KR101672654B1 - 생체 시료의 선별적 처리방법 - Google Patents

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Abstract

생체 시료들이 배치된 기판을 제공하는 단계; 상기 생체 시료들의 종류 및 위치를 판독하여 상기 생체 시료들 중 적어도 하나의 대상 시료를 선별하는 단계; 상기 대상 시료의 주변을 둘러싸도록 배리어 구조물을 형성하여 상기 대상 시료가 위치한 영역을 구획화함으로써 상기 대상 시료를 나머지 생체 시료들로부터 공간적으로 분리시키는 단계; 상기 구획화된 영역 내에 생화학 반응시약을 도입하는 단계; 및 상기 생화학 반응시약과 상기 대상 시료의 생화학 반응을 수행하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 처리 방법이 제공된다.

Description

생체 시료의 선별적 처리방법 {SELECTIVE TREATING METHOD FOR BIOSPECIMEN}
본 명세서에 개시된 기술은 생체 시료의 선별적 처리방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체 시료 중 원하는 대상 시료를 선별해내고 다른 생체 시료의 오염없이 전처리 및 회수가 용이한 생체 시료의 선별적 처리방법에 관한 것이다.
생체 시료의 일례로서, 조직은 매우 많은 수의 세포로 이루어져 있고 그 세포들이 모두 같은 DNA나 RNA를 가지고 있는 것은 아니다. 따라서 조직, 일례로 암 조직이 어떤 변이나 이상을 갖는지를 정확하게 판단하기 위해 세포를 하나씩 분리하여 단일세포로 분석하는 기술이 필요하다.
단일세포 분석 방식은 세포 관찰방식과, DNA/RNA/단백질 분석방식으로 구분되며, 여기서 세포 관찰방식은 분석을 위해 처음부터 분석대상을 분리해내는 DNA/RNA/단백질 분석방식과는 달리 현미경으로 세포를 관찰 도중 분석이 필요한 것으로 선별된 타겟 세포를 추후 분리하게 되는데, 이 경우 타겟 세포에 손상 혹은 오염의 우려가 있다. 또한 한꺼번에 여러 세포를 분리하기 어렵고 미량으로 고순도 분석이 어렵다는 단점이 있다.
상기 단일세포 분석의 상용화된 기술들로는, 서스펜드 세포(suspend cell) 상태에서 세포를 하나씩 분리하는 방법과, 고체조직 상에서 미세절제(microdissection)을 이용하여 분리하는 방법 등을 들 수 있다.
전자의 경우, 관련 기술로서 미국공개특허 제2013-0295602호에 마이크로유체(microfluidics) 디바이스를 개시하고 있고, 미국공개특허 제2008-0124726호에 FACS (Fluorescence-activated cell sorting) 관련 기술을 개시하고 있으며, 이밖에 마이크로피펫팅(micropipetting)을 포함할 수 있는데, 액체 상태에서 부유하는 세포들만 하나씩 분석가능한 단점이 있다.
후자의 경우, 레이저 미세절제(laser microdissection)가 있으며, 주로 고체 상태의 세포를 레이저를 이용하여 분리하기 때문에 세포에 손상이 전해질 수 있고 하나의 세포만 분리하기에는 정확도가 떨어질 뿐 아니라 자동화하기 어렵고 한꺼번에 여러 세포를 분리하기 힘든 단점이 있다. 특히, 목적 시료를 분리하여 개별 실험 튜브로 옮기는 방식에 해당하므로 해당 목적 시료가 오염되는 문제점을 갖는다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, 생체 시료들이 배치된 기판을 제공하는 단계; 상기 생체 시료들의 종류 및 위치를 판독하여 상기 생체 시료들 중 적어도 하나의 대상 시료를 선별하는 단계; 상기 대상 시료의 주변을 둘러싸도록 배리어 구조물을 형성하여 상기 대상 시료가 위치한 영역을 구획화함으로써 상기 대상 시료를 나머지 생체 시료들로부터 공간적으로 분리시키는 단계; 상기 구획화된 영역 내에 생화학 반응시약을 도입하는 단계; 및 상기 생화학 반응시약과 상기 대상 시료의 생화학 반응을 수행하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 처리 방법이 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, 생체 시료들이 배치된 기판을 제공하는 단계; 상기 생체 시료들을 관찰하여 상기 생체 시료들 중 적어도 하나의 대상 시료를 선별하는 단계; 상기 대상 시료의 주변을 둘러싸도록 배리어 구조물을 형성하여 상기 대상 시료가 위치한 영역을 구획화함으로써 상기 대상 시료를 나머지 생체 시료들로부터 공간적으로 분리시키는 단계; 상기 구획화된 영역 내에 상기 생화학 반응시약을 도입하는 단계; 상기 생화학 반응시약과 상기 대상 시료의 생화학 반응을 통해 상기 대상 시료를 전처리하는 단계; 및 상기 대상 시료를 상기 기판 상에서 분석하거나 상기 기판으로부터 회수하여 분석하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 분석방법이 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 생체 시료들이 배치된 기판을 제공하는 단계; 상기 생체 시료들의 종류 및 위치를 판독하여 상기 생체 시료들 중 적어도 하나의 대상 시료를 선별하는 단계; 상기 대상 시료의 주변을 둘러싸도록 배리어 구조물을 형성하여 상기 대상 시료가 위치한 영역을 구획화함으로써 상기 대상 시료가 위치한 마이크로웰을 형성하는 단계; 상기 마이크로웰 내에 라이시스 용액을 도입하여 상기 대상 시료를 용해시키는 단계; 상기 용해에 의해 상기 대상 시료로부터 유래된 핵산 분자들을 생화학 반응시약으로 전처리하여 시퀀싱을 위한 상기 핵산 분자들의 라이브러리를 준비하는 단계; 상기 핵산 분자들의 라이브러리를 상기 기판으로부터 회수하는 단계; 및 회수된 상기 핵산분자들의 라이브러리를 시퀀싱하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 분석방법이 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 생체 시료들이 배치된 기판을 장착한 스테이지; 상기 생체 시료들을 관찰하고 적어도 하나의 대상 시료를 선별하기 위한 이미징 처리부; 상기 선별된 대상 시료가 위치한 영역 주변을 둘러싸도록 배리어 구조물을 쌓음으로써 마이크로웰을 형성하기 위한 마이크로웰 제조부; 및 상기 마이크로웰 내의 상기 대상 시료의 생화학 반응을 위한 생화학적 처리부를 포함하는 생체 시료의 선별적 처리장치가 제공된다.
도 1은 생체 시료 중 대상 시료를 선택적으로 처리하는 방법의 일 구현예를 나타낸 공정흐름도이다.
도 2는 생체 시료 중 대상 시료의 선별 및 그 분석을 위한 배리어 구조물 형성 공정의 일 구현예를 나타낸 개략도이다.
도 3은 도 2의 C에 해당하는 배리어 구조물이 존재하는 기판의 부분확대 단면도를 나타낸다.
도 4는 배리어 구조물이 형성된 기판 위에 생화학 반응 시약을 도입하는 과정의 일 구현예를 나타낸다.
도 5는 도 1에서 나타낸 생체 시료의 선별적 처리방법의 구체적 적용 예시도이다.
도 6은 생체 시료의 선별적 처리장치의 일 구현예를 나타낸 도면이다.
이하, 도면을 참조하여 본 명세서에 개시된 기술의 구현예들에 대해 상세히 설명하고자 한다. 다음에 소개되는 구현예들은 당업자에게 개시된 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위한 예로서 제공되는 것이다. 따라서 개시된 기술은 이하 설명된 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 그리고 도면들에 있어서, 구성요소의, 폭, 길이, 두께 등은 편의를 위하여 과장되어 표현될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조 부호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다. 전체적으로 도면 설명시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 구성요소가 다른 구성요소 위에 있다고 할 때, 이는 다른 구성요소 바로 위에 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 또 다른 구성요소가 있는 경우도 포함한다.
도 1은 생체 시료 중 대상 시료를 선택적으로 처리하는 방법의 일 구현예를 나타낸 공정흐름도이다. 도 1을 참조하면, 단계 110에서 생체 시료들이 배치된 기판이 제공된다.
상기 생체 시료는 상기 기판 위에 고정되거나 고정되지 않을 수 있다. 상기 생체 시료는 달리 특정되지 않는 한, 조직, 혈액, 세포, DNA, RNA, 단백질, 엑소좀, 대사체(metabolite) 및 생검 검사물(biopsy specimen)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 상기 조직은 일례로 고형 조직(solid tissue)일 수 있고, 상기 세포는 일례로 서스펜션(suspension) 세포, 혹은 스미어드(smeared) 세포일 수 있다.
상기 기판은 상기 생체 시료를 지지하기 위한 표면을 제공하는 것이라면 특별히 제한되지 않지만, 슬라이드 글래스, 마이크로 비드, 나노입자, 나노 구조체, 모세관, 미세유체 지지체, 공극 구조체, 스폰지 구조체, 및 덴드리머로 이루어진 군중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 상기 기판은 통상 슬라이드 글래스일 수 있다.
상기 기판은 유리, 실리콘 또는 고분자 재질로 이루어질 수 있으며, 예를 들어, DNA나 단백질 등의 생체 시료가 집적된 마이크로어레이 기판, 차세대염기서열 분석 기판일 수 있다.
단계 120에서, 상기 생체 시료들의 종류 및 위치를 판독하여 상기 생체 시료들 중 적어도 하나의 대상 시료를 선별한다.
상기 생체 시료들의 위치는 예를 들어 이미지 관찰, 형광 신호 또는 좌표 정보를 통해 판독될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 상기 대상 시료를 선별하는 단계는 광학 현미경 또는 전자 현미경을 통해 직접 눈으로 관찰하는 방식 또는 별도 소프트웨어를 이용한 자동화된 방식으로 상기 생체 시료들의 위치 정보를 얻음으로써 수행할 수 있다.
단계 130에서, 상기 대상 시료의 주변을 둘러싸도록 배리어 구조물을 형성하여 상기 대상 시료가 위치한 영역을 구획화함으로써 상기 대상 시료를 나머지 생체 시료들로부터 공간적으로 분리시킨다.
도 2는 생체 시료 중 대상 시료의 선별 및 그 분석을 위한 배리어 구조물 형성 공정의 일 구현예를 나타낸 개략도이다. 도 2를 참조하면, A, B, C, D 각 그림별로 좌측 평면도에서 점선 표시된 절단선의 측단면도를 우측 도면으로 병기한다. 구체적으로, 도 2의 A는 기판(210) 위에 배치된 생체 시료(220), 일례로 복수개의 세포들의 이미지를 개략적으로 나타낸 것이고, 도 2의 B는 기판 위에서 선별된 대상 시료(220), 일례로 단일 세포를 도시한 것이다. 도 2의 C에서 대상 시료(220)의 주변을 둘러 싼 배리어 구조물(230)이 형성된다. 배리어 구조물(230)은 종래에 기판에서 대상 시료(target specimen)를 분리해내면서 어떠한 방식으로든지 대상 시료에 손상을 주었던 문제점을 극복하고 대상 시료에 손상을 주지 않도록 도입된 것이다. 도 2의 D를 참조하면, 배리어 구조물(230)은 일례로 기판(210)에서 생화학 반응 시약(270)이 대상 시료(220)가 위치한 구획화된 영역(260)의 외부로 유출되지 않도록 하여 생화학 반응 시약(270)이 다른 시료에 미치는 영향을 차단한다. 배리어 구조물(230)은 생화학 반응 시약(270)에 대해 물리적 또는 화학적으로 보호되는 재질로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 배리어 구조물(230)은 고분자 수지, 왁스, 금속, 금속 산화물 및 유리로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 재질로 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, 상기 배리어 구조물을 형성하는 단계는 경화성 물질을 상기 기판 위에 도포하고 빛 또는 열로 경화하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 경화성 물질은 불포화 단량체를 포함할 수 있으며, 상기 불포화 단량체의 비제한적인 예들은 에톡시화 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트, 경화형 에폭시(제품명 NOA), 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리프로필렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리우레탄 아크릴레이트 및 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 상술한 폴리에틸렌 디아크릴레이트는 폴리에틸렌 글리콜 양 말단에 아크릴레이트 작용기를 갖는 구조를 가지므로 자유라디칼 중합이 일어날 경우 3차원 구조로 가교될 수 있다. 기타, 경화성 물질은 액체에서 고체로 변할 수 있는 어떠한 형태의 매질도 포함할 수 있다.
상기 경화성 물질은 개시제를 더 포함할 수 있으며, 외부의 에너지원에 의해 자유라디칼 중합을 유발할 수 있다. 개시제는 아조계 화합물 또는 과산화물이 될 수 있다. 경화성 물질은 적절한 가교제를 더 포함할 수 있으며, 예를 들면 N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드, 메틸렌비스메타크릴아마이드 및 에틸렌글리콜디메타크릴레이트 등을 들 수 있다. 상기 경화반응에 적절한 에너지원은 열, 자외선, 가시광선, 적외선 및 전자빔을 제한 없이 포함할 수 있다.
상기 배리어 구조물을 형성하기 위한 방식은 다양한 패터닝 공정에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 리소그래피 방식, 잉크젯 프린팅 방식 또는 3D 프린팅 방식으로 형성할 수 있다. 구체적으로 상기 배리어 구조물을 형성하기 위해 일례로 일반적인 광 리소그래피를 이용하거나, 디지털 미러 디바이스(DMD)를 이용한 광유체적 무마스크 리소그래피(Optofluidic Maskless Ligthography)를 이용할 수 있다.
상기 배리어 구조물에 의해 상기 구획화된 영역은 마이크로웰(microwell) 형태를 가질 수 있다. 이때 상기 마이크로웰은 웰 내부의 너비가 1um 내지 1mm 범위 내일 수 있고, 웰의 모양은 원형, 다각형 혹은 무정형일 수 있다.
상기 구획화된 영역들은 상기 기판 위에 하나 혹은 복수 개 존재할 수 있으며, 복수 개 존재할 경우 그 크기가 서로 동일하거나 다를 수 있다. 상기 구획화된 영역의 크기는 관심있는 대상 시료의 개수에 따라 정해질 수 있으며, 상기 구획화된 영역 내에 상기 대상 시료가 1개 존재하거나, 2개 이상 다수 존재할 수 있으며, 예를 들어 대상 시료의 종류 및 크기에 따라 상기 구획화된 영역 내에 수십 개 혹은 수백 개 이상 존재할 수도 있다. 또한 예를 들어, 대상 시료가 세포일 경우 상기 구획화된 영역은 세포를 1개를 수용하는 크기이거나, 심지어 세포 1개 미만의 크기를 가질 수도 있다. 즉 하나의 세포의 일부분 위에 상기 구획화된 영역이 존재할 수도 있다.
도 3은 도 2의 C에 해당하는 배리어 구조물이 존재하는 기판의 부분확대 단면도를 나타낸다. 도 3을 참조하면, 대상 시료로서 특정 단일세포(310)를 선별한 경우 배리어 구조물(320)이 특정 단일세포(310) 주변을 둘러싸며 형성됨으로써, 구획화된 영역(330) 내에 하나의 세포만이 존재하고 외부의 다른 세포들은 대상 시료로부터 공간적으로 분리되는 형태를 제시한다. 그리하여 이러한 상태에서 추후 생체 시료를 단일세포 레벨로 분석해낼 수 있다.
단계 140에서, 상기 구획화된 영역 내에 생화학 반응시약을 도입한다.
도 2의 D를 참조하면, 선별된 대상 시료(225)가 위치한 구획화된 영역(260) 내로 생화학 반응시약(270)이 도입된다. 상기 생화학 반응시약의 도입은 마이크로디스펜싱 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 상기 마이크로디스펜싱(Microdispensing)은 1 마이크로리터 미만, 혹은 0.1 마이크로리터 미만의 액상 매질을 투입하는 기술이다. 상기 마이크로디스펜싱의 바람직한 예로 잉크젯 프린팅을 들 수 있다. 필요에 따라서는 상기 생화학 반응시약의 도입은 0.1 마이크로리터 이상의 대용량 피펫팅에 의해 수행될 수 있다.
상기 생화학 반응시약은 라이시스 용액(lysis solution), PCR 반응용 시약, 전장유전체증폭 반응(whole genome amplification)용 시약 및 전사체 증폭 반응(whole transcriptome amplification)용 시약 등 여러 생화학 반응에 필요한 시약을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
상기 라이시스 용액으로는, 일례로 염기성 용해시약 혹은 프로티네이즈 (Proteinase) 등을 사용할 수 있다.
이때 기타의 생화학 반응 시약을 도입하기 이전에 먼저 라이시스 용액(lysis solution)을 사용한 다음 목적에 맞는 기타의 생화학 반응시약을 도입하거나 라이시스 용액과 기타의 생화학 반응시약을 함께 상기 구획화된 영역 내에 도입할 수도 있다.
상기 생화학 반응시약은 예를 들어 트랜스포사제(transposase), 리가제(ligase) 등을 포함하는 차세대 염기서열 분석을 위한 라이브러리 준비 반응을 위한 시약일 수 있다.
상기 생화학 반응 시약은 상기 배리어 구조물에 의해 구획화된 영역 내에만 주입될 수 있고, 필요에 따라서는 상기 배리어구조물에 의해 구획화된 영역뿐 아니라 상기 구획화된 영역 외에도 주입될 수 있다.
도 4는 배리어 구조물이 형성된 기판 위에 생화학 반응 시약을 도입하는 과정의 일 구현예를 나타낸다. 도 4를 참조하면, 생화학 반응시약이 구획화된 영역 내 뿐만 아니라 구획화된 영역 밖의 영역에 주입되더라도 배리어 구조물에 의한 확산(diffusion) 방지 등의 효과로 반응 결과물이 서로 섞이지만 않으면 추후 대상 시료에 대한 정확한 분석이 가능할 수 있다.
상기 생화학 반응 시약은 DNA 마이크로어레이 기판, 차세대염기서열 분석기판 혹은 차세대염기서열분석용 플로우 셀(flow cell) 위에 있는 바이오 물질을 반응시키기 위한 시약 주입을 위해 사용될 수도 있다.
단계 150에서, 상기 생화학 반응시약과 상기 대상 시료의 생화학 반응을 통해 상기 대상 시료를 전처리한다. 이들 생화학 반응에 의해 일례로 대상 시료로부터 유래된 핵산 분자를 증폭하게 된다.
상기 생화학 반응은 서로 다른 마이크로웰의 반응물을 태깅(tagging) 하기 위해 서로 다른 종류의 올리고뉴클레오타이드들(oligonucleotides)을 주입하여 기존 반응물에 라이게이션(ligation), 삽입(insertion) 시키는 반응을 포함할 수 있다. 상기 생화학 반응은 또한 ELISA, 앱타머 바인딩(aptamer binding), 질량 분광법(mass spectroscopy)을 위한 전처리 반응을 포함할 수 있다.
일 구현예에서 상기 구획화된 영역에 교반, 진동 또는 초음파 등의 물리적 힘을 인가하여 상기 생화학 반응을 더욱 촉진시킬 수 있다. 또한 목적에 따라 적절한 생화학 반응을 유도하기 위해 온도의 조절과정이 필요할 수 있다. 한편, 상기 전처리하는 과정에서 항습 유지 및 오일을 이용한 실링 처리 등과 같은 건조방지 처리 과정을 추가하면 상기 생화학 반응시약의 건조를 방지할 수 있어 바람직하다.
단계 160에서, 상기 대상 시료를 상기 기판으로부터 회수한다.
상기 대상 시료를 상기 기판으로부터 회수하는 과정은 마이크로 피펫팅, 초음파, 광압, 레이저, 스탬핑, 풀링, 및 흡수 및 마이크로 비드를 이용한 혼성화 방식으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 방법으로 수행될 수 있다. 회수 방식의 구체적인 예로서, 1개 이상의 대상 시료를 그룹화하여 인덱싱 후 풀링하여 회수할 수 있고, 각 구획의 대상 시료를 미세 유체관을 이용하여 회수할 수 있다.
본 명세서에 개시된 생체 시료의 선별적 처리방법은 생체 시료 중에서 원하는 대상 시료를 이미징 등을 통해 관찰하면서 선별하고 다른 생체 시료에 오염되지 않고 전처리할 수 있으며 손상없이 원하는 대상 시료를 용이하게 기판으로부터 분리하여 회수할 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, 상술한 단계 110 내지 단계 150의 방법으로 얻은 대상 시료를 상기 기판 위에서 그대로 분석하거나 상기 기판으로부터 회수하여 분석함으로써 기판 상의 생체 시료를 선별적으로 분석하는 방법이 제공된다.
생체 시료를 선별적으로 분석하는 방법의 일 구현예는 다음과 같이 수행될 수 있다. 먼저 생체 시료들이 배치된 기판을 제공한다. 다음 상기 생체 시료들을 관찰하여 상기 생체 시료들 중 적어도 하나의 대상 시료를 선별한다. 이어서 상기 대상 시료의 주변을 둘러싸도록 배리어 구조물을 형성하여 상기 대상 시료가 위치한 영역을 구획화함으로써 상기 대상 시료가 위치한 마이크로웰을 형성한다. 그리고 상기 마이크로웰 내에 라이시스 용액을 도입하여 상기 대상 시료를 용해시킨다. 다음 상기 용해에 의해 상기 대상 시료로부터 유래된 핵산 분자들을 생화학 반응시약으로 전처리하여 시퀀싱을 위한 상기 핵산 분자들의 라이브러리를 준비한다. 이어서 상기 핵산 분자들의 라이브러리를 상기 기판으로부터 회수한다. 이후 회수된 상기 핵산분자들의 라이브러리를 시퀀싱함으로써 기판 상의 생체 시료를 선별적으로 분석할 수 있다.
바람직하게는 상기 시퀀싱은 분석 효율이 매우 높은 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing) 기술과 같은 하이-쓰루풋 시퀀싱(high-throughput sequencing) 기술에 의해 수행될 수 있다.
시퀀싱을 수행함으로써 염기서열의 종류에 따라 순차적으로 발생하는 광학적, 전자기적 시그널을 위치 정보와 함께 제공받을 수 있다. 차세대 염기서열 분석법을 이용하면 한번에 동시에 수십만 개 이상의 서열을 분석하게 되므로 기존의 전통적인 염기서열 분석방법에 비해 분석처리량이 매우 높으며(high-throughput), 이를 통해 분석하고자 하는 표본의 염기서열에 대한 통계자료를 제공받을 수 있다.
도 5는 도 1에서 나타낸 생체 시료의 선별적 처리방법의 구체적 적용 예시도이다. 도 5를 참조하면, 본 명세서에 개시된 기술에 따른 생체 시료의 선별적 처리방법은 다음과 같은 순서로 이루어질 수 있다.
도 5의 (a)를 참조하면, 생체 시료의 일종인 세포가 배치된 기판을 관찰하여 상기 생체 시료들 중 적어도 하나의 대상 시료를 선별한다. 그 위에 UV 경화성 폴리머를 도포하며, 이미징 장치(미도시)를 통해 선별된 대상 시료 주변으로 디지털 미러 디바이스(DMD)를 통해 UV램프를 조사하여 광유체적 무마스크 리소그래피(Optifluidic Maskless Lithography) 혹은 일반적인 광 리소그래피를 이용하여 경화성 물질을 광경화한다. 도 5의 (b)를 참조하면, 상기 대상 시료의 주변을 둘러싸도록 배리어 구조물을 형성하여 상기 대상 시료가 위치한 마이크로웰 내에 존재하도록 한다. 도 5의 (c)를 참조하면, 잉크젯 디스펜서를 이용하여 라이시스 용액 등 생화학 반응시약을 상기 마이크로웰 내로 도입하여 상기 대상 시료를 전처리를 함으로써 상기 대상 시료로부터 유래된 핵산 분자들의 라이브러리를 얻는다. 도 5의 (d)를 참조하면, 얻어진 핵산 분자들의 라이브러리를 회수하여 차세대 염기서열 분석장비(NGS machine)를 이용하여 시퀀싱한다.
상술한 바와 같은 생체 시료의 선별적 처리 방법 또는 분석 방법에 따르면, 조직 (특히 암조직)이 어떤 변이나 이상을 가지고 있는지 정확하게 판단할 수 있다.
예를 들어 암환자로부터 추출한 암 조직을 글래스에 도포한 후 통상 사용하는 염색 시약(일례로 giemsa)을 염색하여 현미경으로 관찰하면서 원하는 세포를 선별하여 회수하여 염기서열 분석을 할 수 있다.
레이저 미세절단 기술과 비교하면, 레이저를 사용하지 않으므로 생체 시료를 손상시키지 않고, 생화학적 반응을 위해 생체 시료를 다른 반응 공간으로 옮기는 과정이 필요없기 때문에 오염의 문제가 적어진다. 또한 공정의 특성상 자동화가 쉽기 때문에 상용 제품화가 용이하다.
특히 마이크로 스케일의 반응 공간에서 생체 시료에 대한 생화학 반응이 일어나기 때문에 매우 적은 양의 시약만 사용해도 되며 대량분석이 용이한 장점이 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 생체 시료의 선별적 처리방법에 사용되는 장치가 제공된다. 도 6은 생체 시료의 선별적 처리장치의 일 구현예를 나타낸 도면이다. 도 6을 참조하면, 생체 시료 중 대상 시료의 선별적 처리장치(600)는 생체 시료들이 배치된 기판을 장착한 스테이지(610); 상기 생체 시료들을 관찰하고 적어도 하나의 대상 시료를 선별하기 위한 이미징 처리부(620); 상기 선별된 대상 시료가 위치한 영역 주변을 둘러싸도록 배리어 구조물을 형성하기 위한 마이크로웰 제조부(630); 및 상기 마이크로웰 내의 상기 대상 시료의 생화학 반응을 위한 생화학적 처리부(640)를 포함한다.
스테이지(610)는 기판을 장착하기 위한 마운트를 포함할 수 있으며, 정밀한 조작을 위해 전동 스테이지인 것이 바람직하다.
이미징 처리부(620)는 기판 상의 대상 시료의 종류 및 위치 판독을 위한 이미징 장치를 포함할 수 있고, 구체적인 예로 관찰을 위한 광학 현미경 또는 전자 현미경 등을 들 수 있다.
마이크로웰 제조부(630)는 구체적인 예로, 리소그래피 시스템, 잉크젯 프린팅 시스템 혹은 3D 프린팅 시스템을 포함할 수 있다. 일례로 마이크로웰 제조부(630)는 광유체적 무마스크 리소그래피 시스템을 구비할 수 있다. 이를 위해 상기 마이크로웰 제조부(630)는 UV 광원, 디지털 미러 디바이스, 렌즈 등을 구비할 수 있다.
생화학적 처리부(540)는 생화학 반응시약의 저장 수단 및 공급 수단 등을 구비할 수 있다. 일 구현예에서, 생화학적 처리부(540)는 마이크로웰과 같이 대상 시료가 위치한 구획화된 반응 공간에 교반, 진동 또는 초음파 등의 물리적 힘을 인가하기 위한 반응촉진 장치를 포함할 수 있다. 또는 일 구현예에서, 생화학적 처리부(540)는 반응 온도 조절을 위한 온도 제어장치를 포함할 수 있다.
상술한 생체 시료의 선별적 처리장치는 필요에 따라 생화학 반응 시약으로 전처리된 대상 시료를 추출하기 위한 추출장치 및/또는 상기 추출장치로 추출된 시료를 시퀀싱하기 위한 염기서열 분석장비를 더 포함할 수 있다. 상기 염기서열 분석 장비는 통상 사용하는 염기서열 분석장비라면 특정하지 않으나, 시퀀싱의 분석 효율을 고려할 때 차세대 염기서열 분석장비(Next generation sequencing)를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 생체 시료의 선별적 처리장치는 단일세포 수준까지 분석이 가능하므로 다양하게 응용될 수 있다. 즉, 원하는 생체 시료를 선별적으로 분석하기 위한 바이오 분석기기나, 유전자 진단용 장비 등에 적용될 수 있다.
이상에서 본 명세서에 개시된 기술의 구현예들에 대해 상세히 기술하였지만, 해당 기술 분야에 있어서 통상의 지식을 가진 사람이라면, 본 명세서에 개시된 기술의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 명세서에 개시된 기술을 변형하여 실시할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (17)

  1. 생체 시료들이 배치된 기판을 제공하는 단계;
    상기 생체 시료들의 종류 및 위치를 판독하여 상기 생체 시료들 중 적어도 하나의 대상 시료를 선별하는 단계;
    상기 대상 시료의 주변을 둘러싸도록 생화학 반응시약에 대해 보호되는 재질로 이루어지거나 경화성 물질의 경화로 이루어진 배리어 구조물을 형성하여 상기 대상 시료가 위치한 영역을 구획화함으로써 상기 대상 시료를 나머지 생체 시료들로부터 공간적으로 분리시키는 단계;
    상기 구획화된 영역 내에 상기 생화학 반응시약을 도입하는 단계; 및
    상기 생화학 반응시약과 상기 대상 시료의 생화학 반응을 수행하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 처리 방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 생체 시료는 조직, 혈액, 세포, DNA, RNA, 단백질, 엑소좀, 대사체(metabolite) 및 생검 검사물(biopsy specimen)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상인 생체 시료의 선별적 처리방법.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 대상 시료를 선별하는 단계는 광학 현미경 또는 전자 현미경을 통해 직접 눈으로 관찰하는 방식 또는 별도 소프트웨어를 이용한 자동화된 방식으로 상기 생체 시료들의 위치 정보를 얻음으로써 수행하는 생체 시료의 선별적 처리방법.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 생체 시료들의 위치를 판독하는 단계는 이미지 관찰, 형광 신호 또는 좌표 정보를 통해 수행되는 생체 시료의 선별적 분석방법.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 구획화된 영역은 마이크로웰 형태를 갖는 생체 시료의 선별적 처리방법.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 배리어 구조물은 상기 생화학 반응 시약이 상기 대상 시료가 위치한 상기 구획화된 영역 외부로 유출되지 않도록 물리적 또는 화학적으로 보호되는 재질로 이루어진 생체 시료의 선별적 처리방법.
  7. 제6 항에 있어서,
    상기 배리어 구조물은 고분자 수지, 왁스, 금속, 금속 산화물 및 유리로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 재질로 이루어진 생체 시료의 선별적 처리방법.
  8. 제1 항에 있어서,
    상기 배리어 구조물의 형성은 리소그래피 방식, 잉크젯 프린팅, 및 3D 프린팅 방식으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방식에 의해 이루어지는 생체 시료의 선별적 분석방법.
  9. 제1 항에 있어서,
    상기 배리어 구조물을 형성하는 단계는 경화성 물질을 상기 기판 위에 도포하고 빛 또는 열로 경화하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 처리방법.
  10. 제1 항에 있어서,
    상기 대상 시료를 상기 기판으로부터 회수하는 단계를 더 포함하는 생체 시료의 선별적 처리방법.
  11. 제1 항에 있어서,
    상기 생화학 반응시약의 도입은 마이크로디스펜싱 방법을 이용하여 수행되는 생체 시료의 선별적 처리방법.
  12. 제1 항에 있어서,
    상기 생화학 반응시약은 라이시스 용액(lysis solution), PCR 반응용 시약, 전장유전체증폭 반응(whole genome amplification)용 시약 및 전사체 증폭 반응(whole transcriptome amplification)용 시약으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상인 생체 시료의 선별적 처리방법.
  13. 제10 항에 있어서,
    상기 대상 시료를 상기 기판으로부터 회수하는 단계는 마이크로 피펫팅, 초음파, 광압, 레이저, 스탬핑, 풀링 및 흡수로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 방법으로 수행되는 생체 시료의 선별적 처리방법.
  14. 생체 시료들이 배치된 기판을 제공하는 단계;
    상기 생체 시료들을 관찰하여 상기 생체 시료들 중 적어도 하나의 대상 시료를 선별하는 단계;
    상기 대상 시료의 주변을 둘러싸도록 생화학 반응시약에 대해 보호되는 재질로 이루어지거나 경화성 물질의 경화로 이루어진 배리어 구조물을 형성하여 상기 대상 시료가 위치한 영역을 구획화함으로써 상기 대상 시료를 나머지 생체 시료들로부터 공간적으로 분리시키는 단계;
    상기 구획화된 영역 내에 상기 생화학 반응시약을 도입하는 단계;
    상기 생화학 반응시약과 상기 대상 시료의 생화학 반응을 통해 상기 대상 시료를 전처리하는 단계; 및
    상기 대상 시료를 상기 기판 상에서 분석하거나 상기 기판으로부터 회수하여 분석하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 분석방법.
  15. 생체 시료들이 배치된 기판을 제공하는 단계;
    상기 생체 시료들을 관찰하여 상기 생체 시료들 중 적어도 하나의 대상 시료를 선별하는 단계;
    상기 대상 시료의 주변을 둘러싸도록 생화학 반응시약에 대해 보호되는 재질로 이루어지거나 경화성 물질의 경화로 이루어진 배리어 구조물을 형성하여 상기 대상 시료가 위치한 영역을 구획화함으로써 상기 대상 시료가 위치한 마이크로웰을 형성하는 단계;
    상기 마이크로웰 내에 라이시스 용액을 도입하여 상기 대상 시료를 용해시키는 단계;
    상기 용해에 의해 상기 대상 시료로부터 유래된 핵산 분자들을 생화학 반응시약으로 전처리하여 시퀀싱을 위한 상기 핵산 분자들의 라이브러리를 준비하는 단계;
    상기 핵산 분자들의 라이브러리를 상기 기판으로부터 회수하는 단계; 및
    회수된 상기 핵산분자들의 라이브러리를 시퀀싱하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 분석방법.
  16. 생체 시료들이 배치된 기판을 장착한 스테이지;
    상기 생체 시료들을 관찰하고 적어도 하나의 대상 시료를 선별하기 위한 이미징 처리부;
    상기 선별된 대상 시료가 위치한 영역 주변을 둘러싸도록 생화학 반응시약에 대해 보호되는 재질로 이루어지거나 경화성 물질의 경화로 이루어진 배리어 구조물을 쌓음으로써 마이크로웰을 형성하기 위한 마이크로웰 제조부; 및
    상기 마이크로웰 내의 상기 대상 시료의 생화학 반응을 위한 생화학적 처리부를 포함하는 생체 시료의 선별적 처리장치.
  17. 제16 항에 있어서,
    상기 생화학적 처리부는 교반, 진동 및 초음파로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 물리적 힘을 인가하기 위한 반응촉진 장치를 더 포함하는 생체 시료의 선별적 처리장치.
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