KR20090042104A - 흉선상피세포 특이적으로 ＬａｃＺ를 발현하는 생쥐 및 그제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 흉선상피세포에서 특이적으로 LacZ를 발현하는 생쥐 및 그 제조방법과 그 임상적 용용에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 흉선상피세포에서 특이적으로 발현되는 TSCOT 유전자좌에 IRES(Internal Ribosome Entry Site)를 통하여 발현되도록 만든 LacZ 유전자를 삽입하여, 이 유전자가 발현되는 곳에서 동시에 LacZ 단백질이 발현될 수 있도록, IRES-LacZ 융합 유전자를 적중한 생쥐 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 생쥐는 흉선상피세포에서 LacZ를 발현시킴으로써 TSCOT과 연관된 흉선상피세포의 발달을 추적하고, 또한 이들 세포에서 LacZ를 모델항원으로 이용하여, 흉선상피세포의 구획화된 면역기능을 연구하기 위한 동물모델로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한 극소수의 항원이 발현하여도 그 항원 특이적인 항체반응을 소멸시킬 뿐 아니라 항원 특이성 T 세포를 선택적으로 제거할 수 있다는 점을 이용하여 흉선상피세포 유전자 이식법을 제시하여 항원이 알려진 자가 면역이나 이식거부의 제거에 응용한다.
흉선상피세포, LacZ, 생쥐, TSCOT
Description
본 발명은 흉선상피세포에서 특이적으로 LacZ를 발현하는 생쥐 및 그 제조방법과 그 임상적 용용에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 흉선상피세포에서 특이적으로 발현되는 TSCOT 유전자좌에 IRES(Internal Ribosome Entry Site)를 통하여 발현되도록 만든 LacZ 유전자를 삽입하여, 이 유전자가 발현되는 곳에서 동시에 LacZ 단백질이 발현될 수 있도록, IRES-LacZ 융합 유전자를 적중한 생쥐 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
흉선은 골수줄기세포를 성숙한 T 세포로 발달시키는 기관으로 이곳에서 미성숙 T 세포가 분열, 분화의 과정을 거치고 이러한 과정 속에서 다양한 형태의 T 세포 선택과정이 이루어지게 된다. T 세포는 분화의 과정을 거치면서 다양한 형태의 세포막 단백질을 발현하게 되고, 결국 적절한 세포막 단백질을 발현함으로써 그 기 능을 수행하게 된다. 그러나 T 세포의 분화는 엄격히 조절되어야 정상적인 면역력을 가지게 되며 이러한 조절은 흉선이 수행한다.
상술한 바와 같이 T 세포의 선택과정을 통해서 T 세포의 내성이 형성된다. T세포는 분화과정을 통해서 고유의 항원을 인식하는 T 세포 수용체를 갖게 되는데, 이때 T 세포 수용체가 스스로의 항원 (self-antigen)을 인식하는 경우도 발생하게 된다. 따라서 이러한 T 세포는 흉선외부로 나가기 전에 제거가 되어야 자기면역질환을 예방하게 된다. 흉선은 T 세포의 분화뿐만이 아니라, 자기면역을 유발하는 T 세포의 선택적 제거과정에도 관여하며, 특히 이러한 과정은 흉선상피세포가 중심적인 역할을 한다.
현재 흉선상피세포의 기능을 연구하는데 있어서 가장 큰 어려움은 이들 세포를 효과적으로 분류해낼 수가 있는 마커가 부족하다는 점이다. 다른 군집의 세포와 구별되는 마커를 통하여 이들 세포를 분리하여, 그 특징을 연구할 수가 있다.
이에 본 발명자들은 TSCOT 유전자가 특정한 흉선상피세포에서 발현된다는 점을 이용하여 흉선상피세포를 쉽게 추적할 수 있을 뿐만 아니라, 이들 세포의 기능을 연구하기 위하여, TSCOT 유전자좌에 IRES-LacZ 융합 유전자를 적중하여 TSOCT 유전자가 발현되는 곳에서 동시에 LacZ 단백질이 발현되는 생쥐를 제조하고 이를 흉선상피세포의 면역관용(tolerance) 유도 메카니즘의 연구 및 흉선상피세포의 발생과 분화의 세포학적 연구에 이용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하었다.
또한 본 발명자들은 흉선 상피세포 특이적인 항원의 발현을 통하여 특이 항원에 반응하는 항체와 T세포의 면역 기능을 조절할 수 있음을 유전자 적중 생쥐 모델을 통하여 확인하였고, 하나의 항원을 비록 극히 한정된 흉선 상피세포에 발현하여도 항체반응과 T 세포 반응 모두를 제거할 수 있다는 본 발명의 면역학적 연구 결과는 자가면역과 장기이식의 거부 반응을 조절하는데 이용할 수 있는 가능성을 제시한다.
따라서 본 발명의 목적은 흉선상피세포 특이적 유전자인 TSCOT 유전자를 이용하여 흉선상피세포에서 특이적으로 LacZ를 표지한 생쥐 및 그의 제조방법을 제공하고 흉선 상피세포에 이식된 유전자를 특이 항원으로 설정하여 면역 반응을 제거하는 기술을 제시하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TSCOT 유전자좌에 IRES-LacZ를 적중시킨 형질전환 생쥐 및 이를 제조하기 위한 적중벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 생쥐의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 TSCOT 유전자좌에 IRES-LacZ를 적중시킨 형질전환 생쥐는 흉선상피세포 특이적으로 LacZ를 발현하는 특징이 있다.
TSCOT은 thymic stromal cotransporter의 약자로, SCID 면역 결핍 (severe combined immunodeficiency) 생쥐의 흉선으로부터 mRNA를 분리하여 클로닝된 약 2kb mRNA 크기를 갖는 유전자이다. 노던블랏의 결과에 의하면 흉선에서만 발현이 되며, SCID 생쥐의 흉선에서는 발현량이 증가된 상태로 발견된다.
본 발명자들은 상기 TSCOT 유전자가 흉선상피세포에서 특이적으로 발현된다는 사실에 착안하여 TSCOT 유전자가 발현되는 프로모터 하위에 IRES-LacZ 카세트를 삽입하여 LacZ를 흉선상피세포 특이적으로 발현하는 생쥐를 제조하였다. 상기에서 IRES는 TSOCT 유전자 조절과 동일하게 mRNA가 만들어지도록 하기 위해 사용하였으며, 여기에 형질전환세포의 선별을 위한 마커로 항생제 내성 유전자를 함께 사용하였다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 형질전환 생쥐를 제조를 위한 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 TSCOT 유전자 및 상기 유전자의 첫 번째 엑손에 순차적으로 연결된 IRES-LacZ-항생제 저항성 유전자 카세트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기에서 항생제 저항성 유전자는 형질전환 세포의 선별을 위한 것으로 이에 한정되지는 않으나 예를 들면, 네오마이신 저항성 유전자, 퓨로마이신 저항성 유전자 등을 들 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 벡터는 pBluescript 벡터에 포함된 TSCOT 유전자의 첫 번째 엑손을 BamHI으로 절단 한 후 IRES-LacZ-네오마이신 저항성 유전자 카세트를 삽입하여 제작된 것을 특징으로 하는 pBluescript Genomic TSCOT/LacZ-neo 벡터이다.
본 발명의 일 실시예에서는 p1049 벡터(Nehls et al., Science, 1996, 272:886-889)로 부터 제한효소로 절단하여 수득한 IRES-LacZ-네오마이신 저항성 유전자 카세트를 TSCOT 유전자를 포함하는 벡터에 삽입함으로써 제조하였다(실시예 1 참조).
또한, 본 발명은 상기 벡터에 네거티브 선택을 위해 HSV-TK (Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase)유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 적중벡터를 제공한다. 즉, 본 발명은 HSV-TK 유전자, TSOCT 유전자 및 IRES-LacZ-항생제 저항성 유전자 카세트가 순차적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 적중벡터를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 적중벡터는 pBluescript 벡터에 HSV-TK를 XhoI 제한효소자리에 삽입하여 pBluescript/TK 벡터를 제조하고 이를 SalI 제한효소로 절단한 후 여기에 pBluescript Genomic TSCOT/LacZ-neo를 SalI 제한효소로 절단하여 생성된 11746bp 절편을 삽입하여 제작된 것을 특징으로 하는 pBluescript/TK/Genomic TSCOT/LacZ-neo 벡터이다. 상기 벡터의 개열지도는 도 1에 나타낸 바와 같다.
상기 본 발명의 적중벡터를 포함하는 세포주 (E.coli 1C12 Knock-out vector-contained Stbl2 strain)를 2007년 9월 12일에 한국미생물보존센터에 기탁번호 제 KFCC11395P 호로서 기탁하였다.
또한 상기 본 발명의 적중벡터는 적합한 숙주세포에 도입될 수 있다. 바람직한 숙주세포로는 생쥐의 배아간세포를 들 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 적중벡터가 도입된 생쥐의 배아간세포를 제공한다.
배아간세포는 생쥐의 포배아로부터 유래된 세포주로서, 정상적인 염색체 구성을 가지며 생쥐 발생과정 중의 모든 종류의 세포 형태로 분화할 수 있는 잠재 능력, 즉 전분화능(totipotency)을 갖는다는 특성 때문에 포유류 유전학 연구에 있어 중요한 의미를 지닌다(Evans and Kaufman, Nature, 292, 154-156(1984); and Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 72, 3585-3595(1991)).
배아상태의 간세포(embryonic stem cell, ES cell)는 일반적으로 시험관내에서 배양한 착상 전 초기배아(pre-implantation embryos)로부터 수득될 수 있다(Evans et al., Nature, 292:154-156, 1981; Bradley, et al., Nature, 309:225-258, 1984; Gossler et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 83:9065-9069, 1986). 배아간세포주는 주로 129/sv종 생쥐(Robertson, E. J.(1987), Teratocarcin oma and Embryonic Stem Cell, IRL press, Oxford-Washington DC) 또는 C57BL/6J 혈통(Schwartzberg et al. Science, 246, 799-803(1989))의 포배아로부터 유래된 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 129 배아줄기세포주(R1)를 사용하였다(실시예 2 참조).
상기 배아간세포는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 배양될 수 있다(Robertson, "Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells , a Practical Approach", IRL Press, Washington D. C., 1987; Bradley et al., Current Topics in Devel . Biol. 20:357-371, 1986; Hogan et al., "Manipulating the Mouse Embryo":A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986).
본 발명에 따른 적중벡터의 배아간세포로의 도입은 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 전핵주입법(pronuclear microinjection), 레트로바이러스 매개 유전자 트랜스퍼(retrovirus mediated gene transfer), 유전자 적중(gene targeting), 전기천공법(electroporation), 정액 매개 유전자 트랜스퍼, 칼슘 포스페이트/DNA 공-침전법 및 미세주입법(microinjection) 등이 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 적중벡터를 전기천공법에 의해 배아간세포로 도입하였다(실시예 2 참조).
또한, 본 발명의 본 발명의 적중벡터가 도입된 배아간세포를 포배기의 숙주 배아의 포낭속에 미세 주입한 후 이 혼합 세포로 이루어진 배아를 대리모의 자궁내 에 이식하여 발생시키면 숙주의 배아세포와 주입된 배아간세포가 함께 어우러져 분화된 키메라 생쥐(chimeric mouse)가 태어나게 된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 배아간세포를 대리모의 자궁에 이식하여 제조된 것을 특징으로 하는 키메라 생쥐를 제공한다.
또한, 상기 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배함으로써 한쪽 유전자 적중 생쥐를 수득할 수 있으며, 상기 한쪽 유전자 적중 생쥐를 교배함으로써 양쪽 유전자 적중 생쥐를 수득할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 수득된 유전자 적중 생쥐는 TSCOT 유전자좌에 IRES-LacZ-항생제 저항성 유전자가 적중되어 흉선상피세포 특이적으로 LacZ를 발현하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 방법에 따라 제조된 생쥐에서 IRES-LacZ 카세트가 TSCOT 유전자좌에 정상적으로 적중되었는지를 확인하기 위하여, 서던블랏 및 노던블랏을 수행하였다(실시예 2 참조). 그 결과, 본 발명의 유전자 적중 생쥐의 TSCOT 유전자좌에 IRES-LacZ 카세트가 정상적으로 삽입되었음을 확인할 수 있었으며(도 2 참조), 삽입된 IRES-LacZ 융합 유전자로부터 정상적으로 mRNA가 만들어짐을 확인할 수 있었다(도 3 참조).
나아가, 본 발명의 일 실험예에서는 TSCOT 유전자좌에 적중된 LacZ 유전자 발현분포를 LacZ 염색법 및 조직면역염색을 수행하여 확인한 결과(실험예 1 참조), 11일 및 16일된 태아에서 흉선이 발달하는 곳에서 LacZ 염색이 된 것을 확인할 수 있었으며, 신생아로부터 분리된 흉선을 이용하여 LacZ 염색을 수행한 결과, 정상생쥐는 LacZ 염색이 이루어지지 않았고, 한쪽유전자 적중 생쥐와 양쪽유전자 적중 생쥐는 LacZ 염색이 이루어졌음을 확인할 수 있었다(도 4 참조). 이러한 결과로부터 본 발명에 따라 TSCOT 유전자좌에 LacZ 유전자를 적중한 생쥐를 이용하여, TSCOT 유전자가 발현되는 기관을 추적할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 조직면역염색 결과, 본 발명의 유전자 적중 생쥐에서 LacZ의 발현이 TSCOT 유전자좌와 동일하게 주로 흉선상피피질 부분에서 다량 발현됨을 확인할 수 있었다(도 5 참조). 따라서, 본 발명에서 제조된 적중생쥐는 LacZ의 발현을 이용하여 TSCOT 발현 세포의 특성을 연구하는데 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
이에 본 발명자들은 본 발명에 따른 흉선상피세포 특이적으로 LacZ를 발현하는 생쥐를 이용한 T 세포 발달 분석을 수행하였다. 즉, 본 발명의 일 실험예에서는 흉선상피피질세포에서 발현되는 LacZ에 의해 T 세포의 네가티브 선택 과정이 유도되는 가를 조사한 결과(실험예 <2-1> 참조), 본 발명의 생쥐에서 적중되어 발현되는 LacZ 단백질이 항원으로 사용되어 자가면역과정에서 네가티브 선택 과정을 유도함을 확인할 수 있었다(도 6 참조).
또한, 본 발명의 다른 실험예에서는 이러한 자가면역억제가 덴드리틱 세포(dendrtic cell)나 UEA-1을 발현하는 흉선상피세포에 의해서 유도되는 것이 아니 라 CDR1과 LacZ 단백질을 발현하는 흉선상피세포에 의해서 유도됨을 본 발명에서 제조한 생쥐를 이용하여 증명할 수 있었다(도 7 참조).
또한, 다른 관점으로서 본 발명은 상기 본 발명의 유전자 적중 생쥐의 제조방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명의 제조방법은 (a) HSV-TK 유전자, TSOCT 유전자 및 IRES-LacZ-항생제 저항성 유전자 카세트가 순차적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 적중벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 적중벡터를 배아간세포에 도입시키는 단계;
(d) 상기 배아간세포를 포배기의 숙주 배아의 포낭속에 주입하는 단계;
(e) 상기 배아간세포가 주입된 배아를 대리모의 자궁에 이식하여 키메라 생쥐(chimera mouse)를 수득하는 단계;
(f) 상기 (e) 단계의 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배하여, 흉선상피세포 특이적으로 LacZ를 발현하는 한쪽 유전자 적중 생쥐를 제조하는 단계;
(g) 상기 (f) 단계의 한쪽 유전자 적중 생쥐를 교배하여, 양쪽 유전자 적중 생쥐를 제조하는 단계를 포함한다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 TSCOT을 발현하는 흉선상피세포 특이적 LacZ 표지 생쥐는 흉선상피세포에서 LacZ를 발현시킴으로써 TSCOT과 연관된 흉선상피세포의 발달을 추적하고, 또한 이들 세포에서 LacZ를 새로운 자가항원으로 발현 하게 함으로써, 흉선상피세포의 구획화된 면역기능을 연구하기 위한 동물모델로서 유용하며 흉선 상피세포에 유전자를 이식함으로써 자가면역과 면역 거부 반응에 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
TSCOT 유전자좌에 LacZ 유전자의 삽입을 위한 적중벡터의 제조
TSCOT 유전자좌에 LacZ 유전자를 삽입하기 위하여, 본 발명자들은 TSCOT 게놈 유전자의 절편과 LacZ 유전자, 네오마이신 저항유전자를 결합하여, 첫 번째 액손에 LacZ 유전자와 네오마이신 저항유전자가 삽입되도록 TSCOT 적중벡터를 제조하였다. 구체적으로, p1049 벡터(Nehls et al., Science, 1996, 272:886-889)를 제한효소 BamHI으로 절단하여 네오마이신 마커를 포함하는 IRES-LacZ 카세트(IRES-LacZ-네오마이신 저항성 유전자, 약 5000bp)를 수득하였다. TSCOT 유전자(SalI 절편, 7030bp)를 포함한 pBluescript 벡터(Stratagene)를 BamHI으로 절단하여 TSCOT 유전자의 첫번째 엑손(284bp)을 제거하고 상기 카세트를 삽입하였다. 이렇게 제조 된 플라스미드를 pBluescript Genomic TSCOT/LacZ-neo 플라스미드라 명명하였다. 또한 pBluescript 벡터(Stratagene)에 네거티브 선택을 위한 HSV-TK(Dr. Hua Gu, National Institutes of Health)를 XhoI 제한효소자리에 삽입한 벡터를 제조하고 이를 pBluescript/TK 플라스미드라고 명명하였다. 상기에서 수득한 pBluescript/TK를 SalI 제한효소로 절단하고 여기에pBluescript Genomic TSCOT/LacZ-neo를 SalI 제한효소로 절단하여 생성된 11746bp 절편을 리가아제 효소로 접합하여 적중벡터를 제조하고 이를 pBluescript/TK/Genomic TSCOT/LacZ-neo라고 명명하였다(도 1).
<실시예 2>
TSCOT 유전자좌에 LacZ 유전자가 적중된 생쥐의 제조
<2-1>
키메라
생쥐의 제조
상기 실시예 1에서 제조된 pBluescript/TK/Genomic TSCOT/LacZ-neo를 이용하여 유전자적중 배아간세포를 제조하고 이를 이용하여 각각 키메라 생쥐 및 한쪽유전자 적중 생쥐, 양쪽유전자 적중 생쥐를 제조하였다.
구체적으로, 제조된 적중벡터 pBluescript/TK/Genomic TSCOT/LacZ-neo를 NotI 제한효소로 절단한 후에 생쥐의 129 배아줄기세포주(R1)에 전기천공법을 사용하여 삽입하였다. 삽입된 벡터가 염색체 상에 적중된 배아줄기세포주를 네오마이신 선별법을 통하여 선별하였다. 이와 같은 방법으로 제조된 형질전환 배아줄기세 포주를 생쥐의 낭배세포속덩이에 주입하고, 이를 다시 대리모 생쥐에 착상시켜서 키메라 생쥐를 제조하였다.
상기에서 제조된 키메라 생쥐의 꼬리로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이로부터 네오마이신 저항 유전자에 대한 PCR 및 서던블랏을 수행하였다. PCR은 네오마이신 저항성 유전자에 대해 특이적인 프라이머와 LacZ 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 수행하였다. 생쥐에서 적중된 유전자를 확인하기 위하여 사용된 PCR 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
Neo primer : ACCGCTATCAGGACATAGCGTTGG (서열번호 1)
1C12 F1 primer : TTACTCAAAGTGATGCTGGACTGG (서열번호 2)
1C12 B2 primer : CCGAGGGTTCCTTGGTACATTC (서열번호 3)
그 결과, 각각 415bp 및 830bp의 PCR 산물이 검출되었다. 이는 네오마이신 저항성 유전자와 LacZ 유전자가 적중되어 존재하고 있음을 의미한다.
서던블랏은 키메라 생쥐로부터 추출된 게놈 DNA를 BclI 제한효소로 절단한 다음, 각각 LacZ 및 네오마이신 저항성 유전자에 대한 프로브를 사용하여 수행하였다. 서던블랏에 사용된 프로브가 결합하는 부위는 도 1에 표시하였다. BclI 제한효소로 게놈 DNA를 절단하게 되면, 상기 유전자가 적중된 DNA 절편을 위의 프로브로 검출할 경우, 적중되지 않은 DNA 절편(6.5kb)보다 큰 사이즈인 7.9kb로 검출되므로, 서던블랏 결과를 통하여 7.9kb가 6.5kb와 함께 검출되는 한쪽 유전자 적중 생쥐 및 7.9kb만 검출되는 양쪽 유전자 적중 생쥐의 제조를 확인할 수 있다.
<2-2> 한쪽 유전자 적중 생쥐 및 양쪽 유전자 적중 생쥐의 제조
상기의 방법으로 제조된 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배시킴으로써 한쪽유전자 적중 생쥐를 제조하였다. 키메라 생쥐로부터 얻은 자손도 꼬리에서 추출된 DNA를 이용하여 PCR 및 서던블랏을 수행함으로써 한쪽 유전자 적중 생쥐를 선별하였다. PCR 및 서던블랏은 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 수행하였다.
또한 한쪽 유전자 적중 생쥐를 교배하여 양쪽 유전자 적중 생쥐를 제조하였다. 이와 같이 제조된 한쪽 유전자 적중 생쥐 및 양쪽 유전자 적중 생쥐는 서던블랏 및 노던블랏을 수행함으로써 확인하였다.
또한, 삽입된 유전자로부터 정상적인 mRNA가 만들어지는가를 확인하기 위해 노던블랏을 수행하였다. 노던블랏은 TSCOT, LacZ에 대한 프로브를 사용하였으며, GAPDH 프로브를 대조군으로 사용하였다. 생쥐의 흉선으로부터 전체 RNA를 분리한 후 이중 30 ug RNA에 cDNA의 5‘ 말단 으로부터 PCR 증폭시킨 TSCOT probe (약 400 bp)와 LacZ 전체 유전자(약 600 bp)를 32P로 표지된 프로브를 이용라여 노던 블랏을 수행 하였다.
서던블랏 결과, TSCOT 유전자에 돌연변이가 발생하지 않은 정상생쥐(+/+)의 경우 6.5kb의 정상 유전자 밴드가 검출되었고, 양쪽 유전자 적중 생쥐(Δ/Δ)의 경우에는 7.9kb의 적중된 유전자 밴드를 나타냈다. 한편, 한쪽 유전자 적중 생쥐(+/ Δ)는 정상 유전자 및 적중된 유전자 밴드를 모두 나타냈다(도 2). 따라서 본 발명의 유전자 적중 생쥐의 TSCOT 유전자좌에 IRES-LacZ 카세트가 정상적으로 적중되었음을 확인할 수 있었다.
또한, 노던블랏 분석 결과, 본 발명에 따른 유전자 적중 생쥐의 경우 삽입된 IRES-LacZ 융합 유전자로부터 정상적으로 mRNA가 만들어짐을 확인할 수 있었다(도 3).
<실험예 1>
TSCOT 유전자좌에 적중된 LacZ 유전자 발현의 기관 분포 확인
<1-1>
LacZ
염색
TSCOT 유전자의 첫번째 엑손에 적중된 LacZ 유전자가 어떤 기관에서 발현하는 가를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 LacZ 유전자의 의해서 발현되는 단백질인 β-갈락토시다아제의 활성을 측정하는 LacZ 염색법 (Michael Nehls et al., Two Genetically Separable Steps in the Differentiation of Thymic Epithelium, Science, Vol 272, 886~889, 1996)을 수행하였다. 상기 염색법은 β-갈락토시다아제가 존재하는 곳을 파란색으로 염색할 수 있는 방법으로서 이로부터 TSCOT 유전자의 프로모터가 활성을 갖는 기관을 확인할 수 있다.
우선 한배에서 나온, 발생한지 11일 된 태아 및 16일된 태아를 LacZ 염색하였다. 한배에서 나온 태아들의 유전자형을 분석하여 정상생쥐의 태아와 적중생쥐 의 태아를 선택하였으며, 전체 생쥐의 태아를 LacZ 염색하였다. 또한, 신생아 생쥐로부터 흉선을 분리하여 LacZ 염색을 수행하였다.
그 결과, 11일 된 태아의 흉선이 발달하는 곳에서 LacZ 염색이 된 것을 확인하였다. 태아 11일 상태에서는 아직 흉선이 온전히 발달하지 않은 상태이며, 흉선전구세포의 형태로 세포집단을 이루고 있는 형태이다. 이러한 결과는 TSCOT 유전자가 흉선 전구세포 시기부터 발현이 되고 있음을 나타낸다.
또한, 흉선의 발달이 이루어진 16일된 배아에서 LacZ 염색을 하였을 경우에도 역시 흉선에서 강하게 발현이 확인되었다. 11일 배아에 비해서 LacZ 염색이 더욱 뚜렷하게 이루어졌다. 이 시기에는 장에서도 발현이 확인되지만, 이는 정상생쥐에서도 동일한 양상으로 관찰되었다.
신생아 생쥐로부터 분리된 흉선을 이용하여 LacZ 염색을 수행한 결과, 정상생쥐는 LacZ 염색이 이루어지지 않았고, 한쪽유전자 적중 생쥐와 양쪽유전자 적중 생쥐는 LacZ 염색이 이루어졌으며, 뿐 만 아니라 한쪽유전자 결핍 생쥐보다 양쪽유전자 결핍 생쥐에서 더 강하게 LacZ 염색이 이루어졌다(도 4). 이는 유전자양에 따라서 LacZ의 발현양도 결정된다는 것을 나타낸다.
이들 결과는 TSCOT 유전자좌에 LacZ 유전자를 적중한 생쥐를 이용하여, TSCOT 유전자가 발현되는 시기 및 기관을 추적할 수 있음을 보여준다.
<1-2> 조직면역염색
TSCOT은 흉선기관 중에서도 특히 상피세포에 특이적으로 발현되는 것으로 알 려져 있다. 따라서 TSCOT 유전자좌에 LacZ 유전자를 적중한 생쥐에서 LacZ의 발현을 조직면역염색법으로 확인하였다. 즉, 신생아 생쥐로부터 분리한 흉선을 β-갈락토시다아제 단백질에 대한 항체(제품번호 MAB1802, CHEMICON International, Inc)를 이용하여 염색하였다. C흉선을 분리한 후에 이에 대한 절편을 만든 후에 항체를 처리하고, 이 항체를 인식하기 위하여 다시 Peroxidase 가 부착된 2차 항체를 처리한 후에 DAB을 이용하여 이를 검출해내었다. 또한, 상기 면역염색 결과를 헤마토자일린으로 염색한 경우 및 LacZ 염색법을 이용하여 염색한 결과와 비교하였다.
그 결과 본 발명의 유전자 적중 생쥐에서 LacZ의 발현이 TSCOT 유전자좌와 동일하게 주로 흉선상피 피질부분에서 다량 발현됨을 확인할 수 있었다(도 5). 도5의 A, B에서는 진한 갈색으로 표시되는 부분들과 도5의 C에서는 파란색 점으로 표시된 부분들이 LacZ가 발현된 부위로 이 부분은 흉선상피 피질부위이다. 이러한 결과는 헤마토자일린 염색이나 LacZ 염색 결과와 동일하였다.
따라서, 본 발명에서 제조된 적중생쥐는 LacZ의 발현을 이용하여 TSCOT 발현 세포의 특성을 연구하는데 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
<실험예 2>
본 발명에 따른
흉선상피세포에서
특이적으로
LacZ
를 발현하는 생쥐를 이용한 항체 및 T 세포의 면역 기능 조절
<2-1>
흉선상피세포의
면역관용(
tolerance
) 유도
메카니즘
연구
흉선상피 수질세포는 자가면역을 방지하기 위하여 T 세포의 네가티브 선택의 과정을 유도하는 것으로 알려져 있지만, 흉선상피 피질세포가 이러한 기능을 갖는가에 대해서는 논란이 많다. 따라서 본 발명자들은 흉선상피 피질세포에서 주로 발현되는 LacZ에 의해서 이와 같은 네가티브 선택과정이 유도되는가를 조사하였다. 정상생쥐(+/+), 한쪽유전자 적중 생쥐(+/Δ), 양쪽유전자 적중 생쥐(Δ/Δ)에 각각 LacZ 단백질을 주입하고 이에 대해서 생성되는 항체를 ELISA 방법으로 조사하였다.
그 결과, 정상생쥐에서는 LacZ에 대한 항체가 생성되었지만, LacZ 유전자 적중 생쥐에서는 LacZ에 대한 항체가 생성되지 않았다. 이는 적중되어 발현되는 LacZ 단백질이 항원으로 사용되어서 자가면역과정에서 네가티브 선택 과정을 유도하였음을 나타낸다.
본 발명에 따른 LacZ 유전자 적중 생쥐의 흉선 상피세포에 삽입한 유전자인 LacZ 단백질항원에 대한 항체반응만이 제거되었음을 제시한다(도6).
또한 T 세포 증식 반응에서도 일반 생쥐의 경우에는 LacZ 항원에 대한 T 세포의 증식 반응이 항원의 투여한 양에 따라 나타났으나 LacZ 적중 생쥐에서는 오히려 항원의 양에 따라 더욱 감소하는 현상을 보였다 (도7). 따라서 LacZ 유전자의 흉선 상피세포에 이식하여 항체 반응과 T 세포 반응을 모두 제거할 수 있음을 알 수 있다.
<2-2>
CDR1
및
LacZ
단백질 발현
흉선상피세포의
자가면역억제 연구
또한 본 발명자들은 이러한 자가면역억제가 다른 항원 제시 세포 특히, 덴드리틱 세포 (dendrtic cell)나 UEA-1 (Ulex Eeuropaeus Agglutinin-1)을 발현하는 흉선상피세포에 의해서 유도되는 것이 아니라 CDR1과 LacZ 단백질을 발현하는 흉선상피 기질세포에 의해서 유도됨을 본 발명에서 제조한 생쥐를 이용하여 증명할 수 있었다.
즉, 본 발명의 흉선상피세포 특이적 LacZ 표지 생쥐로부터 추출한 흉선기질세포(stromal cell)와 LacZ 특이적 TCR을 발현하는 T 세포(LacZ에 대한 TCR이 적중된 BgII 형질 전환 생쥐(D. Palmer, Marc R. Theoret, N. Restifo 그룹으로부터 입수)로부터 분리)를 혼합배양하여 흉선기질세포가 T 세포의 선택과정에 미치는 영향을 분석하였다.
흉선기질세포 중에서 UEA-1과 CD45를 발현하는 세포를 제거하고 남은 CDR1을 발현하는 흉선기질세포와 LacZ에 대한 TCR을 발현하는 흉선세포 (thymocyte)를 혼합 배양하면 (reaggregate thymic organ culture(RTOC)), 정상생쥐에서는 CD8은 발현하지 않고 CD4만 발현하는 T세포가 정상적으로 발달되는 것이 관찰되지만, LacZ 적중생쥐에서는 이러한 T세포의 발달이 관찰되지 않았다. 즉, LacZ 적중생쥐에서는 미분화 T세포가 LacZ를 발현하는 흉선기질세포에 의해서 자가면역 활성을 갖는 T 세포로 인지되어서 네가티브 선택의 과정을 통하여 제거되었음을 나타낸다 (도 8).
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 기술하였으나 이는 어디까지나 예시에 불과한 것으로 본 발명에 대한 다양한 변형과 변경이 가능하다. 또한 그러한 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 사실은 하기의 특허청구범위를 통하여 보다 분명해질 것이다.
도 1은 IRES-LacZ 융합 유전자가 삽입된 TSCOT 유전자좌, 상기 유전자좌에 IRES-LacZ 융합 유전자를 삽입하기 위한 적중벡터의 모식도 및 이를 이용하여 TSCOT 유전자좌에 IRES-LacZ가 적중된 상태를 나타낸 모식도이다.
B : 제한효소 BamHI에 의해서 절단되는 사이트
BclI : 제한효소 BclI에 의해서 절단되는 사이트
프로브 : 써던블랏에서 사용된 프로브가 인지하는 사이트
도 2는 정상생쥐(+/+), 하나의 염색체에만 유전자가 삽입된 생쥐(+/Δ), 양쪽 염색체에 유전자가 삽입된 생쥐(Δ/Δ)를 서던블랏을 통하여 분석한 결과이다. 6.5kb의 밴드는 정상 유전자를, 7.9kb의 밴드는 적중된 유전자를 나타낸다.
도 3은 정상생쥐(+/+), 하나의 염색체에만 유전자가 삽입된 생쥐(+/Δ), 양쪽 염색체에 유전자가 삽입된 생쥐(Δ/Δ)에서 삽입된 IRES-LacZ 융합 유전자로부터 정상적으로 mRNA가 만들어지는가를 확인한 노던블랏 결과이다. TSCOT의 5'UTR 및 LacZ를 인지하는 프로브를 각각 사용하여 분석하였으며, GAPDH 프로브는 대조군으로 사용되었다.
도 4는 본 발명에 따른 생쥐의 배아에서 IRES-LacZ를 통하여 발현되는 β-갈락토시다아제 단백질의 위치를 배아에서 분석한 결과이다. 11일 배아와 16일 배아에서는 개체 전체에서 확인하였으며, 신생아 생쥐에서는 흉선을 분리하여 흉선에서의 발현 정도를 측정하였다.
+/+ : 정상 생쥐
+/Δ : 하나의 염색체에 유전자가 이식된 생쥐
Δ/Δ : 양쪽 염색체에 유전자가 이식된 생쥐
도 5는 본 발명에서 제조된 생쥐의 흉선을 β-갈락토시다아제 단백질에 대한 항체를 이용하여 염색한 결과(A, B), LacZ 염색법을 이용하여 염색한 결과(C) 및 전체 세포를 헤마토자일린을 이용하여 염색한 결과(D)이다.
m : 흉선 상피 수질 부위 (medullay thymic epithelial cell)
c : 흉선 상피 피질 부위 (cortical thymic epithelial cell)
도 6은 본 발명의 흉선상피세포 특이적 LacZ 표지 생쥐를 이용하여 흉선상피세포에 발현된 항원이 특이 항체 기능을 소멸시키는 면역관용(tolerance) 유도에 대한 연구 결과이다.
M, G1, G2a, G2b, G3, A : 각각은 항체의 아형(isotype)으로 LacZ 항원이 발현된 생쥐에서 항체의 반응이 소멸 되었다.
도7. 본 발명의 흉선 상피세포에 발현시킨 항원에 대한 T 세포 면역 기능의 소멸에 대한 연구 결과이다.정상 생쥐에 LacZ 단백질을 주입하게 되면 이에 반응하는 T 세포가 활성화되는데, 본 발명의 형질전환생쥐에 LacZ 단백질을 주입하더라도 이에 대한 T 세포의 반응이 관찰되지 않는다. 이는 본 형질전환생쥐가 흉선에 LacZ를 발현함으로써 이를 자가항원으로 인식하게 되었음을 의미한다.
+/+ : 정상 생쥐
Δ/Δ : 흉선상피세포특이적 LacZ를 발현하는 형질전환생쥐
도 8은 본 발명의 흉선상피세포 특이적 LacZ 표지 생쥐로부터 추출한 흉선기 질세포(stromal cell)와 LacZ 특이적 TCR을 발현하는 T 세포를 혼합배양하여 흉선기질세포가 항원반응 T 세포가 발생시기에 소멸되는 것을 분석한 결과이다.
+/+ : 정상생쥐로부터 추출된 흉선기질세포
+/Δ : 한쪽유전자 적중생쥐로부터 추출된 흉선기질세포
LacZ TCR tg : LacZ에 대한 T 세포 수용체로 형질전환된 생쥐로부터 추출한 흉선면역 T세포
<110> INHA-INDUSTRY PARTNERSHIP INSTITUTE
<120> Mouse expressing LacZ in the thymic epithlial cells and
preparation method thereof, and appliication of thymic epithelial
cell specific antigen for immune tolerance
<160> 3
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Neo primer
<400> 1
accgctatca ggacatagcg ttgg 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1C12 F1 primer
<400> 2
ttactcaaag tgatgctgga ctgg 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1C12 B2 primer
<400> 3
ccgagggttc cttggtacat tc 22
Claims (13)
- TSCOT(thymic stromal cotransporter) 유전자 및 상기 유전자의 첫 번째 엑손에 순차적으로 연결된 IRES(Internal Ribosome Entry Site)-LacZ-항생제 저항성 유전자 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제1항에 있어서, pBluescript 벡터에 포함된 TSCOT 유전자의 첫번째 엑손을 BamHI으로 절단 한 후 IRES-LacZ-네오마이신 저항성 유전자 카세트를 삽입하여 제작된 것을 특징으로 하는 pBluescript Genomic TSCOT/LacZ-neo 벡터.
- HSV-TK (Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase)유전자, TSOCT 유전자 및 IRES-LacZ-항생제 저항성 유전자 카세트가 순차적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 적중벡터.
- 제3항에 있어서, pBluescript 벡터에 HSV-TK를 XhoI 제한효소자리에 삽입하여 pBluescript/TK 벡터를 제조하고 이를 SalI 제한효소로 절단한 후 여기에 제2항의 pBluescript Genomic TSCOT/LacZ-neo를 SalI 제한효소로 절단하여 생성된 11746bp 절편을 삽입하여 제작된 것을 특징으로 하는 pBluescript/TK/Genomic TSCOT/LacZ-neo 적중벡터.
- 제4항에 있어서, 도 1의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 적중벡터.
- 제5항에 따른 적중 벡터를 포함하는 기탁번호 KFCC11395P인 세포주.
- 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 적중벡터가 도입된 생쥐의 배아간세포.
- 제7항의 배아간세포를 포배기의 숙주 배아의 포낭속에 주입하고 이를 대리모의 자궁에 이식하여 제조된 것을 특징으로 하는 키메라 생쥐.
- 제8항의 키메라 생쥐를 교배하여 제조된 것을 특징으로 하는 한쪽 유전자 적중 생쥐.
- 제9항의 한쪽 유전자 적중 생쥐를 교배하여 제조된 것을 특징으로 하는 양쪽 유전자 적중 생쥐.
- TSCOT 유전자좌에 IRES-LacZ-항생제 저항성 유전자가 적중되어 흉선상피세포 특이적으로 LacZ를 발현하는 형질전환 생쥐.
- 제11항에 있어서, 상기 항생제 저항성 유전자가 네오마이신 저항성 유전자 또는 퓨로마이신 저항성 유전자임을 특징으로 하는 생쥐.
- (a) 제3항 또는 제4항의 적중벡터를 제조하는 단계;(b) 상기 적중벡터를 배아간세포에 도입시키는 단계;(d) 상기 배아간세포를 포배기의 숙주 배아의 포낭 속에 주입하는 단계;(e) 상기 배아간세포가 주입된 배아를 대리모의 자궁에 이식하여 키메라 생쥐(chimera mouse)를 수득하는 단계;(f) 상기 (e) 단계의 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배하여, 흉선상피 세포 특이적으로 LacZ를 발현하는 한쪽 유전자 적중 생쥐를 제조하는 단계;(g) 상기 (f) 단계의 한쪽 유전자 적중 생쥐를 교배하여, 양쪽 유전자 적중 생쥐를 제조하는 단계를 포함하는 흉선상피세포 특이적으로 LacZ를 발현하는 생쥐의 제조방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020070108019A KR20090042104A (ko) | 2007-10-25 | 2007-10-25 | 흉선상피세포 특이적으로 ＬａｃＺ를 발현하는 생쥐 및 그제조방법 |
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-
2007
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