KR20090035401A

KR20090035401A - 단일세포의 신호분석방법

Info

Publication number: KR20090035401A
Application number: KR1020070100670A
Authority: KR
Inventors: 박상현; 허재영
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2007-10-06
Filing date: 2007-10-06
Publication date: 2009-04-09
Also published as: KR100968640B1

Abstract

본 발명은 단일세포의 신호분석방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 단일세포 신호분석용 효모 형광균주를 제조하는 단계; 및 상기 형광 균주의 단일 세포로부터 신호 반응으로 단일세포를 분석하는 단계를 포함하는, 단일세포의 신호분석방법에 관한 것이다. 본 발명의 단일세포의 신호분석 방법을 이용하면 실시간 반응분석을 통하여 세포의 신호 조절 기작을 이해할 수 있다.

신호분석, 형광 단백질, 나노환경, 효모 형광균주

Description

단일세포의 신호분석방법{Cell Signaling Analysis Method of Single-Cell}

본 발명은 단일세포의 신호분석방법에 관한 것이다.

살아있는 단일세포의 분리, 포획, 분석 및 진단 기능이 모두 작은 칩 속에 집적된 휴대용 나노기반 플랫폼 기기가 개발되고, 질병에 대한 개체별 특이성은 DNA나 단백질 분석 수준에 더하여, 해당 개체의 (살아있는) 단일세포 및 세포군 앙상블에 대한 분석을 통해 직접적인 상관관계가 성립될 수 있으며, 이는 의료 현장에서 신속 정확한 개인 맞춤형 건강 상태의 진단이 가능하므로 이로 인해 인간의 수명을 연장하여 국민 보건 상태가 크게 향상됨을 기대 할 수 있다(M. C. Park, J. Y. Hur, K. W. Kwon, S.-H. Park and K. Y. Suh. Pumpless, selective docking of yeast cells inside a microfluidic channel induced by receding meniscus. Lab Chip (2006), 6:988-994).

생체 내의 세포는 끊임없이 외부환경으로부터 다양한 자극을 받는다. 변화 하는 환경 자극에 대해 정확하게 이를 감지하고 그에 대응하는 세포반응을 제어하는 것은 생명현상을 유지하는 데에 있어 가장 중요한 생체 기작이다. 이러한 자극의 감지 그리고 상응하는 생체반응의 제어는 단백질 상호작용 네트워크로 구성된 수많은 신호전달 경로를 통해 이루어진다. 생체 신호전달계의 특징은 그 다양성과 선택적 특이성이다. 특정 자극은 항상 그에 상응하는 특정 생체반응을 일으키며, 이러한 신호전달체계의 선택적 특이성은 수많은 단백질 상호작용의 유기적 연결에 의해 유지된다(도 1)(S.-H. Park, A. Zarrinpar and W. A. Lim. Rewiring MAP kinase pathways using alternative scaffold assembly mechanisms. Science (2003), 299: 1061-1064 ; A. Zarrinpar, S.-H. Park and W. A. Lim. Optimization of specificity in a cellular protein interaction network by negative selection. Nature (2003), 426: 676-680). 따라서 신호전달의 오작동은 많은 경우 암 등의 질병 현상으로 나타나게 된다.

이러한 중요성에 비추어 세포 신호 전달 조절 기작의 이해는 매우 중요하나, 현재 이에 대한 이해는 부족한 현실이다.

대부분의 생물학 연구에 사용되는 세포군 대상 연구방법론의 경우 세포군내의 개별 세포가 균일한 세포반응을 일으킨다는 가정 하에 데이터의 분석이 이루어진다. 하지만 실제로 개별세포가 균일한 반응을 일으키지 않을 경우, 평균 측정값에 기반을 둔 결과분석은 오류를 초래할 수 있다(도 3). 이러한 오류는 세포군의 용혈처리 과정에서 각 세포의 세포질이 섞임으로써 개별세포의 차별성이 합산되는 현상에 기인한다. 실제 개별세포가 균일한 반응을 일으키는 지의 여부는 여러 기술적인 문제로 인해 실험적으로 증명된 경우가 지극히 미미하다.

이에, 본 발명자들은 나노바이오기술을 이용하여 세포군내 개별세포의 신호전달이 차별성을 가지는지를 단일세포 수준에서 통합적 규명하고자 노력하던 중, 나노기술, 세포 생물학 및 분자 생물학적 연구 기법을 이용하여 개별세포에서 신호 전달의 활성, signal adaption 등의 flux(도 2)를 시간별로 관찰하고 신호 전달의 제어 및 조절 기작을 다각적으로 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 microchannel 구조물을 이용한 단일세포 분석을 통하여 MAP kinase 신호 전달계를 모델로 외부 자극에 의한 세포 신호전달 네트워크의 stochasticity를 제공하는 것이다.

본 발명은 ⅰ) 단일세포 신호분석용 효모 형광균주를 제조하는 단계; 및 ⅱ) 상기 형광 균주의 단일 세포로부터 신호 반응으로 단일세포를 분석하는 단계를 포함하는, 단일세포의 신호분석방법을 제공한다.

본 발명의 단일세포의 실시간 반응분석을 통하여 신호 flux 기전, 역학을 이해할 수 있으며, 신호전달의 활성, 적응, stochasticity를 규명한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 단일세포의 신호분석방법에 있어서, 상기 효모 형광균주의 제조단계 이후에 추가적으로, 상기 균주를 이용한 세포포획을 위한 나노환경을 구축하는 단계; 및 상기 나노환경으로부터 단일 세포를 포획하는 단계를 포함시키는 것이 바람직하고, 상기 나노환경의 구축은 마이크로유체역학에 기반을 둔 마이크로 채널을 이용하는 것이 보다 바람직하며, 상기 마이크로 채널의 이용은 광식각(photolithography) 공정으로 제작된 음각의 실리콘 웨이퍼 마스터 위에 PDMS(polydimethyl siloxane) 고분자를 경화시켜 양각의 PDMS stamp를 제작하고, glass coverslip 위에 생체적합 UV 경화성 고분자를 코팅하고 양각의 PDMS stamp를 이 고분자와 접촉시킨 후 UV로 경화시키면 음각의 고분자 마이크로웰 구조를 glass coverslip 위에 형성하고, glass coverslip과 PDMS microfluidic mold를 플라즈마 표면 처리하여 bonding하면 원하는 형태의 마이크로 채널을 제작하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 단일 세포 포획은 메니스커스가 후진하면서 마이크로 우물 안에 세포를 포획하는 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명의 단일세포의 신호분석방법에 있어서, 상기 신호 반응의 단일세포 분석은 살아있는 단일세포들의 신호반응을 정량적으로 time-course 분석하여 세포 신호반응의 stochasticity 여부를 확인하는 것이 보다 바람직하고, 상기 신호 반응의 단일세포 분석은 페로몬 또는 고농도염을 처리하고, 형광 단백질의 밝기정도를 측정하여 분석하는 것이 가장 바람직하다.

세포군으로부터 단일세포를 분리하고, 생체 내의 환경(in vivo environment)과 유사하게 설계된 표면에 단일 세포 수준으로 포획하며, 나아가 고립된 단일 세포에 기계적 응력, 다양한 신호전달계를 자극할 수 있는 화학물질을 공급하여 단일 세포의 분비물, 모양변화, 형광 등을 제어, 측정할 수 있는 나노환경 시스템의 구축은 단일세포 연구를 통한 병리의 규명과 치료법 발굴에 필수적이다(도 4).

본 발명은 효모의 교배신호 반응을 매개하는 페로몬 유도 mating MAP kinase pathway와 고농도염에서의 생존 반응을 매개하는 고농도염 유도 stress MAP kinase pathway를 모델로 하여 개별세포에서 신호 전달의 활성, signal adaption 등의 flux를 실시간으로 관찰하고 신호 전달의 제어 및 조절 기작을 다각적으로 규명한다.

MAP kinase 신호전달계는 효모로부터 인간에 이르기까지 대부분의 진핵 생명계에서 잘 보존되어 있다. 특히, mating과 stress MAP kinase pathway는 인간을 포함한 고등 생명체에서 각각 세포의 분화, 발생, 주기조절에 중요한 역할을 담당하는 ERK MAP kinase 신호전달계와 세포의 다양한 외부 stress를 조절하는 JNK MAP kinase 신호전달계와 구성 및 기능 면에서 고도의 유사성을 지닌다(E. Elion. Pheromone response, mating and cell biology. Curr Opin Microbiol. (2000), 3:573-581 ; J. L. Brewster, T. de Valoir, N. D. Dwyer, E. Winter, M. C. Gustin. An osmosensing signal transduction pathway in yeast. Science (1993), 259:1760-1763).

효모의 mating MAP kinase 신호 전달계는 MAP kinase kinase kinase (MAPKKK)인 Ste11, MAP kinase kinase (MAPKK)인 Ste7, MAP kinase (MAPK)인 Fus3, 그리고 scaffold protein인 Ste5 로 구성되어있다. 단수체 효모 세포가 mating 페로몬을 감지한 경우, Ste11, Ste7, Fus3 kinase의 순차적 인산화를 통해 mating 신호 정보가 전달된다고 알려져 있다. 이들 세 종류 kinase와 scaffold protein Ste5는 페로몬 유도 교배 신호전달에 필수적 인자들이다. 이들 중 어느 한 인자의 활성이 부재할 시 신호전달이 일어나지 않게 되고, 이러한 효모 세포는 교배 불능의 비생식(sterile) 상태로 전환된다(E. Elion. Pheromone response, mating and cell biology. Curr Opin Microbiol. (2000), 3:573-581). 또한, 효모의 stress MAP kinase 신호 전달계는 MAP kinase kinase kinase(MAPKKK)인 Ste11, MAP kinase kinase(MAPKK)와 scaffold protein 기능을 동시에 수행하는 Pbs2, MAP kinase(MAPK)인 Hog1로 구성되어 있다. 단수체 효모 세포가 고농도염을 감지한 경우, Ste11, Pbs2, Hog1 kinase의 순차적 인산화를 통해 stress 신호 정보가 전달된다고 알려져 있고, 각각의 kinases와 scaffold protein Pbs2는 고농도염 유도 stress 신호전달에 필수적 인자들이다. 이들 중 어느 한 인자의 활성이 부재할 시 신호전달이 일어나지 않게 되고, 이러한 효모 세포는 고염도의 환경에서 생존하지 못한다(도 5)(J. L. Brewster, T. de Valoir, N. D. Dwyer, E. Winter, M. C. Gustin. An osmosensing signal transduction pathway in yeast. Science (1993), 259:1760-1763).

본 발명자들은 신호전달 report 단백질 발현 효모, 특히 단일세포 신호분석용 효모 형광균주를 제조하였다. 구체적으로, 형광 단백질과 필수 아미노산 합성 유전자(selection marker)를 코딩하는 플라스미드를 제조하고, 이를 PCR로 증폭하고, 상기 PCR 산물을 효모의 염색체에 삽입하였다(도 6 및 표 1 참조)(M. S. Longtine et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast (1998), 14: 953-961). 그 결과, 외부자극에 의해 세포내 신호전달이 개시되면 형광단백질이 발현되어 형광 현미경을 이용 육안으로 관찰할 수 있다. 신호반응을 측정하기 위한 유전자로는 mating signaling의 경우 Fus1, 그리고 stress signaling의 경우 Gpd1을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명자들은 신개념의 정밀한 나노환경을 구축하고 단일세포를 초미 세유체망 기술을 이용해 나노환경 플랫폼 내부로 포획하여(도 7 참조), 여러 가지 신호전달에 의한 생체신호반응을 살아있는 단일세포를 대상으로 고속, 실시간 측정하였다(도 8 참조). 상기 방법은 기존의 DEP, sedimentation, hydrodynamic focusing, optical tweezer 방법 등에 비하여 대면적에 높은 확률로 포획할 수 있고 세포에 가해지는 충격을 최소화(non-invasive) 할 수 있다. 아울러, 살아있는 단일세포들의 신호반응을 정량적으로 time-course 분석하여 세포 신호반응의 stochasticity 여부를 확인하였다(도 9 참조).

본 발명자들은 대면적에 단일 세포를 포획할 수 있는 마이크로유체역학 플랫폼을 제조하고, 이를 통하여 90% 이상의 확률로 대면적에 세포를 포획하고 단일세포 수준으로 분석하였다. 먼저 세포를 포획하고 효모의 교배신호 반응을 매개하는 페로몬을 흘려주어 세포 반응을 2시간이 지난 다음 분석하였다(도 10 참조). 또한 고농도염을 흘려주어 세포 반응을 2시간이 지난 다음 분석하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 신호전달 report 단백질 발현 효모(단일세포 신호분석용 효모 형광균주)의 제조

본 발명자들은 신개념의 단일세포 분석을 통하여 효모의 mating과 stress MAP kinase pathway를 모델로 하여 생물학적 현상의 관찰시 필연적인 ensemble average problem을 규명하고 세포군내 개별세포의 신호전달이 차별성을 가지는지를 규명하였다.

이를 위하여, 본 발명자들은 먼저 효모의 mating과 stress MAP kinase pathway의 readout을 위해 형광 단백질을 발현하는 report 유전자를 효모의 염색체에 삽입하였다(도 6).

구체적으로, 형광 단백질과 필수 아미노산 합성 유전자(selection marker)를 코딩하는 플라스미드를 제조하였다. 플라스미드 pKT 128(yEGFP1-His3), pKT 176(Tdimer2-Ura3)은 타인이 제조한 것을 받아 이용했고, pSH1133(yEGFP1-PEST-His3)는 본 발명자들이 실제로 제작하여 이용하였다. 백터인 pKT 128(yEGFP1-His3)을 제한효소인 AscⅠ과 BsrGⅠ으로 37℃에서 2시간 동안 자르고, PEST domain(cln2) 유전자는 Pfu DNA 중합효소을 이용하여 효모 염색체를 주형으로 하고 서열번호 1로 기재되는 sense 프라이머 5'-gaattgtacaaagcatccaacttgaacatttcg-3'과 서열번호 2로 기재되는 antisense 프라이머 5'-gaagtggcgcgccctatattacttgggtattgcc-3'로 PCR를 수행하여 증폭하였다. PCR 온도와 시간 조건은 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분이며 40번 사이클을 수행하였다. 이 PCR 산물을 제한효소인 AscⅠ과 BsrGⅠ으로 37℃에서 2시간 동안 자르고, 이를 백터와 ligase 효소를 이용 25℃ 15분 처리하여 yEGFP1 유전자 뒷부분에 삽입하여 pSH1133(yEGFP1-PEST-His3) 플라스미드를 제작하였다.

상기 플라스미드를 주형으로 하고 효모의 염색체에 삽입하고 싶은 부분과 40 염기쌍 정도 동일한 염기서열을 가진 프라이머로 PCR을 수행하였다. 구체적으로, mating signaling을 측정하기 위한 리포트 유전자를 만들기 위해 서열번호 3으로 기재되는 sense 프라이머 5'-GAGCAGGATATAAGCCATCAAGTTTCTGAAAATCAAAATGggtgacggtgctggtttaat-3'(대문자 부분은 효모 염색체에 삽입되는 부분과 동일한 염기서열이다)과 서열번호 4로 기재되는 antisense 프라이머 5'-TATAGGTATAGATTAAATGCGAACGTCAATATTATTTTCAtcgatgaattcgagctcgtt-3'을 이용하여 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 2분, 36번 사이클 조건으로 PCR을 수행하였다. Stress signaling을 측정하기 위한 리포트 유전자를 만들기 위해 서열번호 5로 기재되는 sense 프라이머 5'-CCCCCCCTCCACAAACACAAATATTGATAATATAAAGATGggtgacggtgctggtttaat-3'(대문자 부분은 효모 염색체에 삽입되는 부분과 동일한 염기서열이다)과 서열번호 6으로 기재되는 antisense 프라이머 5'-AGTGGGGGAAAGTATGATATGTTATCTTTCTCCAATAAATtcgatgaattcgagctcgtt-3'을 이용하여 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 2분, 36번 사이클 조건으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, 형광 단백질과 필수 아미노산 합성 유전자(selection marker)의 앞뒤에 효모의 염색체와 동일한 염기서열을 가지고 있는 PCR 산물을 얻을 수 있었다. 상기 PCR 산물로 효모에 42℃, 15분 열처리를 통해 형질전환을 유도하면 염색체에서 동일한 염기서열을 가지고 있는 부위에 homologous recombination이 일어나 이 PCR 산물이 효모 SO992 균주(University of California San Francisco, USA로부터 입수)의 염색체에 삽입되었다. Mating signaling을 측정하기 위한 리포트 유전자는 효모의 fus1 프로모토 바로 뒷부분 fus1 ORF에 삽입되어지고, stress signaling을 측정하기 위한 리포트 유전자는 효모의 gpd1 프로모토 바로 뒷부분 gpd1 ORF에 삽입되어진다. 이때 homologous recombination이 일어난 효모만이 필수 아미노산 합성 단백질(selection marker)을 발현하기 때문에 제한된 아미노산이 들어 있는 선택 배지에서 생존하여 형질 전환된 효모를 선별 할 수 있다(도 6, 표 1).

신호전달 reporter 유전자

	response gene	fluorscent protein
mating	fus1	yEGFP
high osmolarity	gpd1	Tdimer2

그 결과, 외부자극에 의해 세포내 신호전달이 개시되면 형광단백질이 발현되어 현미경을 통해 육안으로 관찰할 수 있게 되었다. 신호반응을 측정하기 위한 유전자로는 mating signaling의 경우 Fus1, 그리고 stress signaling의 경우 Gpd1을 이용할 수 있다. 상기 유전자들은 각 신호반응계에서 신호 자극시에 발현량이 크게 증가하는 것으로 알려져 있다.

<실시예 2> 세포포획을 위한 나노환경 구축

본 발명자들은 신개념의 정밀한 나노환경을 구축하고 단일세포를 초미세유체망 기술을 이용해 나노환경 플랫폼 내부로 포획하였다.

구체적으로, 살아있는 세포를 단일세포 수준으로 포획하기 위해서는 세포의 크기에 맞는 마이크로웰 구조를 세포의 생존에 적합한 환경으로 제작하여야 한다. 또한, 소량의 시료를 이용하여 대면적에 세포를 포획하고, 외부에서 다양한 신호를 정밀하게 전달하기 위해서는 마이크로유체역학에 기반을 둔 마이크로 채널을 이용하는 것이 유용하다. 이를 위하여 먼저 나노 리터 용량을 가지는 마이크로웰 구조를 형성하기 위해서 모세관 성형(capillary molding) 공정을 이용하였다. 상기 공정에서는 먼저 광식각(photolithography) 공정으로 제작된 음각의 실리콘 웨이퍼 마스터 위에 PDMS(polydimethyl siloxane) 고분자를 경화시켜 양각의 PDMS stamp를 제작하였다. 다음 glass coverslip 위에 생체적합 UV 경화성 고분자를 코팅하고 양각의 PDMS stamp를 이 고분자와 접촉시킨 후 UV로 경화시키면 음각의 고분자 마이크로웰 구조를 glass coverslip 위에 형성하였다. 또한, 마이크로 채널을 제작하기 위해서 마이크로웰 구조가 형성된 glass coverslip과 PDMS microfluidic mold를 플라즈마 표면 처리하여 bonding하면 원하는 형태의 마이크로 채널을 제작하였다(도 7).

<실시예 3> 단일 세포 포획

본 발명자들은 여러 가지 신호전달에 의한 생체신호반응을 살아있는 단일세포를 대상으로 고속, 실시간 측정하고자 하였다.

구체적으로, 마이크로 채널에서 유체가 가지고 있는 표면 장력을 제어하여 단일 세포 수준으로 원하는 위치에 포획하였다. 도 8에 제시한 바와 같이, 메니스커스가 후진하면서 90% 이상의 확률로 마이크로 우물 안에 세포가 포획이 되는 것을 알 수 있다. 상기 방법은 기존의 DEP, sedimentation, hydrodynamic focusing, optical tweezer 방법 등에 비하여 대면적에 높은 확률로 포획할 수 있고 세포에 가해지는 충격을 최소화(non-invasive) 할 수 있다.

<실시예 4> 신호 반응의 단일세포 분석

본 발명자들은 살아있는 단일세포들의 신호반응을 정량적으로 15분 간격으로 time-course 분석하여 세포 신호반응의 stochasticity 여부를 확인하였다.

구체적으로, 세포포획 후 마이크로 채널을 통해 페로몬과 고농도염을 각각 또는 동시에 다양한 농도로 처리해주고 이때 reporter 유전자에서 발현되는 형광 단백질을 형광현미경(automated fluorescence microscopy)을 이용 실시간으로 관찰하고 CCD 카메라로 촬영한다. 촬영한 이미지를 이미지 분석 컴퓨터 프로그램을 사용하여 단일세포에서 발현된 형광단백질의 밝기정도를 측정 분석하였다. 각 형광단백질의 발현량을 기반으로 하여 다양한 농도의 환경 자극과 여러 시간대에서의 신호 반응을 정량적으로 분석하여 신호반응의 stochasticity 여부 그리고 각 단일 세포들이 주어진 자극에 대하여 균질적인 반응을 나타내는 지의 여부를 확인하였다. 이를 기반으로 단일 세포 수준에서 특정 신호반응에 대하여 균일한 반응을 나타내는 지의 여부를 확인하고 실제 ensemble average problem이 존재하는지의 여부를 확인하였다. 도 9는 단일세포의 신호 반응을 분석하기 위한 개략적인 흐름도를 도시한 것이다.

<실시예 5> 세포포획 및 분석

본 발명자들은 대면적에 단일 세포를 포획할 수 있는 마이크로유체역학 플랫폼을 제조하고, 이를 통하여 90% 이상의 확률로 대면적에 세포를 포획하고 단일세포 수준으로 분석하였다. 먼저 세포를 포획하고 효모의 교배신호 반응을 매개하는 페로몬을 흘려주어 세포 반응을 2시간이 지난 다음 분석하였다(도 10).

도 10에 기재된 바와 같이, 형광의 세기가 세포마다 다르며 이는 곧 세포의 반응이 단일세포 수준에서 매우 비균일하다는 것을 알려준다. 본 발명자들은 이것이 세포의 본질적인 문제인지 외부의 배양 및 포획 조건에서 기인하는 것인지 좀 더 보강된 연구가 필요하다. 또한, 두 개의 서로 다른 자극을 주어 신호 전달 체계를 더 명확히 규명할 필요가 있다. 세포 포획 측면에서도 마이크로 웰 크기 및 유체역학 조건을 최적화하여 한 개의 웰에 한 개의 세포만 포획되도록 조건을 개선할 필요가 있다.

도 1은 신호전달 단백질의 생화학적 네트워크를 사용한 세포신호전달을 나타낸 도식도이고,

도 2는 신호 반응의 동력학적 모델이고,

도 3은 Ensemble average problem; 실제 단일 세포수준에서 heterogeneous population을 갖는 경우 bulk population을 대상으로 한 연구에서의 readout은 각 population의 real response의 평균을 readout으로 측정한 것이고,

도 4는 단일세포 제어 및 분석에 중요한 나노환경 변수들(단일세포고립 및 색인; 미세환경제어; 국소신호측정; 고생산성 에세이 플랫폼)이고

도 5는 효모의 페로몬 유도 mating MAP kinase pathway와 고농도염 유도 stress MAP kinase pathway이고,

도 6은 단일세포 신호분석용 효모 형광균주 제작과정을 나타낸 모식도이고,

도 7은 마이크로웰 구조를 가지는 마이크로 채널 제작 과정 모식도 및 실제 제작예이고,

도 8은 효모를 10 mm well에서 단일 세포 수준으로 포획할 수 있음을 나타낸 세포포획이고,

도 9는 단일세포 신호 반응 분석 흐름도이고,

도 10은 단일세포 수준의 세포 포획 및 분석예이다.

<110> Seoul National University industry Foundation <120> Cell Signaling Analysis Method of Single-Cell <130> 2007p-10-186 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEST sense primer <400> 1 gaattgtaca aagcatccaa cttgaacatt tcg 33 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEST antisense primer <400> 2 gaagtggcgc gccctatatt acttgggtat tgcc 34 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mating signaling sense primer <400> 3 gagcaggata taagccatca agtttctgaa aatcaaaatg ggtgacggtg ctggtttaat 60 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mating signaling antisense primer <400> 4 tataggtata gattaaatgc gaacgtcaat attattttca tcgatgaatt cgagctcgtt 60 60 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stress signaling sense primer <400> 5 ccccccctcc acaaacacaa atattgataa tataaagatg ggtgacggtg ctggtttaat 60 60 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stress signaling antisense primer <400> 6 agtgggggaa agtatgatat gttatctttc tccaataaat tcgatgaatt cgagctcgtt 60 60

Claims

ⅰ) 단일세포 신호분석용 효모 형광균주를 제조하는 단계; 및

ⅱ) 상기 형광 균주의 단일 세포로부터 신호 반응으로 단일세포를 분석하는 단계를 포함하는, 단일세포의 신호분석방법.
제 1항에 있어서, 상기 효모 형광균주의 제조단계 이후에 추가적으로,

상기 균주를 이용한 세포포획을 위한 나노환경을 구축하는 단계; 및

상기 나노환경으로부터 단일 세포를 포획하는 단계를 포함시키는 것을 특징으로 하는 단일세포의 신호분석방법.
제 2항에 있어서, 상기 나노환경의 구축은 마이크로유체역학에 기반을 둔 마이크로 채널을 이용하는 것을 특징으로 하는 단일세포의 신호분석방법.
제 3항에 있어서, 상기 마이크로 채널의 이용은 광식각(photolithography) 공정으로 제작된 음각의 실리콘 웨이퍼 마스터 위에 PDMS(polydimethyl siloxane) 고분자를 경화시켜 양각의 PDMS stamp를 제작하고, glass coverslip 위에 생체적합 UV 경화성 고분자를 코팅하고 양각의 PDMS stamp를 이 고분자와 접촉시킨 후 UV로 경화시키면 음각의 고분자 마이크로웰 구조를 glass coverslip 위에 형성하고, glass coverslip과 PDMS microfluidic mold를 플라즈마 표면 처리하여 bonding하면 원하는 형태의 마이크로 채널을 제작하는 것을 특징으로 하는 단일세포의 신호분석방법.
제 2항에 있어서, 상기 단일 세포 포획은 메니스커스가 후진하면서 마이크로 우물 안에 세포를 포획하는 것을 특징으로 하는 단일세포의 신호분석방법.
제 1항에 있어서, 상기 신호 반응의 단일세포 분석은 살아있는 단일세포들의 신호반응을 정량적으로 time-course 분석하여 세포 신호반응의 stochasticity 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 단일세포의 신호분석방법.
제 6항에 있어서, 상기 신호 반응의 단일세포 분석은 페로몬 또는 고농도염을 처리하고, 형광 단백질의 밝기정도를 측정하여 분석하는 것을 특징으로 하는 단일세포의 신호분석방법.