KR20090029015A

KR20090029015A - 아룸 팔래스티눔(ＡｒｕｍｐａｌａｅｓｔｉｎｕｎＢｏｉｓｓ) 유래 항암용 피페라지움 화합물

Info

Publication number: KR20090029015A
Application number: KR1020070094232A
Authority: KR
Inventors: 김영균
Original assignee: 국민대학교산학협력단
Priority date: 2007-09-17
Filing date: 2007-09-17
Publication date: 2009-03-20
Also published as: KR101478253B1

Abstract

본 발명은 아룸 팔래스티눔(Arum palaestinun Boiss) 유래 신규 피레라지움 화합물 (3α,5α-디이소부틸-6α-이소프로필-피레라진-2-온), 그의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항암활성을 갖는 피페라지움 화합물은 체외 배양된 종양 세포주에 대하여 큰 세포독성을 나타내므로 항암 활성이 매우 우수한 선택적인 항암제의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

아룸 팔래스티눔, 피페라진, 항암제

Description

아룸 팔래스티눔(ＡｒｕｍｐａｌａｅｓｔｉｎｕｎＢｏｉｓｓ) 유래 항암용 피페라지움 화합물{A Piperazium compound for anticancer from Arum palaestinun Boiss}

본 발명은 아룸 팔래스티눔(Arum palaestinun Boiss) 유래 세스퀴테르펜(sesquiterpen) 알칼로이드계 신규 피레라지움 화합물(3α,5α-디이소부틸-6α-이소프로필-피레라진-2-온), 그의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학적 조성물에 관한 것이다

배양된 암세포주에 대한 시험관내 (in vitro) 세포증식 저해효과를 지표로 하여 식물 및 미생물의 추출물로부터 우수한 세포증식 저해물질을 추출분리하고 나아가 이를 유용한 항암제로 발전 개발시켜 나가고자 하는 연구방식은 오랫동안 많은 학자들이 추구해왔던 가장 보편적인 연구개발 형식으로서 오늘날 가장 널리 통용되고 있는 택솔(taxol), 빈블라스틴(vinblastin), 캠토테신(camptothecin) 등의 항암제들은 모두 이러한 연구방식에 따라 식물의 추출물로부터 분리된 약제들이다.

아룸(Arum)은 유럽, 북아프리카 및 서아시아 지역에 고유한 천남성과 중 지 중해 연안 지역에서 높은 종 다양성을 지니고 있는 개화식물체(flowering plant) 약 26종의 속(genus)을 의미한다. 이 식물 종에 대해서 파이토케미컬(phytochemical) 연구는 거의 알려지지 않았고, 플라보노이드-C-글리코사이드(flavonoid C- glycosides)의 발생을 보여주는 연구 또한 마찬가지다(F.U. Afifi et al., Ethnopharmacol 65, 173-177, 1999).

한편, 피페라진 및 치환된 피페라진은, Merck HIV 프로테아제 저해제, 크리시반(Crixivan) 및 개발하에 있는 다양한 약물에서처럼 많은 시판 약제에서 발견할 수 있는 중요한 약리작용단에 해당한다.

그러나, 본 발명의 아룸 팔래스티눔 유래 세스퀴테르펜 알카로이드계의 피페라지움 화합물이 인간 암세포주들에 대하여 강력한 세포증식 저해효과를 나타내어 항암제로서 유용하다는 사실은 아직 보고된 바 없다.

본 발명의 목적은 항암활성을 갖는 신규한 피페라지움 화합물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 항암활성을 갖는 신규한 피페라지움 화합물을 아룸 팔래스티눔으로부터 추출하는 제조방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 상기 항암활성을 갖는 신규 피페라지움 화합물을유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 하기 화학식 1로 표시되는 항암활성을 갖는 아룸 팔래스티눔 유래의 세스퀴테르펜 알카로이드계 신규 화합물A 및 그들의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

상기 화학식1에서,

R1, R2 및 R3는 각각 독립적으로 탄소수 1~6의 알킬기, 탄소수 1~6의 알콕시기, 탄소수 2~7의 알카노일기, 탄소수 2~7의 알콕시카르보닐기이다. 바람직하게는 탄소수 1~6의 알킬기이다.

상기 탄소수 1~6의 알킬기로서는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 제1급 내지 제3급의 부틸기, 펜틸기, 헥실기, 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기, 시클로프로필메틸기, 시클로펜틸메틸기 등을 들 수 있다. 바람직하게는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기 및, n-, s- 및 t-부틸기이다.

상기 탄소수 1~6의 알콕시기로서는 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 이소프로폭시기, 부톡시기, 이소부톡시기, 펜톡시기, 시클로펜틸옥시기 등을 들 수 있다.

상기 탄소수 2~7의 알카노일기로서는 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기,이소부티릴기, 부타노일기, 펜타노일기 등을 들 수 있다

상기 탄소수 2~7의 알콕시카르보닐기로서는 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, 프로폭시카르보닐기, 부톡시카르보닐기 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명에 개시된 화합물A의 순수한 형태의 입체이성체, 광학대장체(optical antipode) 또는 부분입체 이성질체의 임의의 혼합물 등은 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 일 태양으로, 상기 화학식 1에서,

바람직하게는 R1, R2 및 R3이 각각 독립적으로 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기 및, n-, s- 및 t-부틸기이다. 더더욱 바람직하게는 각각 독립적으로 이소프로필기 및 이소부틸기이고, 가장 바람직하게는 R1 및 R2은 이소부틸기이고, R3은 이소프로필기인, 하기 화학식2로 표시되는 화합물B (3α,5α-디이소부틸-6α-이소프로필-피레라진-2-온)이다.

본 발명의 항암활성을 갖는 신규한 피페라지움 화합물A는 아룸 팔래스티눔을 수추출(water extract)한 후 여러 종류의 유기용매로 분획하여 얻은 유기용매 추출분획을 실리카 겔 칼럼 크로마토그라피로 분리하여 고속액체 크로마토그라피법으로 정제하여 제조되었다.

본 발명의 항암활성을 갖는 아룸 팔래스티눔 유래 피페라지움 화합물의 물리ㆍ화학적 특성을 성상, 용해도, 적외선 분광분석법, 질량 분석법 및 핵자기 공명 분광분석 등을 통해 분석하였다.

DEPT 측정을 포함하여 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼 분석으로부터 화합물A의 구조 및 상대 입체화학적 특성을 파악하였고, 스펙트럼의 나열은 600 MHz에서 수행된 탄소-양성자 (HSQC, HMBC) 화학적 이동 상관관계 방법을 통하여 이루어진 반면 분자의 상대적 배열은 NOESY 스펙트럼을 통해 추론하였다.

본 발명의 구체적인 일례인 상기 화학식2의 화합물 B는 ¹H NMR 스펙트럼 (DMSO-d₆)상에서, 3.4-3.6 ppm 범위 및, D₂O로 서로 바꿀 수 있는 δ8.45 및 δ9.75의 2개의 넓은 시그널에서 나타나는 3개의 양성자 시그널을 제외한 '높은장 화학적 이동 영역(upfield chemical shifts region)'인 0.8-2.1 ppm 범위에 대부분의 양성자 시그널이 나타났다. 상기 2개의 넓은 시그널은 HSQC 상관관계(correlation)가 없기 때문에 2개의 NH기임을 알 수 있다.

게다가 화합물 A의 ¹³C NMR 스펙트럼은 15 탄소 공명의 존재를 보여주었다. 화학적 이동(chemical shifts) 및 결합상수(coupling constants)와 함께 상기의 모든 스펙트럼 자료들은 화합물 A가 세스퀴터펜익 알카로이드임을 시사한다.

이하 분석 결과를 구체적으로 설명한다.

(1) 성상

본 발명의 항암활성을 갖는 피페라지움 화합물A는 백색의 비결정성 분말이다.

(2) 용해도

본 발명의 항암활성을 갖는 피페라지움 화합물A는 메탄올, 에탄올, 에틸아세 테이트, 디클로로메탄포 및, 디메틸설폭사이드(DMSO) 등에는 매우 잘 용해된다.

(3) 적외선(IR) 분광분석법

본 발명의 항암활성을 갖는 피페라지움 화합물A의 적외선 흡수 스펙트럼을 조사한 결과, 3250-3170 cm^-1, 1680 cm^-1 및 1578 cm^-1에서 흡수대를 나타낸다.

3250-3170 cm^-1의 흡수대는 넓게 뻗은 아미노기(broad NH-stretching)에 의한 것이고, 1680 cm^- ¹ 의 흡수대는 C=O에 의한 것이다. 또한, 1578 cm^- ¹흡수대는 NH기의 굽힘(bending)에 의한 것이다.

(4) 질량 분석법

본 발명의 항암활성을 갖는 피페라지움 화합물A는HRESIMS 질량 분석법에 의해서 분자식 C₁₅H₃₀N₂O, 분자량 253.2280인 것으로 나타난다.

(5) 핵자기 공명 분광분석

본 발명의 항암활성을 갖는 아룸 팔래스티눔 유래 피페라지움 화합물A의 대표적인 화합물B(화학식2의 화합물)를 자기 공명 분광분석법으로 조사하여 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

화학식2로 표시되는 화합물B대한 ¹H, and ¹³C NMR s스펙트럼의 상세한 분석은 6개의 메틸기(methyl group), 6개의 메틴기(methine group), 2개의 메틸렌기(methylene group) 및 1개의 4차 카보닐기(이미드 또는 아미드)의 존재를 가리키고 있다. 고리의 2번 위치에서 카르보닐기의 존재는 HMBC스펙트럼에서, H-3 (δ 3.59), H-1`a (δ 1.54), 및 H-6 (δ 3.47)와의 상관관계를 보여주는 긴 거리 상관관계로부터 도출해낼 수 있었다(도 1). EIMS 스펙트럼에서 관찰된 m / z 43 [C₃H₇]⁺및 m / z 57 [C₄H₉]⁺ 에서의 단편 이온 피크들이, 이소프로필 및 이소부틸 측면 사슬 각각이 존재한다는 가정을 뒷받침하고 있다. 또한, m / z 85 [C₅H₁₁N]⁺ 및 m / z 72 [C₄H₁₀N]⁺ 에서의 단편 피크는 이들 잔기 각각이 하나의 메틴기를 통하여 질소 원자에 부착됨을 확인하였다. 나아가 ¹³C NMR 스펙트럼에서 각각 C-3, C-5 및 C-6에 대하여, 53.6, 59.7 및 60.6 δ_C에 질소원자를 가지는 3개의 메틴 카본 시그널에 의하여 확인되었다. 피페라진 고리에 5-이소부틸 및 6-이소프로필 잔기의 부착 위치는 HMBC 상관관계를 통해 추론하였는데, H-6 (δ 3.47)/C-1``(δ 24.6) 및 H-1```(δ 2.14)/C-5 (δ 59.7) 사이의 상관관계는 양 알킬 잔기의 5,6-위치에서 확인되었다. 이와 유사하게, 두번째 이소부틸 잔기의 위치는 H-1`a (δ1.55)/ C-2 (δ 175.7)의 HMBC 상관관계로부터 C-3임을 확인하였다.

그리고, 화학식2로 표시되는 화합물B의 상대성 입체 화학적 특성은 NOESY 실험에 의해 결정되었다. H-3 및 H-5 사이, 그리고 H-5 및 H-6 사이에서 관찰된 중요한 NOE 크로스-피크(cross-peak)가 H-3, H-5 및 H-6이 피페라진 고리의 동일한 β-페이스(face)에 존재하는 것과, 그 고리의C-3, C-5 및 C-6에서의 치환체가 α-오리엔테이션(orientation)을 가지는 것을 입증하였다. 또한 H-1``a 및 H₃-2```사이의 상관관계와 H₃-2``` 및 H₃-3`` 사이의 상관관계는 상기 화합물의 상대적인 구조를 제공한다 (도 2).

또한, 본 발명의 화학식 1의 화합물 A는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 화학식 1의 화합물A는 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 형용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유리산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 피페라지움 화합물A를 추출하는 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법은

ⅰ) 아룸 팔래스티눔를 물 또는 저급 알코올에 침지시켜 반복 추출하는 단계;

ⅱ) 상기 저급 알코올 추출물에 유기용매를 가하여 추출하는 단계 ;

ⅲ) 상기유기용매 추출 분획을 크로마토그라피(Chromatography)로 분리하여 항암활성물질을 얻는 단계 ; 및

ⅳ) 상기 분리된 각각의 항암활성물질을 정제하는 단계를 포함한다.

즉, 항암활성을 갖는 아룸 팔래스티눔 유래 피페라지움 화합물A의 분리에 따른 각각의 추출물 및 분리물질을 제공하기 위하여, 아룸 팔래스티눔를 저급 알코올 또는 물로 추출하여 얻은 추출물을, 에틸아세테이트 및 부탄올 등의 유기용매로 다시 추출하고, 이를 통하여 얻은 아룸 팔래스티눔 유기용매 추출분획을 실리카젤이 충진된 칼럼 크로마토그라피(Column Chromatography)로 분리하여 피페라지움 화합물A을 얻는다. 상기 수득한 분리물질이 항암활성을 나타냄을 확인하였다(표 2).

이하 상기 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 아룸 팔래스티눔으로부터 항암활성을 갖는 아룸 팔래스티눔 추출물을 분리한다. 이를 위하여, 본 발명자들은 아룸 팔래스티눔을 물 또는 저급 알코올에 침지시켜 반복 추출함으로써 항암활성을 나타내는 아룸 팔래스티눔의 알코올 분획을 얻었다. 이 때, 아룸 팔래스티눔으로는 특히 잎 부분을 사용하고, 알코올로는 n-부탄올을 사용하는 것이 바람직하다.

상기한 바와 같이 아룸 팔래스티눔 잎을 n-부탄올을 이용하여 추출한 후 다시 유기용매를 사용하여 추출한 항암활성을 갖는 물질을 분리한다.

이 때, 유기용매를 이용한 추출은 비극성용매로부터 극성용매의 차례로 실시하며 유기용매는 저급 알코올을 포함하여 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 부탄올 등이 사용될 수 있다. 바람직한 실시예로서, 본 발명은 에틸아세테이트 및 부탄올 등을 차례로 사용하여 각각의 용매 추출분획 및 물 분획을 제조하였다. 상기와 같은 용매를 사용한 용매 추출시, 아룸 팔래스티눔를 추출하는 온도는 4 내지 100℃ 범위인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 실온 또는 4 내지 30℃ 범위인 것이다.

상기의 아룸 팔래스티눔으로부터 분리한 유기용매 추출분획을 실리카젤이 충진된 칼럼 크로마토그라피를 이용하여 항암 활성을 가지는 물질을 분리하기 위하여, 상기 추출분획을 농축한 후 이를 메탄올이나 에틸아세테이트에 용해시켜 실리카젤이 충진된 칼럼 크로마토그라피에 점적하고 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 메탄올을 여러 가지 조성 비율로 혼합한 유기용매를 사용하여 용출·농축시킨 후 박막 크로마토 그라피로 분리하여 항암 활성을 나타내는 분리물질을 제조하였다.

크로마토그래피 분석 결과, 항암활성을 갖는 분리물질의 이동율(run of flow :Rf)은 0.01 내지 0.5 사이에 위치하고 있으며, 이 이동율 부근의 분획을 모아 반복적으로 농축하여 항암활성을 갖는 물질을 분리하였다.

이와 같이 분리한 항암활성을 갖는 화합물을 더욱 정제하기 위하여, 진공 액체 크로마토그라피법(vacuum Pressure Liquid Chromatography)을 사용하여 비결정질의 흰색 분말 가루로서 수득하였다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해, 화학식 1로 표시되는 아룸 팔래스티눔 유래 피페라지움 화합물A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는, 아룸 팔래스티눔 유래 피페라지움 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 임상투여시에 근육 또는 정맥 주사제와 같은 형태의 비경구 투여 뿐 아니라 경구로도 투여할 수 있으며, 일반적인 의약품 제제의 형태로 기존의 항종양 의약품과 병용하여 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화학식 1 내지 3의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제 로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 사람의 경우 활성 화합물의 통상적인 1일 투여량은 1 내지 1,000 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 10 내지 100 ㎎/㎏ 체중의 범위로, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는, 아룸 팔래스티눔 유래 피페라지움 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물은 A549 (인간 폐암 세포주), SK-OV-3 (인간 난소암 세포주), SK-MEL-2 (인간 흑색종 세포주) 및 HCT-15 (인간 결장암 세포주) 등의 인체 기원 암세포주들에 대하여 탁월한 세포증식 저해효과를 나타내므로 각종 암의 예방 및 치료제로서 유용하다.

전술한 바와 같이 아룸 팔래스티눔으로부터 분리된 세스키테르펜 알칼로이드 화합물은 인체기원 암세포주에 대하여 탁월한 세포증식 저해효과를 나타내므로 폐암, 난소암, 흑색종, 결장암 등 각종 악성종양의 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예1 : 아룸 팔래스티눔로으부터 수추출물의 제조

공기-건조된 아룸 팔래스티눔 잎 221.4 g 을 분말로 하여 물 1 L에 침지시킨 후 60 ℃ 5시간 동안 추출하였다. 상기 추출물을 여과한 후 잔사는 다시 물로 반복 추출하였으며, 이 과정을 모두 3회 반복하여 실시하였다. 상기에서 얻은 여과 후의 여액은 60℃에서 농축하여 수추출물 15.6 g을 제조하였다.

실시예2 : 아룸 팔래스티눔 수추출물로부터 다양한 유기용매 추출분획의 제조

(1) 에틸아세테이트 추출분획의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 아룸 팔래스티눔 수추출물(15.6 g)을 에틸아세테이트 100 ㎖을 넣어 진탕시킨 후 5시간 동안 정치시켜 에틸아세테이트로 이행되는 물질을 모았으며, 이를 4회 반복하여 실시하였다. 상기에서 얻은 에틸아세테이트층 을 모아 여과한 후 농축하여 에틸아세테이트 추출분획 1.7 g을 제조하였다.

(2) n- 부탄올 추출분획의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 에틸아세트추출분획을 제외한 아룸 팔래스티눔 수추출물 (13.2 g) 을 부탄올 100 ㎖을 넣어 진탕시킨 후 5시간 동안 정치시켜 부탄올로 이행되는 물질을 모았으며, 이를 4회 반복하여 실시하였다. 상기에서 얻은 부탄올층을 모아 여과한 후 농축하여 부탄올 추출분획 3.6 g을 제조하였다.

실시예3 : 수용성 추출분획으로부터 컬럼 크로마토그라피에 의한 항암 활성물질의 분리

상기 실시예 2에서 제조한 여러 유기용매 추출분획 중 n-부탄올 추출분획 1g을 진공 액체 크로마토그래피(vacuum liquid chromatography)에서 용출시켰다. 이때 용출 용매로는 1 : 1 조성의 디클로로메탄:메탄올을 사용하였다. 그 후, 메탄올과 물의 조성비율을 달리하여 Sepadex-LH20이 충진된 칼럼의 상단부에 주입하여 반복하여 정제한 후, 흰색의 비결정질 분말 형태로 화합물B를 수득하였다 (80 mg).

참고예1 : 각종 인체 기원 암세포주에 대한 세포증식 저해효과 시험

A549 (인간 폐암 세포주, ATCC CCL 185), SK-OV-3 (인간 난소암 세포주, ATCC HTB 77), SK-MEL-2 (인간 흑색종 세포주, ATCC HTB 68), 및 HCT-15 (인간 결장암 세포주, ATCC CCL 225)의 4종의 인체 기원 암세포주를 미국 NCI (국립암연구 센터)로부터 분양받아 계대배양하여 사용하였으며, 암세포 증식 저해효과는 미국 NCI 및 기타 여러 검정기관에서 약물의 일차적 항암효과의 측정방법으로 가장 널리 사용하는 SRB (sulfrhodamine B) 방법 (Skehan, P.et al., (1990), J. Natl. Cancer. Inst., 82, 1107)에 준하여 다음과 같이 측정하였다.

1) 계대중의 암세포들을 트립신-CDTA 용액으로 처리하여 용기 부착면으로부터 분리시키고, 96-웰 편평 바닥 마이크로플레이트 (Falcon)에 각 웰당 세포수가 각각 5 x 10 3 (A549, HCT-15), 1 x 10 4 (SK-MEL-2, XF498) 및 2 x 104 (SK-OV-3)이 되도록 희석하여 분주하였다. 이들을 CO 2 배양기속에서 24시간 배양하여 세포가 웰의 바닥면에 부착(anchor)되도록 한 후 흡입기로 배지를 제거하고 배지에 녹여둔 검체를 농도별로 각각의 웰속에 넣어주고 48 시간동안 계속 배양하였다.

2) 48시간동안의 배양을 마친 후 각 웰속의 배지를 흡입 제거하고 10 % 트리클로로아세트산 (TCA) 용액을 각 웰당 10 ㎕씩 가하고 1 시간동안 상온에서 방치하여 세포들을 고정시킨 다음 물로 5-6회 세척하여 과잉의 TCA 용액을 완전제거하고 건조시켰다.

3) 각 웰당 100 ㎕씩의 SRB 염색용액 (1 % 아세트산 중의 0.4 % 설포로다민)을 가하여 30분간 염색하고 과잉의 염색액은 1 % 아세트산으로 5-6회 반복 세척하여 제거한 후 상온에서 건조시켰다.

4) 각 웰당 100 ㎕씩의 10 mM 트리스마 염기(Trisma base (unbuffered)) 용액을 가한 후 타이터 플레이트 진탕기(titer plate shaker)로 10분간 진탕하여 세 포에 염색된 염색액을 용출시키고 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 520 nm에서의 흡광도치(absorbance)를 측정하였다.

5) 검체용액을 넣어준 검체군의 암세포 증식율 (% cell growth, 항암활성 의 역)은 다음수식에 따라 산출하였다. 즉 검체용액 대신 동량의 배지를 넣어준 대조군의 세포수(C)와 0 시간(zero time)의 세포수(Tz) 및 검체군의 세포수(T)를 각각 각군의 흡광도치로부터 환산하였다. 검체군의 암세포 증식율 (% cell growth)은 Tz> T인 경우에는 수학식1로, Tz< T인 경우에는 수학식 2로 계산하였다.

수학식 1

수학식 2

6) 각각의 농도에서 측정한 검체군의 암세포 증식율을 바탕으로하여 LOTUS 프로그램의 데이터 회귀(data regression)를 사용하여 검체가 해당 암세포의 증식을 50 % 저해하는 농도 (ED 50 )를 계산하였다.

실시예4 : 화합물2의 인체기원 암세포 증식 저해효과(항암 활성 측정)

참고예의 방법에 따라, 실시예 3에서 얻은 화합물 B의 암세포 증식 저해효과를 A549를 비롯한 4종의 인체기원 암세포주에 대하여 검정하여 각 암세포주에 대한 50 % 증식저해 농도(ED₅₀)를 표 2에 나타내었다.

	ED₅₀(㎍/㎖)
인체 세포주	A549	SK-OV-3	SK-MEL-2	HCT15
화합물 B	4.26±0.2μＭ	1.38±0.1μＭ	0.51±0.1μＭ	2.47±0.3μＭ

각 암세포주에 대한 ED₅₀값은 체외 세포증식을 50% 저해할 때의 값을 의미한다.

상기 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 화합물 1은 각종 암세포주에 대하여 우수한 세포 증식 저해효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명의 피페라지움 A의 HMBC(Heteronuclear Multiple Quantum Correlation)을 나타낸 도식도이다.

도 2는 본 발명의 피페라지움 A의 NOESY 상관성(Nuclear Overhauser effect spectroscopy Correlation) 및 상대적 입체화학적 특성을 나타낸 도식도이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 항암활성을 갖는 피페라지움 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R1, R2 및 R3는 각각 독립적으로 탄소수 1~6의 알킬기, 탄소수 1~6의 알콕시기, 탄소수 2~7의 알카노일기, 탄소수 2~7의 알콕시카르보닐기이다.
제1항에 있어서, 상기 R1, R2 및 R3는 각각 독립적으로 탄소수 1~6의 알킬기인 것을 특징으로 하는 피페라지움 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항에 있어서, 상기 R1, R2 및 R3는 각각 독립적으로 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-, s- 및 t-부틸기, 및 이소부틸기인 것을 특징으로 하는 피페라지움 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염 .
제1항에 있어서, 상기 R1, R2 및 R3는 각각 독립적으로 이소프로필기, 및 이소부틸기인 것을 특징으로 하는 피페라지움 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 이소부틸이고, R3는 이소프로필인 것을 특징으로 하는 피페라지움 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항에 있어서, 상기 피페라지움 화합물은 아룸 팔래스티눔(Arum palaestinun) 유래인 것을 특징으로 하는 피페라지움 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
다음 단계를 포함하는, 항암활성을 갖는 피페라지움 화합물의 제조방법:

(ⅰ) 아룸 팔래스티눔(Arum palaestinun)을 저급 알코올 또는 물에 침지시켜 반복 추출하는 단계;

(ⅱ) 상기 저급 알코올 추출물에 용매를 가하여 분배(획)하는 단계;

(ⅲ) 상기 용매 추출 분획을 크로마토그라피(Chromatography)로 분리하여 항암활성 피페라지움 화합물을 얻는 단계; 및

(ⅳ) 상기 분리된 피페라지움 화합물을 정제하는 단계.
제7항에 있어서, 단계 (i)의 아룸 팔래스티눔은 잎을 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항의 피페라지움 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학적 조성물.
제9항에 있어서, 상기 암은 폐암, 난소암, 흑색종, 및 결장암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.