 이 후에 1×TBS 용액으로 5번 세척 후 HRP가 붙어있는 2차 항체인 항 염소 IgG 혹은 항 마우스 IgG, 혹은 항 토끼 IgG(시그마사)를 사용한 1차 항체를 만든 숙주 동물의 종류에 맞게 각각 1시간 처리하고 이를 다시 세척 후 케미루미니슨스 방법으로 멤브레인에 부착된 항체의 신호를 확인한다.
도 1에서 보는 바와 같이 DDR2 혹은 DDR2의 c-말단 세포질 노출 도메인(DDR2-C)만을 발현하는 sf9 곤충세포 파쇄액과 DDR2를 발현하는 HEK293 세포의 파쇄액을 각각 SDS-폴리아크릴아마이드젤에서 전기영동 후 DDR2의 N-말단 부위를 인식하는 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅한 결과, 곤충세포에서 발현되는 DDR2와 동물세포에서 발현한 DDR2가 서로 분자량에 차이가 없음을 확인하였다.
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실시예
5> 발현된 단백질의
세포내
위치
DDR2, DDR2의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단 세포질 노출 도메인(DDR2-C) 또는 DDR2의 세포외 도메인과 인슐린 수용체의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단을 융합한 키메라 단백질(DDR2-E/IR-C)이 발현하도록 코딩된 배큘로 바이러스를 하루나 이틀간 sf9 세포에 감염시킨 후 감염된 sf9 세포가 여전히 배양 슬라이드에 부착되어 있을 때 1% 포르말린으로 고정시킨 후 PBS에 녹인 0.25% 의 트리톤 X-100 용액을 30분간 처리하여 세포막을 통과성을 가지게 하거나 혹은 처리하지 않은 상태에서 PBS에 녹인 1% BSA 용액을 처리하여 곤충세포가 고정된 배양 슬라이드를 3 시간 블록킹한 후 상기에 언급한 DDR2의 N-말단을 인식하는 항체인 H-108 항체를(산타크루주사)를 1 시간 처리하였다. 이를 PBS로 3번 씻어낸 후 산타크루즈사에서 구입한 FITC가 융합된 토끼 IgG을 인식하는 항-IgG1 염소 IgG 항체를 45분간 처리한다. 마지막으로 시료를 PBS로 씻어낸 후 발현된 단백질의 세포내 위치를 콘포칼 형광 현미경으로 영상화하였다.
그 결과 세포막 통과성을 가지게 하거나 혹은 그렇지 않은 경우에 차이가 없이 DDR2의 N-말단을 인식하는 항체가 발현된 DDR2 혹은 DDR2-E/IR-C를 세포막에서 같은 세기로 표식하는 것을 확인하였으며 이는 발현된 DDR2 혹은 DDR2-E/IR-C가 세포막에 존재하고 N-말단이 세포 밖으로 나오게끔 위치함을 보여주는 것이다(도 2).
<
실시예
6>
DDR2
발현 곤충세포의 콜라겐 코팅 표면 결합 에세이
세포 배양용 96 웰 플레이트나 ELISA 용으로 단백질 부착이 잘 되도록 표면을 개질한 96 웰 플레이트의 각 웰에 100-200 ug/ml 정도로 제 1형 콜라겐이나 다른 세포외 기질 단백질을 녹인 용액을 1시간 정도 가한 후 이를 PBS로 2번 세척하여 표면을 세포외 기질 단백질로 코팅한다. 콜라겐류 단백질은 0.01N 아세트산 용액에, 나머지 세포외 기질 단백질은 PBS에 녹여서 사용한다. 배양접시 바닥에 붙어 자라거나 서스펜션 배양중인 sf9 세포에 발현하고자하는 단백질을 코딩하는 배큘로 바이러스를 MOI 10으로 3일 정도 감염한다. 이때 sf9 세포는 감염된 배큘로 바이러스가 코딩하는 단백질을 발현하면서 동시에 배양접시에 붙는 성질을 잃어버린다. 감염된 sf9 곤충 세포를 형광물질로 표식하고자 표면에 바이오틴을 붙이기 위해 약 천 만개의 세포를 5 ml의 PBS 용액에 현탁시킨 후 2 mM 농도로 sulfo-NHS-biotinin(피어스사)을 넣었다. 이를 30 분간 실온에서 반응한 후 세포를 1,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 수집 후 100 mM 글리신을 포함하는 PBS를 가하여 원심 분리하면서 세척하여 반응하지 않은 sulfo-NHS-biotinin을 제거하였다. 세척된 세포를 5 ml PBS에 현탁시킨 후 아비딘(Quantum dot corporation)으로 코팅된 Q dot 655 용액 20 ul를 가하여 상온에서 30분간 방치하였다. 이 후 세포를 다시 원심분리하고 PBS로 3번 이상 세척하여 반응하지 않은 Q dot 655를 제거한 후 10% FBS를 포함하는 5 ml TMN-FH 배지에 세포를 현탁시킨다. 이렇게 Q-dot으로 형광 표식된 sf9 세포 100 ul를 세포외 기질 단백질로 코팅된 96 웰 플레이트에 가하여 1 시간을 방치한 후 코팅된 웰에 부착되지 않은 sf9 세포를 조심스럽게 피펫팅으로 제거 후 웰을 3번 부드럽게 PBS로 세척한다. 코팅된 표면에 부착된 세포를 형광 현미경으로 관찰하면서 부착된 세포 사진을 찍는다.
DDR2, DDR2의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단 세포질 노출 부위(DDR2-C) 또는 DDR2 세포외 노출 부위와 인슐린 수용체의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단을 융합한 키메라 단백질(DDR2-E/IR-C)을 발현하는 곤충세포의 표면을 Q dot으로 표식 후 제 1형 콜라겐으로 코팅한 배양플레이트에 넣고 부착시킨 후 부착되지 않은 세포를 세척 후 형광현미경으로 영상화하였다.
그 결과 DDR2와 DDR2 세포외 노출 부위와 인슐린 수용체의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단을 융합한 키메라 단백질(DDR2-E/IR-C)과 같이 콜라겐과 결합할 수 있는 DDR2의 N-말단 도메인을 가진 단백질이 곤충세포의 세포막에 발현되면 콜라겐이 코팅된 표면에 부착되는 성질을 가짐을 확인하였다(도 3).
또 다른 에세이 방법으로 배큘로 바이러스로 3일간 감염시킨 곤충세포를 형광물질 등으로 표식하지 않고 곧 바로 세포외 기질로 코팅된 96 웰 플레이트에 가하여 1시간을 방치한 후 동일한 부피의 포르말린 용액을 가하여 코팅된 표면에 부착된 세포를 고정한다. 이때 부착되지 않은 세포는 파괴된다. 세포가 고정된 웰을 물로 여러 번 씻은 후 1% 아세트산 용액에 녹인 0.1 % SRB(sulfo-rhodamine B, 시그마사) 용액을 가하여 세포를 염색 후 1% 아세트산 용액으로 씻어낸 후 말린다. SRB로 염색된 세포를 광학현미경 하에서 사진을 찍는다. 세포에 침착된 SRB를 각 96 웰 플레이트의 각 웰에 100 ul의 0.1M Tris-HCl(pH 8.0) 용액을 가하여 10분간 흔들어 우려낸 후 520 nM에서 흡광도를 측정하여 정량한다. 이때 흡광도는 고정된 세포 수에 비례한다.
도 4는 상기 에세이 방법으로 DDR2와 DDR2 세포외 노출 부위와 인슐린 수용체의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단을 융합한 키메라 단백질(DDR2-E/IR-C)과 같이 콜라겐과 결합할 수 있는 DDR2의 N-말단 도메인을 가진 단백질을 발현하는 곤충세포가 콜라겐이 코팅된 표면에 부착되고 포르말린으로 콜라겐이 코팅된 표면에 고정할 수 있음을 확인한 결과이다.
도 5는 상기 에세이 방법으로 세포에 염색된 SRB를 1% 아세트산 용액으로 추출하여 520 nM에서 흡광도를 측정하여 부착된 세포의 상대적인 숫자를 정량한 결과 를 나타내는 것이다. 평균값과 표준 편차를 막대그래프로 표시하였으며 흰색막대는 제 1형 콜라겐이 코팅된 표면에 세포가 부착된 것이며 검은 색 막대는 코팅되지 않은 표면에 세포를 부착시킨 것으로 DDR2의 N-말단 도메인을 가진 단백질을 발현하는 곤충세포가 콜라겐이 코팅된 표면에 부착되는 것을 확인할 수 있다.
<
실시예
7>
세포외
기질 단백질과
DDR2
단백질과의 결합 측정
젤라틴, 파이브로넥틴, 라미닌 및 제 1형, 제 2형, 제 3형 콜라겐과 같은 세포외 기질 단백질을 배양접시 표면에 코팅 후 DDR2를 발현하거나 혹은 DDR2의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단 세포질 노출 부위만을 발현하는 sf9 세포를 부착시킨 후 부착된 세포를 포르말린으로 고정하고 이를 SRB로 염색한 후 염색된 SRB를 추출하여 520 nM에서 흡광도를 측정하여 부착된 세포수를 상대적으로 측정하였다.
그 결과 도 6에서 보는 바와 같이 DDR2의 리간드로 알려진 제 1형, 제 2형, 제 3형 콜라겐으로 코팅된 표면에만 유의성 있게 DDR2를 발현하는 sf9 곤충세포가 부착됨을 보여줌으로써 DDR2를 발현하는 sf9 세포와 콜라겐으로 코팅된 표면사이의 부착력은 DDR2의 세포외 도메인과 코팅된 콜라겐 분자 사이의 결합에 의한 것임을 확인시켜준 것이다.
<
시험예
1>
DDR
단백질과 콜라겐 결합을 저해하는 화합물 검색
상기 실시예에서 제시한 DDR2와 콜라겐 결합을 저해하는 물질의 검색법을 이 용하여 1,500개의 약물을 모아놓은 화합물 라이브러리에서 이들 결합을 저해하는 물질을 선별하였다.
먼저 제 1형 콜라겐으로 코팅된 96웰 배양접시나 ELISA 플레이트를 100 ul의 세포 배양액에 있는 100만개의 DDR2를 발현하는 배큘로 바이러스로 3일간 감염시킨 sf9 세포를 200 uM의 라이브러리 화합물과 동시에 가한 후 이 배양접시를 약 1시간 정도 약하게 흔들어 준다. 여기에 100 ul의 포르말린 용액을 가하여 세포를 고정한다. 부착되지 않은 세포와 배양액을 물로 씻어낸 후 부착된 세포를 SRB로 염색하고 염색된 SRB를 용출하여 흡광도를 측정하여 부착된 세포의 양을 정량하여 부착된 세포의 양을 줄이는 후보 화합물을 선별하였다. 이 선별된 화합물이 실지로 DDR2와 콜라겐과의 결합 저해에 특이적으로 작용하는지를 확인하기 위하여 바이러스를 감염시키지 않아서 배양접시 표면에 잘 부착되는 성질을 가지고 있는 sf9 세포에 이 화합물 처리 시 배양접시 표면에 부착되는 성질의 변화가 생기는지를 관찰하여 바이러스를 감염하지 않은 sf9 세포가 배양접시표면에 부착되는 것을 저해하지 않는 화합물을 다시 선별하였다.
상기 검색방법으로 본 발명에서는 악티노마이신 D 화합물을 발굴하였다. 악티노마이신 D는 DDR2를 발현하는 곤충세포의 콜라겐으로 코팅된 표면에 부착은 IC50= 20 uM 정도로 저해하였지만 대조군으로 전장 DDR1b를 발현하도록 한 곤충세포가 제 1형 콜라겐으로 코팅된 표면에 부착되는 것은 거의 저해하지 않았고 동시에 바이러스를 감염하지 않은 sf9 세포가 배양접시 표면에 부착되는 것도 저해하지 않았다(도 7).
실지로 본 발명에서 기술한 검색법으로 발굴한 악티노마이신 D가 제 1형 콜라겐에 의한 DDR2 활성화를 동물세포에서도 저해하는지 알기 위하여 DDR2를 발현하는 HEK293 세포를 제 1형 콜라겐이 코팅된 배양접시에 플레이팅 한 후 악티노마이신 D를 농도를 바꾸어가며 처리하여 DDR2가 콜라겐에 의해 활성화되면서 증가하는 티로신 인산화가 감소하는지를 살펴 본 결과, 악티노마이신 D 농도 20 uM 정도에서 약 50% 정도 그 인산화 증가를 저해하였다(도 8).
반면에 악티노마이신 D는 또 다른 세포막 수용체 티로신 키나아제인 EGFR이나 인슐린 수용체가 그 리간드에 의해 활성화되는 것에는 100 uM의 고농도 처리에도 영향을 미치지 않았다.
즉, 도 9는 배양 접시에 EGFR을 발현하는 HEK293 세포를 플레이팅 후 EGF와 악티노마이신 D를 농도별로 처리한 후 세포 파쇄액을 만들어 SDS-PAGE에서 전기영동 후 인산화 티로신을 특이적으로 인식하는 항체와 EGFR을 인식하는 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅한 결과로서 EGFR이 EGF에 의해 활성화되어 티로신 인산화되는 것을 악티노마이신 D가 방해하지 않음을 보여준다.
또한, 도 10은 배양 접시에 인슐린 수용체를 발현하는 HEK293 세포를 플레이팅하고 인슐린과 악티노마이신 D를 농도별로 처리한 후 세포 파쇄액을 만들어 SDS-PAGE에서 전기영동 후 인산화 티로신을 특이적으로 인식하는 항체와 인슐린 수용체를 인식하는 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅한 결과로서 인슐린 수용체가 인슐린에 의해 활성화되어 티로신 인산화되는 것을 악티노마이신 D가 방해하지 않음을 보여 준다.
상기 결과는 동물세포에서도 본 검색법에 의해 발굴된 DDR2-콜라겐 결합 저해제인 악티노마이신 D가 특이적으로 리간드 콜라겐에 의한 DDR2 활성화를 저해함을 증명한다.
도 1은 DDR2 또는 DDR2의 c-말단 세포질 노출 도메인(DDR2-C)만을 발현하는 sf9 곤충세포 파쇄액과 DDR2를 발현하는 HEK293 세포의 파쇄액을 각각 SDS-폴리아크릴아마이드젤에서 전기영동 후 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 DDR2, DDR2의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단 세포질 노출 도메인(DDR2-C) 또는 DDR2의 세포외 도메인과 인슐린 수용체의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단을 융합한 키메라 단백질(DDR2-E/IR-C)의 sf9 세포내 위치를 콘포칼 형광 현미경으로 영상화한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 DDR2, DDR2의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단 세포질 노출 부위(DDR2-C) 또는 DDR2 세포외 노출 부위와 인슐린 수용체의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단을 융합한 키메라 단백질(DDR2-E/IR-C)를 발현하는 곤충세포의 표면을 Q dot으로 표식 후 제 1형 콜라겐으로 코팅한 배양플레이트에 부착한 세포를 형광현미경으로 영상화한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 발현한 곤충세포를 형광 표식 없이 바로 제 1형 콜라겐으로 코팅한 배양 플레이트에 넣고 부착된 세포를 픽싱하고 SRB로 염색 후 광학현미경하에서 찍은 사진을 나타내는 도면이다.
도 5는 도 4에서 픽싱된 세포에 염색된 SRB를 용매로 추출하여 520 nM에서 흡광도를 측정하여 부착된 세포의 상대적인 숫자를 정량한 결과로서 평균값과 표준 편차를 막대 그래프로 표시한 것이다.
도 6은 여러 종류의 세포외 기질 단백질을 배양접시 표면에 코팅 후 DDR2를 발현하거나(흰색 막대) 혹은 DDR2의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단 세포질 노출 부위만을 발현하는(검은색 막대) sf9 세포를 부착시킨 후 부착된 세포의 흡광도를 측정하여 부착된 세포수를 상대적으로 측정한 결과이다.
도 7은 악티노마이신 D가 DDR2와 콜라겐 결합을 특이적으로 저해하고 있음을 보여주는 도면이다.
도 8은 DDR2가 콜라겐에 의해 활성화되어 티로신 인산화되는 것을 악티노마이신 D가 방해하는 것을 보여주는 도면이다.
도 9는 EGFR이 EGF에 의해 활성화되어 티로신 인산화되는 것을 악티노마이신 D가 방해하지 않음을 보여주는 도면이다.
도 10은 인슐린 수용체가 인슐린에 의해 활성화되어 티로신 인산화되는 것을 악티노마이신 D가 방해하지 않음을 보여주는 도면이다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
<120> The inhibitor on the binding of DDR proteins to collgens
comprising an actinomycin D as an effective compound
<130> 7p-10-21
<160> 8
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 2567
<212> DNA
<213> DDR2 cDNA
<400> 1
atgatcctga ttcccagaat gctcttggtg ctgttcctgc tgctgcctat cttgagttct 60
gcaaaagctc aggttaatcc agctatatgc cgctatcctc tgggcatgtc aggaggccag 120
attccagatg aggacatcac agcttccagt cagtggtcag agtccacagc tgccaaatat 180
ggaaggctgg actcagaaga aggggatgga gcctggtgcc ctgagattcc agtggaacct 240
gatgacctga aggagtttct gcagattgac ttgcacaccc tccattttat cactctggtg 300
gggacccagg ggcgccatgc aggaggtcat ggcatcgagt ttgcccccat gtacaagatc 360
aattacagtc gggatggcac tcgctggatc tcttggcgga accgtcatgg gaaacaggtg 420
ctggatggaa atagtaaccc ctatgacatt ttcctaaagg acttggagcc gcccattgta 480
gccagatttg tccggttcat tccagtcacc gaccactcca tgaatgtgtg tatgagagtg 540
gagctttacg gctgtgtctg gctagatggc ttggtgtctt acaatgctcc agctgggcag 600
cagtttgtac tccctggagg ttccatcatt tatctgaatg attctgtcta tgatggagct 660
gttggataca gcatgacaga agggctaggc caattgaccg atggtgtgtc tggcctggac 720
gatttcaccc agacccatga ataccacgtg tggcccggct atgactatgt gggctggcgg 780
aacgagagtg ccaccaatgg ctacattgag atcatgtttg aatttgaccg catcaggaat 840
ttcactacca tgaaggtcca ctgcaacaac atgtttgcta aaggtgtgaa gatctttaag 900
gaggtacagt gctacttccg ctctgaagcc agtgagtggg aacctaatgc catttccttc 960
ccccttgtcc tggatgacgt caaccccagt gctcggtttg tcacggtgcc tctccaccac 1020
cgaatggcca gtgccatcaa gtgtcaatac cattttgcag atacctggat gatgttcagt 1080
gagatcacct tccaatcaga tgctgcaatg tacaacaact ctgaagccct gcccacctct 1140
cctatggcac ccacaaccta tgatccaatg cttaaagttg atgacagcaa cactcggatc 1200
ctgattggct gcttggtggc catcatcttt atcctcctgg ccatcattgt catcatcctc 1260
tggaggcagt tctggcagaa aatgctggag aaggcttctc ggaggatgct ggatgatgaa 1320
atgacagtca gcctttccct gccaagtgat tctagcatgt tcaacaataa ccgctcctca 1380
tcacctagtg aacaagggtc caactcgact tacgatcgca tctttcccct tcgccctgac 1440
taccaggagc catccaggct gatacgaaaa ctcccagaat ttgctccagg ggaggaggag 1500
tcaggctgca gcggtgttgt gaagccagtc cagcccagtg gccctgaggg ggtgccccac 1560
tatgcagagg ctgacatagt gaacctccaa ggagtgacag gaggcaacac atactcagtg 1620
cctgccgtca ccatggacct gctctcagga aaagatgtgg ctgtggagga gttccccagg 1680
aaactcctaa ctttcaaaga gaagctggga gaaggacagt ttggggaggt tcatctctgt 1740
gaagtggagg gaatggaaaa attcaaagac aaagattttg ccctagatgt cagtgccaac 1800
cagcctgtcc tggtggctgt gaaaatgctc cgagcagatg ccaacaagaa tgccaggaat 1860
gattttctta aggagataaa gatcatgtct cggctcaagg acccaaacat catccatcta 1920
ttagctgtgt gtatcactga tgaccctctc tgtatgatca ctgaatacat ggagaatgga 1980
gatctcaatc agtttctttc ccgccacgag ccccctaatt cttcctccag cgatgtacgc 2040
actgtcagtt acaccaatct gaagtttatg gctacccaaa ttgcctctgg catgaagtac 2100
ctttcctctc ttaattttgt tcaccgagat ctggccacac gaaactgttt agtgggtaag 2160
aactacacaa tcaagatagc tgactttgga atgagcagga acctgtacag tggtgactat 2220
taccggatcc agggccgggc agtgctccct atccgctgga tgtcttggga gagtatcttg 2280
ctgggcaagt tcactacagc aagtgatgtg tgggcctttg gggttacttt gtgggagact 2340
ttcacctttt gtcaagaaca gccctattcc cagctgtcag atgaacaggt tattgagaat 2400
actggagagt tcttccgaga ccaagggagg cagacttacc tccctcaacc agccatttgt 2460
cctgactctg tgtataagct gatgctcagc tgctggagaa gagatacgaa gaaccgtccc 2520
tcattccaag aaatccacct tctgctcctt caacaaggcg acgagtg 2567
<210> 2
<211> 440
<212> PRT
<213> Domain containing extracellular and transmembrane region of DDR2
<400> 2
Met Ile Leu Ile Pro Arg Met Leu Leu Val Leu Phe Leu Leu Leu Pro
1 5 10 15
Ile Leu Ser Ser Ala Lys Ala Gln Val Asn Pro Ala Ile Cys Arg Tyr
20 25 30
Pro Leu Gly Met Ser Gly Gly Gln Ile Pro Asp Glu Asp Ile Thr Ala
35 40 45
Ser Ser Gln Trp Ser Glu Ser Thr Ala Ala Lys Tyr Gly Arg Leu Asp
50 55 60
Ser Glu Glu Gly Asp Gly Ala Trp Cys Pro Glu Ile Pro Val Glu Pro
65 70 75 80
Asp Asp Leu Lys Glu Phe Leu Gln Ile Asp Leu His Thr Leu His Phe
85 90 95
Ile Thr Leu Val Gly Thr Gln Gly Arg His Ala Gly Gly His Gly Ile
100 105 110
Glu Phe Ala Pro Met Tyr Lys Ile Asn Tyr Ser Arg Asp Gly Thr Arg
115 120 125
Trp Ile Ser Trp Arg Asn Arg His Gly Lys Gln Val Leu Asp Gly Asn
130 135 140
Ser Asn Pro Tyr Asp Ile Phe Leu Lys Asp Leu Glu Pro Pro Ile Val
145 150 155 160
Ala Arg Phe Val Arg Phe Ile Pro Val Thr Asp His Ser Met Asn Val
165 170 175
Cys Met Arg Val Glu Leu Tyr Gly Cys Val Trp Leu Asp Gly Leu Val
180 185 190
Ser Tyr Asn Ala Pro Ala Gly Gln Gln Phe Val Leu Pro Gly Gly Ser
195 200 205
Ile Ile Tyr Leu Asn Asp Ser Val Tyr Asp Gly Ala Val Gly Tyr Ser
210 215 220
Met Thr Glu Gly Leu Gly Gln Leu Thr Asp Gly Val Ser Gly Leu Asp
225 230 235 240
Asp Phe Thr Gln Thr His Glu Tyr His Val Trp Pro Gly Tyr Asp Tyr
245 250 255
Val Gly Trp Arg Asn Glu Ser Ala Thr Asn Gly Tyr Ile Glu Ile Met
260 265 270
Phe Glu Phe Asp Arg Ile Arg Asn Phe Thr Thr Met Lys Val His Cys
275 280 285
Asn Asn Met Phe Ala Lys Gly Val Lys Ile Phe Lys Glu Val Gln Cys
290 295 300
Tyr Phe Arg Ser Glu Ala Ser Glu Trp Glu Pro Asn Ala Ile Ser Phe
305 310 315 320
Pro Leu Val Leu Asp Asp Val Asn Pro Ser Ala Arg Phe Val Thr Val
325 330 335
Pro Leu His His Arg Met Ala Ser Ala Ile Lys Cys Gln Tyr His Phe
340 345 350
Ala Asp Thr Trp Met Met Phe Ser Glu Ile Thr Phe Gln Ser Asp Ala
355 360 365
Ala Met Tyr Asn Asn Ser Glu Ala Leu Pro Thr Ser Pro Met Ala Pro
370 375 380
Thr Thr Tyr Asp Pro Met Leu Lys Val Asp Asp Ser Asn Thr Arg Ile
385 390 395 400
Leu Ile Gly Cys Leu Val Ala Ile Ile Phe Ile Leu Leu Ala Ile Ile
405 410 415
Val Ile Ile Leu Trp Arg Gln Phe Trp Gln Lys Met Leu Glu Lys Ala
420 425 430
Ser Arg Arg Met Leu Asp Asp Glu
435 440
<210> 3
<211> 378
<212> PRT
<213> Tyrosine kinase activation domain of Insuline Receptor
<400> 3
Val Phe Pro Cys Ser Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp Glu Val Ser Arg
1 5 10 15
Glu Lys Ile Thr Leu Leu Arg Glu Leu Gly Gln Gly Ser Phe Gly Met
20 25 30
Val Tyr Glu Gly Asn Ala Arg Asp Ile Ile Lys Gly Glu Ala Glu Thr
35 40 45
Arg Val Ala Val Lys Thr Val Asn Glu Ser Ala Ser Leu Arg Glu Arg
50 55 60
Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val Met Lys Gly Phe Thr Cys His
65 70 75 80
His Val Val Arg Leu Leu Gly Val Val Ser Lys Gly Gln Pro Thr Leu
85 90 95
Val Val Met Glu Leu Met Ala His Gly Asp Leu Lys Ser Tyr Leu Arg
100 105 110
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Glu Asn Asn Pro Gly Arg Pro Pro Pro Thr
115 120 125
Leu Gln Glu Met Ile Gln Met Ala Ala Glu Ile Ala Asp Gly Met Ala
130 135 140
Tyr Leu Asn Ala Lys Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn
145 150 155 160
Cys Met Val Ala His Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met
165 170 175
Thr Arg Asp Ile Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Lys Gly
180 185 190
Leu Leu Pro Val Arg Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val
195 200 205
Phe Thr Thr Ser Ser Asp Met Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu
210 215 220
Ile Thr Ser Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn Glu Gln
225 230 235 240
Val Leu Lys Phe Val Met Asp Gly Gly Tyr Leu Asp Gln Pro Asp Asn
245 250 255
Cys Pro Glu Arg Val Thr Asp Leu Met Arg Met Cys Trp Gln Phe Asn
260 265 270
Pro Lys Met Arg Pro Thr Phe Leu Glu Ile Val Asn Leu Leu Lys Asp
275 280 285
Asp Leu His Pro Ser Phe Pro Glu Val Ser Phe Phe His Ser Glu Glu
290 295 300
Asn Lys Ala Pro Glu Ser Glu Glu Leu Glu Met Glu Phe Glu Asp Met
305 310 315 320
Glu Asn Val Pro Leu Asp Arg Ser Ser His Cys Gln Arg Glu Glu Ala
325 330 335
Gly Gly Arg Asp Gly Gly Ser Ser Leu Gly Phe Lys Arg Ser Tyr Glu
340 345 350
Glu His Ile Pro Tyr Thr His Met Asn Gly Gly Lys Lys Asn Gly Arg
355 360 365
Ile Leu Thr Leu Pro Arg Ser Asn Pro Ser
370 375
<210> 4
<211> 415
<212> PRT
<213> Tyrosine kinase activation domain of DDR2
<400> 4
Met Thr Val Ser Leu Ser Leu Pro Ser Asp Ser Ser Met Phe Asn Asn
1 5 10 15
Asn Arg Ser Ser Ser Pro Ser Glu Gln Gly Ser Asn Ser Thr Tyr Asp
20 25 30
Arg Ile Phe Pro Leu Arg Pro Asp Tyr Gln Glu Pro Ser Arg Leu Ile
35 40 45
Arg Lys Leu Pro Glu Phe Ala Pro Gly Glu Glu Glu Ser Gly Cys Ser
50 55 60
Gly Val Val Lys Pro Val Gln Pro Ser Gly Pro Glu Gly Val Pro His
65 70 75 80
Tyr Ala Glu Ala Asp Ile Val Asn Leu Gln Gly Val Thr Gly Gly Asn
85 90 95
Thr Tyr Ser Val Pro Ala Val Thr Met Asp Leu Leu Ser Gly Lys Asp
100 105 110
Val Ala Val Glu Glu Phe Pro Arg Lys Leu Leu Thr Phe Lys Glu Lys
115 120 125
Leu Gly Glu Gly Gln Phe Gly Glu Val His Leu Cys Glu Val Glu Gly
130 135 140
Met Glu Lys Phe Lys Asp Lys Asp Phe Ala Leu Asp Val Ser Ala Asn
145 150 155 160
Gln Pro Val Leu Val Ala Val Lys Met Leu Arg Ala Asp Ala Asn Lys
165 170 175
Asn Ala Arg Asn Asp Phe Leu Lys Glu Ile Lys Ile Met Ser Arg Leu
180 185 190
Lys Asp Pro Asn Ile Ile His Leu Leu Ala Val Cys Ile Thr Asp Asp
195 200 205
Pro Leu Cys Met Ile Thr Glu Tyr Met Glu Asn Gly Asp Leu Asn Gln
210 215 220
Phe Leu Ser Arg His Glu Pro Pro Asn Ser Ser Ser Ser Asp Val Arg
225 230 235 240
Thr Val Ser Tyr Thr Asn Leu Lys Phe Met Ala Thr Gln Ile Ala Ser
245 250 255
Gly Met Lys Tyr Leu Ser Ser Leu Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala
260 265 270
Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Lys Asn Tyr Thr Ile Lys Ile Ala Asp
275 280 285
Phe Gly Met Ser Arg Asn Leu Tyr Ser Gly Asp Tyr Tyr Arg Ile Gln
290 295 300
Gly Arg Ala Val Leu Pro Ile Arg Trp Met Ser Trp Glu Ser Ile Leu
305 310 315 320
Leu Gly Lys Phe Thr Thr Ala Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val Thr
325 330 335
Leu Trp Glu Thr Phe Thr Phe Cys Gln Glu Gln Pro Tyr Ser Gln Leu
340 345 350
Ser Asp Glu Gln Val Ile Glu Asn Thr Gly Glu Phe Phe Arg Asp Gln
355 360 365
Gly Arg Gln Thr Tyr Leu Pro Gln Pro Ala Ile Cys Pro Asp Ser Val
370 375 380
Tyr Lys Leu Met Leu Ser Cys Trp Arg Arg Asp Thr Lys Asn Arg Pro
385 390 395 400
Ser Phe Gln Glu Ile His Leu Leu Leu Leu Gln Gln Gly Asp Glu
405 410 415
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for tyrosine kinase activation domain of Insuline Receptor
<400> 5
ggccatgggt gtttccatgc tctgtg 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for tyronie kinase activation domain of Insuline Receptor
<400> 6
gggaattctt aggaaggatt ggaccg 26
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for tyrosine kinase activation domain of DDR2
<400> 7
ggggatccac agtcagcctt tccctg 26
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for tyrosine kinase activation domain of DDR2
<400> 8
gggaattctc actcgtcgcc ttgtt 25
Claims (9)
- 청구항 1에 있어서, 상기 DDR 단백질은 DDR2 단백질인 것을 특징으로 하는 DDR 단백질과 콜라겐 결합 저해제.
- 청구항 1에 있어서, 콜라겐은 제 1형, 제 2형 및 제 3형 콜라겐으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 DDR 단백질 리간드인 것을 특징으로 하는 DDR 단백질과 콜라겐 결합 저해제.
- 악티노마이신 D와 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 DDR 단백질 과잉 활성과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 DDR 단백질 과잉 활성과 관련된 질환은 암, 간경화, 류마티스 질환 또는 동맥경화인 것을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 치료적으로 유효한 양의 악티노마이신 D를 인간 또는 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 DDR 단백질 과잉 활성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 DDR 단백질 과잉 활성과 관련된 질환은 암, 간경화, 류마티스 질환 또는 동맥경화인 것을 특징으로 하는 DDR 단백질 과잉 활성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
- 악티노마이신 D를 유효성분으로 하는 DDR 단백질 과잉 활성과 관련된 질환의 예방 및 개선용 건강 기능성 식품.
- 청구항 8에 있어서, 상기 DDR 단백질 과잉 활성과 관련된 질환은 암, 간경화, 류마티스 질환 또는 동맥경화인 것을 특징으로 하는 질환의 예방 및 개선용 건강 기능성 식품.
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