KR20090035861A - 박테리오파지 ｋｃｔｃ１１１２０ｂｐ를 함유하는 세균증식 억제 또는 사멸용 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 박테리오파지 KCTC 11120BP를 함유하는 세균 증식 억제 또는 사멸용 제제에 관한 것으로, 박테리오파지 KCTC 11120BP는 용원성 상태에서도 숙주의 병원성을 감소시키는 효과를 발휘하며, 넓은 범위의 숙주에 대해서 그 생육을 효과적으로 억제 및 사멸시킬 수 있는 특징이 있다.

박테리오파지, 사멸, 세균, 용원성

Description

박테리오파지 ＫＣＴＣ１１１２０ＢＰ를 함유하는 세균 증식 억제 또는 사멸용 제제{Preparation containing bacteriophage KCTC 11120BP to inhibit or kill bacteria}

본 발명은 세균 사멸용 제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 용원성 상태에서도 숙주의 병원성을 감소시키는 박테리오파지에 관한 것이다.

식물 바이러스와 동물 바이러스 발견 후 세균에 감염하는 바이러스 (세균바이러스)가 알려졌으며, 그로부터 수년 후인 1915년에 트워트가 포도상구균의 용균현상을 관찰하였다. 1917년에 파스퇴르연구소의 헤렐르는 적리균에서도 이와 같은 현상을 관찰하였고, 이것이 바이러스에 의한 것임을 알아내었다. 그 후로 세균에 감염하는 바이러스는“세균 (Bacteria)”을 “먹는다 (Phage)”의 의미에서 "박테리오파지 (bacteriophage)"로 불렸으며, 간단히 “파지”로도 불리고 있다.

파지의 크기는 세균의 약 1/10로 그 모양은 전자현미경으로 관찰할 수밖에 없다. 그러나, 파지가 균을 용균하면 한천 배지 상에 증식한 세균 집락에 투명한 반점 (플라크)이 형성되기 때문에 파지의 존재를 육안으로도 확인할 수 있다.

파지는 세균 감염 후 약 30분 경에 100~200개의 새로운 파지가 만들어지고, 세균의 막을 파괴하며 밖으로 나온다. 세균은 2분열 증식하여 빠른 것은 약 20분에 2개의 개체, 40분에 4개의 개체, 60분에 8개의 개체로 되나, 파지의 경우는 약 30분에 100개 이상의 새로운 파지가 생성되므로 증식의 속도에서 파지가 훨씬 우세하다. 특정 세균이 20분에 1회씩 무제한으로 증식한다면 하나의 세포에서 출발한 세균이 지구와 같은 무게가 되는 데는 단지 36시간밖에 걸리지 않으므로, 세균의 증식을 억제할 수 있는 중요한 후보로 파지가 고려될 수 있다.

파지는 용균 파지와 용원성 파지로 분류되며, 용균 사이클만 반복하는 것을 용균 (virulent) 파지, 용원 사이클만 반복하는 것을 약독성 (temperate) 파지로 정의한다. 약독성 파지 (temperate phage)는 숙주 세균의 유전체에 파지의 유전자 정보를 삽입하기 때문에 파지의 모양은 사라지지만 숙주세균이 파괴되지도 않는다. 이러한 상태는 숙주 세균이 좋은 환경조건에 있는 한 계속되는데, 숙주 세균의 환경이 악화되면, 숙주세균의 유전자에 있던 파지 유전자는 파지 입자를 만든 후, 용균 사이클로 변환되어 숙주세균을 용균시키고 숙주세포 밖으로 탈출한다.

파지가 발견된 1910년부터 1930년대에 걸쳐 파지는 숙주 특이성과 숙주 세균의 내독소, 외독소 등 그 당시 과학적으로 풀지 못하는 문제 및 1929년 플래밍에 의한 페니실린과 1943년 워크스만에 의한 스트렙토마이신으로 대표되는 화학요법제의 발견으로 인해 그 활용에 제한이 있었다.

화학요법제는 하나의 약으로 복수의 감염증에 효과 (항균범위가 넓음)가 있 고, 최초 적용시에는 내성균 문제도 없었기 때문에 광범위하게 활용되었으며, 이에 비해 비교 우위가 없던 파지 요법은 거의 사라지게 되었다. 그 후로 1950년 대에 WHO에 의해 파지 요법은 무효 선언되었으며, 동구권과 구소련연방에서만 그 명맥이 겨우 유지되어 왔다.

당시 파지요법이 무효 선언된 이유를 정리하면, 첫째, 앞에서 논한 것과 같이 파지의 숙주범위가 매우 좁아 동일종 (種) 이더라도 주 (株)에 따라 파지에 대한 감수성이 달라지기 때문에 임상에 있어 다른 파지주를 많이 준비해야 하는 문제가 있었기 때문이다.

둘째, 시험적으로는 아주 뚜렷한 용균 작용을 나타내는 파지가 경구적으로 투여될 경우에 강한 위산의 영향을 피할 수 없고, 전신감염증에 적용하는 경우에 체내에 들어간 파지는 세망내피계에 의해 제거되기 때문이다.

셋째, 파지 내성균이 동일 세균 집단에 존재한다는 단점이 있기 때문이다.

그러나, 1980년대에 들어 파지 요법에 대한 생각이 바뀌게 되는데, 1982년 영국의 연구자그룹인 스미스와 휴긴스는 뇌막염 치료 모델 실험으로 마우스를 이용하여 실험하였다. 마우스의 피하 근육 내에 균을 주사하고 반대쪽의 피하에는 균의 특이적인 용균 파지를 주사한 결과, 파지를 주사하지 않은 대조군은 100% 폐사한 것에 비해 파지를 주사한 경우 (실험군) 100% 생존하였으며, 항생제 (스트렙토마이신 등)의 효과보다도 우월한 것이 확인되었다. 더욱 놀라운 것은 균을 직접 뇌 내에 주사한 경우와 파지를 근육주사 하는 경우 모두에서 파지가 뇌에서 회수가 되었는데, 이는 근육 주사한 파지가 혈류를 통해 뇌 조직으로 이동한 것을 의미하며, 파지는 혈액뇌관문 (blood-brain barrier)을 통과할 수 있다는 사실을 의미한다.

최근에는 용균성 파지를 이용하여 송아지의 대장균성 설사증, 어류의 다양한 질병, 반코마이신 내성 장구균 패혈증, 결핵균, 닭의 파라티푸스 및 대장균 O157:H7 등 다양한 질병에 대해 성공적으로 예방 및 치료한 사례가 보고되었으며, 파지를 직접 사용하는 방법뿐만 아니라, 파지가 숙주세균의 세포벽을 특이적으로 파괴하는데 작용하는 리신 (lysin)을 이용하여 탄저, 폐렴구균 등에 특이적인 항생제의 개발도 이루어지고 있는데, 이와 같은 요구에 발맞춰 새로운 파지의 발굴이 필요한 때이다.

이에 본 발명은 세균의 사멸을 유도할 수 있는 새로운 박테리오파지를 분리하여 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 박테리오파지 KCTC 11120BP를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균 증식 억제 또는 사멸용 제제를 제공한다.

본 발명에서는 살모넬라 및 대장균 모두에 대해 증식 억제능 또는 사멸능이 있는 박테리오파지를 서울시 청계천 물로부터 분리하고 이를 KCTC(한국생명공학연구원)에 기탁하고 기탁번호 KCTC 11120BP를 부여받았다. 이 파지는 긴 꼬리와 수축성의 시스 (sheath)가 없으므로 복합형의 쉬포비리데 (Siphoviridae)에 속하며, 볼티모어 분류법 (Baltimor classification)에 의하면, 제1형 바이러스로 분류할 수 있다.

본 발명의 박테리오파지 KCTC 11120BP는 살모넬라와 대장균을 폭넓게 용해시킬 수 있고, 인간 장내에서 분리해 낸 살모넬라 엔테리티디스와 동물에서 분리해낸 살모넬라 타이피뮤리움에 대해서도 감수성을 가짐이 확인되었다.

한편, 본 발명의 박테리오파지 KCTC 11120BP는 여타의 다른 박테리오파지와 달리 용원성 상태에서 세포의 병원성을 낮추는 특징이 있다. 본 발명의 박테리오파 지 KCTC 11120BP에 의해 용원성으로 감염된 세균의 경우 그렇지 않은 대조군 세균에 비해서 상피세포에 대한 침투 능력이 현저히 떨어지는 것을 확인되었다.

본 발명의 박테리오파지는 용원성 상태에서도 숙주의 병원성을 감소시키는 효과를 발휘하며, 박테리오파지의 숙주 특이성 때문에 생기는 제한적인 박테리오파지의 사용을 뛰어 넘어 넓은 범위의 숙주에 대해 그 생육을 효과적으로 억제 및 사멸시킬 수 있는 특징이 있다.

본 발명의 세균 생육 억제 또는 사멸능이 있는 박테리오 파지는 축산, 어류양식 등에 있어 항생제 대신 사용될 수 있으므로, 항생제 사용 절감을 통해 항생제 내성균 출현 가능성을 감소시키고, 환경 안전성을 높일 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 박테리오파지 분리

살모넬라 및 대장균에 대한 박테리오파지를 서울시 청계천 물로부터 분리하고자 하였다.

청계천 물을 박테리아는 걸리지만 박테리오파지는 통과하는 0.45μm의 막필 터로 여과시켰다. 이렇게 여과된 여과액에 NaCl 10%, 이스트 익스트랙트 5%, 트립톤 10%로 조성된 LB 브로스를 첨가하였고, 박테리아(살모넬라 타이피 뮤리움 (Salmonella typhimurium), 대장균 (Escherichia coli) 배양액과 혼합하였다.

상기 샘플을 12시간 동안 37℃에서 배양하였고, 8000rpm의 속도로 원심 분리하여 상등액을 0.45μm 막필터로 여과시켰다. 그 여과액 0.1ml과 12시간 이상 배양한 박테리아(살모넬라 혹은 대장균) 0.1ml의 현탁액을 피펫으로 추출한 후에 섞어주었다. 이 혼합액을 아가 (0.7%) 배지와 함께 섞어서 1.5% 아가 배지를 포함하는 플래이트에 부은 후, 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.

목적하는 박테리오파지가 플래이트 상에 나타난 경우는 독립되고 투명한 플라그 (plaque)가 관찰되었다. 이 플라그 영역을 백금 루프를 이용하여 분리해낸 다음, 새로운 박테리아 배양액에 넣었는데, 배양액이 맑아짐을 관찰할 수 있었다.

그 후에 배양액을 원심분리한 후, 상등액만을 취해 0.45μm 막필터로 여과시켜 용해물에 남아있는 모든 박테리아를 제거하였는데, 이로써 박테리오파지만을 포함하는 여과액을 회수할 수 있었다.

이렇게 얻은 박테리오파지 용액을 아가 배지 상에 다르게 희석하여 주입한 후, 3회에 걸친 플라그의 재분리를 통해 순수한 박테리오파지를 얻을 수 있었다.

실시예 2: 획득한 파지의 모양 및 분류

실시예 1에서 획득한 박테리오파지들 중에서 살모넬라와 대장균 모두를 감염시켰던 파지를 선별해냈고, 이를 KCTC (한국생명공학연구원)에 기탁하고 기탁번호 KCTC 11120BP를 부여받았다. 이 파지의 전자현미경사진을 분석하였는데, 도 1은 그 결과를 나타낸다.

전자현미경은 에너지 여과 투과 전자현미경 (Energy-Filtering Transmission Electron Microscope)을 사용하였다. 관찰하고자 하는 박테리오파지 샘플을 탄소를 입힌 구리 그리드 (grid)에 올리고, 2% 액상 우라닐 아세테이트 (uranyl acetate)로 음성 염색을 하였다. 염색된 시료를 80kV의 전압의 에너지 여과 투과 전자현미경 (LIBRA 120, Carl Zeiss)을 이용하여 관찰하였다.

이렇게 관찰된 박테리오파지는 모양으로 분류하는 기준으로 보았을 때 긴 꼬리와 수축성의 시스 (sheath)가 없으므로 복합형의 쉬포비리데 (Siphoviridae)에 속하며, 볼티모어 분류법 (Baltimor classification)에 의하면, 제1형 바이러스로 분류될 수 있었다.

실시예 3: 분리한 박테리오파지에 대한 숙주 감수성 ( susceptibility ) 결정

숙주 감수성은 연속 희석 적하법 (serial dilution dropping method)을 통해 결정되었다. 2시간 배양된 박테리아 배양액과 0.7%의 아가 배지를 섞은 후 플래이트에 부어서 37℃에서 15분간 건조하였고, 그 위에 희석된 파지를 희석배수 별로 떨어뜨리고, 상온에서 말린 후 37℃에서 10시간 정치 배양시켰다. 균주가 파지에 대해 감수성을 갖는 경우, 플래이트상에 투명한 영역, 즉 플라그 (plaque)를 보이는데, 이는 박테리아 세포가 완전하게 용해 (lysis)된 결과임을 증명하는 것이다. 만약 감수성이 약한 경우는 뿌연 영역이 생기거나, 독립적인 볼드스팟이 나타난다.

하기 표 1은 본 발명의 박테리오파지 KCTC 11120BP의 살모넬라와 대장균에 대한 감수성을 조사한 결과이다.

박테리오파지 KCTC 11120BP의 숙주 감수성 결정(+ 개수는 감수성의 정도를 의미)

숙주		파지	숙주 (살모넬라)	파지	숙주 (살모넬라)	파지
LT2	살모넬라	++	S.E 1	++	S.T 1	-
SL1344		++	S.E 2	++	S.T 2	++
14028s		++	S.E 3	++	S.T 3	++
S. Dublin		++	S.E 4	++	S.T 4	++
UK1		++	S.E 5	++	S.T 5	++
KCTC 1925		+++	S.E 6	++	S.T 6	++
NCTC 12023		++	S.E 7	++	S.T 7	++
ST 4/74		++	S.E 8	++	S.T 8	-
S. enteritidis		++	S.E 9	++	S.T 9	++
DH5α	대장균	+++	S.E 10	+++	S.T 10	++
MC4100		+++
JM109		+++
JM109(DE3)		+++
MG1655		+++
BL21(DE3)		-

상기의 실험 결과, 두 균주를 폭넓게 용해시킬 수 있음이 확인되었고, 인간 장 내에서 분리해낸 살모넬라 엔테리티디스(S.E 1~10)와 동물에서 분리해낸 살모넬라 타이피뮤리움(S.T 1~10) 또한 박테리오파지 KCTC 11120BP에 의해 감수성을 가짐이 확인되었다.

실시예 4: 살모넬라와 대장균에 감수성을 가지게 하는 요인 결정

박테리오파지 KCTC 11120BP의 부분적인 서열 분석으로 숙주세포에 결합하는 파지의 단백질을 찾을 수 있었다. 도 2는 이 단백질의 염기서열을 나타낸다. 이 단백질은 숙주세포의 BtuB 단백질에 붙는데, 숙주세포에서 이 단백질의 염기서열을 돌연변이시켜 단백질이 발현되지 못하게 한 후, 파지의 감수성에 어떤 변화가 생기는지를 본 실시예를 통해 확인하고자 하였다.

도 3은 그 결과를 보여주는데, BtuB 단백질이 돌연변이된 숙주세포는 대조군 대비 감수성이 현저히 낮게 나타났다. 도 3에서 ▲는 야생형의 SL1344이고, ■는 FhuA 단백질을 돌연변이시킨 SL1344이고, □는 BtuB 단백질을 돌연변이시킨 SL1344이다.

실시예 5: 살모넬라에 박테리오파지를 감염시킨 후 용원성 살모넬라의 분리

12시간 이상 배양한 살모넬라 0.1ml의 현탁액을 피펫으로 추출한 후에 아가 (0.7%) 배지에 섞고, 1.5% 아가 배지를 포함하는 플래이트에 부었다. 약 10분 정도 아가를 굳히고, 본 발명의 박테리오파지액을 10분의 1씩 희석하여 10개의 샘플을 만든 후, 각각 5μl씩 아가 배지 위에 떨어뜨렸다 (도 4). 그 후 이 플래이트를 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

배양이 끝난 후, 플라그 (plaque) 내에 생성된 콜로니를 백금 루프를 이용하여 분리해낸 다음 이를 배지에 추가적으로 배양시켰다. 이 세포가 용원성 세포인지를 중합효소 연쇄반응 통해서 확인하였는데, 10회 이상의 계대 배양해도 용원성 상태를 유지할 만큼 안정하였다.

실시예 6: 용원성 감염 살모넬라의 병원성 감소

용원성으로 감염된 살모넬라의 병원성을 확인하기 위하여 살모넬라 모델의 동물세포 침투 실험(invasion assay) 및 생존 실험(survival assay)을 수행하였는데, 이는 살모넬라의 병원성을 측정하는 일반적인 실험으로, 이 실험에서 유의적인 결과를 보인다면, 병원성의 감소 여부를 확인할 수 있다.

먼저, 소장 상피 세포인 ICE-6세포와 대식세포인 RAW264.7 세포를 10% 페탈 보바인 시럼 (fetal bovine serum)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium' Gilbco-BRL) 배지에서 배양하였다. 배양 조건은 37℃, 5% CO₂ 이었으며, 각 세포는 3~4일 정도 간격으로 계대하였다. 그 후, 살모넬라를 중-로그 페이스 (mid-log phase)인 O.D₆₀₀=0.6까지 배양한 후 12-웰 조직 배양 플래이트에 배양된 동물세포에 10 박테리아/동물세포의 비율로 접종시켰다. 한 시간 동안 박테리아를 감염시키고 포스페이트-버퍼드 살린 (phosphate-buffered saline; PBS)으로 3~4번 세척하였다. 그 후, 동물세포 외부의 살모넬라를 제거하기 위하여 젠타미신 (gentamicin)을 포함한 DMEM 배지에서 약 2시간 동안 배양하였고, 1% triton X-100(Sigma Co.)을 포함한 PBS로 세포를 용균시킨 후, 적당한 희석비율로 LB 플레이트에 배양하였다. 그 후, 자란 콜로니의 수와 처음 접종 단계에서 넣어 준 살모넬라 수를 비교하여 침투비율 (invasion ratio)를 결정하였다.

서바이벌 어세이 (Survival assay)의 경우 젠타미신 (gentamicin) 처리 후 새로운 DMEM으로 배지를 교환하고 시간대별로 동물세포를 용균시켜 세포 내 박테리아의 감소 추이를 조사하였다.

각각 실험의 대조군으로 병원성의 감소에 영향을 미친다고 알려져 있는 박테리아 꼬리 유전자 두개를(fliC, fljB) 돌연변이시켜 함께 실험을 수행하였다.

이상의 모세포와 용원성 세포를 가지고 실험한 결과 용원성 세포의 경우 모세포에 비해서 상피세포에 침투 능력 및 생존 능력이 현저히 떨어지는 것을 확인할 수 있었다 (도 5). 도 5a 및 5b에서, 'SL1344'는 살모넬라 야생형 균주, 'lysogen'은 용원성 균주, 'fliC' 및 'fljB'는 살모넬라의 꼬리 유전자를 돌연변이 시킨 균주이다. 5a는 균주를 동물의 장 상피세포에 감염시킨 후 3시간 후에 상피세포 내에 박테리아 수를 계수(단위: cfu, colony forming unit) 한 것이고, 5b는 동물의 대식세포에 4개의 균주를 감염시킨 후 6, 18시간 이후에 대식세포 내에 박테리아 수(단위: cfu, colony forming unit)를 계수 한 그래프이다. 이때, 5b 막대그래프 위의 6, 18 은 시간을 의미한다.

이상의 결과는 파지가 박테리아에 용원성으로 존재하는 경우에도 박테리아의 병원성을 감소시키는 효과를 입증하는 것으로, 본 발명의 특징은 이에 있다.

실시예 7: 본 발명의 박테리오파지를 함유하는 제조물의 생산

본 발명의 박테리오파지 KCTC 11120BP를 12시간 배양된 살모넬라 배양액에 혼합하고, 37℃에서 3시간 동안 배양시켰다. 투명한 배양물 (용해)이 나타난 후, 다음날까지 샘플을 차갑게 유지시켰다. 용해되지 않은 박테리아 세포를 제거하기 위해, 상기 용해물을 0.45㎛ 막필터를 통해 여과시켰는데, 이를 통해 박테리오파지액을 얻을 수 있었다.

무균 배양 파지 용해물은 비교적 장시간의 용균활동 특성을 보인다. 차게 보관하면, 이들은 수년 동안 어떤 경우는 10년 이상동안 존속하게 된다.

이와 같이 회수된 박테리오파지액을 파지 약제의 제조에 이용하였다.

파지 약제는 박테리오파지액을 포함하는 혼합물이다. 약제로서 이 혼합액을 중화처리 (previous neutralization)한 후(예컨대, 겔 알루미니 포스포리시(Gel Alumini phosphorici), 소다 또는 비치수(VIchy water)를 이용함), 매일 3회 식전 30분에 10ml에 해당하는 양씩 경구 투여할 수 있다.

이 혼합액을 상처에 직접 바를 때는, 24시간에 걸쳐 3회 행할 수 있다. 이때, 상처가 소독제로 세척되어서는 안 되는데, 이는 파지의 불활성을 초래할 수 있기 때문이다. 세척이 필요하다면 상처는 무균 배지 또는 0.9% NaCl 생리용액으로 세척할 수도 있다.

한편, 필요하다면 본 발명의 파지 테라피는 항생 치료와 연계되어 응용될 수도 있다.

도 1은 본 발명에서 분리한 박테리오파지의 전자현미경 사진이다.

도 2는 본 발명의 박테리오파지가 숙주의 범위를 넓히는데 영향을 미치는 단백질의 유전자 서열이다.

도 3은 본 발명의 박테리오파지가 숙주의 범위를 넓히는데 영향을 미친 요인을 분석한 그래프이다. (▲는 야생형의 SL1344이고, ■는 FhuA 단백질을 돌연변이시킨 SL1344이고, □는 BtuB 단백질을 돌연변이시킨 SL1344이다)

도 4는 본 발명의 박테리오파지에 의해 용원성으로 감염된 살모넬라를 선별하는 과정을 보여주는 설명도이다.

도 5a 및 5b는 용원성 세포의 경우 모세포에 비해서 상피세포에 대한 침투 능력 및 대식세포에서의 생존능력이 현저히 떨어지는 것을 보여주는 그래프이다.

Claims (2)

1. 박테리오파지 KCTC 11120BP를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균 증식 억제 또는 사멸용 제제
2. 제1항에 있어서,

   상기 세균은,

   살모넬라 또는 대장균인 것을 특징으로 하는 세균 증식 억제 또는 사멸용 제제.

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